Denne protokol giver en omfattende dissektion og analyse guide til brug af dybt okulær vartegn, s-opsin immunhistokemi, Retistruct og brugerdefinerede kode til præcist og pålideligt orientere isolerede mus nethinden i anatomiske rum.
Præcist og pålideligt identificerer rumlige orientering af isolerede mus nethinden er vigtigt for mange undersøgelser i visuelle neurovidenskab, herunder analyse af tæthed og størrelse forløb af retinale celletyper, retning tuning af retning-selektive ganglion celler, og undersøgelsen af topografisk degeneration mønstre i nogle retinal sygdomme. Men der er mange forskellige okulær dissektion metoder rapporteret i litteraturen, der bruges til at identificere og navngive retinal orientering i mus nethinden. Mens metoden for orientering anvendes i sådanne undersøgelser er ofte overset, kan ikke rapportering hvordan retinal orientering bestemmes forårsage forskelle i litteratur og forvirring når du forsøger at sammenligne data mellem undersøgelser. Overfladiske okulær vartegn såsom hornhinde burns er almindeligt anvendt, men har for nylig vist sig at være mindre pålidelige end dybere vartegn såsom rectus musklerne, den plexus revne eller s-opsin gradient. Her, leverer vi en omfattende guide til brug af dybe okulær vartegn til præcist at dissekere og dokumentere de rumlig orientering af en isoleret mus nethinden. Vi har også sammenlignede effektiviteten af to s-opsin antistoffer og omfattede en protokol for s-opsin Immunhistokemi. Fordi orientering af nethinden ifølge s-opsin gradient kræver retinal genopbygning med Retistruct software og rotation med brugerdefineret kode, har vi fremlagt de vigtige skridt, der kræves for at bruge begge af disse programmer. Samlet set er målet med denne protokol til at levere en pålidelig og repeterbare sæt af metoder til præcis retinal orientering, der kan tilpasses til mest eksperimenterende protokoller. Et overordnet mål for dette arbejde er at standardisere retinal orientering metoder for fremtidige undersøgelser.
En vigtig og ofte overset aspekt af retinale neurovidenskab er ordentlig orientering og analyse af isolerede hele-mount nethinden, hvad enten det er retningen af en nethinden i et Elektrofysiologi optagelse kammer eller på en histologisk dias. Dette er især vigtigt for undersøgelser, hvor mus nethinden, som er i øjeblikket den mest udbredte model til undersøgelser af de pattedyr visuelle system. De seneste opdagelser afsløre at musen nethinden ikke er rumligt ensartet men har tæthed og størrelse forløb af funktionelt adskilte retinal celletyper, som melanopsin ganglion celler, forbigående OFF-alpha ganglion celler og kegle opsins1,2 ,3,4,5. Derfor, metoden anvendes til at bestemme retningen af nethinden kan påvirke de eksperimentelle resultater med celle type eller opsin distributioner2,3,6, retning tuning af retning-selektive ganglion celler7,8,9, og topografiske mønstre af retinale degeneration10,11,12,13,14 . Faktisk kan ikke rapportering hvordan retinal orientering er rapporteret forårsage forskelle i litteratur og forvirring når du forsøger at sammenligne data mellem undersøgelser. Det er derfor vigtigt, at forskere rapport metode til at identificere orientering af nethinden, således at resultaterne af sådanne undersøgelser kan fortolkes præcist.
Retinal orientering er almindeligt identificeret ved at score den dorsale, ventrale, nasal eller tidsmæssige hornhinden inden okulære enucleation1,3,12,15,16,17 ,18,19 eller ved at skære eller farvning dybe anatomiske øje vartegn såsom ekstraokulær muskler6,7, årehinden revne20,21, eller s-opsin gradient2,3. Rectus muskler kan bruges til at identificere den dorsale, ventrale, nasal, og tidsmæssige nethinden ved at gøre et dybt lindre snit, der gennemskærer udlæg i enten den overlegne rectus, ringere rectus, mediale rectus eller laterale rectus musklen, henholdsvis. Men for de fleste eksperimenter, ved hjælp af en rectus muskler er tilstrækkelig til orientere nethinden22. Den plexus revne, som er en rest af øjet udvikling, kan ses som en svag vandret streg på bagsiden af øjet. Hver ende af denne linje afslutter på enten nasale eller den tidsmæssige pol på kloden23. Endelig, s-opsin udtryk distribueres asymmetrisk til den ventrale nethinden i mus, og s-opsin antistoffer kan bruges til at afsløre den ventrale nethinden i immunhistokemisk eksperimenter1.
De seneste arbejde af Stabio, et al. 22 viste at overfladiske okulær vartegn såsom hornhinde burns er en mindre pålidelig metode til orientere nethinden i anatomisk rum, sandsynligvis på grund af menneskelige fejl og variabilitet i at gøre hornhindens brænde når ved hjælp af tidsmæssige og mediale canthi som referencepunkter. Derimod har dybe vartegn, såsom den overlegne rectus musklen, plexus fissur og s-opsin gradient, vist sig at være mere pålidelige og nøjagtige vartegn for orientere nethinden22. Identifikation af disse anatomiske landemærker kræver imidlertid entydigt dissektion trin, der ikke er beskrevet i detaljer i litteraturen. Målet med denne protokol er således at levere en omfattende tutorial om hvordan man bruger overlegen rectus muskel, plexus fissur og s-opsin gradient præcist identificere den rumlige orientering af musen nethinden. Desuden har vi medtaget en sammenligning af effektiviteten af to s-opsin antistoffer, samt en protokol for s-opsin Immunhistokemi.
En yderligere udfordring til undersøgelser, der er afhængige af præcise retinal orientering er de store lindre nedskæringer kræves at flade wholemount nethinder på en optagelse kammer, parabol eller dias. Dette kan indføre udfordringer til analyse af hvad er naturligvis en tredimensionel struktur, når det er afbildet som en flad todimensional struktur. Et program kaldet Retistruct24 kan bruges til at returnere en flad wholemount nethinden til sine tre-dimensionelle struktur, før data indsamlet fra det er analyseret. Således, en del af denne protokol er dedikeret til at fremhæve de skridt, der er nødvendige for at bruge Retistruct software til at rekonstruere s-opsin immunostained mus nethinder. Vi har også medtaget et afsnit af protokollen for at bruge vores custom MATLAB script, som blev udviklet til præcist rotere og orientere mus nethinder farves med s-opsin.
Der har været nogen omfattende, standardiseret protokol til bestemmelse og mærkning orientering af isolerede mus nethinden i anatomiske rum. Protokollen detaljeret her forsøg på at udfylde dette tomrum ved at standardisere og beskriver, hvordan du bruger dybe anatomiske landemærker som referencepunkter til pålideligt at identificere retinal orientering. Det har vist sig at de dybe anatomiske landemærker i denne protokol giver en mere nøjagtig og pålidelig metode til orientere mus nethinden end overfladiske vartegn såsom hornhinde burns22. Således, undersøgelser, der har påberåbt sig hornhinde burns for retinal orientering kan have haft større fejl i orientering end undersøgelser, der har påberåbt sig vartegn såsom rectus muskler og plexus revne. Denne uoverensstemmelse fremhæver behovet for og betydningen af denne standardiseret protokol med hensyn til fortolkning af resultater og sammenligninger mellem undersøgelser, der afhænger af nøjagtige retinal orientering. Alt i alt vil en standardiseret protokol give en fælles metode for vision forskere til at følge, hvilket eliminerer tilstedeværelsen af en forstyrrende variabel i dataopsamling, der kan opstå ved brug af ikke-standardiseret metoder til identifikation af retinal orientering.
De metoder, der præsenteres her er let gentagelig og gælder for mange typer af eksperimentelle protokoller. Faktisk er en af de største fordele ved denne protokol dens tilpasningsevne. Fordi plexus revne, s-opsin udtryk og rectus muskel vartegn er alle blevet fundet pålideligt identificere retinal orientering22 kan den milepæl, der passer bedst til de eksperimentelle parametre vælges til at optimere dataopsamling (tabel 1). Derudover metoder af dissektion kan kombineres for at yderligere klarlægge orienteringen af nethinden. For eksempel plexus revne nedskæringer kan kombineres med s-opsin Immunhistokemi for at orientere alle fire pæle af nethinden: nasal og tidsmæssige halvkugle kan identificeres af plexus revne nedskæringer, og s-opsin Immunhistokemi kan identificere ventrale og dorsale halvkugler. Endnu, tilpasningsevne af denne protokol kan være begrænset af tid-følsomme karakter af fysiologi eksperimenter. Fordi den tid, det tager at identificere et vartegn, lave en hornhinde brænde og udføre en lindre cut kunne resultere i væsentlige vævsdød i ex vivo eksperimenter, kan nogle af disse dissektion metoder være mindre end optimal. Heldigvis, når en dissector er blevet bekendt med enten plexus revne eller overlegen rectus muskel dissektion metode, til at identificere de dybe vartegn og gøre den lindre nedskæringer hurtigt blive en del af rutinen dissektion og tilføjer ikke væsentligt til længden af dissektion. Selv om vi erkender at trin detaljeret her kan tilføje på tid til meget tidsfølsomme eksperimenter, foreslår vi at bruge s-opsin gradient for post hoc retinal orientering når levedygtighed af væv er ikke længere et problem (figur 3 ). Farvning nethinden for s-opsin er en effektiv måde at orientere nethinden, som det kan identificere alle fire polakker: s-opsin farvning opdeler nethinden i dorsal og ventral polakker og giver mulighed for identifikation af den nasale og tidsmæssige poler afhængigt af, om nethinden er fra en højre eller venstre øjet (figur 3). Vi mener derfor, denne protokol leverer en pålidelig og repeterbare sæt af metoder til præcis retinal orientering, der kan opfylde enhver eksperimentelle parametre.
Som med enhver forandret retinale dissektion, er gyldigheden af metoden dissektion begrænset af nøjagtigheden af dissector og kvaliteten af det væv, der er blevet isoleret. Hvis alle væv er tabt under dissektion eller en nethinden er også mangled for nøjagtige genopbygningen, vil Retistruct og MATLAB program ikke kunne pålideligt rekonstruere eller orientere nethinden. Det er derfor vigtigt at praktisere metoden dissektion, før du bruger det for data-indsamling eksperimenter. Mens typerne af dissektioner forklaret her ikke er svært, må de praktiseres for at sikre repeterbarhed afdækning af retinale orientering med et bestemt vartegn. Derudover er det vigtigt, at den dissector praksis visuelt at identificere de anatomiske landemærker forud for begyndelsen dataindsamling for at sørge for, at den korrekte landmark bliver brugt. En måde at kontrollere rigtigheden af en særlig dissector er at gøre enten plexus revne nedskæringer eller overlegen rectus muskel nedskæringer og derefter sammenligne placeringen af udskæringer til s-opsin gradient, da det er en fast markør og er således ikke afhængig af nøjagtigheden af dissectio n. potentielle dissectors kan også sammenligne deres rekonstruerede nethinder til eksempler på rekonstruerede nethinder med nøjagtige landmark nedskæringer er vist i figur 1 og figur 2. Det væsentlige, en potentiel dissector skal udføre trinene i denne protokol for en bestemt dissektion type, uanset om det er den overlegne rectus muskel eller choroidea revne metode, og sammenligne resultaterne til s-opsin gradient at fastslå gyldigheden af en særlige dissector. Fordi hvis dissector er i tvivl om placeringen af skelsættende, kan det resultere i en forkert orientering af nethinden der vil som standard berøre dataindsamling og fortolkning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Bretagne dag og Jessica Onyak for deres tekniske bistand og Dr. Liu for venligst at lade os bruge hans epifluorescerende mikroskop. Anerkendelser af støtte: NIH R15EY026255-01 og Karl Kirchgessner Foundation.
0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |