Summary
इस प्रोटोकॉल गहरी नेत्र स्थलों के उपयोग के लिए एक व्यापक विच्छेदन और विश्लेषण गाइड प्रदान करता है, एस opsin immunohistochemistry, Retistruct, और कस्टम कोड को सही और मज़बूती से संरचनात्मक अंतरिक्ष में अलग माउस रेटिना उंमुख ।
Abstract
सही और मज़बूती से पृथक माउस रेटिना के स्थानिक उन्मुखीकरण की पहचान दृश्य तंत्रिका विज्ञान में कई अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण है, रेटिना कोशिका प्रकार के घनत्व और आकार ढाल के विश्लेषण सहित, दिशा की ट्यूनिंग दिशा-चयनात्मक नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं, और कुछ रेटिना रोगों में स्थलाकृतिक अध कि पैटर्न की परीक्षा. हालांकि, वहां कई अलग नेत्र विच्छेदन विधियों कि पहचान करने के लिए और माउस रेटिना में रेटिना अभिविन्यास लेबल इस्तेमाल किया जाता है में रिपोर्ट कर रहे हैं । हालांकि इस तरह के अध्ययनों में इस्तेमाल उन्मुखीकरण की विधि अक्सर अनदेखी की है, कैसे रेटिना अभिविन्यास का निर्धारण किया जाता है रिपोर्टिंग नहीं साहित्य और भ्रम में विसंगतियों का कारण बन सकता है जब अध्ययन के बीच डेटा की तुलना करने का प्रयास. ऐसे corneal जलता के रूप में सतही नेत्र स्थलों आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं, लेकिन हाल ही में इस तरह के rectus की मांसपेशियों, रंजित विदर, या एस opsin ढाल के रूप में गहरी स्थलों की तुलना में कम विश्वसनीय होना दिखाया गया है । यहां, हम गहरी नेत्र स्थलों के उपयोग के लिए एक व्यापक गाइड प्रदान करने के लिए सही काटना और एक पृथक माउस रेटिना के स्थानिक अभिविंयास दस्तावेज । हम भी दो एस opsin एंटीबॉडी की प्रभावशीलता की तुलना में है और एस के लिए एक प्रोटोकॉल-opsin immunohistochemistry शामिल थे । क्योंकि एस opsin ढाल के अनुसार रेटिना के उंमुखीकरण Retistruct सॉफ्टवेयर और कस्टम कोड के साथ रोटेशन के साथ रेटिना पुनर्निर्माण की आवश्यकता है, हम महत्वपूर्ण इन दोनों कार्यक्रमों का उपयोग करने के लिए आवश्यक कदम प्रस्तुत किया है । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि सबसे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है सटीक रेटिना अभिविन्यास के लिए तरीकों का एक विश्वसनीय और दोहराने योग्य सेट देने के लिए है. इस काम का एक व्यापक लक्ष्य को भविष्य के अध्ययन के लिए रेटिना अभिविन्यास तरीकों का मानकीकरण है.
Introduction
रेटिना तंत्रिका विज्ञान के एक महत्वपूर्ण और कभी अनदेखी पहलू उचित अभिविन्यास और पृथक पूरे-माउंट रेटिना का विश्लेषण है, चाहे वह एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग चैंबर में एक रेटिना के उंमुखीकरण या एक ऊतकवैज्ञानिक स्लाइड पर हो. यह माउस रेटिना, जो वर्तमान में स्तनधारी दृश्य प्रणाली की जांच के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल है शामिल अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । हाल की खोजों से पता चलता है कि माउस रेटिना स्थानिक वर्दी नहीं है, लेकिन इस तरह के melanopsin नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं के रूप में कार्यात्मक-अलग रेटिना सेल प्रकार, के घनत्व और आकार ढाल है, क्षणिक ऑफ अल्फा नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं, और शंकु opsins1,2 ,3,4,5. नतीजतन, विधि रेटिना के उन्मुखीकरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक सेल प्रकार या opsin वितरण शामिल परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं2,3,6, दिशा की ट्यूनिंग दिशा-चयनात्मक नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं7,8,9, और रेटिना अध? '10,11,12,13,14 के स्थलाकृतिक पैटर्न . वास्तव में, नहीं रिपोर्टिंग कैसे रेटिना अभिविंयास रिपोर्ट है साहित्य और भ्रम में विसंगतियों का कारण बन सकता है जब अध्ययन के बीच डेटा की तुलना करने का प्रयास । इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ताओं ने रेटिना के उंमुखीकरण की पहचान के लिए विधि की रिपोर्ट ताकि इस तरह के अध्ययनों के परिणाम सही व्याख्या की जा सकती है ।
रेटिना अभिविंयास सामांयतः पृष्ठीय, ventral, नाक या लौकिक कॉर्निया स्कोरिंग से पहले नेत्र enucleation1,3,12,15,16,17 से पहचान की है ,18,19 या काटने या extraocular मांसपेशियों6,7, रंजित विदर20,21, या के रूप में गहरी संरचनात्मक आंख स्थलों धुंधला द्वारा s-opsin ढाल2,3. rectus मांसपेशियों को पृष्ठीय, ventral, नाक की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और एक गहरी राहत कटौती है कि या तो बेहतर rectus, अवर rectus, औसत दर्जे का rectus, या पार्श्व rectus मांसपेशी क्रमशः के लगाव bisects बनाकर लौकिक रेटिना । हालांकि, सबसे प्रयोगों के लिए, एक rectus मांसपेशी का उपयोग रेटिना22ओरिएंट के लिए पर्याप्त है । रंजित विदर, जो आंख के विकास का एक अवशेष है, आंख की पीठ पर एक बेहोश क्षैतिज रेखा के रूप में देखा जा सकता है । इस लाइन के प्रत्येक छोर या तो नाक या23ग्लोब के लौकिक ध्रुव पर समाप्त होता है । अंत में, एस opsin अभिव्यक्ति असममित चूहों में ventral रेटिना को वितरित किया जाता है, और एस opsin एंटीबॉडी immunohistochemical प्रयोगों1में ventral रेटिना प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Stabio, एट अल द्वारा हाल ही में काम करते हैं । 22 प्रदर्शन किया कि ऐसी corneal बर्ंस के रूप में सतही नेत्र स्थलों संरचनात्मक अंतरिक्ष में रेटिना ओरिएंट के लिए एक कम विश्वसनीय तरीका है, सबसे अधिक मानव त्रुटि और परिवर्तनशीलता के कारण corneal जला जब लौकिक और औसत दर्जे का उपयोग करने में होने की संभावना संदर्भ बिंदुओं के रूप में canthi । इसके विपरीत, इस तरह के सुपीरियर rectus मांसपेशी, रंजित विदर, और एस-opsin ढाल के रूप में गहरी स्थलों, रेटिना22ओरिएंट के लिए और अधिक विश्वसनीय और सटीक स्थलों होना दिखाया गया है । हालांकि, इन संरचनात्मक स्थलों की पहचान के लिए अद्वितीय विच्छेदन चरणों की आवश्यकता है जो कि साहित्य में विस्तार से वर्णित नहीं हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को कैसे बेहतर rectus मांसपेशी, रंजित विदर, और एस opsin ढाल का उपयोग करने के लिए सही माउस रेटिना के स्थानिक उंमुखीकरण की पहचान पर एक व्यापक ट्यूटोरियल प्रदान करना है । इसके अलावा, हम दो एस के प्रभाव की तुलना शामिल है-opsin एंटीबॉडी, साथ ही एस के लिए एक प्रोटोकॉल-opsin immunohistochemistry ।
एक सटीक रेटिना अभिविन्यास पर निर्भर अध्ययन के लिए एक अतिरिक्त चुनौती बड़ी राहत कटौती एक रिकॉर्डिंग चैंबर, पकवान, या स्लाइड पर wholemount रेटिना समतल करने के लिए आवश्यक है. यह क्या स्वाभाविक रूप से एक तीन आयामी संरचना है जब यह एक फ्लैट दो आयामी संरचना के रूप में छवि है के विश्लेषण के लिए चुनौतियों का परिचय कर सकते हैं । एक कार्यक्रम24 Retistruct बुलाया अपने तीन आयामी संरचना के लिए एक फ्लैट wholemount रेटिना लौटने से पहले यह विश्लेषण किया जाता है डेटा से एकत्र इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का एक वर्ग कदम है कि Retistruct सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए s-opsin immunostained माउस रेटिना पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक है उजागर करने के लिए समर्पित है । हम भी हमारे कस्टम MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग कर के लिए प्रोटोकॉल का एक खंड शामिल है, जो सही ढंग से घुमाएं और ओरिएंट माउस s-opsin के साथ सना हुआ रेटिना विकसित किया गया था ।
Protocol
यहां वर्णित सभी पद्धतियों को Akron विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. बेहतर Rectus मांसपेशी मील का पत्थर का उपयोग करने के लिए रेटिना अभिविन्यास की पहचान
नोट: सुपीरियर rectus मांसपेशी पृष्ठीय रेटिना (1 टेबल) के लिए एक मील का पत्थर है । प्रयोग पृष्ठीय रेटिना की अंकन की आवश्यकता नहीं है, तो चरण 1 छोड़ें और चरण 2 के लिए जारी रखें ।
- अपने अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल माउस इच्छामृत्यु के लिए का पालन करें ।
- दुनिया के सामांय अभिविंयास की पहचान करने के लिए, एक पृष्ठीय कॉर्निया पर सीधे कॉर्निया के पास नाक और लौकिक canthi के बीच निशान जला कर-श्वेतपटल सीमा के तुरंत बाद इच्छामृत्यु (चित्रा 1एक) । दस सेकंड के लिए एक दाग़ना कलम हीटिंग द्वारा जला निशान बनाओ और फिर एक दूसरे से भी कम समय के लिए पृष्ठीय कॉर्निया को कलम की नोक छू ।
नोट: बहुत लंबे समय के लिए कॉर्निया के लिए दाग़ना पेन होल्डिंग ग्लोब पंचर करने के लिए कारण होगा ।
नोट: कुछ दाग़ना कलम प्रकाश का उत्सर्जन करते हैं, तो दाग़ना कलम सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किसी भी प्रकाश उत्सर्जन नहीं करता है जब गर्म, यह अंधेरे अनुकूलित प्रयोगों के लिए एक सुरक्षित विकल्प बना रही है । - enucleation के लिए, घुमावदार संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे से आंख धक्का बाहर अपने गर्तिका और पकड़ के नीचे से दुनिया । ऑप्टिक तंत्रिका कटौती करने के लिए दुनिया को दूर मत करो; इसके बजाय, धीरे से अपने सॉकेट से दुनिया उठा, जबकि एक साथ इसे धीरे से बाएं से सही करने के लिए दुनिया सॉकेट से जारी की है जब तक चलती है ।
नोट: इस प्रस्ताव rectus मांसपेशियों ग्लोब से जुड़े रहने के लिए जब दुनिया अंत में सॉकेट से पूरी तरह से हटा दिया जाता है की अनुमति देगा । ऑप्टिक नर्व भी अक्सर ग्लोब से जुड़ी रहेगी. - एक पेट्री युक्त डिश में संलग्न rectus की मांसपेशियों के साथ ग्लोब स्थानांतरण मध्यम । जो आंख की बाईं आंख है और जो सही आंख है ट्रैक रखने के लिए सुनिश्चित करें ।
नोट: विच्छेदन अपने प्रायोगिक प्रोटोकॉल के साथ संरेखित करता है कि एक उचित विखण्डन माध्यम का उपयोग करना चाहिए । - विच्छेदन गुंजाइश के तहत, नेत्रहीन पृष्ठीय corneal जला पता लगाने और बेहतर rectus मांसपेशी जिसके साथ यह (चित्रा 1A) जुड़ा हुआ है की पहचान ।
- विच्छेदन कैंची या एक 20 जी (०.९ मिमी x 25 मिमी) सुई का उपयोग ( सामग्री की मेजदेखें), जला निशान पर कॉर्निया पंचर । ऑप्टिक तंत्रिका की ओर दुनिया में एक गहरी राहत कटौती करने के लिए बेहतर मांसपेशी bisect । इस कटौती के साथ एक अलग और खंगाला रेटिना आंकड़े 1b और 1Cमें दिखाया गया है ।
- संदंश के दो सेट का उपयोग करके रेटिना को अलग करने के लिए शुरू ( सामग्री की तालिकादेखें) धीरे चरण १.६ में पंचर के साथ बनाया रेटिना का हिस्सा जब तक आंसू उजागर है ।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि यह धीरे से किया जा सकता है, के रूप में भी जबरदस्ती फाड़ के लिए राहत कटौती का कारण बन सकता है और आंसू । - उपयोग संदंश को चिढ़ाने के लिए श्वेतपटल से रेटिना के अलावा जब तक श्वेतपटल पूरी तरह से हटा दिया गया है । आईरिस, लेंस, अवलेह, और संदंश के साथ किसी भी शेष संरचनाओं जब तक रेटिना पूरी तरह से अलग है निकालें ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । ऊतक s-opsin immunohistochemistry के लिए तय होने जा रहा है, तो चरण ३.५ करने के लिए जारी रखें ।
2. रंजित विदर मील का पत्थर का उपयोग करने रेटिना अभिविन्यास की पहचान
नोट: रंजित विदर आंख के पीछे श्वेतपटल पर मौजूद है, और लौकिक ध्रुव से नाक ध्रुव (आंकड़े 2 बी और 2cके लिए चलाता है; तालिका 1) ।
- माउस इच्छामृत्यु के लिए अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल का पालन करें ।
- दुनिया के सामांय अभिविंयास की पहचान करने के लिए, एक पृष्ठीय कॉर्निया पर सीधे कॉर्निया के पास नाक और लौकिक canthi के बीच निशान जला कर-श्वेतपटल सीमा के तुरंत बाद इच्छामृत्यु (चित्रा 2ए) । दस सेकंड के लिए एक दाग़ना कलम हीटिंग द्वारा जला निशान बनाओ और फिर एक दूसरे से भी कम समय के लिए पृष्ठीय कॉर्निया को कलम की नोक छू ।
नोट: बहुत लंबे समय के लिए कॉर्निया के लिए दाग़ना पेन होल्डिंग ग्लोब पंचर करने के लिए कारण होगा । - Enucleate आंख और एक पेट्री डिश जिसमें विच्छेदन मध्यम से ग्लोब हस्तांतरण । जो आंख की बाईं आंख है और जो सही आंख है ट्रैक रखने के लिए सुनिश्चित करें ।
नोट: विच्छेदन अपने प्रायोगिक प्रोटोकॉल के साथ संरेखित करता है कि एक उचित विखण्डन माध्यम का उपयोग करना चाहिए । - नेत्रहीन नेत्र (चित्रा 2बी, 2c) की पीठ पर रंजित विदर की पहचान और पता लगाने ।
नोट: इंफ्रा-रेड लाइट20के तहत eyecup के अंदर की धमनियां विदर भी दिखाई दे रही है । - पेट्री डिश में दुनिया ओरिएंट इतना है कि पृष्ठीय जला बेहतर पोल पर स्थित है, क्योंकि यह होगा अगर आंख माउस में अभी भी थे ।
नोट: पृष्ठीय जला की उपस्थिति नाक और दुनिया के लौकिक पक्ष की पहचान के लिए अनुमति देता है, जब तक कि यह एक सही या बाईं आंख है प्रलेखित किया गया है: यदि यह एक सही आंख है, नाक रंजित विदर जला और tempora के अधिकार के लिए किया जाएगा एल धमनियां विदर के बायीं ओर जाएंगी । अगर यह एक बाईं आंख है, लौकिक रंजित विदर जला के अधिकार के लिए होगा और नाक रंजित विदर जला के बाईं ओर होगा ।
विच्छेदन कैंची या एक 20 जी (०.९ x 25 मिमी) सुई का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें), दुनिया में एक पंचर बनाने जहां पृष्ठीय जला स्थित है । - ऑप्टिक तंत्रिका जहां पृष्ठीय corneal जला स्थित है की ओर एक उथले राहत कटौती करें । इस कटौती से रंजित विदर को सीधा किया जाएगा, अलगाव के बाद पृष्ठीय रेटिना की पहचान के लिए अनुमति (चित्रा 2डी) ।
- निंनलिखित दो ऑप्टिक तंत्रिका की ओर गहरी राहत कटौती करें: विच्छेदन कैंची के ब्लेड अस्तर से एक आंख की पीठ पर लौकिक धमनियां विदर लाइन के साथ, और एक विच्छेदन कैंची के ब्लेड से नाक रंजित के साथ अस्तर से एक आंख की पीठ पर विदर लाइन । ये कटौती चित्रा 2डी और 2Eमें एक अलग और खंगाला रेटिना पर दिखाया जाता है ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, एक गहरी कटौती लौकिक रंजित विदर पर बनाया जा सकता है और एक उथले कटौती नाक रंजित विदर में बनाया जा सकता है, पृष्ठीय corneal अनावश्यक कटौती जला कर । यह कम राहत कटौती के साथ रेटिना के सटीक अभिविन्यास के लिए अनुमति देता है. - संदंश के दो सेट का उपयोग करके रेटिना को अलग करने के लिए शुरू ( सामग्री की तालिकादेखें) धीरे चरण २.७ और २.८ रेटिना का हिस्सा जब तक में पंचर के साथ बनाया छेद फाड़ करने के लिए सामने आ रहा है.
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि यह धीरे से किया जा सकता है, के रूप में भी जबरदस्ती फाड़ (ओं) को राहत देने के कारण कर सकते है और आंसू । - उपयोग संदंश को चिढ़ाने के लिए श्वेतपटल से रेटिना के अलावा जब तक श्वेतपटल पूरी तरह से हटा दिया गया है । आईरिस, लेंस, अवलेह, और संदंश के साथ किसी भी शेष संरचनाओं जब तक रेटिना पूरी तरह से अलग है निकालें ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । ऊतक s-opsin immunohistochemistry के लिए तय होने जा रहा है, तो चरण ३.५ करने के लिए जारी रखें ।
3. माउस रेटिना में एस opsin ढाल लेबलिंग
नोट: s-opsin photopigment अभिव्यक्ति असममित ventral रेटिना1करने के लिए वितरित किया जाता है, यह रेटिना के ventral आधे के लिए एक उत्कृष्ट मार्कर बना. यह विधि केवल निश्चित और immunostained ऊतक (तालिका 1) के लिए उपयोगी है । निंनलिखित चरणों के लिए लागू किया जा सकता है रेटिना कि aforementioned तरीकों में से किसी का उपयोग कर विच्छेदित किया गया है ।
- माउस इच्छामृत्यु के लिए अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल का पालन करें ।
- इच्छामृत्यु के तुरंत बाद, आंख को enucleate और एक पेट्री डिश में ग्लोब को विच्छेदन माध्यम से लगाएं । का ट्रैक रखने के लिए सुनिश्चित करें कि आंख बाईं आंख है और जो सही आंख है क्रम में रेटिना अभिविन्यास की पहचान करने के बाद रेटिना विदारक है.
नोट: विच्छेदन अपने प्रायोगिक प्रोटोकॉल के साथ संरेखित करता है कि एक उचित विखण्डन माध्यम का उपयोग करना चाहिए । -
संदंश के दो सेट (सामग्री की मेज) का उपयोग करके रेटिना को अलग करने के लिए धीरे रेटिना का हिस्सा जब तक कॉर्निया में एक छेद फाड़ शुरू उजागर होता है ।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि यह धीरे से किया जाना है, के रूप में भी जबरदस्ती फाड़ रेटिना के लिए आंसू पैदा कर सकता है । - उपयोग संदंश को चिढ़ाने के लिए श्वेतपटल से रेटिना के अलावा जब तक श्वेतपटल पूरी तरह से हटा दिया गया है । आईरिस, लेंस, अवलेह, और संदंश के साथ किसी भी शेष संरचनाओं जब तक रेटिना पूरी तरह से अलग है निकालें ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । एक पूर्व vivo प्रयोग के लिए रेटिना का उपयोग करते हैं, तो निम्न चरणों का पालन करने से पहले प्रयोग आचरण । - विच्छेदन कैंची का प्रयोग, रेटिना में चार राहत कटौती करने के लिए इतना है कि यह फ्लैट झूठ होगा । nitrocellulose झिल्ली (सामग्री की मेज) पर धीरे संदंश के साथ झिल्ली पर रेटिना के प्रत्येक कोने दबाकर द्वारा रेटिना नाड़ीग्रंथि सेल-साइड माउंट ।
नोट: रेटिना अभिविन्यास के लिए एस opsin ढाल का उपयोग करते समय राहत कटौती के स्थान मनमाने ढंग से किया जा सकता है. - संदंश का प्रयोग, पहले अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से प्लेट (सामग्री की मेज) में 4% paraformaldehyde के 1 मिलीलीटर (सामग्री की मेज) से भर के लिए घुड़सवार रेटिना हस्तांतरण निर्धारण के लिए । कमरे के तापमान (सामग्री की मेज) पर एक कक्षीय शेखर पर 24 अच्छी तरह से थाली प्लेस और ठीक ४० मिनट के लिए रेटिना ठीक ।
नोट: निंनलिखित धोने और गर्मी चरणों के सभी एक कक्षीय शेखर पर 24 अच्छी तरह से थाली के साथ पूरा किया जाना चाहिए । - कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए यह दूसरी अच्छी तरह से ०.१ मीटर पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ भरा स्थानांतरित द्वारा रेटिना धो लो । दोहराएं इस चरण में दो बार क्रमिक रूप से रेटिना स्थानांतरित करने के लिए ०.१ एम पंजाबियों-भरे तीसरे और चौथे कुओं ।
- पांचवी के लिए घुड़सवार रेटिना स्थानांतरण अच्छी तरह से समाधान अवरुद्ध की 1 मिलीलीटर (१.७% ट्राइटन एक्स-१०० और ०.१ एम पंजाब में ५.२% गधा सामांय सीरम से युक्त; सामग्री की तालिकादेखें) और 4 ° c पर रातोंरात गर्मी ।
- खरगोश विरोधी एस-opsin प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) को अवरुद्ध समाधान करने के लिए 1:500 की एकाग्रता में और तीन दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
- रेटिना से अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी को धोकर छह बार क्रमिक रूप से इसे छह कुओं में रखकर ०.१ मीटर पंजाबियों के 1 एमएल से 10 मिनट के लिए प्रत्येक कमरे के तापमान पर भर दें.
- एक अच्छी तरह से ताजा समाधान अवरुद्ध (१.७% ट्राइटन X-१०० और ५.२% ०.१ एम पंजाब में गधा सामांय सीरम) के साथ में रेटिना प्लेस और गधा विरोधी खरगोश Alexa-५९४ माध्यमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें । माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रेटिना गर्मी ।
- अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी रेटिना से छह बार धो क्रमिक रूप से यह छह कुओं में 10 मिनट प्रत्येक कमरे के तापमान पर के लिए ताजा ०.१ मीटर पंजाबियों के 1 मिलीलीटर से भर में रखकर ।
- संदंश का उपयोग कर, घुड़सवार रेटिना ०.१ एम पंजाबियों से युक्त एक पेट्री पकवान हस्तांतरण । धीरे रेटिना और झिल्ली के बीच संदंश के सुझावों को डालने से nitrocellulose झिल्ली से रेटिना जारी अब तक रेटिना नहीं जुड़ा है.
- एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर धीरे से रेटिना माउंट उकसाने यह संदंश के साथ जब तक रेटिना कांच के लिए चिपक जाती है और पेट्री डिश से स्लाइड को हटा दें ।
- Aquamount के साथ स्लाइड पर रेटिना कवर और यह एक #1 .5 coverslip के साथ कवर । स्लाइड को स्लाइड ट्रे में रखें ( सामग्री तालिकादेखें) और उसे एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें ।
- स्लाइड को फ्रिज में लौटाएं और उपयोग में न आने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड ट्रे ( सामग्री तालिकादेखें) में स्टोर करें । 24 घंटे के लिए स्लाइड coverslipped किया गया है के बाद, सुखाना को रोकने के लिए स्लाइड के किनारों को सील करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करें ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
4. रेटिना अभिविन्यास की पहचान करने के लिए एस-opsin के साथ खंगाला रेटिना Immunostained का उपयोग करना
- या तो एक फोकल माइक्रोस्कोप या एक कैमरा लगाव के साथ एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के साथ एस opsin ढाल कल्पना ( सामग्री की तालिकादेखें) और छवि रेटिना इतना है कि पूरे रेटिना एक छवि में दिखाई दे रहा है (आंकड़े 1b, 2d, 3 ए, और 3 डी). This इमेजिंग द्वारा किया जा सकता है कम बढ़ाई पर वर्गों में रेटिना और फिर एक साथ सिलाई छवियों ।
- रेटिना का नाम तो वे पहचाने जाते हैं । उदाहरण के लिए, "Retina1" को खंगाला जाने वाला पहला रेटिना नाम.
- डाउनलोड करें और https://imagej.nih.gov/ij/download.html पर ImageJ स्थापित करें ।
- प्रत्येक रेटिना को खंगाला जा करने की जरूरत के लिए एक व्यक्तिगत फ़ोल्डर बनाएं, लेकिन फ़ोल्डर्स खाली छोड़ दें । उदाहरण के लिए, "Retina1" शीर्षक वाला फ़ोल्डर बनाएं । इस रेटिना को दोबारा बनाने के लिए आवश्यक सभी फाइलें बाद के चरणों में इस फोल्डर में रखी जाएंगी ।
नोट: केवल फ़ाइलें इन फ़ोल्डरों को शामिल करना चाहिए Retistruct द्वारा विश्लेषण किया जा करने के लिए हैं फ़ाइलें हैं । नीचे विस्तृत लोगों के अलावा किसी भी फाइल Retistruct सॉफ्टवेयर के द्वारा खोला जा करने में असमर्थ रेटिना कर देगा । - फ़ाइल का चयन करके ImageJ में रेटिना की छवि खोलें → खुला और फिर चुनने "Retina1".
- छवि के लिए कोई परिवर्तन करने के बिना, यह "image. png" के रूप में फ़ोल्डर "फ़ाइल का चयन → png के रूप में सहेजें द्वारा" रेटिना 1 "शीर्षक से बचाने के लिए ।
नोट: फ़ाइल को पुनर्निर्माण के लिए एक रेटिना के रूप में फ़ाइल को पहचानने के लिए Retistruct सॉफ़्टवेयर के क्रम में "image. png" का नाम होना चाहिए । - रेटिना के किनारों को बाह्यरेखांकित करने के लिए सेगमेंट्ड लाइन टूल का उपयोग करें. रेटिना की सीमा पर दो आसंन धब्बे पर क्लिक करके, विभाजित लाइन उपकरण अनिवार्य रूप से "डॉट्स कनेक्ट" दो आसंन धब्बे के बीच होगा, एक रूपरेखा बनाने । दोहराएं जब तक पूरे रेटिना को रेखांकित किया गया है । "बाह्यरेखा. रॉय" शीर्षक से "Retina1" के रूप में फ़ोल्डर का विश्लेषण → उपकरण → रॉय प्रबंधक → Add [t] → अधिक → सहेजें का चयन करके रेटिना बाह्यरेखा सहेजें ।
नोट: रेटिना की बढ़त की पहचान की जा सकती है जहां s-opsin पृष्ठभूमि के लिए संक्रमण धुंधला । - ऑप्टिक डिस्क की सीमा को बाह्यरेखांकित करने के लिए चरण ४.७ में निर्देश के रूप में विभाजित लाइन उपकरण का उपयोग करें । "ओडी. रॉय" के रूप में "Retina1" का चयन करके विश्लेषण → उपकरण → रॉय प्रबंधक → जोड़ें [टी] → अधिक → बचाने के लिए शीर्षक फ़ोल्डर में ऑप्टिक डिस्क रूपरेखा सहेजें ।
नोट: ऑप्टिक डिस्क रेटिना के बीच में छोटे छेद के रूप में पहचान की है, और विच्छेदन की गुणवत्ता के आधार पर भिंन होगा ।
नोट: Retistruct पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक सभी फ़ाइलें ("image. png", "बाह्यरेखा. roi" और "od. roi") को अब "Retina1" फ़ोल्डर में सहेजा जाना चाहिए. - डाउनलोड करने के लिए, स्थापित करें, और Retistruct कार्यक्रम खोलने के लिए, Sterratt, एट अल के अनुपूरक सामग्री अनुभाग में पाया Retistruct उपयोगकर्ता गाइड में उल्लिखित निर्देशों का पालन करें । 24
- एक बार Retistruct खिड़की दिखाई है, खिड़की के ऊपर छोड़ दिया पर "खुला" आइकन पर क्लिक करें और निर्देशिका फ़ोल्डर "Retina1" का चयन ।
- एक छवि खिड़की का संकेत है कि कोई पैमाने पर पट्टी मौजूद है पॉप जाएगा । क्लिक करें "बंद" और रेटिना की एक छवि बॉक्स में दिखाई देगा । खिड़की के ऊपरी दाएँ भाग में "गुण" बटन पर क्लिक करके रेटिना की रूपरेखा कल्पना और एक दृश्य रंग (चित्रा 5ए) के लिए रूपरेखा रंग बदल जाते हैं ।
- महत्वपूर्ण: निर्दिष्ट करें कि रेटिना बाईं ओर पैनल में दाईं आंख या बाईं आंख से है (चित्रा 5a).
- बाईं ओर "आंसू जोड़ें" बटन पर क्लिक करें और जहां एक आंसू या कट आंसू के तीन वर्टेक्स (चित्रा 5ए) पर क्लिक करके रेटिना में है निर्दिष्ट । इस कट के तीनों वर्टेक्स को कनेक्ट करने वाली लाइनें बनानी होंगी । रेटिना में सभी कटौती के लिए दोहराएँ.
- रेटिना रूपरेखा के एक मनमाना बिंदु पर क्लिक करके पृष्ठीय रेटिना निर्दिष्ट करें । बाह्यरेखा (चित्र 5B) पर उस बिंदु पर एक अपरकेस अक्षर "D" दिखाई देगा ।
नोट: पृष्ठीय रेटिना रेटिना का गहरा आधा हो जाएगा, एस के विपरीत-opsin ढाल. हालांकि, Retistruct में पृष्ठीय रेटिना अंकन रेटिना के पृष्ठीय आधा की पहचान करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका नहीं है, तो "पृष्ठीय" के अंकन इस कदम में मनमाने ढंग से किया जा सकता है. - स्क्रीन (चित्रा 5बी) के ऊपर छोड़ दिया पर "पुनर्निर्माण रेटिना" बटन पर क्लिक करके रेटिना का पुनर्निर्माण । खंगाला रेटिना का एक ध्रुवीय भूखंड रूपरेखा (चित्रा 5सी) के रूप में एक ही रंग में दिखाई कटौती के साथ दिखाई देगा ।
- स्क्रीन के दाईं ओर "Save" बटन पर क्लिक करें ताकि खंगाला हुआ रेटिना और उसके साथ जुड़े सारे डेटा को "Retina1" फ़ोल्डर निर्देशिका (चित्रा 5D) में सहेजा जाए ।
- दाहिने हाथ के पैनल (चित्रा 5डी) में "पीडीएफ" बटन पर क्लिक करके खंगाला रेटिना को बचाने के । एक बॉक्स आकार विनिर्देशों के लिए पूछ दिखाई देगा । निंन चरणों के लिए डिफ़ॉल्ट आकार स्वीकार्य है । इस कार्रवाई "Retina1" फ़ोल्डर निर्देशिका में "image. ध्रुवीय. pdf" के रूप में खंगाला रेटिना बचाने के लिए होगा ।
- खोलें "image. ध्रुवीय. pdf" एक पेंट कार्यक्रम में (या अंय छवि हेरफेर कार्यक्रम) और "रंग बाल्टी" उपकरण का उपयोग करें (या इसी तरह) को खंगाला रेटिना की पृष्ठभूमि काले रंग में बदल जाते हैं । एक. tif फ़ाइल, जैसे "Retina1" फ़ोल्डर निर्देशिका में "Retina1_reconstructed. tif" के रूप में खंगाला रेटिना सहेजें ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । - "Retina_Rotator. m" (अनुपूरक सामग्री देखें) नामक रेटिना को घुमाने के लिए MATLAB कोड डाउनलोड करें । कोड फ़ाइल को फ़ोल्डर में कोई अंय फ़ाइलों के साथ अपने फ़ोल्डर में रखें ।
- MATLAB, संस्करण 2007b या बाद में खोलें । कोड फ़ाइल पर डबल क्लिक करें MATLAB में इसे खोलने के लिए । आदेश विंडो में, "Retina_Rotator" टाइप करें, और उसके बाद enter कुंजी दबाएं । एक खोज विंडो दिखाई देगी ।
नोट: कोड. tif फ़ाइलों के लिए विशिष्ट है । घुमाया जा करने के लिए फ़ाइल सही स्वरूप में नहीं है, तो कोड रेटिना सही रूप से रोटेट नहीं करेगा । चरण ४.१७ और ४.१८ देखें । के लिए उचित प्रारूप में खंगाला रेटिना को बचाने के लिए । - फ़ाइल को घुमाने के लिए खोलें । उदाहरण के लिए, "Retina1_reconstructed. tif" चुनें । कोड फिर खंगाला रेटिना का विश्लेषण करेगा और स्वचालित रूप से घुमाया रेटिना "Retina1_reconstructed_rotated. tif" के रूप में फ़ोल्डर में जहाँ मूल फ़ाइल स्थित है सहेज लेगा ।
- कोड के बाद रेटिना का विश्लेषण समाप्त हो गया है, एक खिड़की भी रेटिना की छवियों से पहले और तुलना के लिए रोटेशन के बाद दिखा दिखाई देगा आंकड़े 3E और 3F) ।
नोट: इस कोड को खंगाला रेटिना इतना है कि ventral (प्रतिभाशाली) आधा नीचे और पृष्ठीय (dimm) आधा ऊपर है, इस प्रकार सही एस-opsin ढाल1के अनुसार रेटिना उंमुख पर है घूमता है.... यदि रेटिना की दाहिनी आँख या बायीं आँख से है तो प्रलेखित किया गया है, नाक और लौकिक ध्रुवों का स्थान भी उन्मुखीकरण (चित्रा ३) के इस विधि से extrapolated जा सकता है.
Representative Results
एक राहत कटौती कि bisects बेहतर rectus मांसपेशी सही और मज़बूती से पृष्ठीय रेटिना (चित्रा 1) को पहचानता है. रंजित विदर सही और मज़बूती से लौकिक और नाक रंजित विदर (चित्रा 2) के साथ गहरी राहत कटौती के साथ नाक और लौकिक रेटिना की पहचान करता है । इस उदाहरण में, एक राहत कटौती भी पृष्ठीय रेटिना में किया गया है ताकि रेटिना की पृष्ठीय/ventral अक्ष की पहचान करने के लिए (चित्रा 2डी, ऊर्ध्वाधर तीर) । इन प्रक्रियाओं के चरणों को भविष्य के विक्षेत्रों द्वारा प्रतिकृति के उद्देश्य के लिए दिखाए जाते हैं । एस का एक संयोजन-opsin immunohistochemistry (चित्रा 3 डी और 3d), Retistruct सॉफ्टवेयर (बी३, 3E) के साथ पुनर्निर्माण और एक कस्टम MATLAB कोड (3 सी, 3F) के साथ सटीक रोटेशन के लिए अनुमति देता है ventral और रेटिना के पृष्ठीय आधा की पहचान, साथ ही साथ नाक और लौकिक खंभे अगर यह जाना जाता है कि क्या रेटिना एक सही या बाईं आंख से है (चित्रा 3) । हम भी की तुलना में दो आमतौर पर इस्तेमाल एस opsin प्राथमिक एंटीबॉडी लेबलिंग में प्रभावशीलता के लिए एस-opsin कोन (चित्रा 4ए-डी): दोनों बकरी विरोधी एस-opsin प्राथमिक एंटीबॉडी और खरगोश विरोधी एस-opsin प्राथमिक एंटीबॉडी प्रभावी ढंग से लेबल s-opsin शंकु (चित्रा 4ई) एक ही माउस में ।
कटौती से राहत एस पर पहचान की गई-opsin immunostained खंगाला रेटिना और उनके स्थानों एस-opsin ढाल द्वारा निर्धारित अभिविन्यास की तुलना में थे. हमारे कस्टम MATLAB कोड का प्रयोग ( पूरक सामग्रीदेखें), रेटिना सही इतना घुमाया गया कि एस के उच्चतम एकाग्रता-opsin धुंधला ventrally स्थित है, इस प्रकार ९० डिग्री पर सच पृष्ठीय रखने (बेहतर rectus के लिए), सच नाक पर 0 ° (नाक के लिए रंजित विदर) और १८० ° में सच लौकिक (लौकिक धमनियां विदर के लिए) । प्रत्येक व्यक्ति को राहत कटौती कोण के मूल्य ImageJ में कोण उपकरण का उपयोग करने के बाद रेटिना एस opsin ढाल के अनुसार घुमाया गया था निर्धारित किया गया था । एक औसत कोण प्रत्येक राहत कटौती प्रकार के लिए गणना की गई और प्रत्येक राहत कटौती प्रकार का औसत मूल्य तो एक ध्रुवीय भूखंड (चित्रा 6) पर रची गई थी । औसत पर, सुपीरियर rectus मांसपेशी कटौती ९६.३ ± ४.३ ° (n = 11) (चित्रा 6) पर पृष्ठीय ध्रुव की पहचान की । नाक रंजित विदर ६.७ ± ५.८ डिग्री पर नाक पोल की पहचान की और लौकिक धमनियां विदर १७२.० ± ४.४ ° (n = 9 पर लौकिक ध्रुव की पहचान की; चित्रा 6) ।
चित्रा 1: बेहतर rectus मांसपेशी का उपयोग करने के लिए सही एक दाहिनी आंख के पृष्ठीय रेटिना की पहचान । (एक) एक पृष्ठीय corneal का एक उदाहरण corneal-scleral एक दाग़ना टिप कलम (सफेद तीर) के साथ बनाया सीमा के पास जला । इस दृश्य (सफ़ेद तीर) में श्रेष्ठ rectus बलवान भी दिखाई देता है । (ख) बेहतर rectus मांसपेशी bisecting द्वारा पृष्ठीय रेटिना में किए गए एक राहत कटौती के साथ एक पूरे घुड़सवार रेटिना का एक उदाहरण. तीर बेहतर rectus मांसपेशी bisecting द्वारा पृष्ठीय रेटिना में किए गए गहरी राहत कटौती को दर्शाया गया है. रेटिना प्राथमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी के साथ दाग है-s-opsin ( सामग्री की तालिकादेखें) और माध्यमिक एंटीबॉडी गधा विरोधी बकरी Alexa ५९४ ( सामग्री की तालिकादेखें; उत्तेजना: ५९० एनएम; उत्सर्जन: ६२० एनएम) (सियान) । रेटिना एक टेक्सास लाल फिल्टर (५९५ एनएम) के साथ एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के साथ imaged था । (ग) एक रेटिना Retistruct में खंगाला और एक कस्टम MATLAB कोड के साथ घुमाया ( पूरक सामग्रीदेखें) सुपीरियर rectus मांसपेशी राहत कटौती दिखाई (सफेद तीर) के साथ. डी: पृष्ठीय, वी: ventral, टी: लौकिक, एन: नाक । स्केल पट्टियां = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एक सही आंख के रेटिना के नाक और लौकिक डंडे को सही ढंग से पहचानने के लिए रंजित विदर का उपयोग करना । (क) corneal-scleral एक दाग़ना टिप कलम के साथ बनाया सीमा के पास एक पृष्ठीय corneal जला का एक उदाहरण । (ख) श्वेतपटल (सफेद तीर) पर आँख के पीछे वाली धमनियां विदर दिखाई देती हैं । पृष्ठीय corneal जला भी इस दृश्य में दिख रहा है, लौकिक धमनियां विदर से ९० डिग्री के बारे में स्थित है । (ग) श्वेतपटल पर आँख की पीठ पर दिखाई देने वाली रंजित विदर, ऑप्टिक तंत्रिका से corneal-scleral सीमा तक यात्रा. (घ) एक रेटिना बकरी विरोधी के साथ दाग-s-opsin ( सामग्री की तालिकादेखें) और माध्यमिक एंटीबॉडी गधा विरोधी-बकरी Alexa ५९४ ( सामग्री की तालिकादेखें; उत्तेजना: ५९० एनएम; उत्सर्जन: ६२० एनएम) (सियान) धमनियां विदर कटौती के साथ (क्षैतिज तीर) और पृष्ठीय राहत कटौती (अनुलंब तीर) । रेटिना एक टेक्सास लाल फिल्टर (५९५ एनएम) के साथ एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के साथ imaged था । (ङ) एक रेटिना Retistruct में खंगाला और एक कस्टम MATLAB कोड के साथ घुमाया (पूरक सामग्री देखें) पृष्ठीय राहत कटौती और नाक और लौकिक रंजित विदर कटौती दिखाई (सफेद तीर) के साथ । डी: पृष्ठीय, वी: ventral, टी: लौकिक, एन: नाक । स्केल पट्टियां = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एस opsin ढाल का उपयोग करने के लिए रेटिना के सभी चार डंडे की पहचान । (क) एक रेटिना का एक उदाहरण है कि एक सही आंख से विच्छेदित करने के लिए immunostained गया है लेबल s-opsin और एक टेक्सास लाल फिल्टर (५९५ एनएम) के साथ एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के साथ imaged । इस रेटिना में कटौती मनमाने ढंग से कर रहे है के बाद से स्थलाकृतिक उंमुखीकरण s-opsin ढाल द्वारा निर्धारित किया जाता है । (ख) Retistruct के साथ एक में रेटिना के पुनर्निर्माण के परिणाम । ध्यान दें कि s-opsin ग्रैडिएंट सही तरीके से संरेखित नहीं है क्योंकि रेटिना कस्टम MATLAB कोड ( पूरक सामग्रीदेखें) के माध्यम से चलाया नहीं गया है । (ग) एक में कस्टम कोड के साथ रेटिना घूर्णन के परिणाम है । रेटिना घुमाया गया है ताकि s-opsin धुंधला के उच्चतम एकाग्रता नीचे स्थित है और ventral रेटिना के रूप में पहचान की । क्योंकि रेटिना एक दाहिनी आंख से है, लौकिक पोल पृष्ठीय ध्रुव से ९० ° दक्षिणावर्त स्थित है और नाक पोल पृष्ठीय ध्रुव से ९० ° घड़ी स्थित है । (घ) एक रेटिना का एक उदाहरण है कि बाईं आंख से विच्छेदित करने के लिए immunostained गया है लेबल s-opsin और एक टेक्सास लाल फिल्टर (५९५ एनएम) के साथ imaged । इस रेटिना में कटौती मनमाने ढंग से कर रहे है के बाद से स्थलाकृतिक उंमुखीकरण s-opsin ढाल द्वारा निर्धारित किया जाता है । (ङ) Retistruct के साथ डी में रेटिना के डिजिटल पुनर्निर्माण के परिणाम । ध्यान दें कि s-opsin ग्रैडिएंट सही तरीके से संरेखित नहीं है क्योंकि रेटिना को कस्टम कोड द्वारा घुमाया नहीं गया है । (च) कस्टम कोड के साथ डी में रेटिना घूर्णन के परिणाम । रेटिना घुमाया गया है ताकि s-opsin धुंधला के उच्चतम एकाग्रता नीचे स्थित है और ventral रेटिना के रूप में पहचान की । क्योंकि रेटिना एक बाईं आंख से है, नाक पोल पृष्ठीय ध्रुव से ९० ° दक्षिणावर्त स्थित है और लौकिक पोल पृष्ठीय ध्रुव से ९० ° घड़ी स्थित है । डी: पृष्ठीय, वी: ventral, टी: लौकिक, एन: नाक । स्केल पट्टियां = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: लेबलिंग एस-opsin कोन में दो प्राथमिक एस-opsin एंटीबॉडी की तुलना. (क) एक रेटिना दाग बकरी विरोधी के साथ-s-opsin प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें). (ख) एक ही माउस के दूसरे रेटिना खरगोश विरोधी एस opsin प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग ( सामग्री की तालिकादेखें) । (ग) एक प्रतिनिधि क्षेत्र (०.१ x ०.१ mm2) एक रेटिना से सना हुआ बकरी विरोधी एस opsin प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ । छवि 40X आवर्धन पर एक epifluorescent माइक्रोस्कोप पर ले लिया । (घ) एक प्रतिनिधि क्षेत्र (०.१ x ०.१ mm2) एक रेटिना से सना हुआ खरगोश विरोधी के साथ-s-opsin ( सामग्री की तालिकादेखें), एक प्राथमिक एंटीबॉडी विकल्प । छवि 40X आवर्धन पर एक epifluorescent माइक्रोस्कोप पर ले जाया गया था । (ङ) दोनों एंटीबॉडी एस शंकु बाहरी क्षेत्रों की एक ही संख्या लेबल क्योंकि वहां immunopositive एस शंकु की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर है कि बकरी विरोधी द्वारा दाग रहे है-एस-opsin और खरगोश विरोधी एस-opsin परीक्षण रेटिना में से किसी पर सनकी (n = 2; ANOVA के साथ पोस्ट हॉक Bonferroni परीक्षण; p > 0.05) । स्केल पट्टियां = 1 मिमी (A-B); 25 µm (सी-डी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: एस-opsin के साथ रेटिना immunostained पुनर्निर्माण के लिए Retistruct सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक दृश्य गाइड. (क) एक रेटिना के साथ Retistruct में खोला रूपरेखा दिखाई और एक "आंसू" जोड़ा । "आंसू" के अंक आरोपित सफेद तीर के साथ संकेत कर रहे हैं । इस रेटिना में सभी कटौती मनमाने ढंग से कर रहे हैं, कोई विशेष मील का पत्थर के रूप में विच्छेदन के दौरान रेटिना अभिविन्यास निशान इस्तेमाल किया गया. महत्वपूर्ण बटन लाल रंग में उल्लिखित हैं । (ख) सभी आंसू "के साथ एक रेटिना" जोड़ा और पृष्ठीय रेटिना रेटिना के किनारे पर "डी" के साथ की पहचान की । सूचना है कि "पुनर्निर्माण रेटिना" बटन अब दिखाई देता है । महत्वपूर्ण बटन लाल रंग में उल्लिखित हैं । (ग) एक रेटिना के पुनर्निर्माण की प्रक्रिया. खंगाला रेटिना के ध्रुवीय भूखंड सही पर दिखाई देगा, सियान में राहत कटौती दिखा (नीले तीर आरोपित कटौती स्थानों को स्पष्ट करने के लिए). (घ) Retistruct के माध्यम से एक रेटिना चलाने का अंतिम परिणाम. मूल wholemount रेटिना बाईं ओर रहता है और सही पर खंगाला रेटिना दिखाई देता है. राहत कटौती सियान में दिखाई दे रहे हैं (सफेद तीर आरोपित कटौती स्थानों को स्पष्ट करने के लिए). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: सुपीरियर rectus मांसपेशी और रंजित विदर सही करने के लिए माउस रेटिना ओरिएंट इस्तेमाल किया जा सकता है । या तो बेहतर rectus मांसपेशियों में कटौती या रंजित रेटिना में विदर कटौती है कि Retistruct के साथ खंगाला गया है राहत से प्राप्त कोणों का एक ध्रुवीय भूखंड । कटौती से राहत एस-opsin immunostained खंगाला रेटिना और उनके स्थानों एस-opsin ढाल के स्थान की तुलना में थे पर पहचान की गई । कस्टम MATLAB कोड का उपयोग करने के लिए सही रेटिना बारी इतनी है कि एस के उच्चतम एकाग्रता-opsin धुंधला ventrally स्थित है, सच पृष्ठीय (सुपीरियर rectus के लिए ९० °), सच नाक (0 नाक रंजित विदर के लिए °) और सच लौकिक (लौकिक धमनियां के लिए १८० ° विदर) प्रत्येक रेटिना के लिए निर्धारित थे । प्रत्येक व्यक्ति को राहत कटौती कोण का मूल्य ImageJ में निर्धारित किया गया था और एक औसत कोण प्रत्येक राहत कटौती प्रकार के लिए गणना की गई थी । सुपीरियर rectus मांसपेशी कटौती ९६.३ ± ४.३ ° (n = 11) पर पृष्ठीय पोल की पहचान की । नाक रंजित विदर ६.७ ± ५.८ डिग्री पर नाक पोल की पहचान की और लौकिक धमनियां विदर १७२.० ± ४.५ ° (n = 9) में लौकिक ध्रुव की पहचान की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| गहरी मील का पत्थर | Corneal जला स्थान | रेटिना की पहचान की पोल | प्रायोगिक आवेदन |
| सुपीरियर Rectus | पृष्ठीय | पृष्ठीय | लाइव या फिक्स्ड |
| नाक रंजित विदर | पृष्ठीय | नाक | लाइव या फिक्स्ड |
| लौकिक धमनियां विदर | पृष्ठीय | लौकिक | लाइव या फिक्स्ड |
| S-opsin ग्रैडिएंट | कोई | पृष्ठीय, Ventral, नाक, लौकिक | निश्चित |
तालिका 1: डीप लैंडमार्क, रेटिना की पोल वे पहचानते हैं, और चाहे वे लाइव या फिक्स्ड टिशू एप्लीकेशन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Discussion
वहां कोई व्यापक, निर्धारित करने और संरचनात्मक अंतरिक्ष में अलग माउस रेटिना के उंमुखीकरण लेबल के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल गया है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल का मानकीकरण और कैसे संदर्भ अंक के रूप में गहरी संरचनात्मक स्थलों का उपयोग करने के लिए मज़बूती से रेटिना अभिविन्यास की पहचान का ब्यौरा द्वारा इस शूंय को भरने का प्रयास करता है । यह दिखाया गया है कि इस प्रोटोकॉल में गहरी संरचनात्मक स्थलों ऐसे corneal जलता है22के रूप में सतही स्थलों की तुलना में माउस रेटिना ओरिएंट के लिए एक और अधिक सटीक और विश्वसनीय तरीका प्रदान करते हैं । इस प्रकार, अध्ययनों कि रेटिना अभिविंयास के लिए corneal जलता पर भरोसा किया है कि ऐसे rectus मांसपेशियों और रंजित विदर के रूप में स्थलों पर भरोसा किया है अध्ययनों से अभिविंयास में अधिक से अधिक त्रुटियों पड़ा हो सकता है । इस विसंगति की जरूरत है और परिणाम की व्याख्या और अध्ययन है कि सही रेटिना अभिविन्यास पर निर्भर करता है के बीच तुलना करने के संबंध में इस मानकीकृत प्रोटोकॉल के महत्व पर प्रकाश डाला गया । कुल मिलाकर, एक मानकीकृत प्रोटोकॉल दृष्टि शोधकर्ताओं के लिए एक आम विधि प्रदान करने का पालन करें, इस प्रकार डेटा अधिग्रहण कि गैर के उपयोग के साथ हो सकता है में एक चर की उपस्थिति को नष्ट करने के लिए-रेटिना की पहचान के लिए मानकीकृत तरीकों ओरिएंटेशन.
यहां प्रस्तुत तरीकों को आसानी से दोहराया और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के कई प्रकार के लिए लागू कर रहे हैं । वास्तव में, इस प्रोटोकॉल का सबसे बड़ा लाभ में से एक अपनी अनुकूलन क्षमता है । क्योंकि रंजित विदर, एस-opsin अभिव्यक्ति, और rectus मांसपेशी स्थलों सभी मज़बूती से रेटिना अभिविन्यास22 मील का पत्थर है कि सबसे अच्छा सूट प्रयोगात्मक मापदंडों के लिए डेटा प्राप्ति का अनुकूलन चुना जा सकता है की पहचान करने के लिए पाया गया है (तालिका 1). इसके अलावा, विच्छेदन के तरीकों को आगे के रूप में जोड़ा जा सकता है और रेटिना के उंमुखीकरण स्पष्ट है । उदाहरण के लिए, रंजित विदर कटौती एस-opsin immunohistochemistry के साथ जोड़ा जा सकता है क्रम में रेटिना के सभी चार डंडे ओरिएंट: नाक और लौकिक गोलार्द्धों रंजित विदर कटौती द्वारा पहचाना जा सकता है, और एस-opsin immunohistochemistry की पहचान कर सकते है ventral और पृष्ठीय गोलार्द्धों । फिर भी, इस प्रोटोकॉल की अनुकूलता समय के लिए विवश किया जा सकता है, शरीर विज्ञान के प्रयोगों की संवेदनशील प्रकृति । क्योंकि समय यह एक मील का पत्थर की पहचान करने के लिए लेता है, एक corneal जला कर, और एक राहत कटौती निष्पादित पूर्व vivo प्रयोगों में महत्वपूर्ण ऊतक मौत में परिणाम सकता है, इन विच्छेदन विधियों में से कुछ इष्टतम से कम हो सकता है । सौभाग्य से, एक बार एक विच्छेदन या तो रंजित विदर या बेहतर rectus मांसपेशी विच्छेदन विधि के साथ परिचित हो गया है, गहरी स्थलों की पहचान करने और कटौती से छुटकारा पाने के जल्दी एक भाग दिनचर्या का एक हिस्सा बन गया है और काफी नहीं जोड़ विच्छेदन की लंबाई के लिए । हालांकि हम स्वीकार करते है कि यहां विस्तृत कदम समय पर बहुत समय के प्रति संवेदनशील प्रयोगों को जोड़ सकते हैं, हम का उपयोग सुझाव एस-opsin ढाल के लिए पोस्ट हॉक रेटिना अभिविंयास जब ऊतक की व्यवहार्यता अब एक मुद्दा है (चित्रा 3 ). एस के लिए रेटिना धुंधला-opsin एक प्रभावी तरीका है रेटिना ओरिएंट है, क्योंकि यह सभी चार डंडे की पहचान कर सकते हैं: s-opsin धुंधला पृष्ठीय और ventral डंडे में रेटिना विभाजित और नाक और लौकिक डंडे की पहचान के लिए अनुमति देता है पर निरभर है कि रेटिना एक दाएँ या बाएँ आँख (चित्रा ३) से है. इसलिए, हमें विश्वास है कि इस प्रोटोकॉल सटीक रेटिना अभिविन्यास कि किसी भी प्रयोगात्मक मापदंडों को पूरा कर सकते हैं के लिए तरीकों की एक विश्वसनीय और दोहराया जाने वाला सेट बचाता है.
किसी भी संशोधित रेटिना विच्छेदन के साथ के रूप में, विच्छेदन विधि की वैधता विखण्डन की सटीकता और ऊतक है कि अलग किया गया है की गुणवत्ता द्वारा सीमित है । यदि किसी भी ऊतक विच्छेदन के दौरान खो दिया है या एक रेटिना भी सटीक पुनर्निर्माण के लिए mangled है, Retistruct और MATLAB कार्यक्रम मज़बूती से पुनर्निर्माण या रेटिना ओरिएंट करने में सक्षम नहीं होगा. इसलिए यह डेटा एकत्रित प्रयोगों के लिए उपयोग करने से पहले विच्छेदन विधि अभ्यास करने के लिए महत्वपूर्ण है. जबकि विच्छेदों के प्रकार यहां समझाया मुश्किल नहीं हैं, वे एक विशेष मील का पत्थर के साथ रेटिना अभिविन्यास की पहचान की पुनरावृत्ति सुनिश्चित करने के लिए अभ्यास किया जाना चाहिए. इसके अलावा, यह आवश्यक है कि विक्षेत्री अभ्यास नेत्रहीन संरचनात्मक स्थलों की पहचान करने के लिए डेटा संग्रह शुरुआत करने से पहले निश्चित करना है कि सही मील का पत्थर इस्तेमाल किया जा रहा है । एक तरह से एक विशेष विस्थापन की सटीकता की जांच करने के लिए या तो रंजित विदर कटौती या बेहतर rectus मांसपेशी कटौती करना है और फिर एस-opsin ढाल को कटौती के स्थान की तुलना, क्योंकि यह एक निश्चित मार्कर है और इस प्रकार dissectio की सटीकता पर निर्भर नहीं है n. संभावित विक्षेत्री भी सटीक मील का पत्थर कटौती के साथ खंगाला रेटिना के उदाहरण के लिए अपने को खंगाला रेटिना की तुलना कर सकते हैं चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है. मूलतः, एक संभावित विस्थापन एक विशेष विच्छेदन प्रकार के लिए इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित कदम प्रदर्शन करना चाहिए, चाहे वह बेहतर rectus मांसपेशी या रंजित विदर विधि हो, और एस के परिणामों की तुलना-opsin ढाल एक की वैधता स्थापित करने के लिए विषेश विक्षेत्री । क्योंकि अगर विस्थापन मील का पत्थर के स्थान के बारे में अनिश्चित है, यह रेटिना कि, डिफ़ॉल्ट रूप से, डेटा संग्रह और व्याख्या को प्रभावित करेगा के एक गलत अभिविन्यास में परिणाम हो सकता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम अपने तकनीकी सहायता और Dr. लियू के लिए कृपया ब्रिटनी दिवस और जेसिका Onyak शुक्रिया अदा करना चाहूंगा के लिए हमें अपने epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग करें । समर्थन की पावती: NIH R15EY026255-01 और कार्ल Kirchgessner फाउंडेशन ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
| Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
| Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
| Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
| Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
| Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
| Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
| Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
| PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
| Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |
References
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