Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Präparation und Analyse-Leitfaden für die Verwendung von tief okuläre Sehenswürdigkeiten, s-Opsin Immunohistochemistry, Retistruct und benutzerdefinierten Code, präzise und zuverlässig isoliert Maus Netzhaut im anatomischen Raum zu orientieren.
Präzise und zuverlässig identifizieren räumlichen Orientierung der isolierten Maus Netzhaut ist wichtig für viele Studien in den visuellen Neurowissenschaften, einschließlich der Analyse von Dichte und Größe Steigungen von retinalen Zelltypen, die Richtung Stimmung der Richtung-selektive Ganglienzellen, und die Prüfung der topographischen Degeneration Muster in einigen Netzhauterkrankungen. Allerdings gibt es viele verschiedene augenfällige Dissektion-Methoden in der Literatur beschrieben, die verwendet werden, zu identifizieren und kennzeichnen retinalen Orientierung in der Netzhaut Maus. Während die Methode der Ausrichtung verwendet in solchen Studien oft übersehen wird, kann keine Berichterstattung wie Netzhaut Ausrichtung bestimmt ist Abweichungen in der Literatur und Verwirrung verursachen beim Versuch, Daten zwischen den Studien zu vergleichen. Oberflächliche okuläre Sehenswürdigkeiten wie Hornhaut Verbrennungen werden häufig verwendet, aber haben vor kurzem gezeigt, dass weniger zuverlässig als tiefer Sehenswürdigkeiten wie die Rectus Muskeln, der Aderhaut Fissur oder der s-Opsin-Gradient. Hier bieten wir einen umfassenden Leitfaden für die Verwendung von tief okuläre Sehenswürdigkeiten genau untersuchen und dokumentieren die räumliche Orientierung der Netzhaut eine isolierte Maus. Wir haben auch verglichen die Wirksamkeit von zwei s-Opsin-Antikörpern und enthalten ein Protokoll für s-Opsin Immunohistochemistry. Da Orientierung der Netzhaut nach der s-Opsin-Gradient retinalen Rekonstruktion mit Retistruct Software und Rotation mit benutzerdefiniertem Code erforderlich ist, haben wir die wichtigen Schritte erforderlich, um beide Programme verwenden vorgestellt. Insgesamt ist das Ziel dieses Protokolls einen zuverlässigen und wiederholbaren Satz von Methoden für die präzise Ausrichtung der Netzhaut zu liefern, die an die experimentelle Protokolle anpassbar ist. Ein übergeordnetes Ziel dieser Arbeit ist es, retinale Ausrichtung Methoden für zukünftige Studien zu standardisieren.
Ein wichtiger und manchmal übersehener Aspekt der Netzhaut Neurowissenschaften ist die korrekte Ausrichtung und Analyse der isolierten ganze-Mount Netzhaut, sei es die Ausrichtung der Netzhaut in einer Elektrophysiologie Aufnahme Kammer oder auf einer histologischen Folie. Dies ist besonders wichtig für Studien mit der Maus Netzhaut, die derzeit das am weitesten verbreitete Modell für Untersuchungen des Säugetier-visuellen Systems. Die jüngsten Entdeckungen zeigen, dass die Maus Netzhaut nicht räumlich einheitlich ist sondern Dichte und Größe Gradienten der Netzhaut funktionell unterschiedliche Zelltypen, wie Ganglienzellen Melanopsin, transiente OFF-Alpha Ganglienzellen und Kegel Opsins1,2 hat ,3,4,5. Infolgedessen die Methode zur Ermittlung die Ausrichtung der Netzhaut beeinträchtigen die experimentellen Ergebnisse mit Zelle Typ oder Opsin Distributionen2,3,6, Richtung der Richtung-selektiven tuning Ganglion Zellen7,8,9und topografische Muster von Netzhautdegeneration10,11,12,13,14 . In der Tat kann nicht Berichterstattung wie Netzhaut Orientierung gemeldet wird Abweichungen in der Literatur und Verwirrung verursachen beim Versuch, Daten zwischen den Studien zu vergleichen. Es ist daher wichtig, dass Forscher berichten die Methode für die Ausrichtung der Netzhaut zu identifizieren, so dass die Ergebnisse solcher Studien genau interpretiert werden können.
Netzhaut Orientierung wird häufig durch scoring die dorsale, ventrale, nasale oder zeitliche Hornhaut vor dem Okular Enukleation1,3,12,15,16,17 identifiziert ,18,19 oder der Aderhaut Rissbildung durch Schneiden oder färben tief anatomische Auge Sehenswürdigkeiten wie die extraokularen Muskeln6,7,20,21, oder die s-Opsin gradient2,3. Rectus Muskeln können verwendet werden, um die dorsale, ventrale, Nasal und temporal Netzhaut indem man einem tief entspannenden Schnitt, der die Anlage die entweder halbiert überlegene Rectus, minderwertige Rectus, mediale Rectus oder seitlichen Rectus Muskeln, bzw. zu identifizieren. Jedoch ist für die meisten Experimente mit Rectus Muskeln ausreichend für die Orientierung der Netzhaut22. Die Aderhaut Fissur, die ein Überrest der Augenentwicklung ist, kann als eine schwache horizontale Linie auf der Rückseite des Auges betrachtet. Beiden Enden dieser Linie endet an der Nasal oder der zeitlichen Pole der Erde23. Zu guter Letzt s-Opsin Ausdruck ist asymmetrisch verteilt an der ventralen Netzhaut in Mäusen und s-Opsin Antikörper können verwendet werden, um die ventralen Netzhaut in immunhistochemischen Experimente1zeigen.
Neuere Arbeiten von Stabio, Et al. 22 gezeigt, dass oberflächliche okuläre Wahrzeichen wie Hornhaut Verbrennungen eine weniger zuverlässige Methode sind für die Orientierung der Netzhaut im anatomischen Raum, sehr wahrscheinlich durch menschliches Versagen und Variabilität bei der Herstellung der Hornhaut brennen bei der Verwendung der zeitlichen und medialen Augenwinkel als Referenzpunkte. Im Gegensatz dazu haben tiefe Sehenswürdigkeiten wie überlegener Rectus Muskeln, choroid Riss und dem s-Opsin-Gefälle erwiesen zuverlässig und präzise Wahrzeichen für die Orientierung der Netzhaut-22. Allerdings erfordert die Ermittlung von diesen anatomischen Landmarken einzigartige Dissektion Schritte, die nicht in der Literatur ausführlich beschrieben werden. Ziel dieses Protokolls ist es daher, eine umfassende Anleitung, wie die überlegene Rectus Muskeln, choroid Fissur und s-Opsin Farbverlauf verwenden, um die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus genau zu identifizieren können. Darüber hinaus haben wir einen Vergleich der Wirksamkeit von zwei s-Opsin-Antikörper, sowie ein Protokoll für s-Opsin Immunohistochemistry aufgenommen.
Eine weitere Herausforderung Studien unter Berufung auf genaue Ausrichtung der Netzhaut ist die große Linderung Kürzungen erforderlich, um Wholemount Netzhaut auf einer Aufnahme Kammer, Schale oder Folie zu glätten. Dies kann führen, Herausforderungen für die Analyse dessen, was natürlich eine dreidimensionale Struktur ist, wenn es als eine flache zweidimensionale Struktur abgebildet wird. Ein Programm namens Retistruct24 lässt sich eine flache Wholemount Netzhaut seiner dreidimensionalen Struktur zurück, bevor die von ihm gesammelten Daten analysiert werden. So widmet ein Abschnitt dieses Protokolls Hervorhebung der Schritte, die notwendig sind für die Verwendung der Retistruct-Software s-Opsin Immunostained Maus Netzhaut zu rekonstruieren. Wir haben ebenfalls einen Abschnitt des Protokolls für die Verwendung unserer benutzerdefinierte MATLAB-Skript, das, um präzise drehen und orient Maus Netzhaut mit s-Opsin befleckt entwickelt wurde.
Keine umfassende, standardisierte Protokoll für die Bestimmung und Kennzeichnung der Ausrichtung der isolierten Maus Netzhaut im anatomischen Raum stattgefunden hat. Das Protokoll detailliert hier versucht, diese Lücke durch die Standardisierung und Detaillierung tief anatomische Landmarken Verwendung als Referenz verweist auf zuverlässig identifizieren retinalen Orientierung. Es hat sich gezeigt, dass die tief anatomischen Landmarken in diesem Protokoll eine genauere und zuverlässigere Methode für die Orientierung der Maus Netzhaut als oberflächliche Sehenswürdigkeiten wie Hornhaut Verbrennungen22bieten. So können Studien, die auf die Hornhaut Verbrennungen zur Netzhaut Orientierung verlassen haben größere Fehler in der Ausrichtung als Studien gehabt haben, die auf Sehenswürdigkeiten wie dem Rectus Muskeln und choroid Fissur verlassen haben. Diese Diskrepanz unterstreicht die Notwendigkeit und Bedeutung dieses standardisierten Protokolls in Bezug auf die Interpretation der Ergebnisse und Vergleiche zwischen den Studien, die von genau retinalen Orientierung abhängen. Insgesamt wird ein standardisiertes Protokoll eine gängige Methode zur Vision Forscher zu folgen, bieten wodurch das Vorhandensein einer konfundierenden Variablen in der Datenerfassung, die auftreten können mit der Verwendung von nicht-standardisierten Methoden zur Identifizierung von retinalen Orientierung.
Die hier vorgestellten Methoden sind leicht wiederholbar und für viele Arten von experimentelle Protokolle. In der Tat ist einer der größten Vorteile dieses Protokolls seine Anpassungsfähigkeit. Weil die Aderhaut Fissur, s-Opsin Ausdruck und Rectus Muskeln Sehenswürdigkeiten alle gefunden wurden, um retinale Orientierung22 zuverlässig zu identifizieren ist das Wahrzeichen, die am besten die Versuchsparameter wählbar, Datenerfassung (Tabelle zu optimieren 1). Darüber hinaus können Methoden der Dissektion kombiniert werden, um die Ausrichtung der Netzhaut weiter zu klären. Beispielsweise können choroid Fissur Schnitten mit s-Opsin Immunohistochemistry kombiniert werden, um alle vier Stangen der Netzhaut zu orientieren: nasale und Temporale Hemisphären durch die Aderhaut Fissur Kürzungen identifiziert werden können, und s-Opsin Immunohistochemistry erkennen Ventrale und dorsale Halbkugeln. Jedoch kann die Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls durch den zeitkritischen Charakter der Physiologie Experimente abhängig gemacht werden. Da die Zeit, die es braucht, um ein Wahrzeichen zu identifizieren, machen eine Hornhaut brennen und ausführen einen Linderung Schnitt erhebliche Gewebe Tod in ex Vivo Experimenten führen könnten, möglicherweise einige dieser Methoden Dissektion suboptimal. Zum Glück, sobald ein Sezierer mit der Aderhaut Fissur oder überlegener Rectus Muskeln Dissektion Methode vertraut geworden ist, erkennen die tiefen Wahrzeichen und die Linderung von Kürzungen schnell werden Sie ein Teil der Dissektion Routine und nicht deutlich hinzufügen auf die Länge der Dissektion. Obwohl wir anerkennen, dass die hier beschriebenen Schritte auf Zeit extrem zeitkritische Experimente hinzufügen können, empfehlen wir die Verwendung der s-Opsin-Gradient für post-Hoc retinalen Ausrichtung wird die Lebensfähigkeit des Gewebes nicht mehr ein Problem (Abbildung 3 ). Färbung der Netzhaut für s-Opsin ist ein wirksames Mittel die Netzhaut zu orientieren, wie es alle vier Pole identifizieren kann: s-Opsin Färbung teilt die Netzhaut in dorsalen und ventralen Pole und ermöglicht eine Identifikation der nasalen und temporalen je nachdem, ob Pole die Netzhaut wird von einem rechten oder linken Auge (Abbildung 3). Daher glauben wir, dass dieses Protokoll liefert einen zuverlässigen und wiederholbaren Satz von Methoden für die präzise Ausrichtung der Netzhaut, die experimentellen Parameter erfüllen kann.
Als mit jedem veränderten retinalen Dissektion, die Gültigkeit der Dissektion Methode begrenzt durch die Genauigkeit der Sezierer und die Qualität des Gewebes, die isoliert wurde. Wenn jedes Gewebe verloren bei Dissektion oder die Netzhaut ist auch für genaue Rekonstruktion verstümmelt, werden Retistruct und das MATLAB-Programm nicht in der Lage, zuverlässig zu rekonstruieren oder die Netzhaut zu orientieren. Es ist daher wichtig, die Dissektion Methode üben, bevor zum Sammeln von Daten mittels Experimenten. Während die Arten von Dissektionen hier sind nicht schwer erklärt, müssen sie geübt werden, um die Wiederholbarkeit der Identifizierung von retinalen Orientierung ein besonderes Wahrzeichen zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Sezierer Praxis optisch identifizieren die anatomischen Landmarken vor Beginn der Datenerhebung zu sicher, dass das richtige Wahrzeichen verwendet wird. Eine Möglichkeit zur Überprüfung der Richtigkeit einer bestimmten Sezierer ist entweder choroid Fissur zu machen schneidet oder überlegener Rectus Muskel schneidet und dann den Speicherort der die Kürzungen bei den s-Opsin Farbverlauf zu vergleichen, da es eine feste Markierung und somit nicht abhängig von der Genauigkeit der Dissectio ist n. potenzielle Dissectors können auch vergleichen ihre rekonstruierten Netzhaut zu den Beispielen der rekonstruierten Netzhaut mit genauen Wahrzeichen Kürzungen sind in Abbildung 1 dargestellte und Abbildung 2. Im Wesentlichen eine potenzielle Sezierer sollten die Schritte in diesem Protokoll für einen bestimmten Dissektion Typ durchführen, sei es überlegener Rectus Muskeln oder Aderhaut Rissbildung Methode, und vergleichen Sie die Ergebnisse auf den s-Opsin Farbverlauf herzustellen die Gültigkeit einer bestimmten Sezierer. Denn wenn der Sezierer unsicher über den Standort des Wahrzeichens ist, es eine ungenaue Ausrichtung der Netzhaut führen kann, dass wird standardmäßig beeinflussen Datenerhebung und Auswertung.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchte Bretagne Tag und Jessica Onyak für ihre technische Unterstützung und Dr. Liu für bitte lassen Sie uns seine Epifluorescent Mikroskop benutzen. Danksagung des Supports: NIH-R15EY026255-01 und Karl Kirchgessner Stiftung.
0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |