Summary
Bactérias bioluminescentes produçãode luz através de uma variedade de mecanismos, tais como detecção de quórum. Este novo método permite que a investigação em situ de bioluminescência e a correlação de emissão de luz a densidade celular. Um artificial bioluminescentes Escherichia coli sistema permite a caracterização de operons lux , Lux proteínas e sua interação.
Abstract
Há um número considerável de espécies bacterianas capaz de emitir luz. Todos eles compartilham o mesmo cluster de gene, ou seja, o operon lux . Apesar dessa semelhança, estas bactérias mostram variações extremas em características como comportamento de crescimento, intensidade de emissão de luz ou regulamento de bioluminescência. O método apresentado aqui é um ensaio recentemente desenvolvido que combina gravação de crescimento celular e a intensidade de emissão de luz bioluminescente ao longo do tempo, utilizando um leitor de placa. O resultante crescimento e características de emissão de luz podem ser vinculadas a características importantes da estirpe bacteriana respectivo, tais como quórum de sensoriamento do regulamento. O cultivo de uma variedade de bactérias bioluminescentes requer um meio específico (por exemplo, meio de água do mar artificial) e definido de temperaturas. O fácil de manusear, não-bioluminescentes padrão-pesquisa bactéria Escherichia coli (e. coli), por outro lado, pode ser cultivado barata em grandes quantidades em escala de laboratório. Explorando a e. coli através da introdução de um plasmídeo contendo o inteiro lux operon pode simplificar as condições experimentais e adicionalmente abre muitas possibilidades para futuras aplicações. A expressão de genes de lux todos utilizando uma cepa de expressão de Escherichia coli foi conseguida através da construção de um plasmídeo de expressão através de clonagem de Gibson e inserção de quatro fragmentos contendo sete genes lux e três genes costela de o operon lux-costela em um vetor de pET28a. Expressão do gene de e. coli com base lux pode ser induzido e controlado através da adição de isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), resultando em bioluminescentes Escherichia coli células. As vantagens deste sistema são evitar quorum sensing Regulamento restrições e composições complexas de médio juntamente com as condições de crescimento não-padrão, tais como definidas temperaturas. Este sistema permite a análise de genes de lux e sua interacção, a exclusão do respectivo gene o operon lux , ou mesmo adição de genes novos, trocando os genes luxAB de uma estirpe bacteriana por outra, ou Analisando a complexos de proteínas, tais como luxCDE.
Introduction
A emissão de luz por organismos vivos (bioluminescência) é um processo fascinante encontrado em bactérias, fungos, insetos, nematoides, peixes e lulas1. Emissão de luz bioluminescente emerge uma reação quimioluminescente, no qual a energia química (parcialmente) é transformada em energia luminosa "(luz fria"). Em bactérias bioluminescentes, o heterodimérica luciferase de enzima catalisa a monooxygenation de cadeia longa, aldeídos alifáticos, tais como tetradecanal, para os correspondentes ácidos acompanhada de emissão de luz com um máximo em 490 nm2, 3.
Figura 1 : Esquema de reação geral da luciferase bacteriana. A luciferase bacteriana (LuxAB) catalisa a monooxygenation de cadeia longa aldeídos (CH3(CH2)nCHO) utilizando reduziram o mononucleótido de flavina (FMNH2) e oxigênio molecular (O2), produzindo os produtos de cadeia longa ácidos (CH3(CH2)nCOOH), o mononucleótido de flavina (FMN), água (H2O) e a emissão de luz centrado em 490 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A energia liberada durante esta oxidação provoca um estado excitado FMN-4a-hidróxido, que serve como a luz emitindo luciferina4. As proteínas envolvidas na bioluminescência bacteriana, ou seja, LuxCDABEG, são codificados pelo operon lux e são altamente conservadas ao longo de várias estirpes bacterianas2,5. Os genes luxA e luxB codificam para o luciferase heterodimérica; produtos de gene do luxC, do luxDe do luxo são componentes de uma ácido graxo redutase complexa; e luxG codifica para uma flavina redutase6. Um número de bioluminescentes Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) carregam o gene adicional luxF . Foi relatado que LuxF é uma proteína homodimeric que vincula a flavina incomum derivado 6-(3'-(R)-miristílico)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Foram identificados genes adicionais que são responsáveis pela síntese de riboflavina (por exemplo, ribEBH) e além dos genes regulatórios foram relatados, que desempenham um papel no Regulamento sensoriamento de quórum de bioluminescência, especialmente para Vibrio fischeri e Vibrio harveyi6,13. Apesar da ordem de gene altamente conservadas, bactérias bioluminescentes mostram altas variações nas características como comportamento de crescimento, intensidade de emissão de luz, ou regulamento de bioluminescência2,5,14 .
Vários modificado estirpes ou plasmídeos contendo partes ou toda lux operons são conhecidos, explorando a bioluminescência como sistemas de repórter. Diversas aplicações tais como determinar a atividade de promotor, monitoramento de contaminações bacterianas no ambiente ou amostras de alimentos, bioluminescência ressonância energia transferência (BRET), imagem latente na vivo de infecções em organismos eucarióticos, Pyrosequencing e assim por diante foram estabelecidas15,16,17. Curiosamente, os três mais frequentemente utilizado repórter bioluminescente sistemas derivam o vaga-lume-norte-americano (Fotino pyralis), o patógeno entérico de nemátodos (Photorhabdus luminescens) e o falsário de mar (Renilla reniformis). Nenhum desses sistemas tem uma origem bacteriana, mas a utilização de genes de lux e operons de origem bacteriana está ganhando mais interesse para a investigação aplicada,16. O aplicativo menos abundante de proteínas de bioluminescência de fontes bacterianas é principalmente devido à menor estabilidade e longevidade de bactérias derivados luminescentes proteínas que podem estar relacionadas com os habitats marinhos. Bactérias bioluminescentes de habitats marinhos não são cultiváveis em condições de laboratório padrão. Estas bactérias exigem meios de crescimento específico e condições, tais como mar artificial crescimento/incubação médio e baixa a temperatura da água (por exemplo, 28 ° C).
Para simplificar a comparação das características de operon lux ou único lux genes de uma gama de diferentes estirpes de bactérias bioluminescentes, um método para padronizar a análise e expressão do operon lux é um pré-requisito. Assim, surgiu a ideia de integrar o operon lux-costela de toda a pesquisa padrão-bactéria Escherichia coli (e. coli). Para este efeito, montagem Gibson provou para ser uma ferramenta útil para integrar múltiplos fragmentos sobrepostos, lineares vector de uma expressão sem a necessidade de sítios de restrição específica. Esse método também é apropriado quando as inserções de ADN são muito grandes (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ tamanho de operon 9KB) para ser amplificado através do PCR. Um operon lux pode ser separado em múltiplos fragmentos sobrepostos e, em seguida, ser montada em plasmídeo de um expressão e finalmente a sequência verificada produto de montagem pode ser diretamente transformado em um apropriado Escherichia coli sistema para alto rendimento expressão da proteína18,19,20. Além de fácil lidar com a expressão do gene de e. coli com base lux , um método simples, combinando gravação do crescimento celular e emissão de luz bioluminescente permaneceu para ser estabelecida. O método descrito aqui permite a medição em situ e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes.
A análise de genes de lux e ordem de operon lux e regulamento de várias bactérias bioluminescentes com, por um lado, um artificial bioluminescentes Escherichia coli sistema contendo o operon toda lux-costela de P. mandapamensis 27561 e, por outro lado, um ensaio de leitor de placa recentemente desenvolvido combinando a gravação em situ da densidade celular e emissão de luz, ajuda a obter mais informações sobre os diversos sistemas de bacteriana lux . Esta caracterização fundamental e comparação de luciferases e enzimas relacionadas podem levar a alternativas para os sistemas de repórter já estabelecido com atividade e estabilidade melhorada.
Protocol
1. concepção, preparação e a expressão do Operon em Escherichia coli a lux
Nota: Ver Tabela de materiais para obter informações sobre os jogos comerciais usados nesta seção.
- Para transferir o operon lux em Escherichia coli escolher um vetor padrão do animal de estimação com sítios de restrição apropriada e gene de resistência aos antibióticos de interesse (por exemplo, pET28a; NcoI, XhoI, kanamicina).
- Projetar os fragmentos e sobreposição de primers para montagem de Gibson, com base na sequência do DNA de Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
- Configurar uma padrão reação de PCR com primers projetados e o DNA genômico isolado de Photobacterium mandapamensis 27561 como modelo (consulte o Material complementar para primers e condições).
Nota: Isolamento do DNA genômico da respectiva estirpe bacteriana aumenta a eficácia do PCR. - Purifica o produto PCR através da purificação da rotação-coluna.
- Execute uma digestão da limitação do vetor pET28a isolado com NcoI e XhoI a 37 ° C por 45 min.
- Purificar o vetor tornado linear e os fragmentos PCR através de agarose gel eletroforese e purificação subsequente spin-coluna.
- Determinar a concentração de DNA de cada fragmento e o vetor tornado linear e calcular as quantidades ideais para a montagem de acordo com o protocolo de20,21.
Nota: A eficácia do conjunto depende do tamanho do fragmento e número e deve ser ajustado de acordo com protocolo20,21 do fabricante. - Depois de combinar todos os fragmentos e a reserva em um tubo PCR, incube a mistura de montagem em uma máquina PCR, a 50 ° C por 1h.
- Transformar o produto vetorial montado de acordo com os protocolos padrão de transformação transformação de plasmídeo bacteriano de Escherichia coli em um apropriado Escherichia coli sistema para replicação do plasmídeo de alto rendimento (por exemplo, Escherichia coli TOP10 ou XL-1).
- Escolha colônias da placa de transformação e raia em novas placas para isolamento do DNA.
- Isole o Plasmídeo de acordo com protocolos padrão.
- Para verificar a correcta montagem do plasmídeo, incluindo todos os fragmentos, primeiro realize uma colônia PCR de acordo com protocolos padrão utilizando primers específicos para cada fragmento montado.
- Adicionalmente, para a colônia do PCR e eletroforese em gel de agarose subsequentes, preparem-se todos os vetores do conjunto isolado para sequenciamento de DNA verificar a correcta montagem e as sequências de DNA corretas.
- Transformar o plasmídeo verificado de acordo com os protocolos padrão de transformação transformação de plasmídeo bacteriano de Escherichia coli em um apropriado Escherichia coli sistema para produção de proteína de alto rendimento (e.g.,E. coli BL21).
Nota: Continue diretamente com protocolo de expressão abaixo. Para uma conservação mais longa, recomenda-se a preparação de um estoque de glicerol.
2. a expressão de cepas modificado e. coli
- Preparar uma cultura durante a noite (ONC) para expressão por inoculação de um volume adequado de meio LB (por exemplo, 100 mL) com o estoque de glicerol previamente preparado de Escherichia coli BL21 células transformadas com o plasmídeo montado ou diretamente de um placa de transformação. Adicione 100 µ l de canamicina (50 mg/mL; gene de resistência aos antibióticos de pET28a) e incube a ONC a 37 ° C e 120 rpm em um shaker incubadora durante a noite.
- Inocular a cultura de expressão principal (por exemplo, 800 mL de meio LB) com 8 mL da ONC e adicionar 800 µ l de canamicina (50 mg/mL).
- Incubar a cultura principal a 37 ° C e 120 rpm em um shaker incubadora até a densidade celular atinge uma OD600 de 0.6 - 0.8 (aproximadamente 2,5 h).
- Reduzir a temperatura de incubação de 28 ° C.
- Induzi a expressão da proteína com a adição de IPTG para uma concentração final de 0,1 mM.
Nota: Testes empíricos mostraram que a redução da temperatura de 28 ° C deu a maior intensidade de luz. - Observe as células até que eles começam a brilhar (cerca de 1 h).
Nota: Dependendo da finalidade da expressão, as células são cultivadas até o dia seguinte e então são colhidas, ou as células podem ser mantidos tremer enquanto eles estão brilhando (máximo 48 h). Colheita de células e purificação de qualquer proteínas pode ser feita de acordo com os procedimentos padrão.
3. a expressão de estirpes de bactérias bioluminescentes
Nota: Estirpes de bactérias bioluminescentes exigem meio de água de mar meio artificial de crescimento específico para o crescimento e produção de luz.
- Prepare médio de água do mar artificial, composto de dois componentes médios preparados separadamente.
Nota: A preparação do meio de água do mar artificial foi adaptada do original protocolo22. Os seguintes valores são para meio líquido 1L ou meio de agar de 1 L.- Por meio de água do mar artificial, pesar os seguintes sais: 28,13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1,60 g de CaCl2 · 2H2O, 4,80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3e 3,50 g MgSO4 · 7H2O.
- Adicionar 1 litro de água destilada e dissolver todos os componentes.
- Por meio de LB, pesar os seguintes ingredientes: 10 g de extrato de levedura, peptona de 10g e para placas de ágar, ágar um adicional de 20 g.
- Adicionar 250 mL de água da torneira e dissolver os componentes.
- Autoclave ambos preparados mídia separadamente a 121 ° C por 20 min.
- Para placas de ágar, combinar 250 mL de meio LB com 750 mL de meio de água do mar artificial diretamente após a esterilização em autoclave e preparar pratos.
- Para meio líquido, combine 250 mL de meio LB com 750 mL de meio de água do mar artificial ou diretamente após a autoclavagem ou quando arrefecido.
Nota: O meio de água do mar artificial pode ficar turvo através da precipitação do sal.
- Marcam as estirpes de bactérias bioluminescentes em placas de ágar médio de água do mar artificial e incubar durante uma noite a 24-30 ° C.
Nota: Armazenamento de longo tempo de estirpes bacterianas é normalmente alcançado através de congelando as existências de glicerol da cultura bacteriana. Estirpes sempre devem ser listradas em placas de ágar primeiro para assegurar condições de arranque uniformes para todas as estirpes, antes do uso para as culturas de líquido, devido a uma fase de retardo no crescimento após o descongelamento. - Prepare uma ONC, inocular médio de água do mar artificial 100ml com uma única colônia da placa. Incube a ONC a 24-30 ° C e 120 rpm em um shaker incubadora durante a noite.
- Inocule a 800 mL de meio de água do mar artificial com 8 mL de ONC.
- Incube as células bacterianas em 24-30 ° C e 120 rpm em um shaker de incubadora.
Nota: O perfil de intensidade de luz das bactérias bioluminescentes fortemente varia com a temperatura. Dependendo os mecanismos de regulação da produção luz da respectiva estirpe bacteriana, emissão de luz pode começar após cerca de 1-6 h. - Observe a cultura de células bacterianas até que eles começam a brilhar (cerca de 1-6 h).
Nota: Dependendo da finalidade da expressão, as células são cultivadas até o dia seguinte e então são colhidas, ou as células podem ser mantidos a tremer enquanto eles estão brilhando. Colheita de células e purificação de qualquer proteínas pode ser feita de acordo com os procedimentos padrão.
4. ensaio in Vivo da atividade de modificado e. coli tensões e estirpes de bactérias bioluminescentes
Nota: O armazenamento de longo tempo de cepas normalmente é acieved através do congelamento de estoques de glicerol de cultura bacteriana. Estirpes sempre devem ser listradas em placas de ágar primeiro para assegurar condições de arranque uniformes para todas as estirpes, antes do uso para as culturas de líquido, devido a uma fase de retardo no crescimento após o descongelamento.
- Raia a estirpe bacteriana bioluminescente desejada ou modificado e. coli Coe sobre uma placa de ágar e incubar a 28 ° C durante a noite.
Nota: A temperatura de incubação pode variar de cepa para cepa e tem de ser avaliada empiricamente. Para ser capaz de comparar estirpes de bactérias bioluminescentes e modificados estirpes de Escherichia coli , condições de crescimento tem que ser idênticos. - Inocular 3 mL do meio com a respectiva tensão com uma única colônia de uma placa de ágar e incube as celulas a 28 ° C e 180 rpm em um shaker de incubadora para aproximadamente 1-2 h.
- Medir a densidade de células de um 01:10 diluição da cultura líquida a 650 nm. Calcule a proporção e volume para cultura de 1 mL com uma OD650 de 0,05.
Nota: O ensaio de leitor de placa subsequente irá determinar a densidade de células a 650 nm para evitar interferência, a emissão de luz das cepas. - Pipete o volume calculado de cultura e médio para uma placa de 24-poço preto-murado com fundo de vidro. Para o modificado e. coli estirpe, adicionar 1 µ l de canamicina (resistência aos antibióticos de vetor de pET28a) e 1 µ l de IPTG (indução da expressão do gene) para as amostras. Coloque uma tampa sobre a chapa para evitar a evaporação durante as medições.
Nota: Para garantir que o vetor de pET28a contendo o operon toda lux não se perder a cultura de Escherichia coli , canamicina deve ser adicionada para cada amostra de Escherichia coli nos poços da placa e para assegurar que a produção de luz da e. coli as células podem ser medidas, a expressão do gene deve ser induzida por IPTG. Para evitar interferência crosstalk e medição, placas bem preto-murado com fundo de vidro e a tampa transparente mostraram melhores resultados. No entanto, interferência pode ser observada e posições bem tem que ser escolhido com cuidado. - Inicie a medição em um leitor de placa.
Nota: O protocolo de leitor de placa é baseado em um roteiro desenvolvido especialmente para este ensaio (ver Material suplementar) que combina duas medições, absorvência e bioluminescência. Pontos de dados são coletados a cada 10 min com agitação permanente entre as medições e uma temperatura constante de 28 ° C.
Representative Results
A ordem do gene de operon do lux - luxCDABFEG - é altamente conservada ao longo de várias estirpes2,5,14. Para a concepção do plasmídeo, as informações de sequência foi tiradas da estirpe bacteriana bioluminescente Photobacterium mandapamensis 27561 sua ordem de gene foi mantido o mesmo e, também, sequências não-codificadoras entre genes único foram consideradas. Uma visão esquemática da estratégia aplicada clonagem Gibson é retratada na Figura 2. Quatro fragmentos no total, luxCDAB, luxF, luxEG e ribEBH, com 20-40 pares de base sobreposição sequências foram gerados. Depois de seguir todos os passos da montagem Gibson20, sequenciamento de DNA confirmou a correcta montagem do plasmídeo, incluindo todos os fragmentos. O mapa do vetor de pET28a de produto a montagem final contendo o operon lux-costela é retratado na Figura 3. Uma vantagem significativa deste vetor pET28a modificada é a utilização de padronizado condições de crescimento de Escherichia coli e controlada por indução com IPTG.
Para medir a emissão de luz de bactérias bioluminescentes e a densidade celular respectivos, foi desenvolvido um método com base de leitor de placa. O método para o leitor de placa foi gerado combinando scripts de medição única para densidade luz de intensidade e celular. Este romance script habilitado a medição de OD650 e intensidade de luz cada 10 min para um usuário definido de tempo, que deve ser ajustado para o tempo de geração das bactérias utilizadas para a respectiva análise (por exemplo, 10 h). A medição da densidade óptica foi realizada a 650 nm para evitar a interferência com a emissão de luz. Como uma prova de conceito e para garantir a saúde e o comportamento correto do crescimento das células de Escherichia coli , foram realizadas medidas de referência. Figura 4 comparação de Escherichia coli BL21 células, as células de Escherichia coli BL21 contendo um vetor vazio pET28a e Escherichia coli BL21 células contendo o vetor de pET28a com o operon lux-costela inserir são apresentados. Para o último esforço, sem IPTG foi adicionado para analisar a emissão de luz devido a leakiness do promotor T7. Todos os três medições de referência mostram uma curva sigmoidal de crescimento com três fases de crescimento (fase de retardo, exponencial e estacionário). Apenas as células de BL21 de e. coli contendo o vetor de pET28a com o início de inserção do operon lux-costela a emitir luz, mas em contraste com as medidas onde a expressão é induzida pela adição de IPTG e luz é emitida após 30 min, as células não-induzida só começar a brilhar após aproximadamente 5 h e mostrar uma muito baixa emissão de luz (ca. 4-fold) em comparação com o sistema induzido.
Figura 5 fornece uma comparação das curvas de crescimento e intensidades luminosas do operon lux expressado em e. coli e a estirpe bacteriana bioluminescente mandapamensis p. 27561, LB médio ou médio e água do mar artificial, usar o romance estabelecido in situ método. Para comparar estas bactérias, as medições foram realizadas a uma temperatura de incubação de 28 ° C. Esta diminui de temperatura, a taxa de crescimento do modificado e. coli estirpe em meio LB, bem como médio de água do mar artificial, mas para temperaturas mais baixas estirpes de bactérias bioluminescentes é cruciais. Esta dependência da temperatura é visível na Figura 5A, como p. mandapamensis 27561 mostra uma densidade celular muito maior do que a e. coli. Além disso, enquanto que para as estirpes de Escherichia coli , LB médio permite a geração de maiores densidades de célula, por estirpes de bactérias bioluminescentes naturais, médio de água do mar artificial é preferencial e essencial para a bioluminescência. As densidades de célula gravada correlacionam com as respectivas intensidades luminosas, como mostrado na Figura 5B. Notável, o bioluminescentes Escherichia coli células alcance semelhante máximos de emissão de luz em ambos médio de água de mar médio, bem como artificial LB, embora as intensidades mais elevadas foram registradas em pontos diferentes do tempo. Em contraste com esta observação, mandapamensis p. 27561 é viável com taxas de crescimento altamente reduzido em meio LB, mas as células bacterianas não emitem luz em todas as (Figura 5B). No meio de água do mar artificial, mandapamensis p. 27561 mostra um máximo de emissão de luz em cerca de 1 x 104 contagens por segundo, que é quase um fator de 200 inferior a Escherichia coli. Figura 5 C representa unidades relativas de luz onde a bioluminescência é normalizada pelo OD. Estes resultados confirmam que não só foi a inserção de um plasmídeo contendo o operon lux em Escherichia coli , bem sucedida e funcional, mas também que esta modificado e. coli cepa é uma alternativa válida com emissão de luz ainda maior rendimentos e sem a limitação de bioluminescência bacteriana de bactérias de marina, como uma complexa água salgada médias e baixas temperaturas.
Além disso, uma medida a longo prazo da expressão gene lux-costela Escherichia coli com base em mais de 24 h foi realizada para analisar a longevidade da emissão de luz (Figura 6). Emissão de luz durou 19,5 h, muito mais do que as cepas bacterianas (por exemplo, mandapamensis p. 27561) onde uma diminuição gradual foi observada resultando em emissão de luz muito baixa após 10 h.
Para ilustrar as limitações do ensaio desenvolvido, a Figura 7 mostra os resultados de medição de três estirpes de bactérias bioluminescentes, ou seja, S1 Photobacterium mandapamensis , mandapamensis Photobacterium TH1 e Vibrio harveyi 14126. Para a primeira estirpe (S1), o método funciona muito bem e mostra uma intensidade máxima de bioluminescência de quase 2 x 106. Para as outras duas cepas (TH1 e 14126), a intensidade de luz máxima não pode ser determinada porque a intensidade da luz gerada por ambos excedeu o limite de detecção das configurações do instrumento utilizado. O ganho de valor definido para o método desenvolvido (roteiro) para essas duas linhagens foi ajustado muito alto. No entanto, o início da atividade de bioluminescência pode ser comparado com o outro. P. mandapamensis TH1 e mandapamensis p. S1 começam a brilhar após aproximadamente 1 h e um valor de650 OD de 0.1 - 0.2, respectivamente. Em contraste, V. harveyi 14126 começa a emitir luz após aproximadamente 5,5 h em um valor de650 OD de 1.0. Observado início da emissão de luz é acompanhado por um aumento exponencial no OD, bem como a bioluminescência. É conhecido que subjacente a bioluminescência de V. harveyi 14126 quorum sensing regulamento e, portanto, uma determinada célula densidade permitindo a ativação do operon lux , que pode ser claramente observado na Figura 713. Este resultado demonstra que, com este romance em situ , ensaio de leitor de placa é possível comparar facilmente bactérias bioluminescentes e também mais ou menos definir um mecanismo regulatório destas tensões, determinando se um quorum sensing regulamento pode ser observado ou não.
A Figura 8 mostra um exemplo de uma expressão de cultura de células de Escherichia coli BL21 abrigando o plasmídeo pET28a montado contendo o operon lux após indução com IPTG. Após aproximadamente um h após a indução, as células de e. coli começam a brilhar com uma cor azul esverdeado. Figura 8 A mostra a expressão de e. coli cultura fotografado na luz e Figura 8B dá a mesma cultura no escuro. Figura 8 C mostra uma placa de ágar de médio de água do mar artificial com p. mandapamensis S1 brilhando no escuro na mesma característica cor azul-esverdeada pela bioluminescência bacteriana.
Figura 2 : Representação esquemática do Gibson aplicada estratégia de clonagem. Etapa (I): primeiras demão de sobreposição (setas coloridas; ca. 20-40 pares de base se sobrepõem) são projetadas. Sobreposição de cartilhas contêm sequências recozimento constituído a respectiva região 5' e 3' de um fragmento e a respectiva região 3' e 5' do segmento adjacente. Passo (II): Os fragmentos projetados para montagem são gerados através de reações de PCR padrão. Passo (III): O vetor de destino é linearizado pela digestão de restrição (por exemplo, NcoI, XhoI). Passo (IV): As concentrações de DNA de todos os fragmentos e o vetor tornado linear tem que ser determinada ajustar a concentração adequada para a montagem de Gibson (de acordo com o protocolo do fabricante). Passo (V): Todos os fragmentos e o vetor tornado linear com concentrações de DNA otimizadas são combinados com a mistura de mestre do montagem Gibson (do exonuclease T5, DNA polimerase e DNA ligase) e são incubados a 50 ° C, durante 1 h. etapa (VI): o produto de montagem é transformado de acordo com protocolos padrão para um apropriado Escherichia coli cepa para replicação do plasmídeo de alto rendimento (por exemplo, Escherichia coli TOP10 ou XL-1). Etapa (VII): Para verificar a correcta montagem do plasmídeo, sequenciamento de DNA do plasmídeo montado tem de ser realizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Mapa do vetor de pET28a contendo o operon lux-costela . O operon lux-costela de mandapamensis p. 27561 é inserido no site da clonagem múltiplos de pET28a na ordem original de gene (luxCDABFEG-ribEBH). Sítios de restrição utilizados para clonagem são NcoI e XhoI. Fragmentos utilizados para montagem de Gibson do operon são luxCDAB em laranja, luxF em verde, luxEG em azul e ribEBH em lavanda; os genes dentro de um fragmento são mostrados como uma caixa separada. Sequências não-codificadoras entre cada gene do operon estão incluídas na estratégia de clonagem aplicada. O tamanho final do plasmídeo de pET28a contendo o operon toda lux-costela é 14.625 pares de bases. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Comparação de curvas de crescimento e intensidades luminosas de cepas de referência. A D.O. a 650 nm e a intensidade de bioluminescência em contagens por segundo foram medidos a cada 10 minutos, mais 10 h a 28 ° C. Todas as medições são valores médios de três réplicas biológicas com quatro técnicas repetições cada. Barras de erro representam desvios-padrão. E. coli BL21 células (quadrados cinzas), células de Escherichia coli BL21 contendo um vazio pET28a vector (círculos cinzas), e Escherichia coli BL21 células contendo o vetor de pET28a com a inserção de operon lux-costela (diamante negro) foram analisadas para garantir o comportamento correto de crescimento das nossas células de Escherichia coli . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Comparação das curvas de crescimento e intensidades luminosas do operon do lux expressaram em Escherichia coli (praças) e p. mandapamensis 27561 (círculos) em meio LB (símbolos abertos) ou médio de água do mar artificial (símbolos preenchidos). Todas as medições são valores médios de três réplicas biológicas com quatro técnicas repetições cada. Barras de erro representam desvios-padrão. Todos os experimentos foram realizados a uma temperatura de incubação de 28 ° C. (A) medições de densidade (OD) de óptica a 650 nm foram realizadas a cada 10 min para 10 h. expressão do operon de Escherichia coli lux (painel esquerdo) é comparado com mandapamensis p. 27561 (painel direito), no meio de água de mar médio e artificial LB. Densidades de célula são determinadas a 650 nm para evitar a interferência de bioluminescência. (B) medição da intensidade de luz (bioluminescência [contagens/s]) foi a cada 10 min para 10 h. expressão do operon de Escherichia coli lux (painel esquerdo) é comparado com mandapamensis p. 27561 (painel direito) em LB mar médio e artificial médio de água. (C) luz relativa (RLU/OD) de intensidades do operon lux expressado em Escherichia coli (painel esquerdo) e p. mandapamensis 27561 (painel direito) são determinadas pela normalizando bioluminescência à densidade celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Comparação das curvas de crescimento e intensidades luminosas de e. coli com base em expressão de gene lux para 24 h. A D.O. a 650 nm e a intensidade de bioluminescência em contagens por segundo foram medidos a cada 10 min mais de 24 h a 28 ° C. Todas as medições são valores médios de três réplicas biológicas com quatro técnicas repetições cada. Barras de erro representam desvios-padrão. Além disso, as intensidades de luz relativas (RLU/OD) onde bioluminescência é normalizada pela densidade da célula são representadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Comparação de bactérias bioluminescentes para avaliar potencial quorum sensing regulamento. Emissão de luz e densidade celular são medidos a cada 10 min para 10 h e representam valores médios de três réplicas biológicas com quatro técnicas repetições cada. Barras de erro representam desvios-padrão. Medições de mandapamensis Photobacterium TH1 (preto praças), Vibrio harveyi 14126 (círculos cinzas) e Photobacterium mandapamensis S1 (cinzas diamantes) foram comparados entre si; (A) retrata a densidade óptica (OD) a 650 nm, (B) a luz intensidade (bioluminescência [contagens/s]) e (C) intensidades de luz relativas (RLU/OD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Bioluminescência em meio líquido e em placas de ágar. (A) balão de 5 L com média de 2 L LB inoculadas com Escherichia coli BL21 células expressando o plasmídeo de operon pET28a lux fotografado em luz. (B) a mesma cultura como em (A) fotografada no escuro. Fotos A e B foram tiradas aproximadamente 2h após a indução da expressão. (C) mar Artificial água médio placa de ágar com listras cultura de p. mandapamensis S1 fotografado no escuro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A construção de um plasmídeo de expressão contendo quatro fragmentos compondo o operon toda lux-costela de mandapamensis p. 27561 foi conseguida através de clonagem de Gibson. Esta expressão de gene de lux Escherichia coli baseado permite que células de Escherichia coli a emitir luz. Evitar o quórum sensoriamento regulamento e condições de crescimento não-padrão é substanciais vantagens deste sistema.
As vantagens de usar a estratégia de clonagem Gibson são a fácil montagem de vários fragmentos de DNA lineares, alta flexibilidade e sem necessidade de restrição específicas sites18,19,20. Este método permite alterar facilmente um operon lux , excluindo os genes único ou clusters de gene ou introduzindo novos genes ou intercâmbio de genes de uma estirpe com outro. Um pré-requisito para a aplicação deste método é a disponibilidade da sequência do gene de operon respectivos lux . Apenas para um pequeno número de bactérias bioluminescentes é a sequência de DNA completa do respectivos lux operon conhecidos e/ou disponível. Muitas dessas sequências são fragmentadas porque eles foram gerados usando o sequenciamento de espingarda. No caso do inquérito mandapamensis p. 27561 a sequência de DNA completa do operon lux é conhecido e disponível a partir do banco de dados do NCBI gene (GenBank: DQ988878.2).
Um passo crítico no protocolo da Assembleia Gibson é o cálculo da concentração de DNA dos fragmentos único. No protocolo de montagem do fabricante foi recomendado usar 0,2 - 0,5 pmoles e um volume total de 20 µ l para 4-6 fragmentos20,21. No nosso caso, onde luxCDABFEG-ribEBH é composto de 4 fragmentos, as concentrações e volumes totais foram pmol 0.1 e 45 µ l, respectivamente, dependendo do rendimento dos produtos PCR. Por um lado, a concentração teve de ser reduzido, e por outro lado, o volume teve que ser aumentada. No entanto, a Assembleia funcionou muito bem e sequenciamento de DNA confirmou a inserção correta na primeira tentativa. Este achado confirmado montagem Gibson como um método robusto e apropriado para nossas investigações, o que pode ser facilmente modificado18,19,20.
O ensaio de leitor de placa recém-criada é um fácil de lidar com o método. Permite uma análise simples primária de novo ou (un-) conhecido estirpes de bactérias bioluminescentes e dá já uma primeira dica sobre o mecanismo regulatório de produção de luz (por exemplo, atraso na luminescência em densidades de pilha baixa). Além disso, as condições de crescimento em combinação com a produção de luz facilmente podem ser avaliadas simplesmente mudando o meio de cultura ou temperatura.
Foram realizadas as medidas com o leitor a 28 ° C. A razão para esta configuração incomum é a sensibilidade de temperatura de estirpes de bactérias bioluminescentes, onde as temperaturas acima de 30 ° C conduzem a menos ou até mesmo nenhum crescimento e/ou emissão de luz. Note que o leitor é capaz de manter uma temperatura definida ao longo do tempo com a limitação da falta de um ativo sistema de arrefecimento. Portanto, a temperatura ambiente deve estar abaixo da temperatura da medição.
Como uma prova de conceito, a comparação da construção de e. coli com a cepa bioluminescente p. mandapamensis (Figura 5), por um lado e as medições de referência (Figura 4) por outro lado foram realizadas e confirmar a confiabilidade deste sistema recém-criada. Além disso, a longo prazo medida garantiu a longevidade da emissão de luz (Figura 6). Mas deve-se considerar que os valores de OD não são fiáveis acima de uma certa densidade óptica, dependendo das características do dispositivo de medição utilizado (aproximadamente 15 h no presente caso) onde seria necessário uma diluição adequada para uma medição na escala linear do detector. Estes desvios altos nos valores de OD fazem estas medições de tempo não confiável. Portanto, medições mais curtas como 10 h são recomendadas usando a configuração experimental relatou aqui.
Limitações do ensaio do leitor de placa estabelecida podem ser vistas na Figura 7. A dificuldade é encontrar uma configuração apropriada da medição. O valor de 'ganhar' ajusta a sensibilidade do tubo foto multiplicador (PMT). O ganho é a amplificação do sinal no PGTO, significando que um fator de ganho mais elevado aumentará o sinal. Se o ganho é definido muito baixo, relação sinal / ruído torna-se maior e intensidades luminosas de bactérias bioluminescentes brilhantes "baixas" não podem ser medido qualquer (sinais mais próximo de zero, dados não mostrados). O desafio em um ensaio bioluminescente é ajustar o ganho para que os resultados de medição para todas as estirpes bacterianas fiquem dentro da escala do instrumento. Além disso, o intervalo de medição para luminescência varia de acordo com o tempo de intervalo de medição (por exemplo, máximo de 2.000.000 para 1 s).
O ganho foi definido como 2800, empiricamente, que foi testado e escolhido para o leitor de placa específicos utilizado para o estabelecimento deste método. O ajuste de ganho utilizado permite a gravação de máxima luz emitida pela bioluminescentes sistema de Escherichia coli , mandapamensis p. 27561 e p. mandapamensis S1 sem um estouro, mas para as tensões TH1 p. mandapamensis e V. harveyi 14126 o ganho era muito alto. Portanto, estas variedades último excederem o limite de detecção e a intensidade da luz real máxima não pode ser medida. Essa limitação técnica pode impedir que a comparação de bactérias bioluminescentes, que mostram variações altas em emissão de luz máxima, embora as condições de crescimento e as densidades de célula podem ser comparáveis.
Posicionamento das cepas bacterianas analisadas dentro as placas bem usadas tem de ser avaliada empiricamente. Apesar de placas bem pretas com fundo de vidro foram usadas, crosstalk entre as amostras foi observada. A intensidade da luz de cepas específicas é tão elevada, que todos os poços vizinhos mostrará falsas positivas luz das emissões (por exemplo, em branco). Portanto, é importante medir duas linhagens diferentes separadamente ou com uma certa separação espacial uns aos outros.
Já existem muitos modificado cepas de e. coli conhecidas que contêm partes do operon do lux e são principalmente orientada a aplicação15,16,17. Os métodos descritos aqui, visam a investigação fundamental, por exemplo, a possibilidade de analisar cada gene lux separadamente. Embora pesquisas da bioluminescência tem uma longa história, há ainda muitas questões abertas. Excluindo ou introduzir genes do operon do lux , troca de genes com genes de outra estirpe luxAB ou analisando proteínas complexos, incorporado no fácil de lidar com o sistema de e. coli e ainda mais a aplicação da placa ensaio do leitor, é possível obter mais informações sobre processos regulatórios e as funções dos genes de lux .
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Queremos agradecer Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) pelo seu apoio no estabelecimento o script auto escrito para o leitor. Este trabalho foi apoiado pelo austríaco "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen pesquisa" (FWF) para PM (P24189) e o programa de doutoramento "DK Molecular enzimologia" (W901) para PM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
| Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
| GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
| Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
| GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| 24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
| FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
| Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
| Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |
References
- Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
- Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
- Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
- Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
- Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
- Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
- Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
- Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
- Meighen, E.
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
- Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence living lights, lights for living. , Harvard University Press. (2013).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
- Atlas, R. M. Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , CRC Press. (2004).
