In Situ Medição e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioluminescência. Tais como, encontrar condições ideais de crescimento para a intensidade máxima de luz de bactérias bioluminescentes e determinar o mecanismo regulador. A principal vantagem desta técnica é a fácil configuração, que pode ser usada para várias cepas e organismos, bem como as possibilidades de ajuste simples e rápido.

Seguir esse método pode fornecer informações sobre as características do operon lux. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como sistemas bacterianos, ambientais, de relatórios ou sensores. Para começar, prepare uma cultura durante a noite inoculando 100 mililitros de meio LB com canamicina, com células E.coli BL21 transformadas em operon lux do estoque de glicerol ou diretamente de uma placa de transformação.

Incube a cultura a 37 graus Celsius e 120 RPM durante a noite. No dia seguinte, inocular 800 mililitros de meio LB canamicina com 8 mililitros da cultura noturna. Incubar a cultura a 37 graus Celsius e 120 RPM em um agitador de incubadora, até que a densidade celular atinja um OD600 de 0,6 a 0,8.

Reduza a temperatura de incubação para 28 graus Celsius e induza a expressão de proteínas adicionando IPTG 0,1 milimolar. Em seguida, observe as células até que comecem a brilhar. Depois de preparar o meio de acordo com o protocolo de texto, listre as cepas bioluminescentes bacterianas em placas de ágar médio de água do mar artificial e incuba-as a 24 a 30 graus Celsius durante a noite.

Prepare uma cultura durante a noite inoculando 100 mililitros de meio artificial de água do mar com uma única colônia da placa. Em seguida, incube a cultura a 24 a 30 graus Celsius e 120 RPM durante a noite. No dia seguinte, inocule 800 mililitros de meio artificial de água do mar com 8 mililitros de cultura durante a noite.

Incube as células bacterianas a 24 a 30 graus Celsius e 120 RPM e observe as células até que comecem a brilhar. Risque a cepa bacteriana bioluminescente desejada ou a cepa de E.coli modificada em uma placa de ágar e incube a cultura a 28 graus Celsius durante a noite. Inocule 3 mililitros de meio com uma única colônia da placa noturna e incube as células a 28 graus Celsius e 180 RPM por aproximadamente uma a duas horas.

Meça a densidade celular de uma diluição de um a dez da cultura líquida a 650 nanômetros. Em seguida, calcule a proporção e o volume de um mililitro de cultura com um OD650 de 0,05. Pipetar o volume calculado de cultura e meio para uma placa de parede preta de 24 poços com fundo de vidro.

Para garantir que o vetor pET28a contendo todo o operon lux não se perca, e isso é expresso na cepa E.coli modificada, adicione um microlitro de canamicina e um microlitro de IPTG às amostras. Em seguida, coloque uma tampa na placa, para evitar a evaporação durante as medições. Por fim, use um leitor de placas ajustado para 28 graus Celsius e um script encontrado no protocolo de texto, para fazer medições de absorbância e bioluminescência a cada 10 minutos, com agitação entre os pontos de dados.

Esta figura compara as medições OD650 de células E.coli BL21, células BL21 contendo um vetor pET28a vazio e células BL21 contendo um vetor pET28a com a inserção do operon lux-rib, mas sem indução. Todas as três medições de referência para emissão de luz mostram uma curva de crescimento sigmoidal com fases de crescimento lag, exponencial e estacionária, mas sem emissão de luz, exceto para a última amostra, que mostra emissão de luz após 300 minutos, devido ao vazamento do promotor T7. Aqui, as curvas de crescimento e intensidades de luz do operon lux expressas em E.coli e a cepa bacteriana bioluminescente, fotobactéria mandapamensis 27561, foram comparadas a 28 graus Celsius em LB, ou meio artificial de água do mar.

A cepa E.coli modificada e P.mandapamensis crescem em meio artificial de água do mar, bem como em meio LB, e ambos apresentam emissão de luz. Mas no meio LB, P.Mandapamensis não emite luz alguma. Notavelmente, a cepa de E.coli modificada mostra uma intensidade de luz máxima mais alta do que as bactérias bioluminescentes.

Neste experimento, a expressão gênica do operon lux-rib baseado em E.coli foi medida ao longo de 24 horas para analisar sua longevidade. A emissão de luz durou 19 horas e meia, muito mais do que as cepas bacterianas, onde foi observada uma diminuição gradual, resultando em emissão de luz muito baixa após 10 horas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da bioluminescência explorarem operons lux em organismos modelo, como E.Coli.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como trabalhar com bactérias bioluminescentes.