Summary
Kollarındaki bakteri gibi çekirdek algılama mekanizmaları, çeşitli aracılığıyla ışık üretim düzenler. Bu roman yöntemi bioluminescence in situ incelenmesi ve hücre yoğunluğu için ışık emisyon korelasyon sağlar. Bir yapay kollarındaki Escherichia coli sistemi sağlar lux operons, Lux proteinler ve onların Interplay karakterizasyonu.
Abstract
Işık yayan yetenekli önemli sayıda bakteri. Hepsi aynı gen küme, yani lux operon paylaşmak. Bu benzerlik rağmen bu bakterilerin büyüme davranış, ışık emisyon yoğunluğu veya bioluminescence düzenlenmesi gibi özellikleri aşırı farklılıklar gösterir. Burada sunulan hücre büyümesi ve kollarındaki ışık emisyon yoğunluğu kayıt plaka okuyucu kullanmak zaman içinde birleştiren yeni geliştirilen bir tahlil yöntemidir. İlgili bakteriyel gerginliği, yönetmelik algılama çekirdek gibi önemli özellikleri elde edilen büyüme ve ışık emisyon özelliklerini bağlanabilir. Kollarındaki bakteri bir dizi ekimi özel bir ortam (Örneğin, yapay deniz suyu orta) gerektirir ve sıcaklıklar tanımlanan. Kolay, kollarındaki standart-araştırma bakteri Escherichia coli (e.coli), öte yandan, ucuz laboratuvar ölçekte yüksek miktarlarda ekili. Bütün lux içeren bir plazmid tanıtarak E. coli istismar operon deneysel koşullar basitleştirebilir ve ayrıca gelecekteki uygulamalar için birçok olanaklar açar. Bir E. coli ifade zorlanma kullanan tüm lux genlerin ifade bir ifade plazmid Gibson klonlama yoluyla inşaatı ve yedi lux genler ve üç kaburga genler içeren dört parçalarının ekleme tarafından elde edildi lux-kaburga operon pET28a vektör içine. Dayalı E. coli lux gen ekspresyonu indüklenen ve kollarındaki E. coli sonuçlanan izopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ek üzerinden kontrol hücreleri. Bu sistemin çekirdek düzenleme kısıtlamaları ve karmaşık orta besteleri ile birlikte standart dışı büyüme koşulları, gibi algılama önlemek için sıcaklıklar tanımlanan avantajları. Bu sistem lux operon üzerinden ilgili gen dışlanma veya başka bir tarafından bir bakteriyel zorlanma luxAB gen alışverişi roman genlerin bile ek çözümleme lux genler ve onların etkileşim sağlar veya luxCDEgibi protein kompleksleri analiz.
Introduction
Işık yaşayan organizmalar (bioluminescence) tarafından emisyon bakteriler, mantarlar, böcekler, nematod, balık ve mürekkep1bulunan büyüleyici bir süreçtir. Kollarındaki ışık emisyon chemiluminescent bir tepki içinde kimyasal enerji dönüştürülür (kısmen) ışık enerjisi ("soğuk ışık") çıkar. Kollarındaki bakterilerde heterodimeric enzim luciferase uzun zincirli, alifatik aldehitler, tetradecanal, 490 nm2, maksimum ışık emisyon eşliğinde karşılık gelen asitler için gibi monooxygenation tromboksan. 3.
Resim 1 : Bakteriyel luciferase düzeninin genel tepki. Bakteriyel luciferase (LuxAB) uzun zincirli monooxygenation tromboksan tarafından kullanan aldehitler (CH3(CH2)nCHO) azaltılmış flavin mononucleotide (FMNH2) ve moleküler oksijen (O2), ürünlerin verimli uzun zincir asitler (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), su (H2O) ve 490 merkezli ışık emisyon nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bu oksidasyon sırasında enerji FMN-4a-ışık yayan biyoluminesans4hizmet veren hidroksit, heyecanlı bir duruma neden olur. Bakteriyel bioluminescence, yani LuxCDABEG, yer alan proteinler lux operon tarafından kodlanmış ve çeşitli bakteri suşları2,5üzerinde son derece korunmuş. Genler luxA ve luxB için heterodimeric luciferase kodlamak; luxC'ın, luxD'ınve luxE'ın gen ürünleri bir yağ asidi alfa redüktaz karmaşık bileşenleridir; ve luxG için flavin redüktaz6kodlar. Kollarındaki Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bir dizi ek luxF gen taşımak. Bu LuxF sıradışı flavin türev 6-(3'-(R)-myristyl bağlar bir homodimeric protein olduğunu bildirildi)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Ek genler riboflavin sentezi (Örneğin, ribEBH) için sorumlu olan tespit edilmiştir ve ayrıca düzenleme genler bildirilmiştir, bu çekirdek algılama düzenleme bioluminescence, özellikle Vibrio için bir rol oynamaktadır fischeri ve Vibrio harveyi6,13. Son derece korunmuş gen sipariş rağmen büyüme davranış, ışık emisyon yoğunluğu veya düzenleme bioluminescence2,5,14, gibi özellikleri yüksek varyasyonları kollarındaki bakteri gösterir .
Birkaç suşları veya bölümü içeren plazmid değiştirilmiş veya bioluminescence muhabir sistemleri olarak istismar bütün lux operons bilinir. Organizatörü etkinlik, belirleme gibi çeşitli uygulamalar ortamda ya da gıda örnekleri, Bioluminescence rezonans enerji transferi (BRET), bakteriyel contaminations izlenmesi ökaryotik organizmalarda enfeksiyonların vivo içinde görüntüleme pyrosequencing ve benzeri kurulan15,16,17yaşındaydın. İlginçtir, üç kollarındaki muhabir sistemleri Kuzey Amerika ateş böceği (Photinus pyralis), nematodlar (Photorhabdus luminescens) enterik patojen ve deniz hercai menekşe (Renilla elde edilen en sık kullanılan reniformis). Bu sistemlerin hiçbiri bakteriyel bir kaynağı vardır, ama lux genler ve bakteriyel kökenli operons için uygulamalı araştırma16daha fazla ilgi kazanıyor. Bakteriyel kaynaklardan bioluminescence proteinlerin uygulama daha az bol esas olarak daha düşük istikrar nedeniyle ve deniz habitatlarını ilgili Işıksaçan proteinler bakteriler uzun ömürlü türetilmiş. Kollarındaki bakteri deniz alanları Standart laboratuvar koşullarında cultivable değildir. Bu bakterilerin belirli büyüme medya ve yapay deniz suyu orta ve düşük büyüme/kuluçka sıcaklıkları (Örneğin, 28 ° C) gibi koşulları gerektirir.
Genlerin farklı kollarındaki bakteri suşları, lux operon ifade ve analiz standartlaştırmak için bir yöntem bir dizi karşılaştırma lux operon özellikleri veya tek lux basitleştirmek için bir ön koşul olduğunu. Böylece, bütün lux-kaburga operon standart-araştırma bakteri Escherichia coli (e.coli) entegre fikri ortaya çıktı. Bu amaçla, Gibson derleme bir ifade vektör belirli kısıtlama siteleri için gerek kalmadan birden çok doğrusal, çakışan parçaları bütünleştirmek için yararlı bir araç olduğu ortaya çıktı. Bu yöntem ayrıca DNA ekler çok büyük olduğunda uygundur (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon boyutu) PCR ile kuvvetlendirilmesine. Lux operon birden çok örtüşen parçalara ayrılmış, daha sonra bir ifade plazmid monte edilebilir ve nihayet sıra derleme ürün doğrudan uygun bir E. coli dönüştürülmüş doğrulanmadı için yüksek verimli sistem protein ifade18,19,20. Kolay yanı sıra dayalı E. coli lux gen ekspresyonu, hücre büyümesi ve kollarındaki ışık emisyon kayıt birleştirerek basit bir yöntem kurulacak kaldı. Burada açıklanan yöntemi in situ ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon sağlar.
Analiz lux genler ve lux operon düzen ve düzenleme çeşitli kollarındaki bakteri ile bir yandan, bir yapay kollarındaki E. coli , s. bütün lux-kaburga operon içeren sistem mandapamensis ve 27561, diğer yandan, hücre yoğunluğu ve ışık emisyon, in situ kayıt birleştirerek yeni geliştirilen plaka okuyucu tahlil çeşitli bakteri lux sistemleri hakkında daha fazla bilgi elde etmek için yardımcı olur. Bu temel karakterizasyonu ve luciferases ve ilgili enzimler karşılaştırılması alternatifler zaten kurulmuş muhabir sistemleri için geliştirilmiş istikrar ve etkinlik neden olabilir.
Protocol
1. tasarım, hazırlık ve lux Operon Escherichia coli olarak ifade
Not: Tablo malzemeleri ticari kitleri bu bölümde kullanılan hakkında bilgi için bkz.
- Lux operon E. coli aktarmak için uygun kısıtlama siteleri ve antibiyotik direnci gen (Örneğin, pET28a; ilgi ile standart bir evde beslenen hayvan vektör seçin NcoI, XhoI, sefaloridin).
- Parçaları tasarım ve astar Photobacterium mandapamensis 27561 DNA sıralamasına dayanan Gibson derleme için üst üste (GenBank: DQ988878.2).
- Bir standart PCR reaksiyon tasarlanmış astar ve Photobacterium mandapamensis 27561 izole genomik DNA ile şablon olarak ayarlayın (astar ve koşullar için Tamamlayıcı bilgileri konusuna bakın).
Not: Yalıtım ilgili bakteriyel baskı genomik DNA PCR etkinliğini artırır. - Spin-sütun arıtma üzerinden PCR ürün arındırmak.
- NcoI ve XhoI ile izole pET28a vektör 37 ° C'de bir kısıtlama hazım için 45 dk gerçekleştirin.
- Doğrusallaştırılmış vektör arındırmak ve PCR parçaları ile özel Jel Elektroforez ve sonraki spin-sütun arıtma.
- Her parça ve Doğrusallaştırılmış vektör DNA konsantrasyonu belirlemek ve derleme iletişim kuralı20,21göre en uygun miktarlarını hesaplamak.
Not: Derleme etkinliğinin parçası boyutu ve sayısı üzerinde bağlıdır ve üreticinin iletişim kuralı20,21göre ayarlanması gerekir. - Tüm parçaları ve PCR tüp arabellekte birleştirerek sonra 1 h 50 ° C'de bir PCR makinesi montaj karışımı kuluçkaya.
- E. coli bakteri plazmid dönüşümü içine uygun bir E. coli için Standart dönüştürme protokolleri göre monte vektör ürün dönüşümü sistemi yüksek verimli plazmid çoğaltma (Örneğin, E. coli TOP10 için veya XL-1)
- Koloniler dönüştürme plaka ve DNA izolasyonu için yeni plakalar üzerinde çizgi seç.
- Standart protokolleri göre plazmid DNA izole et.
- Bütün parçaları dahil olmak üzere plazmid doğru Meclisi doğrulamak için ilk birleştirilmiş her parçası için astar özel kullanarak standart iletişim kuralları göre bir koloni PCR gerçekleştirin.
- Ayrıca koloni PCR ve sonraki özel Jel Elektroforez için tüm izole montaj vektörel çizimler doğru montaj ve doğru DNA dizileri doğrulamak DNA sıralama için hazır olun.
- E. coli bakteri plazmid dönüşümü içine uygun bir E. coli için Standart dönüştürme protokolleri göre doğrulanmış plazmid dönüşümü sistemi için yüksek verimli protein üretim (coli e.g.,E. BL21).
Not: doğrudan ifade iletişim kuralıyla aşağıdaki devam. Daha uzun depolama için bir gliserol hisse senedi hazırlanması tavsiye edilir.
2. değiştirilmiş E. coli suşlarının ifade
- Bir gecede Kültür (Onkoloji) tarafından uygun bir farenin LB orta aşılama ifade için hazırlamak (Örneğin, 100 mL) önceden hazırlanmış gliserol hisse senedi monte plazmid ile ya da doğrudan doğruya--dan dönüştürülüyordu E. coli BL21 hücre ile bir dönüştürme plaka. 100 µL sefaloridin (50 mg/mL; pET28a antibiyotik direnci gen) ekleyin ve 37 ° C ve bir kuluçka Shaker 120 rpm ONC gecede kuluçkaya.
- ONC 8 mL ile (Örneğin, 800 mL LB orta) ana ifade kültürü aşılamak ve 800 µL sefaloridin (50 mg/mL) ekleyin.
- Hücre yoğunluğu 0,6 - bir OD600 ulaşıncaya kadar 37 ° C ve bir kuluçka Shaker 120 rpm Ana kültür kuluçkaya 0,8 (yaklaşık 2,5 h).
- İnkübasyon sıcaklığı 28 ° C'ye azaltmak
- Protein ifade 0,1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyerek teşvik.
Not: 28 ° c sıcaklık azalma yüksek ışık şiddeti verdi ampirik testler gösterdi. - (Yaklaşık 1 h) parlayan başlamak kadar hücreleri gözlemlemek.
Not: Bağlı olarak ifade amacı, hücreleri ertesi güne kadar yetişkin ve o zaman hasat veya hücreler olabilir (en fazla 48 h) parlayan vardır sürece sallayarak devam etti. Hücreleri ve arıtma herhangi bir proteinlerin hasat standart prosedürler göre yapılabilir.
3. bakteriyel kollarındaki suşları ifadesidir
Not: Bakteriyel kollarındaki suşları belirli büyüme orta/yapay deniz suyu orta büyüme ve ışık üretimi için gereklidir.
- Yapay deniz suyu orta, iki ayrı ayrı hazırlanan orta bileşenlerden oluşan hazırlayın.
Not: Yapay deniz suyu orta hazırlanması orijinal Protokolü22uyarlanmıştır. 1 L sıvı orta veya 1 L agar orta için aşağıdaki tutarlardır.- Yapay deniz suyu orta için aşağıdaki tuzları tartmak: 28.13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1.60 g CaCl2 · 2H2O, 4.80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3ve 3.50 g MgSO4 · 7H2O.
- 1 L distile su ekleyin ve tüm bileşenleri geçiyoruz.
- LB orta için aşağıdaki maddeler içinde ağırlık: 10 g maya ekstresi, 10 g pepton ve ağar kaplamalar, bir ek 20 g agar için.
- Musluk suyu 250 mL ekleyin ve bileşenleri geçiyoruz.
- Otoklav her iki medya ayrı ayrı 121 ° C'de 20 min için hazır.
- Ağar kaplamalar, 250 mL LB orta yapay deniz suyu orta 750 mL ile doğrudan ısıyla sonra birleştirmek ve tabak hazırlamak.
- Sıvı orta için 250 mL LB orta ısıyla hemen sonra ya da soğuduktan yapay deniz suyu orta 750 mL ile birleştirin.
Not: Yapay deniz suyu orta tuz yağış bulanık alabilirsiniz.
- Bakteriyel kollarındaki suşları yapay deniz suyu orta agar plakalar üzerinde çizgi ve gecede 24-30 ° C'de kuluçkaya
Not: Uzun zaman depolama bakteri suşlarının normalde gliserol stokları bakteriyel kültürünün dondurma aracılığıyla elde edilir. Suşların her zaman ilk kullanım nedeniyle çözdürme sonra büyüme gecikme aşamasında sıvı kültürleri için önce tüm suşları için Tekdüzen başlangıç koşulları sağlamak için agar plakalar üzerinde çizgili. - Bir Onkoloji 100 mL yapay deniz suyu orta bir koloni plaka ile aşı hazırlayın. 24-30 ° C ve bir kuluçka Shaker 120 rpm ONC gecede kuluçkaya.
- Yapay deniz suyu orta 800 mL ONC 8 mL ile aşılamak.
- 24-30 ° C ve bir kuluçka Shaker 120 rpm bakteri hücreleri kuluçkaya.
Not: Işık şiddeti profil kollarındaki bakterilerin şiddetle sıcaklık ile değişir. İlgili bakteriyel zorlanma ışık üretimini düzenleyici mekanizmaları bağlı olarak, ışık emisyon yaklaşık 1-6 h sonra başlayabilir. - (Yaklaşık 1-6 h) parlayan başlamak kadar bakteri hücre kültür gözlemlemek.
Not: Bağlı olarak ifade amacı, hücreleri ertesi güne kadar yetişkin ve o zaman hasat veya hücreler olabilir onlar parlayan vardır sürece sallayarak devam etti. Hücreleri ve arıtma herhangi bir proteinlerin hasat standart prosedürler göre yapılabilir.
4. Vivo içinde faaliyet tahlil bakteriyel kollarındaki suşları ve değiştirilmiş E. coli suşları için
Not: Uzun süre suşları normalde gliserol stokları bakteriyel kültürünün dondurma ile acieved saklanmasıdır. Suşların her zaman ilk kullanım nedeniyle çözdürme sonra büyüme gecikme aşamasında sıvı kültürleri için önce tüm suşları için Tekdüzen başlangıç koşulları sağlamak için agar plakalar üzerinde çizgili.
- Çizgi istenen kollarındaki bakteriyel zorlanma veya değiştirilmiş E. coli agar plaka üzerinde gerginlik ve 28 ° C'de gecede kuluçkaya.
Not: Kuluçka sıcaklık zorlanma zorlanma değişebilir ve ampirik olarak değerlendirilmek üzere vardır. Değiştirilmiş ve kollarındaki bakteri suşları karşılaştırmak için E. coli suşları, büyüme koşullar aynı olması gerekir. - Bir koloni bir agar plaka ile ilgili zorlanma ile orta 3 mL aşılamak ve 28 ° C ve yaklaşık 1-2 h için bir kuluçka makinesi Shaker 180 rpm hücreleri kuluçkaya.
- 1:10 hücre yoğunluğunu ölçmek seyreltme sıvı kültür, 650 nm. Oranı ve birim 0,05 OD650 ile 1 mL kültür için hesaplar.
Not: Sonraki plaka okuyucu tahlil 650, hücre yoğunluğu belirleyecek nm suşları ışık emisyon tarafından önlemek için. - Cam alt ile 24-şey siyah duvarlı plaka içine kültür ve orta hesaplanan hacmi pipette. Değiştirilmiş E. coli için zorlanma, sefaloridin (pET28a vektör antibiyotik direnci) 1 µL ve IPTG (gen ekspresyonu İndüksiyon) 1 µL örnekleri için ekleyin. Ölçümler sırasında buharlaşma önlemek için plaka üzerinde bir kapak koyun.
Not: bütün lux operon içeren pET28a vektör E. coli kültüründen kaybolmak değil ki sizi temin ederim ki, sefaloridin E. coli örnekleri E. coli ışık üretim temin etmek için ve plaka Wells için eklemeniz gerekir hücreleri ölçülebilir, gen ekspresyonu IPTG tarafından indüklenen gerekir. Çapraz karışma ve ölçüm girişimi engellemek için en iyi sonucu cam alt ve şeffaf kapak ile iyi tabak siyah duvarlı gösterdi. Yine de, crosstalk gözlenen ve iyi pozisyonlar özenle seçilmiş zorunda. - Ölçüm bir plaka okuyucu olarak başlatın.
Not: Özel olarak geliştirilen bir el yazısı plaka okuyucu Protokolü dayanmaktadır Bu tahlil için (bkz. Ek malzeme) bu iki ölçüm, absorbans ve bioluminescence birleştirir. Veri noktaları ile kalıcı sallayarak ölçümleri ve 28 ° c sabit sıcaklık arasında her 10 min toplanır
Representative Results
Lux operon - luxCDABFEG - gen sırasını çeşitli suşları2,5,14üzerinde son derece korunmuş. Plazmid tasarım, sırası bilgi kollarındaki bakteriyel zorlanma Photobacterium mandapamensis 27561 çekildi ve gen siparişi aynı tutuldu ve, Ayrıca, arasında tek gen kodlamayan diziler kabul edildi. Uygulamalı Gibson klonlama strateji şematik bir bakış Şekil 2' de tasvir edilir. Toplam, luxCDAB, luxF, luxEG, ve ribEBH, dört parçaları ile 20-40 baz çifti dizileri örtüşen üretildi. Gibson derleme20tüm adımları uyguladıktan sonra DNA sıralama bütün parçaları dahil olmak üzere plazmid, doğru Meclisi doğruladı. Lux-kaburga operon içeren vektör Haritası son montaj ürün pET28a Şekil 3' te tasvir edilir. Kullanımı bu değiştirilmiş pET28a vektör önemli bir avantaj olduğunu E. coli büyüme koşulları standart ve indüksiyon IPTG ile kontrol edilir.
Kollarındaki bakteri ve ilgili hücre yoğunluğu ışık emisyon ölçmek için bir plaka okuyucu müstenit yöntem geliştirilmiştir. Plaka okuyucu için yöntem ışık yoğunluğu ve hücre yoğunluğu için tek ölçüm komut dosyaları birleştirerek oluşturuldu. Bu yeni komut dosyası OD650 ölçümü etkin ve zaman dilimi, oluşturma süresi (Örneğin, 10 h) ilgili çözümlemesi için kullanılan bakteri için ayarlanacak olan ışık şiddeti her 10 min için bir Kullanıcı tanımlı. Optik yoğunluğu ölçümü 650 gerçekleştirildi nm ışık emisyon girişimi engellemek için. Bir kanıtı kavramı ve sağlık ve E. coli hücrelerinin doğru büyüme davranışı sağlamak için olarak, başvuru ölçümleri yapıldı. Şekil 4 E. coli BL21 hücreleri, bir boş pET28a vektörü içeren E. coli BL21 hücreler ve E. coli BL21 hücreleri içeren pET28a vektör lux-kaburga operon ile karşılaştırılması Ekle sunulmaktadır. İkinci baskı için hiçbir IPTG leakiness nedeniyle ışık emisyon T7 düzenleyicinin analiz etmek için eklendi. Tüm üç başvuru ölçümleri üç büyüme fazları (gecikme, üstel ve sabit faz) ile sigmoidal büyüme eğrisi göster. Sadece pET28a vektör ışık yayması için lux-kaburga operon Ekle başlaması ile birlikte, ama aksine ölçümleri içeren E. coli BL21 hücreler nerede ifade IPTG ve ışık eklenmesi tarafından indüklenen 30 dk sonra sigara kaynaklı hücreler duyulur sadece yaklaşık 5 h sonra parlaklık ve bir çok daha düşük ışık emisyon göstermek başlar (ca. 4-fold) indüklenen sisteme göre.
Şekil 5 büyüme eğrilerinin karşılaştırılması ve E. coli ve kollarındaki bakteriyel zorlanma P. mandapamensis 27561, LB orta veya yapay deniz suyu orta ifade lux operon ışık yoğunluklarda verir, Roman kullanarak situ yöntemi kurulmuş. Bu bakterilerin karşılaştırmak için ölçümler bir kuluçka 28 ° c sıcaklığında yapıldı Bu sıcaklık azalır değiştirilmiş E. coli büyüme hızının zorlanma LB orta yanı sıra yapay deniz suyu orta ama kollarındaki bakteri suşları daha düşük sıcaklıklar için büyük önem taşımaktadır. P. mandapamensis 27561 E. colidaha çok daha yüksek bir hücre yoğunluğu gösterdiği gibi bu sıcaklık bağımlılık Şekil 5'A, görünür. Bundan başka E. coli suşları için üretimi LB orta bırakmak için doğal kollarındaki bakteri suşları, daha yüksek hücre yoğunluğu, yapay deniz suyu orta tercih edilen ve bioluminescence için gerekli. Kaydedilen hücre yoğunluğu ile ilgili hafif yoğunluklarını, Şekil 5' teBgösterildiği gibi aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Önemli, kollarındaki E. coli hücreleri ulaşmak benzer ışık emisyon maxima her iki LB orta hem de yapay deniz su ortamı, her ne kadar en yüksek yoğunluklarda farklı zaman noktalarda kaydedildi. Bu gözlem, aksine P. mandapamensis 27561 LB orta son derece düşük büyüme oranları ile uygun ama bakteri hücreleri tüm (Şekil 5B) ışık yayarlar değil. Yapay deniz su ortamı, P. mandapamensis 27561 1 x 10-4 sayıları yaklaşık 200 E. colidüşük bir faktör olan saniye başına en fazla ışık emisyon gösterir. Şekil 5 C bioluminescence OD tarafından nerede normalleştirilmiş göreli ışık birimleri temsil eder. Bu sonuçlar doğrulama sadece yapıldı bir plazmid ekleme içeren lux operon E. coli başarılı ve fonksiyonel, ama aynı zamanda bu E. coli değiştiren yük daha yüksek ışık emisyon ile geçerli bir alternatif olduğunu verimleri ve karmaşık bir deniz suyu gibi marina bakteriler bakteri biyolüminesans sınırlama olmaksızın Orta ve düşük sıcaklıklarda.
Ayrıca, dayalı E. coli lux-kaburga gen ekspresyonu 24 h üzerinden uzun vadeli bir ölçü belgili tanımlık uzun yaşam ışık emisyon (Şekil 6) çözümlemek için gerçekleştirildi. Işık emisyon 19.5 saat sürdü, çok daha uzun daha bakteri suşları (örn., P. mandapamensis 27561) kademeli bir düşüş nerede çok düşük ışık emisyon 10 h sonra sonuçlanan gözlendi.
Gelişmiş tahlil sınırlarını göstermek için Şekil 7 üç kollarındaki bakteri suşları, yani Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 ve Vibrio ölçüm sonuçlarını gösterir harveyi 14126. İlk zorlanma (S1) için bu yöntem çok iyi çalışıyor ve yaklaşık 2 x 106maksimal bioluminescence yoğunluğunu gösterir. Diğer iki suşları (TH1 ve 14126), her iki tarafından üretilen ışık şiddeti kullanılan araç ayarları algılama sınırını aştığından maksimal ışık şiddeti belirlenemiyor. Gelişmiş yöntemi (komut dosyası) bu iki suşlar için tanımlanan kazanç değeri çok yüksek ayarlandı. Yine de, bioluminescence etkinlik başlangıcı birbirleriyle karşılaştırılabilir. P. mandapamensis TH1 ve P. mandapamensis S1 başlatmak yaklaşık 1 saat ve bir OD650 değerini 0.1 sonra parlayan - 0.2, anılan sıraya göre. Buna ek olarak, harveyi V. 14126 1.0 bir OD650 değeri yaklaşık 5.5 saat sonra ışık yayması başlar. Işık emisyon gözlenen baslangici yanı sıra bioluminescence OD üstel artış eşlik ediyor. V. harveyi 14126 biyolüminesans yönetmelik algılama çekirdek altında yatan ve bu nedenle belirli bir hücre Şekil 713' te açıkça görülebilir lux operon aktivasyonu sağlayan yoğunluğu bilinmektedir. Bu roman situ ile plaka okuyucu tahlil kolayca kollarındaki bakteri karşılaştırmak ve aynı zamanda kabaca bir düzenleyici mekanizma bu suşların yönetmelik algılama bir çekirdek olup olmadığını belirleyerek tanımlamak mümkün olabilir bu sonucu gösterir ya da değil görülmektedir.
Şekil 8 E. coli BL21 hücreleri indüksiyon ile IPTG sonra lux operon içeren birleştirilmiş pET28a plazmid barındıran bir ifade kültürünün bir örneği gösterilir. İndüksiyon sonra yaklaşık bir saat sonra E. coli hücreleri mavi-yeşil renk ile parlayan başlamak. Şekil 8 A kültür fotoğrafı ışık ve Şekil 8B verir aynı kültür karanlıkta E. coli ifade gösterir. Şekil 8 C bir agar plaka P. mandapamensis S1 bakteriyel bioluminescence için aynı mavi-yeşil renk karakteristik karanlıkta parlayan ile yapay deniz su ortamının gösteriyor.
Resim 2 : Strateji klonlama uygulanan Gibson şematik gösterimi. Adım (ı): (renkli oklar; ca. 20-40 baz çifti üst üste) Overlapping astar tasarlanmıştır. Üst üste gelen astar tavlama sıraları oluşan bir parçasının ilgili 5' ve 3' bölge ve bitişik kesiminin ilgili 3' ve 5' bölge içerir. Adım (II): Derleme için tasarlanmış parçaları standart PCR reaksiyonları ile oluşturulur. Adım (III): Hedef vektör (Örneğin, NcoI, XhoI) kısıtlama sindirim tarafından Doğrusallaştırılmış. Adım (IV): Tüm parçaları ve Doğrusallaştırılmış vektör DNA konsantrasyonları Gibson derleme (göre üreticinin iletişim kuralı) için uygun toplama ayarlamak kararlı olmak zorunda. Adım (V): Tüm parçaları ve en iyi duruma getirilmiş DNA konsantrasyonları ile Doğrusallaştırılmış vektör Gibson derleme ana karışımı ile (T5 eksonükleaz aktivitesi, DNA polimeraz ve DNA ligaz) birleştirilir ve 1 h için 50 ° C'de inkübe adım (VI): derleme ürün dönüştürüldükten uygun bir E. coli içine standart protokolleri göre yüksek verimli plazmid çoğaltma (Örneğin, E. coli TOP10 veya XL-1) için zor. Adım (VII): Plazmid doğru Meclisi doğrulamak için birleştirilmiş plazmid DNA sıralama yapılması gerekiyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Lux-kaburga operon içeren vektör harita pET28a. P. mandapamensis 27561 lux-kaburga operon pET28a orijinal gen sırayla (luxCDABFEG-ribEBH) birden çok klonlama sitenin eklenir. Klonlama için kullanılan kısıtlama siteleri NcoI ve XhoI vardır. Operon Gibson montaj için kullanılan luxCDAB turuncu, yeşil luxF , luxEG mavi ve ribEBH lavanta oluşuyor; genlerde bir parçası ayrı bir kutu gösterilir. Arasında operon her gen kodlamayan diziler uygulanan klonlama stratejisinde yer almaktadır. Bütün lux-kaburga operon içeren son plazmid pET28a 14,625 baz çifti uzunluğundadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Büyüme eğrileri ve başvuru suşlarının ışık yoğunluklarda karşılaştırılması. OD, 650 nm ve sayıları saniyedeki bioluminescence şiddeti her 10 min 10 h 28 ° C'de üzerinden ölçülen Tüm ölçümler ile dört teknik çoğaltır her üç biyolojik çoğaltır ortalama değerleridir. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. E. coli BL21 hücreleri (gri kareler), boş bir pET28a içeren E. coli BL21 hücreler (gri daireler) vektör ve E. coli BL21 hücreleri içeren pET28a vektör lux-kaburga operon eklemek (siyah elmas) ile analiz edildi E. coli hücrelerimizin davranışını doğru büyüme sizi temin ederim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Büyüme eğrilerinin karşılaştırılması ve lux operon ışık yoğunluklarda 27561 (daireler) LB Orta (açık sembolleri) veya yapay deniz suyu Orta (dolgulu semboller) ifade E. coli (kare) ve P. mandapamensis . Tüm ölçümler ile dört teknik çoğaltır her üç biyolojik çoğaltır ortalama değerleridir. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Tüm deneylerin bir kuluçka 28 ° c sıcaklığında yapıldı (A) optik yoğunluk (OD) ölçülerde 650 nm gerçekleştirilen her 10 min için 10 h. E. coli lux operon ifade (sol panelde) P. mandapamensis için 27561 (doğru kapı aynası) LB orta ve yapay deniz su ortamda karşılaştırılır. Hücre yoğunluğu belirlenir 650 nm bioluminescence girişimi engellemek için. (B) 10 h. E. coli lux operon ifade (sol panelde) P. mandapamensis için 27561 (doğru kapı aynası) içinde LB karşılaştırılır için ışık şiddeti (bioluminescence [sayar/s]) ölçümü her 10 min gerçekleştirildi orta ve yapay deniz su orta. (C) göreli ışık yoğunluklarda (RLU/OD) E. coli (sol paneli) ve P. mandapamensis 27561 (doğru kapı aynası) ifade lux operon bioluminescence hücre yoğunluğu için normalleştirme tarafından belirlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Büyüme eğrilerinin karşılaştırılması ve E. coli ışık şiddetlerde göre lux gen ekspresyonu 24 h için OD, 650 nm ve sayıları saniyedeki bioluminescence şiddeti her 10 min 24 h 28 ° C'de üzerinden ölçülen Tüm ölçümler ile dört teknik çoğaltır her üç biyolojik çoğaltır ortalama değerleridir. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Ayrıca, nerede bioluminescence hücre yoğunluğu tarafından normalleştirilmiş göreli ışık yoğunluklarda (RLU/OD) temsil edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Potansiyel çekirdek yönetmelik algılama değerlendirmek için karşılaştırma kollarındaki bakteri. Işık emisyon ve hücre yoğunluğu her 10 min 10 h için ölçülür ve dört teknik çoğaltır her ile üç biyolojik çoğaltır Ortalama değerlerini temsil eder. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Photobacterium mandapamensis TH1 ölçümleri (siyah kareler), Vibrio harveyi 14126 (gri daireler) ve Photobacterium mandapamensis S1 (gri elmaslar) karşılaştırıldığında birbirine; (A) tasvir optik yoğunluğuna (OD) 650 nm, (B) ışık yoğunluğu (bioluminescence [sayar/s]) ve (C) göreli ışık yoğunluklarda (RLU/OD). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Bioluminescence sıvı medya ve ağar kaplamalar. (A) 5 L şişe 2 L LB orta ile aşılanmış ışığında fotoğrafı pET28a lux operon plazmid ifade E. coli BL21 hücreleri ile. (B) karanlıkta fotoğrafı aynı Kültür (A) olduğu gibi. Fotoğraf A ve B yaklaşık 2 h ifade indüksiyon sonra çekildi. (C) yapay deniz suyu orta agar plaka karanlıkta fotoğraflandı P. mandapamensis S1 çizgili kültürü ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
P. mandapamensis 27561 bütün lux-kaburga operon birçok parçalardan oluşan dört parçaları içeren bir ifade plazmid inşaatı Gibson klonlama elde edildi. Bu dayalı E. coli lux gen ekspresyonu E. coli hücreleri ışık yayılmasını sağlamak sağlar. Yönetmelik ve standart olmayan büyüme koşulları algılama çekirdek kaçınarak bu sistemin önemli avantajlar vardır.
Gibson klonlama strateji kullanmanın yararları birden çok doğrusal DNA parçalarının, yüksek düzeyde esneklik ve belirli kısıtlama siteleri18,19,20gerek yok kolay montaj vardır. Bu yöntem tek gen veya gen kümeleri hariç veya yeni genlerin tanıtan veya başka bir ile bir zorlanma gen alışverişi lux operon, kolayca değiştirmenizi sağlar. Durumu ilgili lux operon gen dizisinin bu yöntemin uygulanması için bir önkoşuldur. Sadece az sayıda kollarındaki bakteri için ilgili lux operon tam DNA dizisi bilinen ve/veya kullanılabilir. Çünkü onlar av tüfeği sıralama kullanarak oluşturulan bu dizilere çoğunun parçalanmış. İncelenen P. mandapamensis durumunda 27561 lux operon tam DNA dizisi bilinen ve NCBI gen veritabanı edinilebilir (GenBank: DQ988878.2).
Gibson derleme protokolündeki bir kritik adım tek parçaları DNA konsantrasyon hesaplaması olur. Üreticinin Bu 0,2 - kullanmak için tavsiye edilen derleme protokolündeki 0.5 pmols ve 4-6 parçaları20,2120 µL toplam hacmi. Nerede luxCDABFEG-ribEBH 4 parçaları oluşur, bizim durumumuzda konsantrasyonları ve toplam birimleri 0.1 pmol ve 45 µL, sırasıyla, PCR ürünleri verim bağlı olarak idi. Bir yandan, konsantrasyonu azalır gerekiyordu ve öte yandan, birimin artmış gerekiyordu. Yine de, derleme çok iyi çalıştı ve DNA sıralama ilk girişiminde doğru ekleme doğruladı. Bu bulgu Gibson derleme kolayca tarihinde18,19,20olabilir araştırmalarımız için sağlam ve uygun bir yöntem olarak doğruladı.
Yeni kurulan plaka okuyucu tahlil yöntemi işlemek bir kolay. Yeni basit bir birincil analizini etkinleştirir veya (BM-) bilinen kollarındaki bakteri suşları ve verir zaten hafif üretim (Örneğin, düşük hücre yoğunluğu, ışıma lag) düzenleyici mekanizma bir ilk ipucu. Ayrıca, ışık üretimi ile birlikte büyüme koşullarına kolayca sadece büyüme orta veya sıcaklık değiştirerek değerlendirilebilir.
Ölçümleri plaka okuyucu ile 28 ° C'de gerçekleştirilmiştir Bu alışılmadık ayarı nedeni 30 ° C üzerindeki sıcaklıklarda daha az hatta yok büyüme ve / veya ışık emisyon için nereye kollarındaki bakteri suşları, sıcaklık hassasiyeti var. Unutmayın, plaka okuyucu tanımlanmış bir sıcaklık kayıp bir sınırlama ile zaman içinde aktif soğutma sistemi saklamaktan yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, ortam sıcaklığı ölçümü sıcaklık altında olmalı.
Kavramının bir kanıtı olarak E. coli yapı kollarındaki zorlanma ile karşılaştırılması P. mandapamensis (Şekil 5) bir yandan ve başvuru ölçümleri (Şekil 4) öte yandan gerçekleştirilen ve onaylamak Bu yeni kurulan sistemin güvenilirliği. Ayrıca, uzun vadeli ölçüm ışık emisyon (Şekil 6) uzun ömürlü güvence verdi. Ama OD değerleri güvenilir bir optik belirli yoğunluk, nerede uygun bir seyreltme gerekli bir ölçüm için kullanılan ölçüm cihazı (yaklaşık 15 h mevcut durumda) özelliklerine bağlı olarak yukarıda değildir düşünün zorunda Dedektör doğrusal dizi. Bu yüksek farklarını OD değerleri bu uzun zaman ölçümleri değil güvenilir olun. Bu nedenle, 10 h gibi daha kısa ölçümleri deneysel kurulumu kullanarak rapor burada tavsiye edilir.
Şekil 7' de kurulan plaka okuyucu tahlil sınırlamaları görülebilir. Zorluk ölçü uygun bir ortam bulmak mümkün. 'Kazanç değeri' fotoğraf çarpanı tüp (PMT) duyarlılığını ayarlar. Daha yüksek bir kazanç faktörü sinyali artacaktır anlam Devresel_ödeme, sinyalin amplifikasyon kazanç olduğunu. Kazanç çok düşük ayarlanmışsa, sinyal-gürültü oranı daha büyük olur ve "düşük" parlayan kollarındaki bakteri ışık yoğunluklarda olamaz sıfıra, değil gösterilen veriler yakın herhangi bir daha fazla (sinyal) ölçülür. Kollarındaki tahlil mücadelesine ölçüm sonuçları tüm bakteri suşları için araç aralığında kalmak kazanç ayarlamaktır. Ayrıca, ışıma ölçüm aralığı ölçüm aralığı zaman bağlıdır (Örneğin, en fazla 1 için 2.000.000 s).
Kazanç için 2800, hangi ampirik olarak test edilmiş ve bu yöntem kurulması için kullanılan özel plaka okuyucu için seçilen kuruldu. Kullanılan kazanç ayarı en fazla verilmiş ışık kayıt kollarındaki tarafından sağlayan E. coli sistemi, P. mandapamensis 27561 ve P. mandapamensis S1 bir taşma olmadan, ama suşları P. mandapamensis TH1 ve için Harveyi V. 14126 kazancı çok yüksek. Bu nedenle, bu ikinci suşları algılama sınırını aşan ve gerçek maksimal ışık şiddeti ölçülemez. Bu teknik sınırlama büyüme koşulları ve hücre yoğunluğu karşılaştırılabilir olabilir, ancak yüksek çeşitleri içinde en fazla ışık emisyon, göstermek kollarındaki bakteriler, karşılaştırılması engelleyebilir.
Ampirik olarak değerlendirilmek üzere kullanılan iyi tabak içinde analiz bakteri suşlarının konumlandırma vardır. Her ne kadar iyi pilakalar siyah ve cam dipleri kullanıldı, crosstalk örnek arasında gözlendi. Belirli suşları ışık yoğunluğu çok yüksek, tüm komşu wells yanlış pozitif ışık emisyon (Örneğin, boş) gösterecektir. Bu nedenle, iki farklı suşları ayrı ayrı ya da birbirlerine belirli bir uzamsal ayırmalı ölçmek önemlidir.
Zaten birçok lux operon bölümlerini içeren bilinen E. coli suşları ve esas olarak uygulama odaklı15,16,17değiştirilebilen vardır. Yöntem tanımlamak burada, temel araştırma, örneğin her lux gen ayrı ayrı analiz imkanı nişan al. Bioluminescence araştırma uzun bir geçmişi olmasına rağmen hala birçok açık sorular vardır. Hariç veya genlerin lux operon tanıtmak, başka bir soy genler ile luxAB gen alışverişi veya protein analizi kompleksleri, gömülü kolay E. coli sistem ve daha fazla uygulama plaka işlemek için okuyucu tahlil, düzenleyici işlemler ve lux genlerin fonksiyonları hakkında daha fazla bilgi elde etmek olasılığı vardır.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Plaka okuyucu için kendini yazılı komut kurulmasında onun desteği için Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Avusturya tarafından desteklenen "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) ile saatleri (P24189) ve doktora programı "DK moleküler Enzimologiya" (W901) için PM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
| Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
| GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
| Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
| GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| 24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
| FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
| Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
| Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |
References
- Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
- Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
- Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
- Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
- Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
- Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
- Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
- Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
- Meighen, E.
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
- Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence living lights, lights for living. , Harvard University Press. (2013).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
- Atlas, R. M. Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , CRC Press. (2004).
