Summary
Vi præsenterer en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop, og dens gennemførelse at sonde celle mekanik uden perler i Drosophila embryo.
Abstract
Morfogenese kræver koordinering mellem genetiske mønstre og mekaniske kræfter håndfast forme celler og væv. Derfor er en udfordring at forstå morfogenetiske processer direkte måle cellulære styrker og mekaniske egenskaber i vivo under embryogenese. Vi præsenterer her, en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop, som tillader direkte anvende styrker på celle-celle kontakter af den tidlige Drosophila embryo, mens imaging med en hastighed på flere billeder per sekund. Denne teknik har den fordel, at det ikke kræver indsprøjtning af perler i embryo, normalt bruges som mellemliggende sonder som optisk styrker er udøvet. Vi detaljeret trin for trin gennemførelsen af opsætningen, og foreslå værktøjer til at udtrække mekaniske oplysninger fra forsøgene. Ved at overvåge fordrivelse af celle-celle kontakter i realtid, kan man udføre spænding målinger og undersøge celle kontaktpersoners reologi.
Introduction
Fosterudviklingen er en yderst reproducerbar proces hvor celler og væv deformere for at forme det fremtidige dyr. Disse deformationer har vist sig at kræve den aktive generation af styrker på celle niveau1,2. For at forstå morfogenetiske processer, hvorunder celler og væv ændre deres form, er det derfor nøglen til at vurdere de mekaniske egenskaber af celler involveret og måle kræfter i vævet under processen3,4 . Epitel lag, især i Drosophila, er blevet meget studeret deres kvasi-2D-geometri og deres let manipulation.
En række teknikker har således udviklet af os og andre til at vurdere epitelial mekanik i vivo under udvikling. Vi vil give et hurtigt overblik over de tre vigtigste teknikker, der anvendes i epitel væv. Laser ablation, en meget udbredt metode, giver mulighed for at afsløre den lokale mekanisk stress på celle vejkryds5,6,7,8 eller større skala9,10,11 ved at udføre lokale nedskæringer, der forstyrrer den mekaniske integritet af målet. Dynamikken i åbningen efter snittet giver oplysninger både om stress forudgående ablation og på reologi væv12,13. En ulempe ved laser ablation er, at det er invasive, da det kræver de lokale forstyrrelser af celle cortex. Derfor kan man kun udføre et begrænset antal ablations hvis man ønsker at bevare vævet intakt. En anden ulempe er, at ablations kun give relative skøn af spænding i celle kontakter, idet den indledende hastighed er afhængig af tyktflydende friktion, som ikke er kendt. Magnetiske manipulation er også blevet udviklet og anvendt i Drosophila, der involverer enten brugen af ferrofluids14 eller ultramagnetic Liposomer15. De kan give absolutte målinger16,17, men er også invasive i den forstand, at de kræver indsprøjtning af sonder på den ønskede placering. Dette kan være meget vanskelig afhængigt af systemet, som ikke altid er indstillet til præcise injektioner. En tredje teknik, fuldstændig ikke-invasiv, er kraft inferens18,19,20. Kraft inferens bygger på en antagelse om mekanisk ligevægt på triple point (tricellular vejkryds eller vertices), og gør det muligt for at udlede spændinger på alle celle-celle kontakter (og eventuelt pres i alle celler) ved at løse en invers problem. For spændinger giver hver vertex to ligninger (X og Y). Dette giver et stort system af lineære ligninger, som kan vendes på visse betingelser at vurdere spænding på alle celle kontakter. Mens denne metode er meget attraktiv, da det kun kræver en segmenteret billede og ingen ekstra eksperiment eller setup, dets nøjagtighed er endnu til at bestemme, og igen det kun indeholder relative værdier, medmindre en absolut kalibrering måling udføres.
For at overvinde nogle af disse begrænsninger, vi indfører i denne artikel en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop til at anvende kontrollerede styrker på celle skala i Drosophila melanogasterembryonale epitel. Optisk pincet har været brugt til mange biologiske applikationer herunder målinger på enkelt proteiner og manipulation af organeller og celler21. Her rapporterer vi anvendte kræfter i rækken af et par dusin pN, som er små endnu tilstrækkelig til at fremkalde lokale deformationer af celle kontakter og udføre mekaniske målinger i vivo. Vi bruger typisk vinkelrette afbøjning af celle kontakter, overvåget gennem en analyse af kymographs, skal vedrøre deformation kraft. Vigtigere, kræver vores setup ikke indsprøjtning af perler på den ønskede placering i væv, som Optisk pincet er i stand til direkte lægge kræfter på celle-celle kontakter. Kobling af den optiske pincet til en lys ark mikroskop gør det muligt at udføre hurtige imaging (flere billeder pr. sekund), som er meget mærkbar for en mekanisk analyse på kort tidsskalaer, og med reducerede fototoksicitet, siden belysningen af den prøven er begrænset til flyet i imaging22.
Samlede, Optisk pincet er en non-invasiv måde at anvende kontrollerede styrker på celle kontakter in vivo i Drosophila embryo og udtrække mekaniske oplysninger såsom stivhed og spænding i celle kontakter23, rheologiske egenskaber 24, og gradueringsfyld eller anisotropy spænding23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oprettelse af lys ark mikroskop
- Henvise til beskrivelse af opsætningen i tidligere publikation25.
Bemærk: Konfigurationen er sammensat af en opretstående mikroskop fase og en lys ark modul producerer en lys ark i det vandrette plan. Et 10 X excitation mål linse dirigerer arket lys ind i et glas kuvette (figur 4). Påvisning mål linse har en høj NA (1.1), som er nødvendig for effektiv pincet (se nedenfor).
2. oprettelse af stien Optisk pincet
Bemærk: Figur 1 giver en generel ordning af den optiske setup.
- Placer 1070 nm laser enhed og lave fiber på tabellen optisk med en V-clamp mount. Sikre, at fiber kollimatoren er parallelle med den optiske tabel (dermed vandrette) og at højden valgt her bliver højde for alle de optiske komponenter justeret på tabellen optisk.
Bemærk: 100 mm kan være et godt valg for denne højde. - Drej nøglen af den infrarøde laser enhed og tryk på knappen "Vælg" Slå justering markøren. Lyset har at være vandret udgående af fiber.
- Placer lukkeren i den optiske bane, og ordne det til tabellen optisk, således at den infrarøde laserstråle passerer blænde på udløseren. Sikre, at afstanden mellem tabellen optisk og midten af blænde af lukkeren er højden valgt i trin 2.1.
- Drej nøglen af udløserknappen controller, skal du vælge den manuelle tilstand med pile og tryk på knappen "Aktiver" for at åbne lukkeren.
- Sted, justere og lave de første Drejespoleinstrument spejl.
Bemærk: De to Drejespoleinstrument spejle er nødt til at være konjugeret til tilbage blænde af målet påvisning således at når en af spejlene roterende, laserstrålen ikke går ud af den tilbage blænde af målet. Bemærk, at afstanden mellem den første galvanometer og tilbage blænde af målet har beregnes for at vurdere placeringen af denne Drejespoleinstrument i forhold til mål (f1 + f1 + f2 + f2 + f3 + f3 + f4 + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = 1550 mm; fi = brændvidden af linsen n ° jeg). - Tænde Drejespoleinstrument strømforsyning. Sikre, at galvanometers er drevet til resten af justering-protokollen.
- Sæt af galvanometers til nul afbøjning (med NIMAX eller Optisk pincet software - se trin 3 for Drejespoleinstrument forbindelser).
- Sted, justere og lave relæ teleskopet består af de to objektiver med en brændvidde på 30 mm.
- Sted, justere og lave andet Drejespoleinstrument spejlet. Bemærk, at afstanden mellem de to galvanometers 4f = 4 x 30 mm = 120 mm (f = brændvidde).
- Placere og lave teleskopet.
Bemærk: Teleskopet er sammensat af to objektiver, der udvider strålen til bredde mindst lig med diameter på objektive linse tilbage blænde. Linse med den mindste brændvidde bør komme først. - Sted, justere og lave periscope bringe opad den optiske transmissionslængde tættere til indgangen af dichroic spejl jernbane.
- Fix varme spejlet i skinnen, placere skinnen i mikroskopet. Sikre, at skinnen er savet i højre side at tillade indgangen af infrarød laser (figur 2).
- Kontroller, at laserlys går ud af mikroskop, først uden mål derefter med formålet. Korrekt placering af laser før målet med den nederste spejl af periscope. Korrekt placering af laser efter mål med den øverste spejl af periscope.
- Sætte 1 µL af 500 nm fluorescerende perler i glas kuvette og der tilsættes 10 mL destilleret vand. Sætte kuvette under målet i kuvette indehaveren og Fokusér mål (Z position), således at målet rører vandoverfladen.
- Start erhvervelse hjemmelavet softwaren at kontrollere AOTF, kameraet og den piezoelektriske fase. En gratis software som micromanager kan også bruges. Tænd levende erhvervelse mode ved at trykke på "Live" push-knappen.
- Justere IR laser power 1 W.
-
Sætte på beskyttelsesbriller (og fjern det ikke før slutningen af forsøget) og tænd for laseren. En perle skal være fanget på laser fokus.
- Hvis ingen perle er fanget på laser fokus, tjekke hvis rød laserpointer (som er kolineære med IR laser) er på vej ud af målet. Hvis ikke, starte igen justering trin, især trin 2.13. Eller øge IR laser power.
- Hvis perle er fanget ude af fokus (af imaging flyet), forsigtigt flytte placeringen af den sidste linsen af sidst teleskop (L4 i figur 1) langs den optiske akse at bringe perle i fokus med den billeddiagnostiske fly. Hvis ikke nok, flytte den første linse af sidst teleskop (L3 i figur 1) langs den optiske akse.
- Hvis fanget perle ikke er centreret i billedet, skal du bruge 2 periscope spejle til at justere placeringen af fælden. Hvis placeringen af perlen er ændret ved at ændre vinklen på det første spejl, også kompensere retning af strålen ved at ændre den tilsvarende vinkel i den anden spejl. Rette X placeringen kun (1 skrue for hvert spejl), og derefter korrigere Y position (1 skrue for hvert spejl).
- Hvis det er nødvendigt, justere placeringen af 2nd teleskop objektivet at observere perle i fokus.
- Hvis det er nødvendigt, justere vinklen på periscope spejle til at have den perle centreret i billedet.
3. en grænseflade instrumentet
Bemærk: Figur 3 giver en generel ordning af de nationale instrumenter (NI) Card forbindelser.
- Indsæt kortet output (NI-9263) i det første slot i kabinettet (cDAQ-9178). Bemærk, at andre modeller af NI kort med mindst 2 analoge udgange og 3 analoge indgange kan bruges.
- Indsæt kortet input (NI-9215) i det andet slot af kabinettet.
- Tilslut den første Drejespoleinstrument til analogt udgang AO0 og det analoge input AI0 med BNC kabler. Bemærk, at en T-adapter kan bruges til at forbinde 2 BNC kabler til en. Se i brugervejledningen til den Drejespoleinstrument at lokalisere benene på Drejespoleinstrument driver board.
- På samme måde, skal du tilslutte den anden Drejespoleinstrument til AO1 og AI1.
- Tilslut PFI1 til udløser IN på udløseren (bagsiden af controlleren).
- Tilslut PFI0 til brand i kameraet og til AI2.
- Tilslut AI3 til udløseren ud af lukkeren (bagsiden af controlleren).
- Justere indstillingerne for udløserknappen controller. Brug pilene til at ændre parameterværdier og tryk på "Vælg" for at validere valget og videregive til de næste parameter. Sætte "tid åbne sec" parameter til 000.000, "tid lukket sec" til 000.000, "mode" SINGLE og "trigger" til EXT. Tillad kontrol af lukkeren ved at trykke på knappen "Aktiver".
- Åbne QtCreator (hentet fra https://www.qt.io/, gratis version).
Bemærk: QtCreator er den integreret udviklingsmiljø bruges til at udvikle i C++ Optisk pincet software. QT-bibliotek bruges her til at skabe widgets. - Åbne filen OT.pro (leveret i Qt kodefiler). Denne aktion vil åbne projektet. Ændre navnet på input og output i AOGenerator.cpp fil efter NI Card (s), der bruges.
- Kompilere og køre OT software.
4. kalibrering af den optiske fælde holdning med perler
-
Optagelse af en kalibrering film
- Sætte 1 µL af 500 nm rød fluorescerende perler i glas kuvette, derefter udfylde kuvette med 10 mL destilleret vand. Figur 4 giver et overblik over kuvette i forbindelse med observation.
- Fix kuvette på den piezoelektriske scene.
- Juster Z stilling i kuvette, så påvisning mål dypper i vand.
- Tænd den infrarøde laser og Indstil magt til 1 W.
- Slå billede erhvervelse software.
- For at erhverve tid lapse billeder, skal du vælge eksponeringstiden, gain, tiden mellem to billeder, antallet af billeder der skal erhverves, og laser power. Bemærk at for optisk pincet kalibrering med perler, belysningen laser (561 nm) er ikke påkrævet. 2-foton effekt induceret af den infrarøde laser er nok til at vække fluorescens af en fanget perle.
- Start den optiske pincet hjemmelavede software.
- Angive parametrene optiske pincet til at spore en cirkel. Angive SamplingRate 250 samp/s, bufferSize som 1000, Waveform1 parametre (galvo 1) som Sinusoidal, nbPeriod 1, amplitude 0,5 V, fase 0.0 rad, Offset 0,0 V, bølgeform 2 parametre (galvo 2) som Sinusoidal, nbPeriod 1, amplitude 0,5 V, fase 1.57 rad, Offset 0,0 V.
- Check boksen "AI parametre", og "Vent til det"... boks.
- Start billede erhvervelse (500 eller 1000 billeder med en høj billedhastighed, såsom 10 fps).
- Tænd den optiske pincet ved at trykke på knappen "Generering!".
- Tillad fanget perlen til at udfylde mindst to fulde cirkler og stoppe den optiske pincet af un-presserende den "generering!" knappen.
- Stoppe billede erhvervelse. Bemærk, at en tiff film og en tekstfil med Drejespoleinstrument spændinger er oprettet i standarden "C:/TEMP /" mappe (medmindre en brugerdefineret placering er angivet). Bemærk, at flere kalibrering film med tilhørende datafiler kan oprettes, hvis nødvendigt.
- Hvis cirklen ikke er komplet, er perle tabt under cirkel bane. Måske er hastigheden for høj. Mindske det ved faldende samplingfrekvens i OT software. Eller bruge den røde laserpointer af den infrarøde laser, tjekke hvis laseren kommer ud af mål under hele kredsen bane. Hvis ikke, Drejespoleinstrument spejle kan ikke være konjugeret med tilbage brændplanet af formålet objektivet. Rette positioner af galvanometers i forhold til tilbage brændplanet af målet, starter igen justering trinene fra trin 2,5.
- Angive amplituder til nul og tænde laser til at fælde en perle på en fix position. Placer en milepæl på lokationen fælde.
-
Position interpolation med billedanalyse
- Åbne Matlab, gå til mappen kalibrering og køre scriptet "position2tension" (leveres i Matlab kodefiler). Dette script beregner funktionen interpolation oversætte Drejespoleinstrument spændinger til optisk fælde holdning.
- Vælge antallet af kalibrering film vil blive brugt. Flere film kan vælges med forskellige baner, som to vinkelrette ellipser. Generelt, en enkelt kalibrering film med en cirkulær bane er nok.
- Give den første og sidste billede tal i dialogboksen (én dialogboks per film) sekvenser med en klar bane og god signal / støjforhold.
- Give stien til den tekstfil, der indeholder spændinger under erhvervelse for hver film. Bemærk at scriptet læser filen og beregner de gennemsnitlige spænding af de to galvanometers for hvert billede.
- Give stien til den tilsvarende kalibrering film.
Bemærk: Scriptet registrerer perle for hver ramme med en subpixel opløsning ved at montere en 2D Gaussisk til perle, ved hjælp af brugerdefinerede funktioner og funktioner udvundet af MTT26. Det viser en graf, der viser den perle bane. - Fjerne ethvert dårligt detekterede punkt (outliers) ved at klikke på den.
- Tjek om interpolationen kort for x og y laser positioner beregnes og vises af scriptet er færdig. Hvis der er en masse af manglende værdier (hvide områder på kortet), Gentag handlingen med en ny kalibrering film, med et bedre signal til støjforhold, eller / og med en langsommere hastighed på galvanometers.
Bemærk: Disse billeder og interpolation værdier gemmes automatisk i samme mappe som billede med navn convertFct.mat.
5. montering Drosophila embryoner27
- Indsamle Drosophila embryoner fra et bur, inkuberes ved 25 ° C.
- Fjerne gær, passerer plade indhold gennem en sigte (porestørrelse bør være omkring 100 µm).
- Vaske embryoner med 100% blegemiddel (2,6% natriumhypochlorit) for 45 s for at fjerne chorion.
- Vask af embryoner med vand i 2 min.
- Sætte embryoner på en agar pad med en børste.
- Vælg ca. 10 embryoner efter det ønskede tidspunkt og justere embryoner med en gedde eller en fugtig pensel.
Bemærk: Justering bør udføres efter region af interesse (region af interesse så tæt som muligt til påvisning mål). - Ved hjælp af en diamant-mærkning pen, skære et stykke af et glas dias af 10 x 20 x 1 mm3.
- Tilføje lim på den ene side af den afskårne stykke, og lad det tørre for 20 s.
- Vend de afskårne stykke og placere den på linje af embryoner, at holde det på kanten af diaset.
- Installer denne forberedelse i prøveholderen og placere den i kuvette. Figur 4 giver et overblik over kuvette i observation sammenhæng.
- Sætte kuvette på den piezoelektriske scene.
6. fældefangst eksperiment In Vivo
-
Diffusering af celle kontakter — svingninger (figur 5)
- Find placeringen af interesse i vævet.
Bemærk: Ved hjælp af fluer, hvor cadherins er mærket kan være nyttigt, hvis man skal arbejde i flyet af adherens vejkryds. - Flytte målet krydset midtpunktet på trap position (landmark indstillet på trin 4.1.14) ved hjælp af piezo scenen.
- Angive parametrene fælde at opnå svingninger vinkelret på køreledningen. Angiv faserne som nul. Indstille amplituder i X og Y retninger at have en bevægelse vinkelret på køreledningen. Amplitude skal typisk 0,1 V.
- Start erhvervelse (med en hurtig billedfrekvens, såsom 10 fps).
- Tænd den optiske pincet at trykke på knappen "Generering!".
- Når du er færdig, skal du slukke pincet og stop billede erhvervelse. En film og en tekstfil med Drejespoleinstrument spændinger under erhvervelse vises nu i den angivne mappe.
- Diffusering af celle kontakter — pull-release (figur 6)
- Find placeringen af interesse i vævet.
- Flytte målet krydset med piezo-etape, så dens midtpunkt er typisk 1 µm fra trap position (landmark indstillet på trin 4.1.14).
- Indstille amplituder til 0 for at have en stabil fælde.
- Start billede erhvervelse (med en hurtig billedfrekvens, såsom 10 fps).
- Tænd den optiske pincet at trykke på knappen "Generering!".
- Efter det ønskede tidspunkt, slukke fælden og vente på afslapning at forekomme.
- Stoppe billede erhvervelse. En film og en tekstfil med Drejespoleinstrument spændinger under erhvervelse vises nu i den angivne mappe.
- Find placeringen af interesse i vævet.
-
Semi-automatiske kymograph generation og påvisning af positionen interface.
- I vinduet Matlab kommandoen indlæse interpolation kortet genereres under kalibrering procedure (4b): load('convertFct.mat'). Dette giver fx og fy variabler.
- Kør autokymo(fx,fy), leveres i Matlab kodefiler i kommandovinduet Matlab. Formålet med denne funktion er at generere en kymograph langs laser bane, og til at registrere placeringen af køreledningen med subpixel opløsning for hver ramme.
- Vælg stien bedt tekst fil der indeholder værdierne for spænding.
- Vælg den første og sidste ramme antal film der skal analyseres.
- Vælg tiff filmfil. To nye tal vil blive vist: den første er et billede af kymograph. Den anden er en graf for påvisning af de kontakte linje og laser positioner, versus billede nummer.
Bemærk: Funktionen gemmer den graf, der repræsenterer placeringen af prøven og laser versus billede nummer (matlab figur, jpg), kymograph (tiff-billede) og kymograph stilling med laser position (tiff-billede). Støt fælde eksperimenter har kymograph skal gøres manuelt, for eksempel ved hjælp af ImageJ. Påvisning af grænseflade fra kymograph kan derefter ske ved hjælp af den samme algoritme.
7. mekaniske målinger
-
Stivhed og spændinger målinger
- Foretage en svingning eksperiment (trin 6.1) og den tilsvarende analyse (trin 6.3) af tid bortfalder film.
- Plot interface stilling
som en funktion af den fælde holdning 
ved hjælp af Matlab plot funktion eller data plotte software.
Bemærk: Dette bør være ca lineær. - Udføre en lineær passer, ved hjælp af Matlab "ezfit" gratis værktøjskasse eller enhver software, så passer. Inverse af den pasform hældning giver den gennemsnitlige ratio
. - Udføre beregninger af den tilsyneladende bøjning stivhed af grænsefladen, som antager små deformationer og en kvadratiske potentiale for diffusering, er givet ved
. 
er den fælde stivhed (Se trin 8 til fælde stivhed kalibrering). - Udføre beregninger af spændinger, som kan defineres som23:
.
-
Rheologiske målinger
- Udføre pull release eksperimenter (trin 6.2) og den tilsvarende analyse (trin 6.3)
- Passe den resulterende kurve med den brugerdefinerede rheologiske model.
som en funktion af den fælde holdning 
ved hjælp af Matlab plot funktion eller data plotte software.
.
. 
er den fælde stivhed (Se trin 8 til fælde stivhed kalibrering).
.8. kalibrering af Trap stivhed
Bemærk: Bestemmelse af de absolutte styrker kræver kendskab til fælde stivhed på grænseflader. Dette kan tilgås ved hjælp af perler gennem en totrinsprocedure.
-
Bestemmelse af cytosol viskositet
- Placer embryoner i halocarbon olie og sprøjt dem ved hjælp af en mikroinjektion setup med fluorescerende polystyren perler (1:1, 000 stock fortynding, 0,46 µm diameter)23,27.
- Placer de injicerede embryoner under mikroskop.
- Spore bevægelser af enkelt perler findes i cytosol. Uddrag den kvadratiske forskydning af perler (bruge et stort antal baner > 100 perler). Bestemme konstanten perle diffusion fra hældningen af middelværdi forskydning. Vedrørende konstanten diffusion viskositet ved Stokes-Einstein ligning, udlede cytosol effektiv viskositet. I den tidlige embryoner er en viskositet på cirka 3,5 Pa.s rapporterede23.
-
Bestemmelse af trap stivhed på perler
- Fælde enkelt perler i cytosol med optisk pincet.
- Flytte perle i en trinvis måde mellem to fælde positioner adskilt af 0,5 µm
- Bestemme den fælde stivhed på perler, som forholdet mellem træk koefficient og perle afslapning tid i en trap position til den anden.
Bemærk: Træk koefficient er
, hvor 
er viskositeten bestemmes i (8.1) og 
perle radius. Afslapning tid er fremstillet af eksponentielle anfald af perle position, ved hjælp af Matlab eller enhver software, så passer. Typiske værdier af trap stivhed er 120 ±50 pN.µm-1 på 200 mW laser excitation.
-
Bestemmelse af trap stivhed på celle grænseflade
- Fokusere laseren på en køreledning, og aflede det (som beskrevet i trin 6). Måle deformationen amplitude. Dette bør gentages på flere kontakt linjer til at opnå et repræsentativt gennemsnit.
- Undersøg den producerede deformation med at induceret af perler skubbet mod kontakt linjer. Da deformationen er omvendt proportional med den fælde stivhed, udlede den fælde stivhed på celle kontakter.
Bemærk: Trap stivhed på celle kontakter var typisk findes 2 til 3 gange mindre end på perler (0,46 µm diameter).
, hvor 
er viskositeten bestemmes i (8.1) og 
perle radius. Afslapning tid er fremstillet af eksponentielle anfald af perle position, ved hjælp af Matlab eller enhver software, så passer. Typiske værdier af trap stivhed er 120 ±50 pN.µm-1 på 200 mW laser excitation.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 viser eksperimentelle data opnået ved at pålægge en sinusformet bevægelse at fælden. Fælden producerer en fordrejning af grænsefladen, som eksemplificeret af 3 snapshots viser 3 successive interface positioner (figur 5A)23. Optagede film bruges til at generere en kymograph (figur 5B) og analyseres yderligere for at bestemme placeringen af grænsefladen med subpixel opløsning, ved hjælp af en Gaussisk passer langs x-retning for hver ramme. Styret af små deformationer, fælde og interface positioner er proportionale (figur 5 c). Amplituden af den grænseflade afbøjning i forhold til fælde (fig. 5 d) giver adgang til interface spænding eller stivhed (Se trin 7.1).
Figur 6 viser eksperimentelle data opnået ved at udføre pull frigive eksperimenter. Den optiske fælde er tændt ca. 1 µm fra midtpunktet af grænsefladen mellem to celler, der forårsager grænsefladen til at aflede mod fælde position (figur 6A)24. Fælden er derefter slukket efter den ønskede mængde af tid. Position xm interface (fig. 6B) er fremstillet af kymographs (figur 6 c), igen ved hjælp af Gauss passer langs x-retning for hver ramme. Den resulterende graf kan sammenlignes med en hypotese rheologiske modeller, for eksempel, Maxwell model (figur 6D).
Figur 1: skematisk af opsætningen af optisk pincet (rød kurve) kombineret med lys ark mikroskop. Dette tal er blevet ændret fra Bambardekar, K. et al. 23. Lys ark mikroskop, komponeret af belysning enhed og påvisning enhed, der beskrives tidligere25. De optiske pincet svarer til den røde del af ordningen med: den infrarøde laser passerer gennem et optisk lukkeren og 2 galvanometers, som styrer placeringen af fælden i prøven. En 1-fold teleskopet er placeret mellem de 2 galvanometers at holde konjugation mellem dem. Derefter et teleskop øger størrelsen af stråle af 2.5-fold og periscope bringer det til højden af mikroskopet. Den infrarøde laser træder påvisning formålet med mikroskop takket være en dichroic spejl. Vigtigt afstande mellem optiske elementer er givet direkte i figuren. Afstanden mellem den sidste linse (focal længde 500 mm) og tilbage blænde af målet er 500 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: hjemmelavet modificerede jernbane holding dichroic spejle og det varme spejlet. Dichroic spejl jernbanen af mikroskopet er skåret på venstre side for at tillade indgangen til den infrarøde laser. Dichroic spejle afspejler det infrarøde lys og sender det synlige lys (Fluorescens). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tilslutning af instrumenter til NI kort. AO: analog output, AI: analog indgang, AO0 og AI0 er forbundet med galvo1, AO1 og AI1 er forbundet til galvo2, PFI0 er tilsluttet brand af kameraet, for at AI2 og PFI1 er forbundet til triggeren om udløserknappen og AI3 er forbundet til udløseren ud af lukkeren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: prøveholderen i forbindelse med observation. Dette tal er blevet ændret fra Chardès, C., mfl. 25. embryonerne er immobiliseret på glas coverslip. Diasset er i besiddelse af prøveholderen. Prøveholderen indsættes i glas kuvette, afholdt af indehaveren fast til den piezoelektriske fase. Arket lys er horisontalt og belyser embryoner fra siden. Påvisning mål linse er lodret over prøven, og dypper i kuvette.
Figur 5: Interface afbøjning af sinusformet bevægelse af fælden. Dette tal er blevet ændret fra Bambardekar, K. et al23. (A) fælden er flyttet sinusoidally vinkelret på grænsefladen. De fælde og interface positioner er xt og xm, henholdsvis. De rigtige paneler viser tre billeder af interface på forskellige positioner. Laser fælde position er markeret med en gul pilespids. Interface er mærket med en membran markør (GAP43::mcherry). (B) Kymograph langs aksen defineret af trap betjeningsanordningens (vinkelret på grænsefladen) (periode = 5 s). (C) repræsentative plot af indbøjningen versus tid viser både trap (røde streg) og interface positioner (sort streg). (D) grænseflade position som en funktion af trap holdning under par cyklusser af laser svingning (Amplitude = 0,5 µm, periode = 2 s). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Interface fordrejning af pull-release eksperimenter. Dette tal er blevet ændret fra Serge, A., mfl. 24. (A) fælden er tændt i en afstand fra midtpunktet af grænsefladen, så slukket igen. (B) de fælde og interface positioner er xt og xm, henholdsvis. Kymographs genereres langs x retning, vinkelret på køreledningens midtpunktet. (C) Kymograph af en pull-release eksperiment. Celle kontakter er mærket med Utrophin::GFP. (D) repræsentative plot af indbøjningen versus tid viser både trap (punkteret rød/grønne linjer) og interface position (sort streg). Den røde streg viser en pasform, der er fremstillet ved hjælp af en Maxwell-lignende rheologiske model24. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: Pincet eksperiment. Pixelstørrelse = 194 nm, 10 fps, fælde svingning periode = 2 s, mærkning: Gap43::mCherry. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optisk pincet gør det muligt for at udføre absolutte mekaniske målinger direkte i det udviklende embryonale epitel i en ikke-invasiv måde. I henseende præsenterer det fordele frem for andre metoder såsom laser ablation, som er invasive og giver relativ målinger, magnetiske kræfter, som kræver injektioner, eller tvinge inferens, som bygger på stærke antagelser og også give relative målinger.
Protokollen indeholder et par kritiske trin. Først, da formålet objektivet kan vise kromatisk aberration og at laser fælde skubber objektet "nedstrøms", er det vigtigt at kontrollere, at IR laser fælder perle i tænkelig plan, og til sidst korrekte for det (trin 2.18). For det andet bygger metoden på målinger af celle kontakter holdning. Det er således afgørende for at bruge en høj kontrast fluorescerende markør.
Kvaliteten af formålet objektivet og laserstrålen er afgørende for effektiv diffusering. Numerisk blænde af formålet objektivet bør overstige 1,0. Hvis diffusering er ineffektive, Sørg for, at laserstrålen fylder den bageste blænde på objektive linse.
Vores metode kommer med flere begrænsninger. Først, det er ikke klart, hvad præcis giver støtte til optiske diffusering. Selvom er fundet en uoverensstemmelse i brydningsindeks, stadig sin oprindelse skal fastlægges. Andet kan kalibreringsprocessen, hvis man er interesseret i absolutte målinger, være en smule trættende, da det kræver en passiv microrheology eksperimenter og kalibrering af trap stivhed på perler. Det er vigtigt at erkende, at kalibreringen af stivhed på celle kontakter er eksperimenterende usikkerhed: den bygger på målinger af trap stivhed på perler, som kan måles kun i i cytosol, men ikke i nærheden af celle kontakter. For det tredje er uklart hvordan alsidigt Optisk pincet kan være. Selv om de er i stand til at deformere celler i Drosophila embryo, kan andre væv præsentere højere spændinger eller vanskeligere adgang (såsom at gå gennem en kutikula) og derfor mindre modtagelig for optisk pincet.
Optisk styrker er små (< par snese pN) og kan være således utilstrækkelige til at deformere stiv eller meget spændte strukturer. Magnetiske pincet på store partikler ville sandsynligvis være mere effektive i dette tilfælde.
Vi beskrevet her kobling af optisk pincet til en lys ark mikroskop, men optisk pincet kan være koblet til andre typer af mikroskoper, såsom et epifluorescensmikroskop eller en Konfokal spinning disk mikroskop. Indførelsen af IR fældefangst laser i mikroskopet afhænger af konfigurationen af mikroskop. Det kræver først og fremmest mulighed for at tilføje en dichroic spejl for at kombinere stier for tænkelig og optisk manipulation. De fleste mikroskopi virksomheder foreslå modulære belysning systemer, med en to-lags modul, som giver mulighed for denne kombination.
Adskillige retninger der findes for at forbedre eller opgradere teknikken. En mulighed er at opdele laser opholdstid blandt flere positioner eller til at bruge mere avancerede holografisk teknikker til at producere flere fælder. Dette kan gøre det muligt for at oprette mere komplekse kraft mønstre på target-cellerne eller celle kontakter. En anden forbedring kunne være at udforme en real-time feedback mellem deformation forårsaget og placeringen af fælden. Dette kunne give ordentlig krybe eksperimenter hvor den kraft holdes konstant gennem hele eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (til P.-F.L.). Vi erkender Frankrig-BioImaging infrastruktur støttet af det franske nationale forskning agentur (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringer for fremtiden»). Vi takker Brice Detailleur og Claude Moretti fra PICSL-FBI infrastruktur for teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30 mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200 mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500 mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
References
- Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
