Summary
نقدم داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة خفيفة، وتنفيذه للتحقيق ميكانيكا الخلية دون الخرز في الجنين المورفولوجية .
Abstract
Morphogenesis يتطلب التنسيق بين القوات الميكانيكية لتشكيل قوة الخلايا والأنسجة والزخرفة الوراثية. ومن ثم تحديا لفهم العمليات morphogenetic مباشرة قياس قوات الخلوية والخصائص الميكانيكية في فيفو أثناء امبريوجينيسيس. نقدم هنا، داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة ضوء، مما يسمح لمباشرة تطبيق القوات على الاتصالات خلية الجنين المورفولوجية المبكر، بينما التصوير بسرعة عدة إطارات في الثانية الواحدة. ويمتاز هذا الأسلوب فإنه يحتاج إلى حقن الخرز إلى الجنين، عادة ما تستخدم كالوسيطة المسابير التي تبذل قوات الضوئية. ونحن بالتفصيل خطوة بخطوة في تنفيذ برنامج الإعداد، واقتراح أدوات لاستخراج المعلومات الميكانيكية من التجارب. برصد عمليات النزوح من خلية خلية الاتصالات في الوقت الحقيقي، يمكن للمرء إجراء قياسات التوتر والتحقيق ريولوجيا خلية الاتصالات.
Introduction
التطور الجنيني هو عملية استنساخه بشدة خلالها الخلايا والأنسجة التي تشوه شكل الحيوان مستقبلا. أظهرت هذه التشوهات تتطلب توليد النشطة من القوات في مستوى1،الخلية2. فهم العمليات morphogenetic خلالها الخلايا والأنسجة تغيير شكلها، هو ذلك المفتاح لتقييم الخواص الميكانيكية للخلايا المعنية، وقياس القوى داخل الأنسجة خلال3،العملية4 . وقد درست طبقات طلائي، لا سيما في المورفولوجية، على نطاق واسع سبب هذه الهندسة شبه 2D والتلاعب سهولة.
وهكذا وضعت عددا من التقنيات وغيرهم لتقييم ميكانيكا الظهارية في فيفو أثناء التطوير. وسوف نعطي لمحة سريعة عن التقنيات الرئيسية الثلاثة المستخدمة في الأنسجة الظهارية. ليزر تذرية، أسلوب مستخدمة على نطاق واسع، يسمح للكشف عن الضغط الميكانيكي المحلية في الخلية تقاطعات5،6،،من78 أو في أكبر حجم9،10،11 عن طريق إجراء تخفيضات المحلية التي تخل بسلامة الميكانيكية للهدف. القوى المحركة لفتح عقب القطع يوفر معلومات على الاجتثاث مسبقة الإجهاد، وعلى ريولوجيا ل النسيج12،13. عيب تذرية الليزر أنها الغازية، كما أنه يتطلب تعطيل القشرة الخلية المحلية. ومن ثم، واحدة فقط تنفيذ عدد محدود من أبلاتيونس إذا كان أحد يرغب في المحافظة على سلامة الأنسجة. عيب آخر هو أن أبلاتيونس لا تقدم سوى التقديرات النسبية للتوتر في خلية الاتصالات، نظراً لسرعة فتح تعتمد على الاحتكاك اللزج، الذي هو عموما غير معروف. وقد تم التلاعب المغناطيسي أيضا وضعها واستخدامها في المورفولوجية، التي تنطوي على استخدام فيروفلويدس14 أو15من أولتراماجنيتيك الدهنية. أنها يمكن أن توفر قياسات مطلقة16،17، ولكن هي أيضا الغازية بمعنى أنها تحتاج إلى حقن تحقيقات في الموقع المطلوب. وهذا يمكن أن تكون صعبة للغاية اعتماداً على النظام، هي ليست دائماً قابلة للحقن دقيقة. تقنية ثالث، غير الغازية على تماما، هو قوة الاستدلال18،،من1920. قوة الاستدلال يعتمد على افتراض التوازن الميكانيكي في نقاط ثلاثية (الوصلات تريسيلولار أو القمم)، ويسمح باستنتاج التوتر في كل خلية-خلية الاتصالات (وربما الضغوط في كافة الخلايا) بحل مشكلة معكوس. للتوترات، ويوفر كل ذروة معادلتين (X و Y). وهذا ينتج نظام كبير من المعادلات الخطية التي يمكن مقلوب تحت بعض الظروف لتقييم التوتر في كل خلية الاتصالات. في حين أن هذا الأسلوب جذابة للغاية، إلا أنها تتطلب صورة مجزأة ولا من تجربة إضافية أو الإعداد، لم يتحدد دقة لتحديد، ومرة أخرى فإنه يوفر فقط القيم النسبية، ما لم يتم تنفيذ قياس معايرة مطلقة.
للتغلب على بعض هذه القيود، نقدم في هذه المقالة داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة خفيفة لتطبيق القوات الخاضعة للمراقبة على مستوى الخلية في ظهارة الجنينية من melanogaster المورفولوجية. وقد استخدمت ملاقط بصرية للعديد من التطبيقات البيولوجية بما في ذلك القياسات على البروتينات وحيدة والتلاعب من العضيات والخلايا21. هنا، نحن تقرير قوات التطبيقية في نطاق pN عشرات قليلة، وصغيرة كافية بعد للحث على التشوهات المحلية للاتصالات المحمولة وإجراء القياسات الميكانيكية في الجسم الحي. عادة ما نستخدم انحراف عمودي لاتصالات الخليوي، ترصد من خلال تحليل كيموجرافس، تتعلق بالقوة إلى تشوه. الأهم من ذلك، لدينا الإعداد لا تتطلب حقن الخرز في الموقع المطلوب في الأنسجة، وملاقط بصرية قادرون على بذل القوات في خلية خلية اتصالات مباشرة. اقتران ملاقط بصرية مجهر ورقة ضوء يسمح أحد للقيام بالتصوير السريع (عدة إطارات في الثانية الواحدة)، وملحوظ جداً لإجراء تحليل ميكانيكية في فترات زمنية قصيرة، ومع انخفاض الضيائية، منذ الإضاءة نموذج يقتصر على الطائرة من التصوير22.
ملاقط الضوئية عموما، وطريقة غير الغازية لتطبيق القوات الخاضعة للرقابة في خلية الاتصالات في المجراة في الجنين المورفولوجية ، واستخراج المعلومات الميكانيكية مثل تصلب والتوتر في خلية الاتصالات23، خصائص انسيابية 24، ومن التدرج أو تباين من التوتر23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-وضع المجهر ورقة خفيفة
- الرجوع إلى وصف الإعداد في المنشور السابق25.
ملاحظة: الإعداد تتكون من مرحلة مجهر تستقيم ونمطية ورقة خفيفة المنتجة ورقة خفيفة في الطائرة الأفقي. 10 X عدسة الهدف الإثارة يوجه الورقة الخفيفة إلى زجاج ومبومو (الشكل 4). وقد العدسة الهدف الكشف عن نا عالية (1-1)، الذي ضروري لكفاءة كاياالاقل (انظر أدناه).
2. إنشاء المسار ملاقط بصرية
ملاحظة: الرقم 1 يعطي مخطط عام لإعداد البصرية.
- ضع وحدة ليزر 1070 نانومتر وإصلاح الألياف على الجدول البصرية مع جبل الخامس-المشبك. التأكد من أن صيد تلسكوب الألياف موازية للجدول الضوئية (ومن ثم، الأفقي) الانحياز وأن الارتفاع المحدد هنا الطول بالنسبة لجميع المكونات البصرية على الطاولة الضوئية.
ملاحظة: 100 ملم يمكن أن يكون خياراً جيدا لهذا الارتفاع. - تشغيل المفتاح لوحدة ليزر الأشعة تحت الحمراء واضغط على الزر "تحديد" تشغيل مؤشر المحاذاة. على ضوء قد تكون أفقية الصادرة من الألياف.
- وضع المصراع في مسار بصري، وإصلاحه للجدول الضوئية، حيث أن شعاع ليزر الأشعة تحت الحمراء يمر من خلال فتحه المصراع. التأكد من أن المسافة بين الجدول البصرية ومركز الفتحة مصراع هو الارتفاع اختياره في الخطوة 2، 1.
- تشغيل مفتاح تحكم مصراع وحدد الوضع اليدوي بالأسهم واضغط على زر "تمكين" لفتح المصراع.
- مكان، ومحاذاة وإصلاح مرآة جلفانومتر الأولى.
ملاحظة: اثنين من المرايا جلفانومتر يجب أن يكون مترافق للفتحة الخلفية للكشف عن الهدف، وذلك عندما هو واحد من المرايا بالتناوب، شعاع الليزر لا تخرج من الفتحة الخلفية للهدف. علما أن المسافة بين جلفانومتر الأولى والفتحة الخلفية للهدف يجب أن تحسب لتقييم موقف هذا جلفانومتر فيما يتعلق بالهدف (f1 f1 + f2 + f2 + f3 + f3 + f4 + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = 1550 مم؛ وأي فأي = البعد البؤري للعدسة جوان أنا). - قم بتشغيل جلفانومتر وحدة الإمداد بالطاقة. ضمان أن تعمل بالطاقة جالفانوميتيرس لبقية البروتوكول المحاذاة.
- تعيين جالفانوميتيرس إلى انحراف صفر (مع نعيم أو البرمجيات الملاقط الضوئية-راجع الخطوة 3 للاتصالات جلفانومتر).
- مكان، ومحاذاة وإصلاح التلسكوب ترحيل تتألف من اثنين من العدسات مع طول بؤري من عيار 30 ملم.
- مكان، ومحاذاة وإصلاح مرآة جلفانومتر الثانية. لاحظ أن المسافة بين جالفانوميتيرس هما 4f = 4 × 30 = 120 مم (f = البعد البؤري).
- وإصلاح التلسكوب.
ملاحظة: التلسكوب وتتألف من اثنين من العدسات التي توسع الشعاع إلى عرض مساوية على الأقل لقطر فتحه العدسة الهدف مرة أخرى. العدسة بطول بؤري أصغر يجب أن يأتي أولاً. - مكان، ومحاذاة وإصلاح الناظور جلب صعودا من المسار البصري أقرب إلى مدخل للسكك الحديدية مرآة مزدوج اللون.
- إصلاح مرآة ساخنة في السكك الحديدية والسكك الحديدية في المجهر. ضمان أن يتم أعادوا السكك الحديدية على الجانب الأيسر للسماح بدخول ليزر الأشعة تحت الحمراء (الشكل 2).
- تحقق من أن ضوء الليزر هو الخروج من المجهر، أولاً دون الهدف، ثم مع الهدف. تصحيح موقف الليزر قبل الهدف مع مرآة السفلي المنظار. تصحيح موقف الليزر بعد الهدف مع مرآة المنظار العلوي.
- 1 ميليلتر من 500 نانومتر الفلورسنت الخرز في ومبومو الزجاج وإضافة 10 مل ماء المقطر. وضع ومبومو في إطار الهدف في حامل ومبومو وضبط تركيز الهدف (موقف Z) حيث الهدف تلامس سطح الماء.
- بدء تشغيل برامج محلية الصنع اكتساب السيطرة أوتف والكاميرا ومرحلة كهرضغطية. يمكن أيضا استخدام برمجيات حرة مثل micromanager. تشغيل وضع اكتساب العيش عن طريق الضغط على زر "لايف".
- ضبط سلطة 1 دبليو ليزر الأشعة تحت الحمراء
-
وضع نظارات واقية (ولا إزالته قبل نهاية التجربة) والتبديل على الليزر. ينبغي أن تكون حبة محاصرين في تركيز الليزر.
- إذا كان لا يوجد حبة المحاصرين في تركيز الليزر، تحقق إذا كان مؤشر الليزر الأحمر (التي تربطها علاقة خطية متداخلة مع ليزر الأشعة تحت الحمراء) هو الخروج من الهدف. إذا لم يكن كذلك، بدء مرة أخرى الخطوات المحاذاة، وبخاصة خطوة 2.13. أو زيادة قوة ليزر الأشعة تحت الحمراء.
- إذا حبة المحاصرين من التركيز (من الطائرة تصوير)، نقل بلطف موضع العدسة الماضي آخر التلسكوب (L4 في الشكل 1) على المحور البصري جلب حبة في التركيز على متن الطائرة التصوير. إذا لم يكن كافياً، تحرك العدسة الأولى من آخر التلسكوب (L3 في الشكل 1) على المحور البصري.
- إذا لم يتم توسيط حبة المحاصرين في الصورة، استخدم المرايا الناظور 2 لضبط موضع الفخ. إذا تم تغيير موضع حبة عن طريق تغيير زاوية المرأة الأولى، أيضا تعويض اتجاه الشعاع عن طريق تغيير زاوية المقابلة للمرأة الثانية. تصحيح الموقف X فقط (مسمار 1 لكل مرآة)، ثم تصحيح موقف Y (مسمار 1 لكل مرآة).
- إذا لزم الأمر، تعديل موضع العدسة 2nd التلسكوب لمراقبة حبة في التركيز.
- إذا لزم الأمر، ضبط زاوية المرايا الناظور أن يكون حبة تركزت في الصورة.
3-التواصل في الصك
ملاحظة: يعطي الشكل 3 مخطط عام للصكوك الوطنية (ني) بطاقة الاتصالات.
- إدراج بطاقة الإخراج (ني-9263) في الفتحة الأولى من الهيكل (كداق-9178). لاحظ أنه يمكن استخدام نماذج أخرى من بطاقات ني مع النواتج التمثيلية على الأقل 2 و 3 مدخلات التناظرية.
- إدراج بطاقة الإدخال (ني-9215) في الفتحة الثانية من الهيكل.
- الاتصال جلفانومتر الأولى التناظرية الإنتاج AO0 و AI0 المدخلات التناظرية مع BNC الكابلات. لاحظ أنه يمكن استخدام محول تي للاتصال 2 BNC الكابلات بأحد. أرجع إلى دليل جلفانومتر لتعريب السنون الموجودة على متنها سائق جلفانومتر.
- بنفس الطريقة، قم بتوصيل جلفانومتر الثانية إلى AO1 و AI1.
- قم بتوصيل PFI1 في المشغل من المصراع (الخلفي لوحدة التحكم).
- الاتصال PFI0 على النار للكاميرا و AI2.
- قم بتوصيل AI3 بالمشغل من المصراع (الخلفي لوحدة التحكم).
- ضبط إعدادات وحدة تحكم مصراع. استخدم الأسهم لتغيير قيم المعلمات وتضغط على الزر "تحديد" التحقق من صحة الاختيار وتمرير المعلمة التالية. وضع المعلمة "الوقت ثانية مفتوحة" إلى 000.000، "الوقت مغلقة ثانية" إلى 000.000، "الوضع" لواحد، و "المشغل" للسماح تحويله سيطرة المصراع بالضغط على زر 'تمكين'.
- فتح قتكريتور (تحميلها من https://www.qt.io/، النسخة المجانية).
ملاحظة: قتكريتور هو "بيئة تطوير متكاملة" تستخدم لتطوير البرمجيات "ملاقط بصرية" في c + +. مكتبة كيو تي يستخدم هنا لإنشاء الحاجيات. - قم بفتح الملف OT.pro (المتوفر في ملفات التعليمات البرمجية كيو تي). هذا الإجراء سيتم فتح المشروع. تغيير اسم الإدخال والإخراج في ملف AOGenerator.cpp وفقا لبطاقة (ق ني) المستخدمة.
- ترجمة وتشغيل البرنامج بعد التمديد.
4-معايرة موقف فخ بصري مع الخرز
-
تسجيل فيلم المعايرة
- وضع 1 ميليلتر من 500 نانومتر الأحمر نيون الخرز ومبومو الزجاج، ثم شغل في ومبومو مع 10 مل ماء المقطر. ويعطي الشكل 4 طريقة عرض ومبومو في سياق المراقبة.
- إصلاح في ومبومو في مرحلة كهرضغطية.
- ضبط موضع Z ومبومو حيث أن الهدف الكشف عن الانخفاضات في الماء.
- قم بتشغيل ليزر الأشعة تحت الحمراء وتعيين السلطة إلى 1 دبليو
- قم بتشغيل البرنامج الحصول على الصورة.
- للحصول على صور انقضاء الوقت، حدد وقت التعرض، الكسب الوقت بين اثنين من الصور وعدد الصور الحصول على قوة الليزر. نلاحظ أن الإضاءة لمعايرة الملاقط بصري مع الخرز، الليزر (561 nm) غير مطلوب. 2-فوتون التأثير الناجم عن ليزر الأشعة تحت الحمراء ما يكفي لإثارة الأسفار من حبة المحاصرين.
- بدء تشغيل البرنامج ملاقط بصرية محلية الصنع.
- تعيين معلمات ملاقط بصرية لتتبع دائرة. مجموعة SamplingRate 250 عصيدة/s، بوفيرسيزي ك 1000، معلمات Waveform1 (جالفو 1) كما سينوسويدال، نببيريود 1، سعة 0.5 V، المرحلة راد 0.0، إزاحة 0.0 الخامس، 2 الموجي معلمات (جالفو 2) Sinusoidal، نببيريود 1، سعة 0.5 V، المرحلة 1.57 راد، إزاحة 0.0 V.
- تحقق من مربع "معلمات منظمة العفو الدولية"، و "الانتظار لأنها".. مربع.
- ابدأ الحصول على الصور (الصور 500 أو 1000 مع معدل إطار عالية، مثل 10 إطارا في الثانية).
- التبديل على ملاقط بصرية عن طريق الضغط على زر "المدرة!".
- تسمح حبة المحاصرين لإنجاز دائرتين كاملة على الأقل ووقف ملاقط بصرية بالأمم المتحدة الملحة "توليد!" زر.
- إيقاف الحصول على الصورة. لاحظ أن فيلم المشاجرة وملف نصي مع جلفانومتر الفولتية يتم إنشاؤها في الافتراضي "c:/TEMP/" المجلد (إلا إذا تم تحديد موقع مخصص). لاحظ أنه لا يمكن إنشاء عدة أفلام المعايرة مع ملفات البيانات المرتبطة بها إذا لزم الأمر.
- إذا لم تكتمل الدائرة، يضيع حبة خلال مسار الدائرة. ربما السرعة عالية جداً. تقليلها بتقليل معدل أخذ العينات في البرنامج بعد التمديد. أو، باستخدام مؤشر الليزر الأحمر ليزر الأشعة تحت الحمراء، تحقق إذا كان الليزر يخرج من الهدف أثناء مسار دائرة كاملة. أن لم يكن الأمر كذلك، قد لا يكون مترافق المرايا جلفانومتر مع العودة البؤري للعدسة الهدف. تصحيح مواقف جالفانوميتيرس فيما يتعلق بالمستوى البؤري العودة للهدف، وبدء خطوات المحاذاة مرة أخرى من الخطوة 2، 5.
- تعيين في الاتساع إلى الصفر والتحول عن الليزر فخ حبة في وضع إصلاح. ضع علامة بارزة في الموقع فخ.
-
موقف الاستيفاء مع تحليل الصورة
- فتح Matlab، انتقل إلى المجلد المعايرة، وتشغيل البرنامج النصي "position2tension" (المتوفرة في ملفات التعليمات البرمجية Matlab). يحسب هذا البرنامج النصي وظيفة الاستيفاء ترجمة الفولتية جلفانومتر لموقف فخ بصري.
- اختر ستستخدم عدد الأفلام المعايرة. يمكن تحديد عدة أفلام مع المسارات المختلفة، مثل علامات الحذف عمودي اثنين. وبصفة عامة، كفى فيلم معايرة واحدة مع مسار دائري.
- تقديم الصورة الأولى والأخيرة أرقام في مربع الحوار (مربع حوار واحد للفيلم الواحد)، تسلسل مع مسار واضح وجيد إشارة إلى نسبة الضوضاء.
- توفير مسار الملف النصي الذي يحتوي على الفولتية من خلال اقتناء لكل فيلم. علما بأن البرنامج النصي يقرأ الملف ويقوم بحساب الفولتية يعني من جالفانوميتيرس اثنين لكل صورة.
- توفير مسار الفيلم المعايرة المقابلة.
ملاحظة: البرنامج النصي بالكشف عن حبة لكل إطار مع قرار subpixel باحتواء غاوسي 2D إلى حبة، باستخدام الدالات المخصصة ووظائفها المستخرجة من MTT26. ويعرض الرسم بياني عرض مسار حبة. - القضاء على أي نقطة ضعف الكشف عن (المتطرفة) بواسطة النقر فوقها.
- الاختيار إذا كان الاستيفاء خريطة ل x و y الليزر المواقف المحسوبة وعرضها بواسطة البرنامج النصي, يتم إكمال. إذا كان هناك الكثير من القيم المفقودة (المناطق البيضاء في الخريطة)، كرر العملية مع فيلم معايرة جديدة، مع أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء، أو/و بسرعة أبطأ من جالفانوميتيرس.
ملاحظة: هذه الصور والقيم الاستيفاء يتم حفظها تلقائياً في نفس المجلد مثل الصورة، مع convertFct.mat الاسم.
5-تصاعد المورفولوجية الأجنة27
- جمع الأجنة المورفولوجية من قفص، المحتضنة عند 25 درجة مئوية.
- إزالة الخميرة، مرورا بمحتويات لوحة غربال (يجب أن يكون حجم المسام حوالي 100 ميكرومتر).
- تغسل الأجنة مع التبييض 100% (2.6% هيبوكلوريت الصوديوم) ل 45 ثانية لإزالة المشيمة في.
- تغسل الأجنة بالماء لمدة 2 دقيقة.
- وضع الأجنة في جهاز pad أجار بفرشاة.
- اختيار أجنة حوالي 10 وفقا لمرحلة المطلوب ومحاذاة الأجنة مع إيك أو فرشاة رطبة.
ملاحظة: المحاذاة، وينبغي أن يتم وفقا لمنطقة الفائدة (منطقة فائدة في أقرب وقت ممكن بهدف الكشف). - باستخدام قلم تمييز الماس، قطع قطعة من شريحة زجاجية من 10 × 20 × 1 مم3.
- إضافة الغراء على جانب واحد من قطعة قطعة، وأتركها تجف ل 20 ثانية.
- اقلب قطعة قطعة ووضعه على سطر الأجنة، التمسك بها عند الحافة من الشريحة.
- تثبيت هذه الإعداد في صاحب العينة ووضعه في ومبومو. ويعطي الشكل 4 طريقة عرض ومبومو في سياق المراقبة.
- وضع في ومبومو في مرحلة كهرضغطية.
6-محاصرة التجربة في فيفو
-
تعويض اللون لجهات الاتصال الخلية – ذبذبات (الشكل 5)
- العثور على موقع للاهتمام في الأنسجة.
ملاحظة: الذباب التي تسمى كادهيرينس باستخدام يمكن أن تكون مفيدة إذا كان على المرء أن يعمل في طائرة تقاطعات أدهيرينس. - نقل نقطة الوسط في مفترق الطرق المستهدفة على موقف فخ (معلما في خطوة 4.1.14) باستخدام مرحلة بيزو.
- تعيين معلمات مصيدة لتحقيق الذبذبات عمودي على خط الاتصال. تعيين المراحل كصفر. تعيين الاتساع في العاشر واتجاهات Y لحركة عمودي على خط الاتصال. يجب أن تكون السعة عموما 0.1 V.
- بدء اقتناء (مع معدل إطار سريعة، مثل 10 إطارا في الثانية).
- قم بالتبديل في ملاقط بصرية الضغط على زر "المدرة!".
- عند القيام بذلك، إيقاف تشغيل ملاقط والتوقف عن الحصول على الصور. الآن يجب أن يظهر فيلم وملف نصي يحتوي على الفولتية جلفانومتر من خلال اقتناء في المجلد المحدد.
- تعويض اللون لجهات الاتصال الخلية – سحب-الإفراج (الشكل 6)
- العثور على موقع للاهتمام في الأنسجة.
- نقل تقاطع المستهدفة باستخدام مرحلة بيزو حتى منتصفه هو عادة 1 ميكرومتر بعيداً عن موقف فخ (معلما في خطوة 4.1.14).
- تعيين في الاتساع إلى 0 إلى فخ مطرد.
- ابدأ الحصول على الصور (مع معدل إطار سريعة، مثل 10 إطارا في الثانية).
- قم بالتبديل في ملاقط بصرية الضغط على زر "المدرة!".
- بعد الوقت المطلوب، أوقف في الفخ والانتظار للاسترخاء بحيث تحدث.
- إيقاف الحصول على الصورة. الآن يجب أن يظهر فيلم وملف نصي يحتوي على الفولتية جلفانومتر من خلال اقتناء في المجلد المحدد.
- العثور على موقع للاهتمام في الأنسجة.
-
كيموجراف شبه التلقائي توليد والكشف عن الموقف الذي واجهة.
- في نافذة الأوامر Matlab، تحميل الخريطة الاستيفاء المتولدة أثناء إجراء المعايرة (4b): load('convertFct.mat'). وهذا يوفر بمتغيرات fx والسنة المالية.
- في نافذة الأوامر Matlab، قم بتشغيل autokymo(fx,fy)، المقدمة في ملفات التعليمات البرمجية Matlab. والغرض من هذه الوظيفة هو لتوليد كيموجراف على طول مسار الليزر، والكشف عن موضع خط الاتصال مع القرار subpixel لكل إطار.
- حدد مسار الملف نص المطالبة التي تحتوي على قيم الجهد الكهربي.
- حدد الأرقام الإطار الأول والأخير من الفيلم ليتم تحليلها.
- حدد ملف الفيلم tiff. سيتم عرض أرقام جديدة اثنين: الأول صورة كيموجراف. والثانية رسم بياني للكشف عن مواقف الليزر وخط الاتصال، مقابل عدد الصور.
ملاحظة: الوظيفة حفظ الرسم البياني الذي يمثل موقف العينة، وموقف الليزر مقابل عدد الصور (الشكل matlab، jpg)، كيموجراف (صورة tiff) وكيموجراف مع موقف الليزر (صورة tiff). لتجارب فخ مطرد، قد كيموجراف القيام بذلك يدوياً، على سبيل المثال باستخدام إيماجيج. ثم يمكن أن يتم الكشف عن الواجهة من كيموجراف استخدام نفس الخوارزمية.
7. القياسات الميكانيكية
-
القياسات وصلابة والتوتر
- القيام بتجربة التذبذب (الخطوة 6.1) وتحليل المقابلة (الخطوة 6.3) الفيلم انقضاء الوقت.
- ارسم موقف واجهة
كدالة للموقف فخ 
استخدام Matlab ارسم الدالة أو أية بيانات التخطيط للبرامج.
ملاحظة: وهذا ينبغي أن تكون خطية تقريبا. - القيام خطي تناسب، باستخدام Matlab أدوات الحرة "ازفيت" أو أي برنامج يسمح ليناسب. يوفر معكوس المنحدر لتناسب متوسط نسبة
. - إجراء تقديرات لتصلّب الانحناء الظاهر من الواجهة، والتي، على افتراض التشوهات الصغيرة ومن الدرجة الثانية المحتملة للملائمة، وترد عليه
. 
هو تصلب فخ (راجع الخطوة 8 لفخ صلابة المعايرة). - إجراء تقديرات للتوتر، والتي يمكن تعريفها بأنها23:
.
-
قياسات انسيابية
- إجراء تجارب إطلاق سحب (الخطوة 6، 2) وتحليل المقابلة (الخطوة 6.3)
- تناسب المنحنى الناتج مع نموذج مخصص انسيابية.
كدالة للموقف فخ 
استخدام Matlab ارسم الدالة أو أية بيانات التخطيط للبرامج.
.
. 
هو تصلب فخ (راجع الخطوة 8 لفخ صلابة المعايرة).
.8-معايرة صلابة فخ
ملاحظة: تحديد القوى المطلق يتطلب المعرفة بصلابة فخ على الواجهات. وهذا يمكن الوصول إليها باستخدام الخرز عن طريق إجراء خطوتين.
-
تحديد اللزوجة سيتوسول
- وضع الأجنة في الهالوكربون النفط وحقن لهم باستخدام إعداد microinjection مع الخرز البوليسترين الفلورسنت (1:1، 000 إضعاف الأسهم، قطرها ميكرومتر 0.46)23،27.
- وضع الأجنة حقن تحت المجهر.
- تتبع حركة الخرز واحدة وجدت في سيتوسول. استخراج متوسط مربع تشريد الخرز (استخدام عدد كبير من المسارات > 100 الخرز). تحديد ثابت نشر حبة من منحدر تشريد متوسط مربع. المتعلقة بنشر ثابت اللزوجة بمعادلة اينشتاين ستوكس، نستنتج لزوجة سيتوسول فعالية. في الجنين المبكر، هو لزوجة لما يقرب من 3.5 Pa.s عنها23.
-
تحديد صلابة فخ على الخرز
- فخ الخرز واحد في سيتوسول مع ملاقط بصرية.
- نقل حبة بطريقة متدرجة بين هذين الموقفين فخ مفصولة 0.5 ميكرومتر
- تحديد صلابة فخ على الخرز، كالنسبة بين معامل السحب ووقت الاسترخاء حبة من موقف مصيدة واحدة إلى أخرى.
ملاحظة: معامل السحب
، حيث 
هو اللزوجة العزم في (8.1) و 
دائرة نصف قطرها حبة. يتم الحصول على وقت الاسترخاء من أسي يلائم الموقف حبة، استخدام Matlab أو أي برنامج يسمح ليناسب. هي القيم النموذجية لتصلّب فخ 120 ±50 pN.µm-1 في 200 ميغاواط الليزر الإثارة.
-
تحديد صلابة فخ على واجهة الخلية
- تركيز الليزر على خط اتصال، ويصرف عليه (على النحو المفصل في الخطوة 6). قياس السعة التشوه. يجب تكرار هذا على عدة خطوط الاتصال للحصول متوسط ممثل.
- قارن تشوه المنتجة مع التي تحدثها الخرز دفعت ضد خطوط الاتصال. ولما تناسبا عكسيا مع صلابة فخ التشوه، نستنتج صلابة فخ الاتصالات المحمولة.
ملاحظة: صلابة فخ الاتصالات خلية عادة عثر على 2 إلى 3 إضعاف أصغر من أن على الخرز (0.46 ميكرومتر القطر).
، حيث 
هو اللزوجة العزم في (8.1) و 
دائرة نصف قطرها حبة. يتم الحصول على وقت الاسترخاء من أسي يلائم الموقف حبة، استخدام Matlab أو أي برنامج يسمح ليناسب. هي القيم النموذجية لتصلّب فخ 120 ±50 pN.µm-1 في 200 ميغاواط الليزر الإثارة.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يبين الشكل 5 البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها بفرض حركة جيبية إلى الفخ. وتنتج الفخ انحراف الواجهة، كما يتضح من اللقطات 3 عرض واجهة المتعاقبة 3 مواقع (الشكل 5A)23. الأفلام المسجلة تستخدم لتوليد كيموجراف (الشكل 5 (ب))، وكذلك يتم تحليلها لتحديد الموقف الذي واجهة مع القرار subpixel، استخدام ضبابي تناسب على طول اتجاه x لكل إطار. تتناسب في نظام التشوهات الصغيرة والمواقف الملائمة وواجهة (الشكل 5). السعة لانحراف واجهة بالنسبة إلى الفخ (الشكل 5) يتيح الوصول إلى الواجهة التوتر أو تصلب (راجع الخطوة 7، 1).
يبين الشكل 6 البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها عن طريق إجراء سحب الإفراج عن تجارب. يتم تبديل في فخ بصري على ما يقرب من 1 ميكرومتر بعيداً عن نقطة الوسط للتفاعل بين خليتين، الذي يتسبب في الواجهة لصرف نحو موقف (الشكل 6A) فخ24. إيقاف تشغيل في الفخ ثم بعد مقدار الوقت المطلوب. Xm موقف واجهة (الشكل 6B) يتم الحصول عليها من كيموجرافس (الشكل 6)، ومرة أخرى باستخدام غاوسي يناسب على طول اتجاه x لكل إطار. ويمكن مقارنة الرسم البياني الناتج الافتراض انسيابية النماذج، على سبيل المثال، نموذج ماكسويل (الشكل 6).
رقم 1: التخطيطي للإعداد ملاقط بصرية (المسار الأحمر) جنبا إلى جنب مع ورقة الخفيفة الميكروسكوب. وقد تم تعديل هذا الرقم من بامبارديكار، ك. et al. 23. يرد وصف المجهر الورقة الخفيفة، تتألف من وحدة الإضاءة ووحدة الكشف، سابقا25. ملاقط بصرية تتوافق مع الجزء الأحمر من المخطط: ليزر الأشعة تحت الحمراء يمر من خلال مصراع ضوئية وجالفانوميتيرس 2 التي تتحكم بوضع مصيدة في العينة. يتم وضع تلسكوب 1-fold بين جالفانوميتيرس 2 للحفاظ على تصريف بينهما. ثم، تلسكوب يزيد حجم الشعاع من 2.5-fold والناظور لأنه يجلب ارتفاع المجهر. ليزر الأشعة تحت الحمراء يدخل هدف اكتشاف المجهر فضل مرآة مزدوج اللون. وترد أهمية المسافات بين العناصر البصرية مباشرة في الشكل. المسافة بين العدسة الأخيرة (البعد البؤري 500 ملم) والفتحة الخلفية للهدف هو 500 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: محلية الصنع السكك الحديدية تعديل عقد مزدوج اللون مرآة ومرآة ساخنة. قطع السكك الحديدية مرآة مزدوج اللون المجهر على الجانب الأيسر للسماح بدخول ليزر الأشعة تحت الحمراء. مرآة مزدوج اللون يعكس الضوء الأشعة تحت الحمراء، وينقل الضوء المرئي (الأسفار). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: اتصال الصكوك المتعلقة "بطاقات ني". AO: التناظرية الإنتاج، منظمة العفو الدولية: الإدخال التناظري، ترتبط AO0 و AI0 galvo1 و AO1 و AI1 ترتبط galvo2، PFI0 متصل بنار الكاميرا، وإلى AI2 و PFI1 متصل بالمشغل في مصراع و AI3 متصل بالمشغل من المصراع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: حامل عينة في سياق المراقبة. وقد تم تعديل هذا الرقم من Chardès، جيم، وآخرون. 25-الأجنة هي معطلة في ساترة زجاجية. ويقام الشريحة قبل صاحب العينة. يتم إدراج صاحب العينة في ومبومو الزجاج، الذي عقد قبل صاحب ثابت إلى مرحلة كهرضغطية. الورقة الضوء الأفقية وينير الأجنة من الجانب. عدسة الهدف الكشف عن الرأسي، أعلاه العينة، والانخفاضات في ومبومو.
الرقم 5: واجهة انحراف تفرضها حركة جيبية من الفخ. وقد تم تعديل هذا الرقم من بامبارديكار، وآخرونك.23. يتم نقل (A) الفخ سينوسويدالي عمودي على الواجهة. هي مواقف فخ وواجهة xt و xm، على التوالي. تظهر لوحات حق ثلاث صور للواجهة في المواقف المختلفة. يتسم موقف فخ الليزر على رأس سهم أصفر. هي المسمى واجهة مع علامة غشاء (GAP43::mcherry). (ب) كيموجراف على طول محور المعرفة باتجاه حركة فخ (عمودي على الواجهة) (الفترة = 5 s). (ج) ارسم الممثل من انحراف مقابل الوقت تظهر كلا من فخ (الخط الأحمر الصلبة) ووظائف واجهة (خط الصلبة السوداء). ضع واجهة (د) كدالة للموقف فخ خلال الدورات القليلة من التذبذب الليزر (السعة = 0.5 ميكرومتر، الفترة = 2 s). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: واجهة انحراف في تجارب سحب الإصدار. وقد تم تعديل هذا الرقم من سيرج، أ.، وآخرون. 24-(A) الفخ يتم تشغيله على مسافة من نقطة الوسط للواجهة، ثم إيقاف تشغيل مرة أخرى. (ب) هي المواقف الملائمة وواجهة xt و xm، على التوالي. يتم إنشاء كيموجرافس على طول اتجاه x، عمودي على نقطة الوسط خط الاتصال. (ج) كيموجراف لتجربة سحب الإصدار. هي المسمى خلية اتصالات مع Utrophin::GFP. (د) ارسم الممثل من انحراف مقابل الوقت تظهر كلا من فخ (منقط الخطوط الحمر/الخضر) وواجهة موقف (خط الصلبة السوداء). ويبين الخط الأحمر الخالص نوبة الحصول عليها باستخدام نموذج انسيابية مثل ماكسويل24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
فيلم التكميلي 1: كاياالاقل التجربة. حجم بكسل = 194 نيوتن متر، 10 إطارا في الثانية، وفترة التذبذب فخ = 2 s، وضع العلامات: Gap43::mCherry. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ملاقط بصرية تسمح لإجراء القياسات الميكانيكية المطلقة في ظهارة الجنينية النامية مباشرة بطريقة غير الغازية. وبهذا المعني، فإنه يقدم مزايا أكثر أساليب أخرى مثل التذرية الليزر، التي هي الغازية وتوفير القياسات النسبية، والقوى المغناطيسية، التي تتطلب الحقن، أو قوة الاستدلال، الذي يعتمد على افتراضات قوية وأيضا تقدم نسبي القياسات.
ويتضمن البروتوكول بضع خطوات حاسمة. أولاً، كما قد تظهر العدسة الهدف الانحرافات اللونية، وأن يدفع فخ الليزر الكائن في "المصب"، من المهم للتأكد من أن يعوض ليزر الأشعة تحت الحمراء حبة في الطائرة التصوير، والصحيح في نهاية المطاف لأنها (خطوة 2.18). ثانيا، الأسلوب الذي يعتمد على قياسات موقف جهات الاتصال الخلية. وبالتالي من الأهمية بمكان استخدام علامة نيون عالية التباين.
نوعية العدسة الهدف وشعاع الليزر ذات الأهمية الحاسمة لتعويض فعال. وينبغي أن تتجاوز الفتحة العددية للعدسة الهدف 1.0. إذا كان تعويض اللون غير فعالة، تأكد من أن شعاع الليزر يملأ الفتحة الخلفية للعدسة والهدف.
لدينا أسلوب يأتي مع العديد من القيود. أولاً، ليس من الواضح تماما ما يوفر الدعم لتعويض بصري. على الرغم من أن تم الكشف عن عدم تطابق للانكسار، أصله ما زال يتعين تحديد. ثانيا، عملية المعايرة، إذا كان أحد مهتم بالمقاييس المطلقة، يمكن أن تكون مملة بعض الشيء، أنها تتطلب التجارب السلبية ميكرورهيولوجي، والمعايرة لتصلّب فخ على الخرز. من المهم أن ندرك أن معايرة صلابة عن خلية الاتصالات رهنا بعدم اليقين التجريبي: يعتمد على قياسات صلابة فخ على الخرز، الذي يمكن أن يقاس إلا في سيتوسول، ولكن ليس بالقرب من الاتصالات المحمولة. ثالثا، من غير الواضح كيف يمكن أن يكون تنوعاً ملاقط بصرية. على الرغم من أنها قادرة على تشوه الخلايا في الجنين المورفولوجية ، قد يقدم التوتر العالي أو أكثر يصعب الوصول إليها (مثل يمر بشرة) الأنسجة الأخرى ولذلك يكون أقل قابلية كاياالاقل الضوئية.
القوات البصرية صغيرة (< بضع عشرات من السندات الإذنية)، وقد يكون ذلك غير كافية لتشوه هياكل صلبة أو المتوترة جداً. ملاقط مغناطيسية على جزيئات كبيرة ربما يكون أكثر فعالية في هذه الحالة.
وصفناها هنا اقتران ملاقط بصرية مجهر ورقة ضوء، ولكن يمكن أن يقترن ملاقط بصرية لأنواع أخرى من المجاهر، مثل ابيفلوريسسينسي أو مجهر قرص غزل [كنفوكل]. إدخال الأشعة تحت الحمراء ليزر الملائمة في المجهر تعتمد على تكوين المجهر. فهو يتطلب أساسا إمكانية إضافة مرآة مزدوج اللون الجمع بين المسارات من أجل التلاعب بالتصوير والبصرية. معظم الشركات مجهرية اقتراح نظم وحدات الإضاءة، مع وحدة نمطية لطبقتين، التي تسمح لهذا المزيج.
وتوجد العديد من الاتجاهات تحسين أو تطوير التقنية. إمكانية لتقسيم الوقت الإقامة الليزر بين عدة مواقف أو متقدمة باستخدام أكثر التقنيات الثلاثية الأبعاد، لإنتاج عدة اعتراضات. قد يسمح هذا لإنشاء أنماط القوة أكثر تعقيداً على الخلايا المستهدفة أو خلية الاتصالات. يمكن أن تحسن آخر لتصميم التغذية مرتدة في الوقت الحقيقي بين انحراف تسبب والموقف من الفخ. قد يسمح هذا لزحف السليم التجارب الذي يحتفظ فيه قوة تطبيق ثابت في كافة مراحل التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل العلاجات ايكيب منحة العلاجات DEQ20130326509، الوكالة الوطنية de la بحوث بلانك ANR "منحة"، ANR مورفور-11-BSV5-0008 (إلى ص-ف). نحن نعترف بفرنسا-بيويماجينج البنية التحتية تدعمها وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (ANR-10-إينبس-04-01، «الاستثمارات في المستقبل»). ونحن نشكر ديتايليور برايس وموريتي كلود من البنية التحتية بيكسل--مكتب التحقيقات الفدرالي للمساعدة التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30 mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200 mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500 mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
References
- Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
