Summary
我们提出了一个设置的光学推子耦合到光片显微镜, 它的实现, 以探测细胞力学没有珠子在戈德罗迪拉胚胎。
Abstract
形态发生需要遗传模式和机械力之间的协调, 以有力地塑造细胞和组织。因此, 了解形态发生过程的一个挑战是在胚胎发生过程中直接测量体内的细胞力和机械性能。在这里, 我们提出了一个光学推子的设置耦合到光片显微镜, 允许直接施加力量的细胞接触早期德沃菲拉胚胎, 同时成像在几个帧每秒。这种技术的优点是, 它不需要在胚胎中注入珠子, 通常用作施加光学力的中间探针。我们逐步详细介绍了设置的实现, 并提出了从实验中提取机械信息的工具。通过实时监测细胞触点的位移, 可以进行张力测量, 研究细胞触点的流变学。
Introduction
胚胎发育是一个高度可重复的过程, 在此过程中, 细胞和组织变形, 以塑造未来的动物。这种变形已被证明需要在第1,2级的细胞中主动产生部队。为了了解细胞和组织改变形状的形态发生过程, 评估所涉及的细胞的机械特性, 并测量过程3、4 中组织内的力, 是关键.上皮层, 特别是在嗜德维拉,由于其准二维和几何形状和易于操作, 已被广泛研究。
因此, 我们和其他人开发了一些技术来评估体内的上皮力学 。我们将简要概述用于上皮组织的三种主要技术。激光消融是一种广泛使用的方法, 可以揭示细胞连接点5、6、7、8或更大比例的 9、10、11处的局部机械应力通过执行破坏目标机械完整性的局部切割。切割后的开口动力学提供了关于应力先前消融的信息, 以及关于组织12、13 的流变性的信息。激光消融的一个缺点是它是侵入性的, 因为它需要局部破坏细胞皮层。因此, 只有当一个人想要保持组织的完整性时, 才能进行有限数量的消融。另一个缺点是, 消融只提供细胞接触时张力的相对估计, 因为开口速度依赖于粘性摩擦, 这通常是未知的。磁操作也已开发并用于嗜德维拉, 涉及使用铁液14 或超磁性脂质体15。它们可以提供绝对测量16,17, 但也具有侵入性, 因为它们需要在所需的位置注射探针。这可能是非常棘手的, 取决于系统, 这并不总是适合精确的注射。第三种技术, 完全非侵入性, 是力推断18, 19,20.力推断依赖于三个点 (三细胞连接点或顶点) 的机械平衡假设, 并允许通过求解逆问题来推断所有细胞触点 (可能还有所有细胞中的压力) 的张力。对于张力, 每个顶点提供两个方程 (x 和 y)。这就产生了一个大的线性方程组, 可以在某些条件下倒置, 以评估所有细胞接触的张力。虽然这种方法非常有吸引力, 因为它只需要分割图像, 没有额外的实验或设置, 但它的准确性尚未确定, 并且它只提供相对值, 除非执行绝对校准测量。
为了克服其中的一些限制, 我们在本文中引入了光推子的设置, 结合到光片显微镜, 以施加控制力在细胞规模的胚胎上皮果蝇. 光学推拿器已被用于许多生物应用, 包括单个蛋白质的测量和细胞器和细胞21的操作。在这里, 我们报告在几十个 pn 范围内的施加力, 这是小的, 但足以诱导局部变形的细胞接触, 并在体内进行机械测量。通常情况下, 我们使用细胞触点的垂直偏转, 通过对 kymographs 的分析进行监测, 以将力与变形联系起来。重要的是, 我们的设置不需要在组织中所需的位置注入珠子, 因为光学推拿器能够直接对细胞触点施加力。光推子与光片显微镜的耦合使人们能够进行快速成像 (每秒几个帧), 这对于在较短的时间尺度上进行机械分析非常明显, 并且光毒性降低, 因为照明的样本仅限于成像22的平面。
总体而言, 光学推拿器是一种非侵入性的方法, 可在体内对嗜德维拉胚胎的细胞接触施加控制力, 并提取机械信息, 如细胞接触物 23的刚度和张力、流变特性等。24、梯度或各向异性的张力23。
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Protocol
1. 设置光片显微镜
- 请参阅以前出版物25中的设置说明。
注: 设置由垂直显微镜阶段和在水平平面上产生光板的光板模块组成。10倍励磁物镜将光板定向到玻璃杯 (图 4)。检测物镜具有较高的 na (1.1), 这是有效的推特所必需的 (见下文)。
2. 设置光推器路径
注:图 1给出了光学设置的一般方案。
- 将 1070 nm 激光装置放置在带有 v 型夹紧装置的光学台上。确保光纤准直器与光学表平行 (因此是水平的), 并且此处选择的高度将是对光学表上的所有光学元件的高度。
注: 100 毫米可以是一个很好的选择, 为这个高度。 - 打开红外激光单元的按键, 然后按 "选择" 按钮打开对齐指针。光必须是光纤的水平输出。
- 将快门放置在光学路径中, 并将其固定在光学桌面上, 使红外激光束通过快门的光圈。确保光学工作台与快门光圈中心之间的距离是步骤2.1 中选择的高度。
- 转动快门控制器的按键, 选择带有箭头的手动模式, 然后按 "启用" 按钮打开快门。
- 放置、对齐并固定第一个电流计镜。
注: 两个电流计反射镜必须与检测目标的后孔径共轭, 这样当其中一个反射镜旋转时, 激光束就不会从目标的后孔中流出。请注意, 必须计算第一个电流计与目标的后孔径之间的距离, 以评估该电流计相对于目标的位置 (f1+f1+f2+f2+f3+f3+f4+f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 = 1550 毫米; fi =镜头焦距 n°i)。 - 打开电流计电源。确保电流计在对齐协议的其余部分都有电源。
- 将电流计设置为零偏转 (使用 nimax 或光推拿器软件-有关电流计连接, 请参阅步骤 3)。
- 放置、对齐和固定由焦距为30毫米的两个镜头组成的继电器望远镜。
- 放置、对齐并固定第二个电流计镜。请注意, 两个电流计之间的距离为 4f = 4 x 30 mm = 120 毫米 (f = 焦距)。
- 放置并固定望远镜。
注: 望远镜由两个透镜组成, 这两个透镜将光束扩展到至少等于物镜后孔径直径的宽度。焦距最小的镜头应该是第一位的。 - 放置, 对齐和固定潜望镜, 将光学路径向上靠近二色镜轨入口。
- 将热镜固定在导轨上, 将导轨放在显微镜下。确保导轨被锯在右侧, 以允许红外激光进入 (图 2)。
- 检查激光是否从显微镜下消失, 首先没有目标, 然后是目标。用潜望镜的底镜在目标前校正激光的位置。用潜望镜的顶镜在目标后校正激光的位置。
- 在玻璃杯中放入1μl 的500纳米荧光珠, 加入10毫升的蒸馏水。将立方体放在立方体支架的目标下, 调整目标 (z 位置) 的焦点, 使目标接触到水面。
- 开始采集自制的软件, 控制 aotf、摄像机和压电级。还可以使用微管理器等自由软件。按下 "实时" 按钮, 打开实时采集模式。
- 将红外激光功率调整为 1 w。
-
戴上护目镜 (在实验结束前不要摘下护目镜), 然后打开激光。一个珠子应该被困在激光焦点。
- 如果激光对焦没有被捕获珠子, 请检查红色激光指针 (与红外激光共线) 是否从目标中取出。如果没有, 请重新开始对齐步骤, 特别是步骤2.13。或者, 增加红外激光功率。
- 如果磁珠被排除在 (成像平面的) 对焦之外, 请沿光轴轻轻移动最后一个望远镜的最后一个镜头 (图1中的l4) 的位置, 使磁珠与成像平面聚焦。如果不够, 请沿光轴移动最后一个望远镜的第一个镜头 (图1中的l3)。
- 如果被困珠没有居中在图像中, 请使用2个潜望镜调整陷阱的位置。如果通过改变第一面镜的角度来改变珠的位置, 也可以通过改变第二面镜的相应角度来补偿光束的方向。仅更正 x 位置 (每个镜像1个螺钉), 然后更正 y 位置 (每个镜1个螺钉)。
- 如有必要, 调整第二望远镜镜头的位置, 以观察聚焦中的珠子。
- 如有必要, 调整潜望镜的角度, 使珠子在图像中居中。
3. 仪器的接口
注:图 3给出了国家仪器 (ni) 卡连接的一般方案。
- 将输出卡 (ni-9263) 插入机箱的第一个插槽 (cdaq-9178)。请注意, 可以使用至少有2个模拟输出和3个模拟输入的 ni 卡的其他型号。
- 将输入卡 (ni-9215) 插入机箱的第二个插槽。
- 使用 bnc 电缆将第一个电流计连接到模拟输出 ao0 和模拟输入 ai0。请注意, t 适配器可用于将 2条 bnc 电缆连接到一条。请参阅电流计手册, 对电流计驱动板上的针脚进行定位。
- 同样, 将第二个电流计连接到 ao1 和 ai1。
- 将 pfi1 连接到快门 (控制器背面) 的触发器 in。
- 将 pfi0 连接到摄像机的火和 ai2。
- 将 ai3 连接到快门 (控制器背面) 的触发器上。
- 调整快门控制器的设置。使用箭头更改参数值, 然后按 "选择" 按钮验证选择并传递到下一个参数。将 "时间打开秒" 参数设置为 000.000, 将 "时间闭合秒" 设置为 000, "模式" 设置为 "单一", 将 "触发器" 设置为 ext, 通过按 "启用" 按钮允许控制快门。
- 打开 QtCreator 者 (从 https://www.qt.io/下载, 免费版本)。
注: QtCreator 者是用于在 c++ 中开发的光推子软件中的集成开发环境。这里使用 qt 库来创建小部件。 - 打开 ot pro 文件 (在 qt 代码文件中提供)。此操作将打开该项目。根据所使用的 ni 卡更改 aogenerator. cpp 文件中的输入和输出的名称。
- 编译并运行 ot 软件。
4. 用珠子校准光学陷阱位置
-
校准影片的录制
- 在玻璃杯中放入1μl 的500纳米红色荧光珠, 然后在杯中加入10毫升的蒸馏水。图 4给出了观察上下文中的 cuvette 视图。
- 把立方固定在压电舞台上。
- 调整 cuvette 的 z 位置, 使检测目标在水中下降。
- 打开红外激光, 并将功率设置为 1 w。
- 打开图像采集软件。
- 要获取延时图像, 请选择曝光时间、增益、两个图像之间的时间、要获取的图像数量以及激光功率。请注意, 对于使用珠子进行光推拿器校准, 不需要照明激光器 (561 nm)。红外激光诱导的2光子效应足以激发被困珠的荧光。
- 启动光学推拿器自制软件。
- 设置光学推子参数以跟踪圆圈。将采样率设置为250小片, 缓冲区大小为 1000, 波形1参数 (galvo 1) 为正弦, nbPeriod 1, 振幅 0.5 v, 相位 0.0 rad, 偏移 0.0 v, 波形2参数 (galvo 2) 作为正弦, nbPeriod 1, 振幅 0.5 v, 相位 1.57 rad, 偏移 0.0 v。
- 选中 "ai 参数" 框和 "等待它" 框。
- 开始图像采集 (500 或1000张具有高帧速率的图像, 如 10 fps)。
- 按下 "生成!" 按钮, 打开光推子。
- 允许被困珠完成至少两个完整的圆圈, 并通过取消按下 "生成!" 按钮来停止光推子。
- 停止图像采集。请注意, 在默认的 "c:/temp/c" 文件夹中创建了一个 tiff 影片和一个具有电流计电压的文本文件 (除非指定了自定义位置)。请注意, 如果需要, 可以创建多个带有关联数据文件的校准影片。
- 如果圆不完整, 则在圆轨迹过程中失去珠子。也许速度太高了。通过降低 ot 软件中的采样率来降低采样率。或者, 使用红外激光的红色激光指针, 检查激光在整个圆周过程中是否从目标中流出。否则, 电流计反射镜可能不会与物镜的后焦平面结合。更正电流计相对于目标的后焦平面的位置, 从步骤2.5 重新开始对齐步骤。
- 将振幅设置为零, 并打开激光, 将珠子捕获在固定位置。在陷阱位置放置一个地标。
-
带有图像分析的位置插值
- 打开 matlab, 转到校准文件夹, 然后运行 "位置 2张力" 脚本 (在 matlab 代码文件中提供)。该脚本计算插值函数, 将电流计电压转换为光学陷阱位置。
- 选择将使用的校准影片的数量。可以使用不同的轨迹选择几部电影, 例如两个垂直椭圆。通常, 具有圆形轨迹的单个校准影片就足够了。
- 在对话框中提供第一个和最后一个图像编号 (每个影片一个对话框), 具有清晰轨迹和良好的信噪比的序列。
- 提供包含每个影片在采集过程中的电压的文本文件的路径。请注意, 脚本读取该文件, 并计算每个图像的两个电流计的平均电压。
- 提供相应校准影片的路径。
注: 该脚本使用从 mtt 26 中提取的自定义函数和函数, 将二维高斯拟合到珠子, 从而检测到具有子像素分辨率的每个帧的珠子。它显示显示珠子轨迹的图形。 - 通过单击任何检测不良的点 (异常值) 来消除它。
- 检查由脚本计算和显示的 x 和 y 激光位置的插值图是否已完成。如果有很多缺失的值 (地图中的白色区域), 请使用新的校准影片重复操作, 具有更好的信噪比, 或者/和电流计的速度较慢。
注: 这些图像和插值值将自动保存在与图像相同的文件夹中, 名称转换 fct. mat。
5. 安装食人鱼27
- 从网箱中收集在25°c 下孵育的亲罗斯拉胚胎。
- 除去酵母, 通过筛子通过果板内容物 (孔径应在100μm 左右)。
- 用100% 漂白剂 (2.6% 次氯酸钠) 清洗胚胎 45秒, 去除绒毛膜。
- 用清水清洗胚胎2分钟。
- 用刷子把胚胎放在琼脂垫上。
- 根据所需的阶段选择大约10个胚胎, 并将胚胎与长矛或潮湿的刷子对齐。
注: 对齐应根据感兴趣的区域 (感兴趣的区域尽可能接近检测目标) 进行。 - 使用钻石标记笔, 切割一块 10 x 20 x 1 毫米3的玻璃幻灯片.
- 在切割件的一侧添加胶水, 让它干燥20秒。
- 把切割的碎片翻过来, 放在胚胎线上, 贴在滑梯边缘。
- 将此制剂安装在样品支架中, 并将其放置在试剂盒中。图 4给出了观察上下文中的 cuvette 视图。
- 把杯在压电舞台上。
6.体内诱捕实验
-
细胞触点的捕获-振荡 (图 5)
- 找出组织中感兴趣的位置。
注: 使用在其中标记钙粘蛋白的苍蝇可以帮助, 如果一个人需要在平面上的粘附物连接点工作。 - 使用压电阶段在陷阱位置 (步骤4.1.14 上设置地标) 移动目标交点的中点。
- 设置疏水阀参数, 以实现垂直于接触线的振荡。将阶段设置为零。在 x 和 y 方向上设置振幅, 使其具有垂直于接触线的运动。振幅通常应为 0.1 v。
- 开始采集 (帧速率快, 如 10 fps)。
- 按下 "生成!" 按钮, 打开光学推子。
- 完成后, 关闭推子并停止图像采集。在采集过程中包含电流计电压的影片和文本文件现在应显示在指定的文件夹中。
- 细胞触点的捕获-拉释放 (图 6)
- 找出组织中感兴趣的位置。
- 使用压电级移动目标交点, 使其中点通常距离陷阱位置 (步骤4.1.14 上设置的地标)。
- 将振幅设置为 0, 以获得稳定的陷阱。
- 开始图像采集 (帧速率快, 如 10 fps)。
- 按下 "生成!" 按钮, 打开光学推子。
- 在所需时间后, 关闭陷阱, 等待放松发生。
- 停止图像采集。在采集过程中包含电流计电压的影片和文本文件现在应显示在指定的文件夹中。
- 找出组织中感兴趣的位置。
-
半自动测速仪的生成和接口位置的检测。
- 在 matlab 命令窗口中, 加载校准过程 (4b) 期间生成的插值映射: 加载 ("转换 fct. mat")。这提供了 fx 和则。
- 在 matlab 命令窗口中, 运行 matlab 代码文件中提供的自动命令 (fx, fy)。此函数的目的是沿激光轨迹生成一个测速仪, 并检测每个帧具有亚像素分辨率的接触线的位置。
- 选择提示的包含电压值的文本文件路径。
- 选择要分析的影片的第一个和最后一个帧数。
- 选择 tiff 影片文件。将显示两个新的数字: 第一个是最新图的图像。第二个是接触线和激光位置与图像号的检测图。
注: 该函数保存表示样品位置和激光相对于图像号 (matlab 图, jpg)、测光仪 (tiff 图像) 和带有激光位置 (tiff 图像) 的测光仪的位置的图形。对于稳定的陷阱实验, 必须手动完成测速仪, 例如使用 imagej。然后可以使用相同的算法从测速仪中检测接口。
7. 机械测量
-
刚度和张力测量
- 对延时电影进行振荡实验 (步骤 6.1) 和相应的分析 (步骤 6.3)。
- 使用 matlab 绘图函数
或任何数据绘制软件绘制接口
位置作为陷阱位置的函数。
注: 这应该是近似线性的。 - 执行线性配合, 使用 matlab "ezfit" 免费工具箱或任何软件允许适合。配合斜率的逆提供了平均比率
。 - 对界面的表观弯曲刚度进行估计, 假设界面变形小, 捕获的二次电位
, 给出了。
是疏水阀刚度 (有关疏水阀刚度校准, 请参见步骤 8)。 - 执行张力估计, 可定义为23:
.
-
流变测量
- 执行拉释放实验 (步骤 6.2) 和相应的分析 (步骤 6.3)
- 将生成的曲线与自定义流变模型相匹配。
或任何数据绘制软件绘制接口
位置作为陷阱位置的函数。
。
, 给出了。
是疏水阀刚度 (有关疏水阀刚度校准, 请参见步骤 8)。
.8. 陷阱刚度的校准
注: 确定绝对力需要了解接口上的陷阱刚度。这可以通过两步过程使用珠子进行访问。
-
细胞溶胶粘度的测定
- 将胚胎放入卤化碳油中, 然后使用带有荧光聚苯乙烯珠的微注射装置 (1:1000 库存稀释, 0.46μm 直径)23,27。
- 将注射的胚胎置于显微镜下。
- 跟踪在细胞溶胶中发现的单个珠子的运动。提取珠子的平均平方位移 (使用大量的轨迹 & gt; 100 颗珠子)。从平均方位移的斜率中确定珠扩散常数。用 Stokes-Einstein 方程将扩散常数与粘度联系起来, 推导出细胞溶胶的有效粘度。在早期胚胎中, 粘度约为3.5 帕. s, 据报道为23。
-
微珠圈闭刚度的确定
- 用光推拿器在细胞溶胶中捕获单个珠子。
- 在两个以0.5μm 分隔的陷阱位置之间以逐步方式移动珠子
- 确定微珠上的疏水阀刚度, 因为阻力系数与珠子从一个疏水阀位置到另一个疏水阀位置的松弛时间之间的比率。
注: 阻力系数是
, 
其中是在 (8.1) 中确定的粘度
和珠半径。放松时间是通过珠子位置的指数拟合获得的, 使用 matlab 或任何允许拟合的软件。在 200 mw 激光激励下, 疏水阀刚度的典型值为 120±50 pnμm-1。
-
细胞界面陷阱刚度的确定
- 将激光聚焦在接触线上, 并将其偏转 (如第6步中所述)。测量变形振幅。这应该在几个接触线上重复, 以获得具有代表性的平均值。
- 将所产生的变形与按接触线的珠子所引起的变形进行比较。由于变形与陷阱刚度成反比, 推导出细胞接触的陷阱刚度。
注: 细胞触点上的疏水阀刚度通常比珠子上的疏水阀刚度小2至 3倍 (直径 0.46μm)。
, 
其中是在 (8.1) 中确定的粘度
和珠半径。放松时间是通过珠子位置的指数拟合获得的, 使用 matlab 或任何允许拟合的软件。在 200 mw 激光激励下, 疏水阀刚度的典型值为 120±50 pnμm-1。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图 5显示了通过将正弦运动施加到陷阱而获得的实验数据。陷阱产生接口的偏转, 如显示3个连续接口位置的3个快照 (图 5a)23。录制的电影用于生成一个测速图 (图 5b), 并进一步分析以确定具有子像素分辨率的接口的位置, 使用沿每个帧的 x 方向的高斯拟合。在小变形的情况下, 陷阱和界面位置是成比例的 (图 5c)。接口偏转相对于陷阱的振幅 (图 5d) 提供了接口张力或刚度 (见步骤 7.1)。
图 6显示了通过执行拉释放实验获得的实验数据。光学疏水阀在距离两个单元之间接口中点约1μm 的地方打开, 这将导致接口向疏水阀位置偏转 (图 6a)24。然后在所需的时间后关闭陷阱。接口的位置 xm (图 6b) 是从 kymographs (图 6B) 获得的, 同样使用高斯与每个帧的 x 方向相匹配。生成的图可以与假设的流变模型进行比较, 例如, maxwell 模型 (图 6d)。
图 1: 光学推子 (红色路径) 设置与光片显微镜相结合的原理图.这一数字已从 bambardekar, k. 等人.23岁由照明单元和检测单元组成的光片显微镜在前面描述了 25个。光推子对应于该方案的红色部分: 红外激光通过一个光学快门和2个电流计, 控制陷阱在样品中的位置。在2个电流计之间放置一个1倍望远镜, 以保持它们之间的共轭。然后, 望远镜将光束的大小增加 2.5倍, 潜望镜将其提升到显微镜的高度。红外激光通过双色反射镜进入显微镜的检测目标。图中直接给出了光学元件之间的重要距离。最后一个镜头 (焦距500毫米) 与目标的后光圈之间的距离为500毫米. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 国产改进的导轨, 手持双色镜和热镜.显微镜的双色镜导轨已被切割在左侧, 以允许红外激光进入。二色镜反射红外光并传输可见光 (荧光)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 仪器与 ni 卡的连接.ao: 模拟输出, ai: 模拟输入, ao0 和 ai0 连接到 galvo1, ao1 和 ai1 连接到 galvo1, pfi0 连接到相机的火焰, 到 ai2 和 pfi1 连接到快门中的触发器, ai3 连接到快门外的触发器。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 观察上下文中的样本持有人.这一数字已从 chardès、c. 等人的报告中修改。25. 胚胎被固定在玻璃覆盖片上。幻灯片由样品支架固定。样品架插入玻璃杯中, 由固定在压电舞台上的支架固定。光板是水平的, 从侧面照亮胚胎。检测物镜是垂直的, 在样品上方, 并浸入试剂盒中。
图 5: 陷阱正弦运动施加的界面偏转.这一数字已从 bambardekar、k. 等人23修改。(a) 陷阱垂直于接口, 被正弦移动。陷阱和接口位置分别为 xt 和 xt。右侧面板显示了界面在不同位置的三个图像。激光陷阱位置用黄色箭头标记。接口用膜标记 (gap43:mcarer) 标记。(b) 沿轴的 kymograph, 由陷阱运动的方向 (垂直于接口) (周期 = 5秒) 定义。(c) 显示陷阱 (红色实线) 和界面位置 (黑色实线) 的偏转随时间变化的代表性图。(d) 在激光振荡的几个周期 (振幅 = 0.5μm, 周期 = 2 s) 中, 接口位置作为陷阱位置的函数。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 拉释放实验中的接口偏转.这一数字已从 serge、a. 等人处修改。24. (a) 陷阱在与接口中点的距离内打开, 然后再次关闭。(b) 陷阱和接口位置分别为 xt 和 xt。Kymographs 是沿着 x 方向生成的, 垂直于接触线的中点。(c) 拉释放实验的 kymot图。细胞接触被贴上了上旋血素的标签:: gfp。(d) 显示陷阱 (虚线红绿线) 和界面位置 (黑色实线) 的偏转与时间的代表性图。实线红线显示了使用类似麦克斯韦的流变模型24获得的拟合。请点击这里查看此图的较大版本.
补充电影 1:推特实验.像素大小 = 194 纳米, 10 fps, 陷阱振荡周期 = 2秒, 标签: Gap43::mCherry。请点击此处下载此文件.
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Discussion
光学推子允许以非侵入性的方式直接在发育中的胚胎上皮中进行绝对的机械测量。从这个意义上说, 它比激光消融等其他方法具有优势, 激光消融是侵入性的, 并提供了相对的测量、需要注射的磁力或力推断, 这些方法依赖于强有力的假设, 也提供了相对的测量。
该协议包括几个关键步骤。首先, 由于物镜可能显示色差, 并且激光陷阱将物体 "向下游" 推送, 因此必须检查红外激光是否将珠子捕获到成像平面中, 并最终对其进行校正 (步骤 2.18)。其次, 该方法依赖于细胞触点位置的测量。因此, 使用高对比度荧光标记是至关重要的。
物镜和激光束的质量是有效诱捕的关键。物镜的数值孔径应超过1.0。如果捕获无效, 请确保激光束填充物镜的后孔。
我们的方法有几个限制。首先, 不清楚究竟是什么为光学捕获提供了支持。虽然检测到折射率不匹配, 但其来源仍有待确定。其次, 校准过程, 如果一个人对绝对测量感兴趣, 可能会有点乏味, 因为它需要被动的微流变实验, 并校准珠子上的陷阱刚度。重要的是要认识到, 细胞触点刚度的校准受到实验不确定性的影响: 它依赖于对珠子上的陷阱刚度的测量, 而这些刚度只能在细胞触点附近进行测量。第三, 目前尚不清楚光学推拿能有多大的用途。虽然它们能够变形果蝇胚胎中的细胞, 但其他组织可能会出现更高的张力或更困难的进入 (如通过角质层), 因此不太适合光推特。
光学力很小 (& lt; 几十 pn), 因此可能不足以变形刚性或高度张力的结构。在这种情况下, 大颗粒上的磁性子可能会更有效。
我们在这里描述了光推子与光片显微镜的耦合, 但光学推子可以耦合到其他类型的显微镜, 如荧光或共聚焦纺丝盘显微镜。将红外捕获激光引入显微镜取决于显微镜的配置。它主要需要增加一个双色镜的可能性, 以结合图像和光学操作的路径。大多数显微镜公司提出模块化照明系统, 具有两层模块, 允许这种组合。
改进或升级该技术有几个方向。一种可能是将激光停留时间分成几个位置, 或使用更先进的全息技术, 以产生多个陷阱。这可能允许在目标细胞或细胞接触点上创建更复杂的力模式。另一个改进可能是在造成的偏转和陷阱的位置之间设计实时反馈。这可以允许适当的蠕变实验, 在整个实验过程中, 所施加的力保持不变。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 frm 设备 grant frm DEQ20130326509、国家政府机构的支持, 为 anr-11-bsv5-0008 (至 p. f. l.) 而代理。我们感谢法国国家研究机构支持的法国生物成像基础设施 (anr-10-inbs-04-01, "未来的投资")。我们感谢 picsl-联邦调查局基础设施的 brice detailleur 和 claude moretti 提供的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30 mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200 mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500 mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
References
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