Developmental Biology

Sondera Cell mekanik med pärla-fri optisk pincett i Drosophila embryot

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/57900

Claire Chardès*¹, Raphael Clement*¹, Olivier Blanc¹, Pierre-François Lenne¹

¹CNRS, Institut de Biologie du Développement de Marseille, Aix-Marseille Université

* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar en inställning av optisk pincett kopplat till lätta blad Mikroskop, och dess genomförande sond cell mekanik utan pärlor i Drosophila embryot.

Abstract

Morfogenes kräver samordning mellan genetiska mallning och mekaniska krafter att kraftfullt forma celler och vävnader. En utmaning att förstå morphogenetic processer är därför att direkt mäta cellulära styrkor och mekaniska egenskaper i vivo under embryogenes. Här presenterar vi en installation av optisk pincett kopplat till lätta blad Mikroskop, vilket gör att direkt tillämpa styrkor på cell-cell kontakter tidigt Drosophila embryot, medan imaging med en hastighet av flera bildrutor per sekund. Denna teknik har fördelen att det inte kräver en injektion av pärlor i embryot, vanligtvis används som mellanliggande sonder som optiska styrkor utövas. Vi detalj steg genomförandet av installationen och föreslår verktyg för att extrahera mekanisk information från experimenten. Genom att övervaka förskjutningarna av cell-cell kontakter i realtid, du kan utföra spänning mätningar och undersöka cell kontakters reologi.

Introduction

Embryonal utveckling är en mycket reproducerbara process under vilken de celler och vävnader deformera för att forma framtida djuret. Sådana deformationer har visat sig kräva aktiva generering av krafter på cell nivå¹^,². För att förstå morphogenetic processer under vilken celler och vävnader ändra sin form, är det därför nyckeln till bedöma de mekaniska egenskaperna hos cellerna som är involverade, och att mäta krafterna inom vävnaden under den process³^,⁴ . Epitelial skikt, särskilt i Drosophila, har studerats allmänt på grund av deras quasi-2D-geometri och deras lätt manipulation.

Ett antal tekniker har således utvecklats av oss och andra att bedöma epitelial mekanik i vivo under utveckling. Vi kommer att ge en snabb överblick över de tre huvudsakliga tekniker som används i epitelial vävnad. Laser ablation, en allmänt använd metod, tillåter för att avslöja den lokala mekanisk stressen på cell korsningar⁵^,⁶^,⁷^,⁸ eller större skala⁹^,¹⁰^,¹¹genom att utföra lokala nedskärningar som stör målet mekanisk integritet. Dynamiken i öppningen efter snittet ger information både på stress tidigare ablation, och reologi av vävnad¹²^,¹³. En nackdel med laser ablation är att det är invasiv, eftersom det kräver lokala störningar av cell cortex. Därför kan man endast utföra ett begränsat antal ablationer om man vill bevara vävnad integritet. En annan nackdel är att ablationer endast ge relativ uppskattningar av spänningen på Cellkontakter, eftersom öppningen hastigheten är beroende av viskös friktion, som i allmänhet inte är känd. Magnetisk manipulation har också utvecklats och används i Drosophila, som omfattar antingen användningen av ferrofluids¹⁴ eller ultramagnetic liposomer¹⁵. De kan ge absoluta mätningar¹⁶^,¹⁷, men är även invasiva i den meningen att de kräver injektion av sonder på önskad plats. Detta kan vara mycket svårt beroende på systemet, vilket inte alltid kan bli föremål för exakt injektioner. En tredje teknik, helt icke-invasiv, är kraft inferens¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Kraft inferens bygger på antagandet att mekaniska jämvikt på tredubbla poäng (tricellular korsningar eller hörn), och tillåter för att härleda spänningar på alla cell-cell kontakter (och eventuellt tryck i alla celler) av lösa ett inversa problem. För spänningar ger varje vertex två ekvationer (X och Y). Detta ger ett stort system av linjära ekvationer som kan inverteras under vissa förutsättningar att bedöma spänningen på alla Cellkontakter. Denna metod är mycket attraktiv, eftersom det endast krävs en segmenterad bild och ingen extra experiment eller setup, dess riktighet är ännu att bestämma medan igen det endast ger relativa värden, såvida inte en absolut kalibrering mätningen utförs.

För att övervinna några av dessa begränsningar, vi införa i denna artikel en inställning av optisk pincett kopplat till lätta blad Mikroskop gälla kontrollerade krafter i cell skala i embryonala epitelet i Drosophila melanogaster. Optisk pincett har använts för många biologiska applikationer inklusive mätningarna på enstaka proteiner och manipulation av organeller och celler²¹. Här rapporterar vi tillämpade styrkor i spänna av några dussin pN, vilket är små ännu tillräcklig för att framkalla lokala deformationer av cellkontakter och utföra mekaniska mått i vivo. Vi använder vanligtvis vinkelrätt omläggning av cellkontakter, övervakas genom analys av kymographs, för att relatera kraft till deformation. Ännu viktigare, kräver våra setup inte injektion av pärlor på önskad plats i vävnaden, som optisk pincett är kan direkt utöva krafter på cell-cell kontakter. Kopplingen av de optisk pincetten för att lätta blad Mikroskop gör att man kan utföra snabba imaging (flera bildrutor per sekund), vilket är mycket märkbar för en mekanisk analys på kort tidsskalor, och med minskad fototoxicitet, sedan belysning av den urvalet är begränsat med imaging²²plan.

Övergripande, optisk pincett är ett icke-invasivt sätt att tillämpa kontrollerade krafter på Cellkontakter in vivo i Drosophila embryot och extrahera mekanisk information såsom stelhet och spänningar på cell kontakter²³, reologiska egenskaper²⁴, och övertoning eller anisotropi spänning²³.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inrätta mikroskopet ljus ark

Se beskrivningen av inställningen i föregående publikation²⁵.
Obs: Installationen består av ett upprätt Mikroskop Stadium och en lättare plåt modul producerar ett ljus ark i horisontalplanet. En 10 X excitation objektiv leder ljus arket i en glas kyvetten (figur 4). Det upptäckt objektivet har en hög NA (1.1), som är nödvändig för effektiv tweezing (se nedan).

2. inrätta optisk pincett sökvägen

Obs: Figur 1 ger en systematik för den optiska setup.

Placera enheten 1070 nm laser och fixa fiber på optiska bordet med en V-clamp fäste. Säkerställa att den fiber kollimator är parallell till tabellen optiska (därav, horisontell) och att den höjd som väljs här blir höjden för alla optiska komponenter anpassas till tabellen optiska.
Obs: 100 mm kan vara ett bra val för denna höjd.
Vrid nyckeln av infraröd laserenheten och tryck på knappen ”Välj” Aktivera justering pekaren. Ljuset måste vara horisontella utgående av fiber.
Placera slutaren i den optiska vägen och fixa det till optiska bordet, så att IR laserstrålen passerar genom öppning av slutaren. Kontrollera att avståndet mellan tabellen optiska och centrera av bländaren på slutaren är höjden valt i steg 2.1.
Vrid nyckeln av slutaren handkontrollen, Välj det manuella läget med pilarna och tryck på knappen ”Aktivera” att öppna slutaren.
Placera, anpassa och fixa första galvanometer spegeln.
Obs: Två galvanometer speglar måste vara konjugerat till öppningens tillbaka i målet med upptäckt, så att när en av speglarna roterande, laserstrålen inte går ur öppningens tillbaka målet. Observera att avståndet mellan första galvanometer och tillbaka bländaren målet har beräknas för att utvärdera positionen för denna galvanometer i förhållande till målet (f1 + f1 + f2 + f2 + f3 + f3 + f4 + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = 1550 mm; fi = brännvidd av linsen n ° jag).
Slå på galvanometer strömförsörjningen. Se till att galvanometrar drivs för resten av protokollet justeringen.
Ange galvanometrar till noll nedböjning (med NIMAX eller optisk pincett programvara - se steg 3 för galvanometer anslutningar).
Placera, anpassa och fixa relä teleskopet består av de två objektiv med en brännvidd på 30 mm.
Placera, anpassa och fixa andra galvanometer spegeln. Observera att avståndet mellan de två galvanometrar 4f = 4 x 30 mm = 120 mm (f = brännvidd).
Placera och fixa teleskopet.
Obs: Teleskopet består av två linser som expanderar balken till en bredd som är minst lika med diametern av tillbaka objektivet. Objektivet med minsta brännvidd ska komma först.
Placera, anpassa och fixa den periscope föra uppåt den optiska vägen närmare till ingången av dichroic spegel järnväg.
Fixa varma spegeln i järnväg, placera skenan i mikroskopet. Se till att skenan är sågade på höger sida att tillåta ingången av infraröd laser (figur 2).
Kontrollera att laserljuset kommer ut ur mikroskopet, först utan målet därefter med målet. Korrigera lasern innan målet läge med botten avspegla av periskop. Korrekt position lasern efter syftet med översta spegeln av periscope.
Lägg 1 µL 500 nm fluorescerande pärlor i glas kyvetten och tillsätt 10 mL destillerat vatten. Sätt i kyvetten under målet i kyvetten hållaren och justera fokus för målet (Z position) så att målet vidrör vattenytan.
Starta programvaran förvärvet hemmagjord kontroll av AOTF, kameran och piezoelektriska scenen. En fri programvara såsom micromanager kan också användas. Vrid på den levande förvärv genom att trycka ”Live” tryckknappen.
Justera IR-lasereffekten till 1 W.
Sätta på glasögon (och ta inte bort den före slutet av experimentet) och slå på lasern. En pärla bör vara instängd på laser focus.
1. Om ingen pärla är fångade på laser focus, kontrollera om den Röd laserpekare (som är collinear med IR laser) kommer ur målet. Om inte, starta igen justering stegen, särskilt steg 2.13. Eller öka IR laser kraften.
2. Om pärlan är fångade ur fokus (av imaging planet), försiktigt flytta upp positionen för sist sista lins teleskop (L4 i figur 1) längs den optiska axeln att föra pärla i fokus med bildplanen. Om inte tillräckligt, flytta sist första lins teleskop (L3 i figur 1) längs den optiska axeln.
3. Om fångade pärla inte är centrerad i bilden, använda 2 periscope speglarna för att justera placering av fällan. Om positionen för kornet ändras genom att ändra vinkeln på första spegeln också kompensera riktning mot balken genom att ändra motsvarande vinkeln på andra spegeln. Korrigera X läge endast (1 skruv för varje spegel) och sedan rätta Y-position (1 skruv för varje spegel).
Om nödvändigt, justera position 2^nd teleskop linsen att iaktta pärlan i fokus.
Justera vinkeln på periscope speglarna har pärla centrerat i bilden om det behövs.

3. gränssnitt instrumentet

Obs: Figur 3 ger en systematiken i de nationella instrument (NI) kort anslutningarna.

Sätt i utdata kortet (NI-9263) i det första facket av chassit (cDAQ-9178). Observera att andra modeller av NI kort med minst 2 analoga utgångar och 3 analoga ingångar kan användas.
Sätt in kortet (NI-9215) i den andra platsen på chassit.
Ansluta första galvanometer till analog utgång AO0 och den analoga ingången AI0 med BNC kablar. Observera att en T-adapter kan användas för att ansluta 2 BNC kablar till en. Bruksanvisningen till den galvanometer att lokalisera stiften på styrelsens galvanometer drivrutin.
På samma sätt, ansluta andra galvanometer till AO1 och AI1.
Anslut PFI1 till den utlösande av slutare (baksidan av handkontrollen).
Anslut PFI0 till avfyra av kameran och AI2.
Anslut AI3 till utlösaren av slutaren (baksidan av handkontrollen).
Justera inställningarna för slutaren handkontrollen. Använd pilarna för att ändra parametervärdena och tryck på ”Välj” för att bekräfta valet och gå till nästa parameter. Sätta den ”tid öppna sec” parametern till 000.000, ”tiden stängt sec” till 000.000, ”mode” för singeln och ”trigger” EXT. Tillåt kontroll av slutaren genom att trycka på knappen ”Aktivera”.
Öppna QtCreator (hämtat från https://www.qt.io/, gratisversionen).
Obs: QtCreator är den integrerade utvecklingsmiljön används för att utveckla i C++ optisk pincett programvaran. Qt-bibliotek används här att skapa widgets.
Öppna filen OT.pro (som tillhandahålls i Qt kodfilerna). Denna åtgärd kommer att öppna projektet. Ändra namnet på indata och utdata i filen AOGenerator.cpp enligt korten som NI använde.
Kompilera och köra programmet OT.

4. kalibrering av optisk fälla placerar med pärlor

Inspelning av en kalibrering film
1. Sätt 1 µL 500 nm röd fluorescerande pärlor i glas kyvetten, sedan fylla kyvetten med 10 mL destillerat vatten. Figur 4 ger en översikt av kyvetten inom ramen för observation.
2. Fixa kyvetten på piezoelektriska scenen.
3. Justera Z position i kyvetten så att syftet upptäckt doppar i vattnet.
4. Slå på infraröd laser och ange makt till 1 W.
5. Slå på förvärvet bildbehandlingsprogram.
6. För att förvärva tid bilder, Välj exponeringstiden, vinsten, tiden mellan två bilder, antalet bilder som skall förvärvas och laser makt. Observera att för optisk pincett kalibrering med pärlor, belysning laser (561 nm) krävs inte. 2-photon effekten induceras av infraröd laser är tillräckligt för att excitera fluorescensen av en instängd pärla.
7. Starta programvaran optisk pincett hemmagjord.
8. Ange parametrarna optisk pincett att spåra en cirkel. Ange SamplingRate som 250 samp/s, bufferSize som 1000, Waveform1 parametrar (galvo 1) som sinus, nbPeriod 1, amplitud 0,5 V, fas 0,0 rad, Offset 0,0 V, vågform 2 parametrar (2 galvo) som sinus, nbPeriod 1, amplitud 0,5 V, fas 1,57 rad, Offset 0,0 V.
9. Kontrollera rutan ”AI parametrar” och ”vänta på det”... rutan.
10. Börja bild förvärv (500 eller 1000 bilder med en hög bildhastighet, såsom 10 fps).
11. Slå på optiska pincetten genom att trycka på knappen ”generera”!.
12. Tillåta de fångade pärlan att slutföra minst två fulla cirklar och stoppa den optisk pincetten av un-trycka på ”Generera”! knappen.
13. Stoppa bild förvärv. Observera att en tiff-film och en textfil med galvanometer spänningar skapas i standard ”C:/TEMP /” mapp (om inte en anpassad plats anges). Observera att flera kalibrering filmer med associerade datafiler kan skapas om det behövs.
  1. Om cirkeln inte är komplett, går kornet förlorad under cirkel banan. Kanske är hastigheten för hög. Minska den genom att minska samplingsfrekvensen i OT-programvaran. Eller, kontrollera med hjälp av den röda laserpekare av infraröd laser om lasern kommer ur målet under hela cirkeln banan. Om så inte är fallet, galvanometer speglarna kan inte vara konjugerat med tillbaka fokalplanet av objektivet. Korrigera positionerna för galvanometrar i förhållande till tillbaka fokalplanet målet, start igen justering anvisningarna från steg 2.5.
14. Ange amplituderna till noll och slå på laser för att fälla en pärla på en fix position. Placera ett landmärke på fällan plats.
Ställning interpolation med bildanalys
1. Öppna Matlab, gå till mappen kalibrering och kör skriptet ”position2tension” (tillhandahålls i Matlab-kodfiler). Detta skript beräknar funktionen interpolation översätta galvanometer spänningar till optisk fälla position.
2. Välj antalet kalibrering filmer kommer att användas. Flera filmer kan väljas med olika bollbanor, såsom två vinkelräta ellipser. En enda kalibrering film med en cirkulär bana är i allmänhet tillräckligt.
3. Ge den första och sista bilden nummer i dialogrutan (en dialogrutan per film), sekvenser med en tydlig bana och bra signal-brus-förhållande.
4. Ange sökvägen för den textfil som innehåller spänningar under förvärv för varje film. Observera att manuset läser filen och beräknar de genomsnittliga spänningarna på de två galvanometrar för varje bild.
5. Anger du sökvägen till motsvarande kalibrering filmen.
  Obs: Skriptet identifierar pärla för varje bildruta med en subpixel upplösning genom att montera en 2D Gaussisk till pärlan, med anpassade funktioner och funktioner som utvinns från MTT²⁶. Det visar ett diagram över pärla banan.
6. Eliminera helst dåligt upptäckta (outliers) genom att klicka på den.
7. Kontrollera om interpolering karta för x och y laser positioner beräknas och visas av skriptet, är klar. Om det finns en hel del Saknade värden (vit regioner i kartan), upprepa operationen med en ny kalibrering film, med en bättre signal-brus-förhållande, eller / och med en långsammare hastighet på galvanometrar.
  Obs: Dessa bilder och interpolation värdena sparas automatiskt i samma mapp som bilden, med den namnet convertFct.mat.

5. montering Drosophila embryon²⁷

Samla in Drosophila embryon från en bur, inkuberas vid 25 ° C.
Ta bort jästen, passerar plattan innehållet genom en sil (porstorlek bör vara ca 100 µm).
Tvätta embryona med 100% blekmedel (2,6% natriumhypoklorit) för 45 s ta bort chorion.
Tvätta embryona med vatten i 2 min.
Embryona pålagt en agar-pad med en borste.
Välj ca 10 embryon enligt önskad scenen och justera embryona med en gädda eller en fuktig pensel.
Obs: Justering bör göras enligt regionen av intresse (region av intresse så nära som möjligt till målet upptäckt).
Använda en diamant-märkning penna, skär en bit av en glasskiva 10 x 20 x 1 mm³.
Lägg lim på ena sidan av den avskurna pappersbiten, och låt det torka i 20 s.
Vänd den avskurna pappersbiten och placera det på raden av embryon, att hålla det vid kanten av bilden.
Installera denna beredning i provhållaren och placera den i kyvetten. Figur 4 ger en översikt av kyvetten i observation sammanhang.
Sätta i kyvetten på piezoelektriska scenen.

6. svällning Experiment In Vivo

Svällning av cellkontakter — svängningar (figur 5)
1. Hitta platsen för intresse i vävnaden.
  Obs: Använder flugor där cadherins är märkta kan vara till hjälp om man behöver arbeta i symmetriplan adherens föreningspunkter.
2. Flytta den målet junction mittpunkten på fällan position (landmark Ställ i steg 4.1.14) använder piezo scenen.
3. Ange parametrar för fällan att uppnå svängningarna vinkelrätt mot kontaktledningen. Ange faserna som noll. Som amplituderna av X och Y riktningar ha en rörelse vinkelrätt mot kontaktledningen. Amplituden bör normalt 0,1 V.
4. Starta förvärvet (med en snabb bildhastighet, såsom 10 fps).
5. Slå på optiska pincetten att trycka på knappen ”generera”!.
6. När klar, Stäng av pincett och stop bild förvärv. En film och en textfil som innehåller galvanometer spänningar under förvärv ska nu visas i den angivna mappen.
7. Svällning av cellkontakter — pull-release (figur 6)
8. Hitta platsen för intresse i vävnaden.
9. Flytta målet korsningen med piezo scenen så att dess mittpunkt är typiskt 1 µm från den fälla positionen (landmark Ställ i steg 4.1.14).
10. Ange amplituderna 0 att ha en stadig fälla.
11. Börja bild förvärv (med en snabb bildhastighet, såsom 10 fps).
12. Slå på optiska pincetten att trycka på knappen ”generera”!.
13. Efter önskad tid, stänga av fällan och väntar avkoppling att inträffa.
14. Stoppa bild förvärv. En film och en textfil som innehåller galvanometer spänningar under förvärv ska nu visas i den angivna mappen.
Halvautomatisk kymograph generation och detektering av gränssnitt ståndpunkt.
1. I kommandofönstret Matlab Ladda interpolation kartan genereras under kalibreringen (4b): load('convertFct.mat'). Detta ger variablerna fx och fy.
2. Kör autokymo(fx,fy), i Matlab kodfilerna i kommandofönstret Matlab. Syftet med denna funktion är att generera en kymograph längs laser banan och upptäcka placeringen av kontaktledningen med subpixel upplösning för varje bildruta.
3. Välj sökvägen till uppmanas text som innehåller spänningsvärden.
4. Välj den första och sista bildrutenummer av filmen för att analyseras.
5. Välj tiff filmfilen. Två nya siffror visas: den första är en bild av kymograph. Den andra är en graf över detektion av kontakt linje och laser positioner kontra bildnumret.
  Obs: Funktionen sparar diagrammet som representerar positionen för provet och laser kontra bildnumret (matlab figur, jpg), kymograph (tiff-bild) och kymograph ställning med laser (tiff-bild). För stadig fälla experiment har kymograph göras manuellt, till exempel med ImageJ. Påvisande av gränssnittet från kymograph kan sedan göras med samma algoritm.

7. mekaniska mätningar

Stelhet och spänningar mätningar
1. Utföra en svängning experiment (steg 6.1) och motsvarande analys (steg 6.3) av en tidsfördröjd videosekvens.
2. Rita gränssnitt position som en funktion av fällan position använda Matlab tomt funktion eller data plottning programvara.
  Obs: Detta bör vara ungefär linjär.
3. Utföra en linjär passar, använda Matlab ”ezfit” gratis verktygslåda eller någon programvara som möjliggör passar. Inversen av passformens lutning ger det genomsnittliga förhållandet .
4. Utföra beräkningar av uppenbara böjstyvheten för gränssnittet, som, förutsatt att små deformationer och en kvadratisk potential för svällning, ges av . är fällan styvheten (se steg 8 för fällan stelhet kalibrering).
5. Utföra beräkningar av spänningen, som kan definieras som²³:
  .
Reologiska mätningar
1. Utföra pull release experiment (steg 6,2) och motsvarande analys (steg 6.3)
2. Passa den resulterande kurvan med den anpassa reologiska modellen.

8. kalibrering av Trap styvheten

Obs: Bestämning av absoluta styrkor kräver kunskap om fällan styvheten på gränssnitt. Detta kan nås med hjälp av pärlor genom ett tvåstegsförfarande.

Bestämning av cytosol viskositet
1. Placera embryona i halocarbon olja och injicera dem med hjälp av en Mikroskop setup med fluorescerande polystyren pärlor (1:1, 000 lager utspädning, 0,46 µm diameter)²³^,²⁷.
2. Placera de injicerade embryona under mikroskopet.
3. Följa utvecklingen av enstaka pärlor finns i cytosolen. Extrahera mean square förskjutningen av pärlor (Använd ett stort antal banor > 100 pärlor). Bestäm konstanten pärla diffusion från sluttningen av mean square förskjutningen. Avser viskositet konstanten diffusion av Stokes-Einstein ekvation, härleda cytosolen effektiv viskositet. I det tidiga embryot är en viskositet på cirka 3,5 Pa.s rapporterade²³.
Bestämning av fällan stelhet på pärlor
1. Fälla enstaka pärlor i cytosolen med optisk pincett.
2. Flytta pärlan i en stegvis sätt mellan två fälla positioner åtskilda av 0,5 µm
3. Bestämma fälla styvheten på pärlor, som förhållandet mellan luftmotståndskoefficienten och pärla avkoppling tid från en fälla position till en annan.
  Obs: Luftmotståndskoefficienten är , där är viskositeten bestämmas i (8.1) och pärla radien. Den avkoppling tid erhålls från exponentiell passar pärla ställning, använda Matlab eller någon programvara som möjliggör passar. Typiska värden för fällan styvheten är 120 ±50 pN.µm^-1på 200 mW laser excitation.
Bestämning av fällan stelhet på cell gränssnitt
1. Fokusera laser på en kontaktledning och avleda det (som beskrivs i steg 6). Mäta deformation amplituden. Detta bör upprepas på flera kontaktledningar att få ett representativt medelvärde.
2. Jämför den producerade deformationen med som induceras av pärlor som trycks mot kontaktledningar. Eftersom deformationen är omvänt proportionell mot fällan styvheten, härleda fälla styvheten på Cellkontakter.
  Obs: Fälla styvheten på Cellkontakter var vanligtvis finns 2 - till 3 - faldig mindre än på pärlor (0,46 µm diameter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 visar experimentella data som erhållits genom att införa en sinusformad rörelse till fällan. Fällan producerar en nedböjning av gränssnittet, som exemplifieras av 3 ögonblicksbilder visar 3 på varandra följande gränssnitt positioner (figur 5A)²³. Inspelade filmer används för att generera en kymograph (figur 5B) och analyseras ytterligare för att bestämma positionen för gränssnittet med subpixel upplösning, använder en Gaussisk plats utmed x riktning för varje bildruta. I ordning för små deformationer, trap och gränssnitt placerar är proportionell (figur 5 c). Amplituden på den gränssnitt deformationen i förhållande till fällan (figur 5 d) ger tillgång till gränssnittet spänningar eller stelhet (se steg 7.1).

Figur 6 visar experimentella data erhållits genom att utföra pull släpp experiment. Optiska fällan slås på cirka 1 µm från mittpunkten av gränssnittet mellan två celler, som orsakar gränssnittet för att avleda mot den fälla position (figur 6A)²⁴. Fällan är sedan avstängd efter önskad mängd tid. Till position xm av gränssnittet (figur 6B) erhålls från kymographs (figur 6 c), igen med Gaussisk passar längs x riktning för varje bildruta. Resulterande grafen kan jämföras med hypotetiska reologiska modeller, exempelvis en Maxwell modell (figur 6 d).

Figur 1: Schematisk bild av inställningen för optisk pincett (röd bana) kombinerat med mikroskopet ljus ark. Denna siffra har ändrats från Bambardekar, K. et al. ²³. Ljusa blad mikroskopet, komponerad av belysning enheten och enheten upptäckt, beskrivs tidigare²⁵. Optiska pincetten motsvara den röda delen av systemet: infraröd laser passerar genom en optisk slutare och 2 galvanometrar som styr placeringen av fällan i provet. En 1-fold teleskop placeras mellan de 2 galvanometrar att hålla konjugationen dem emellan. Sedan ett teleskop ökar storleken på balken av 2,5 gånger och periscope ger det till höjden av mikroskopet. Infraröd laser in syftet upptäckt av mikroskopet tack vare en dichroic spegel. Viktigt avstånd mellan optiska element ges direkt i figuren. Avståndet mellan det sista objektivet (brännvidd 500 mm) och tillbaka bländaren målet är 500 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2: Hemmagjord modifierade järnväg holding dichroic spegeln och heta spegeln. Dichroic spegel järnväg av mikroskopet har skurits på vänster sida för att tillåta ingången av infraröd laser. Dichroic spegeln reflekterar infraröd ljus och överför det synliga ljuset (fluorescens). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: anslutning av instrument som NI korten. AO: analog utgång, AI: analog ingång, AO0 och AI0 är anslutna till galvo1, AO1 och AI1 är anslutna till galvo2, PFI0 är ansluten till kameran för att AI2 eld och PFI1 är anslutna till utlösaren i av slutaren och AI3 är anslutna till utlösaren av slutaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: provhållaren i samband med observation. Denna siffra har ändrats från Chardès, C., et al. ²⁵. embryon är orörlig på täckglaset. Bilden hålls av provhållaren. Provhållaren infogas i glas kyvetten, innehas av innehavaren fast till piezoelektriska scenen. Ljus arket är horisontell och belyser embryona från sida. Det upptäckt objektivet är vertikal, ovanför provet, och doppar in i kyvetten.

Figur 5: gränssnitt deformationen som införts av sinusformade rörelse av fällan. Denna siffra har ändrats från Bambardekar, K. et al²³. (A), fällan flyttas sinusformigt vinkelrätt mot gränssnittet. Fälla och gränssnitt placerar är xt och xm, respektive. De högra panelerna visar tre bilder av gränssnittet på olika positioner. Laser fälla position markeras med en gul pilspets. Gränssnittet är märkta med en membran markör (GAP43::mcherry). (B) Kymograph längs den axeln som definieras av rörelseriktning fällan (vinkelrätt mot gränssnittet) (Period = 5 s). (C) representativa tomt nedböjning kontra tid visar både fälla (röda linjen) och gränssnitt positioner (svart heldragen linje). (D) gränssnitt placerar som en funktion av fällan placerad under några cykler av laser svängning (amplitud = 0,5 µm, Period = 2 s). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: gränssnitt nedböjning i pull-release experiment. Denna siffra har ändrats från Serge, A., et al. ²⁴. (A), fällan är påslagen på avstånd från mittpunkten av gränssnittet, sedan stängs av igen. (B) de fälla och gränssnitt positionerna är xt och xm, respektive. Kymographs genereras längs x riktning, vinkelrätt mot kontaktledningens mittpunkt. (C) Kymograph av en pull-release experiment. Cellkontakter är märkta med Utrophin::GFP. (D) representativa tomt nedböjning kontra tid visar både fälla (prickad röd/grön linje) och gränssnitt position (svart heldragen linje). Den röda linjen visar en passform som erhållits med en Maxwell-liknande reologiska modell²⁴. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Movie 1: Tweezing experiment. Pixelstorlek = 194 nm, 10 fps, fälla svängning period = 2 s, märkning: Gap43::mCherry. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optisk pincett låt utför absoluta mekaniska mätningar direkt i utvecklingsländer embryonala epitelet i ett icke-invasivt sätt. I det avseendet presenterar den fördelar jämfört med andra metoder såsom laser ablation, som är invasiva och ger relativa mätningar, magnetiska krafter, som kräver injektioner, eller tvinga inferens, som bygger på starka antaganden och erbjuder också relativa mätningar.

Protokollet innehåller några kritiska steg. Först, som objektivet kan visa kromatisk aberration och att laser fällan skjuter objektet ”nedströms”, är det viktigt att kontrollera att IR laser fällor pärla i imaging planet, och så småningom rätt för det (steg 2.18). Det andra bygger metoden på mätningar av den cell kontakters position. Således är det viktigt att använda en hög kontrast fluorescerande markör.

Kvaliteten på objektivet och laserstrålen är kritiska till effektiva fångstmetoder. Den numeriska bländaröppningen av objektivet bör överstiga 1,0. Om svällning är ineffektiva, kontrollera att laserstrålen fyller bakre bländaren på objektivet.

Vår metod kommer med flera begränsningar. Först, det är inte klart vad exakt ger stöd för optiska svällning. Även om en obalans av brytningsindex upptäcks, återstår dess ursprung fastställas. Andra kan kalibreringsprocessen, om man är intresserad av absoluta mätningar, vara lite tråkigt, eftersom det kräver passiva microrheology experiment och kalibrering av fällan styvheten på pärlor. Det är viktigt att inse att kalibrering av styvheten på Cellkontakter är experimentell osäkerhet: det bygger på mätningar av fällan styvheten på pärlor, som kan mätas endast i cytosolen, men inte nära Cellkontakter. Det tredje är det oklart hur mångsidig optisk pincett kan vara. Även om de har möjlighet att deformera cellerna i Drosophila embryot, kan andra vävnader uppvisa högre spänning eller svårare tillgång (t.ex. gå igenom ett nagelband) och därför vara mindre mottagliga för optisk tweezing.

Optiska krafter är små (< några tiotals pN) och kan således vara otillräcklig att deformera stel eller mycket spända strukturer. Magnetisk pincett på stora partiklar skulle förmodligen vara mer effektiv i detta fall.

Vi beskrivs här kopplingen av optisk pincett till ett ljus ark Mikroskop, men optisk pincett kan kopplas till andra typer av Mikroskop, såsom en epifluorescence eller en confocal spinning disk Mikroskop. Införandet av IR svällning lasern i mikroskopet beror på konfigurationen av mikroskopet. Det kräver främst möjligheten att lägga till en dichroic spegel för att kombinera sökvägar för bildhantering och optiska manipulation. De flesta mikroskopi företag föreslår modulära belysning system, med en två-lagers modul, som tillåter denna kombination.

Flera håll finns för att förbättra eller uppgradera tekniken. En möjlighet är att dela upp laser uppehållstid bland flera positioner eller för att använda mer avancerade holografisk tekniker, för att producera flera fällor. Detta möjliggör för att skapa mer komplexa kraft mönster på målceller eller Cellkontakter. En annan förbättring kan vara att utforma en återkoppling i realtid mellan den deformationen orsakas och placeringen av fällan. Detta kan möjliggöra korrekt krypning experiment där den kraft som anbringas hålls konstant under hela försöket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av en FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (till s.-F.L.). Vi erkänner Frankrike-BioImaging infrastruktur stöds av franska National Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringar för framtiden»). Vi tackar Brice Detailleur och Claude Moretti från PICSL-FBI infrastrukturen för tekniskt bistånd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW	IPG Laser	YLM-10-LP-SC	including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser
Ø1/2" Optical Beam Shutter	Thorlabs	SH05
Small Beam Diameter Galvanometer Systems	Thorlabs	GVS001	1 for X displacement, 1 for Y displacement
1D or 2D Galvo System Linear Power Supply	Thorlabs	GPS011	galvanometers power supply
2 lenses f = 30 mm	Thorlabs	LB1757-B	relay telescope between 2 galva
Lens f = 200 mm	Thorlabs	LB1945-B	2.5X telescope
Lens f = 500 mm	Thorlabs	LB1869-B	2.5X telescope
Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes	Thorlabs	KCB1E	Periscope
Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style	Thorlabs	LG1
45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror	Edmund Optics	#64-470
Multiphoton-Emitter HC 750/S	AHF	HC 750/SP
CompactDAQ Chassis	National Instruments	cDAQ-9178
C Series Voltage Output Module	National Instruments	NI-9263	Analog output module
C Series Voltage Input Module	National Instruments	NI-9215	Analog input module
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids	ThermoFisher Scientific	F8812	calibration beads
C++ (Qt) home made optical tweezers software			developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).
Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).

Developmental Biology

Sondera Cell mekanik med pärla-fri optisk pincett i Drosophila embryot

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.