Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/57900
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1CNRS, Institut de Biologie du Développement de Marseille, Aix-Marseille Université
* These authors contributed equally

Summary

Biz Optik cımbız hafif levha mikroskop ve hücre mekaniği Drosophila embriyo boncuklar olmadan soruşturma için uygulanması için birleştiğinde bir kurulumu mevcut.

Abstract

Morfogenez genetik desenlendirme ve sağlam hücre ve dokuların şekillendirmek için mekanik kuvvetleri arasındaki koordinasyon gerektirir. Bu nedenle, morfogenetik süreçleri anlamak için bir meydan okuma doğrudan hücresel kuvvetler ve mekanik özellikleri içinde vivo embriyogenez sırasında ölçmek etmektir. Burada, bir Kur Optik cımbız doğrudan kuvvetleri erken Drosophila embriyo hücre-hücre kişiler üzerinde uygulamak için izin verir, bir hafif levha mikroskop birleştiğinde mevcut görüntüleme birkaç kare / saniye hızında iken. Bu teknik genellikle orta sonda üzerinde optik kuvvetleri sarf kullanılan embriyo içine boncuk enjeksiyon gerektirmeyen avantajı vardır. Biz adım adım Kur uygulanması ayrıntı ve deneylerden mekanik bilgi ayıklamak için araçlar önermek. Hücre-hücre kişiler gerçek zamanlı talebiyle izleyerek, bir gerilim ölçümleri gerçekleştirmek ve hücre kişilerinizin Reolojisi araştırmak.

Introduction

Embriyonik gelişim sırasında hücre ve dokulara gelecekteki hayvan şekli deforme son derece tekrarlanabilir bir süreçtir. Bu tür deformasyonlar güçler hücre düzey1,2de etkin nesil gerektirecek şekilde gösterilmiştir. Morfogenetik işlemleri sırasında hücre ve dokuların onların şekli Dönüştür anlamak için o bu nedenle hücreleri ilgili mekanik özelliği değerlendirmek ve doku içinde güçler sırasında işlem3,4 ölçmek için anahtarıdır . Epitel katmanlarda, özellikle Drosophila, yaygın olarak onların yarı-2D geometri nedeniyle ve onların kolayca idare incelenmiştir.

Bir takım teknikler böylece bize ve diğer geliştirme sırasında epitel mekaniği vivo içinde değerlendirmek için tarafından geliştirilmiştir. Biz üç ana teknikleri içinde epitel doku kullanılan hızlı bir bakış verecektir. Yerel mekanik stres hücre kavşak5,6,7,8 veya daha büyük ölçekli9,10,11 ortaya çıkarmak için lazer ablasyon, yaygın olarak kullanılan bir yöntem sağlar hedef mekanik bütünlüğünü bozmaya yerel kesim yaparak. Kesme takip açılış dinamikleri stres önceki ablasyon hem doku12,13Reolojisi bilgi sağlar. İse bir lazer Ablasyon yerel bozulma hücre korteksin gerektirdiği invaziv, dezavantajıdır. Bir doku bütünlüğünün korunması istiyorsa bu nedenle, biri yalnızca ablations sınırlı sayıda yapabilirsiniz. Başka bir dezavantajı açılış hızı genellikle bilinmemektedir viskoz sürtünme üzerinde bağımlı olduğundan ablations sadece gerginlik, hücre kişiler, göreli tahminleri sağlamak olduğunu. Manyetik manipülasyon ayrıca geliştirilmiş ve ferrofluids14 kullanımı ya da ultramagnetic lipozomlar15içeren Drosophilaiçinde kullanılan. Mutlak ölçümler16,17sağlayabilirsiniz, ancak aynı zamanda invaziv Onlar sonda istediğiniz yere, enjeksiyon gerektirir anlamda. Bu her zaman hassas enjeksiyon için müsait değildir sistemine bağlı olarak çok yanıltıcı olabilir. Üçüncü bir teknik, tamamen non-invaziv, kuvvet çıkarım18,19,20' dir. Kuvvet çıkarım mekanik (tricellular kavşak veya köşeleri) puan Equilibrium'da varsayımına dayanır ve gerilimler hiç hücre-hücre kişiler (ve muhtemelen, baskılar tüm hücrelerdeki) tarafından ters bir problem çözme tahmin etmesine olanak verir. Gerginlikler için her köşe iki denklemler (X ve Y) sağlar. Bu gerginlik, tüm hücre kişileri değerlendirmek için bazı koşullar altında ters Lineer Denklem büyük bir sistem verir. Sadece kesimli bir görüntü ve hiçbir ilave deney veya kurulum gerektirir gibi bu yöntem çok çekici olmakla birlikte, onun doğruluğunu henüz tespit etmektir ve tekrar sadece sürece bir mutlak kalibrasyon ölçüm gerçekleştirilir göreli değerleri sağlar.

Bazı bu sınırlamalar üstesinden gelmek için biz tanıtmak bu makalede bir Kur Optik cımbız kontrollü güçler Drosophila melanogasterembriyonik epitel hücre ölçeğinde de uygulamak için hafif levha mikroskop için birleştiğinde. Optik cımbız tek protein ve organelleri ve hücreleri21manipülasyon üzerinde ölçümler de dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik uygulamaları için kullanılmaktadır. Burada, küçük bir kaç düzine pN aralığında uygulanan kuvvetler raporu henüz yerel deformasyonlar hücre kişileri ikna etmek ve mekanik ölçümler vivo içindegerçekleştirmek yeterli. Genellikle, hücre kişileri, kymographs, analizi ile izlenen dik sehimi kuvvet deformasyon için ilişkilendirmek için kullanılır. Önemlisi, Optik cımbız doğrudan kuvvetleri hücre-hücre kişiler üzerinde uygulamak için güçlü olduğu gibi bizim ayarlarına boncuk doku, istenen konumda enjeksiyon gerektirmez. Hafif levha mikroskop için Optik cımbız kaplin bir aydınlatma beri çok kayda değer bir mekanik analiz kısa süre ölçekler ve azaltılmış fototoksisite, hızlı görüntüleme (birkaç kare / saniye), gerçekleştirmek izin verir örnek22Imaging uçak için sınırlıdır.

Genel olarak, Optik cımbız bir non-invaziv kontrollü güçler hücre kişiler içinde Drosophila embriyo vivo de uygulamak için ve sertlik ve hücre kişiler23, gerginlik rheological Özellikler gibi mekanik bilgileri ayıklamak için bir yoludur 24ve degrade veya anizotropi gerginlik23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ayarlama hafif levha mikroskop

  1. Önceki yayın25kurulumunun açıklamasını bakın.
    Not: Kurulum bir dik mikroskop sahne ve yatay düzlemde hafif bir levha üreten bir hafif levha modülü oluşur. 10 X uyarma objektif lens hafif levha cam küvet (Şekil 4) yönlendirir. Algılama objektif lens verimli (aşağıya bakın) tweezing için gerekli olan yüksek NA (1.1), var.

2. ayarlama Optik cımbız yolu

Not: Resim 1 optik kurulum genel düzeninin verir.

  1. 1070 nm lazer birim yerleştirin ve fiber optik masada bir V-kelepçe montajı ile düzeltmek. Fiber kolimatör görme duyusuyla ilgili tabloya paralel olduğundan emin olun (Bu nedenle, yatay) ve burada seçilen yükseklik yükseklik optik bileşenleri için olacak uyumlu optik masaya.
    Not: 100 mm bu yükseklik için iyi bir seçim olabilir.
  2. Kızılötesi lazer birim anahtarı çevir ve hizalama imleci açmak için "Seç" düğmesine basın. Işık yatay lif giden olmalı.
  3. Çekim optik yol yerleştirin ve böylece kızılötesi lazer ışını çekim diyafram geçer optik tabloya düzeltebilirim. Optik tablo arasındaki mesafeyi sağlamak ve obtüratör diyafram adım 2.1 seçilen yükseklik merkezidir.
  4. Çekim denetleyicisi anahtarı çevir, okları ile el ile modunu seçin ve objektif kapağı açmak için "Olanaklı kılmak" düğmesine basın.
  5. Yer, hizalama ve ilk galvanometre ayna düzeltmek.
    Not: bir aynalar dönen zaman, lazer ışını dışında amacın diyafram geri gitmek değil böylece iki galvanometre aynalar için algılama amacın diyafram arka Birleşik var. Not ilk galvanometre ve amacın arka diyafram arasındaki mesafe bu galvanometre amacı ile ilgili olarak konumunu değerlendirmek için hesaplanacak vardır (f1 f1 + f2 + f2 + f3 + f3 + f4 + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = 1550 mm; fi = odak uzaklığı objektif n ° ben).
  6. Galvanometre güç kaynağı açın. Galvanometreler hizalama Protokolü kalanında güç vardır emin olun.
  7. Galvanometreler sıfır saptırma için ayarlayın (bkz. Adım 3 galvanometre bağlantıları için NIMAX veya Optik cımbız yazılım - ile).
  8. Yer, hizalama ve geçiş teleskop iki lenslerin 30 mm odak uzunluğu ile oluşan düzeltmek.
  9. Yer, hizalama ve ikinci galvanometre ayna düzeltmek. İki galvanometreler arasındaki mesafe 4f olduğunu unutmayın 4 x 30 mm = 120 mm = (f = odak uzaklığı).
  10. Yerleştirin ve teleskop düzeltmek.
    Not: Teleskop kiriş genişliği en az objektif lens arka diyafram çapı eşit için genişletin iki lens oluşur. En küçük odak uzaklığı ile objektif önce gelir.
  11. Yer, hizalayın ve yukarı doğru optik yol daha yakın Dikroik ayna demiryolu girişine getiren Periskop düzeltmek.
  12. Sıcak ayna demiryolu düzeltmek, demiryolu içinde mikroskop yer. Demiryolu kızılötesi lazer (Şekil 2) girişine izin vermek için sağ taraftaki testereyle emin olun.
  13. Lazer ışık mikroskobu dışında ilk amacı olmadan sonra amacı ile gidiyor kontrol edin. Amaç önce lazer konumunu Periskop alt ayna ile düzeltin. Amacı ile periskop üst ayna sonra lazer konumunu düzeltin.
  14. 1 µL 500 nm floresan boncuk cam küvet koyun ve 10 mL distile su ekleyin. Amaç altında Küvet Küvet tutucu içinde koymak ve amaç su yüzeyine dokunduğundan (Z pozisyon) objektif odak noktası ayarlayın.
  15. Kontrol AOTF, kamera ve piezoelektrik sahne satın alma ev yapımı yazılımını başlatın. Micromanager gibi ücretsiz bir yazılım da kullanılabilir. Canlı satın alma modunu "Live" buton basarak açın.
  16. IR lazer güç 1 W. için ayarlamak
  17. Gözlük koymak (ve bu deney sona ermeden çıkarmak değil) ve üzerine lazer geçiş. Bir boncuk lazer odak kapana.
    1. Eğer hiçbir boncuk lazer odak tuzak, (IR laser ile collinear olan) kırmızı lazer işaretçi amaç dışında geliyor Eğer kontrol edin. Aksi takdirde, hizalama adımları yeniden başlatın, bilhassa 2,13 adım. Ya da, IR lazer gücü arttır.
    2. Boncuk (görüntüleme uçağın) odak dışında kalmış, yavaşça son son objektif konumunu taşıyın boncuk görüntüleme uçak ile odak getirmek için optik eksen boyunca teleskop ( Şekil 1' deki L4). Eğer değil yeterli, hareket son ilk lens optik eksen boyunca ( Şekil 1' deki L3) teleskop.
    3. Kapana kısılmış boncuk resimdeki merkezli değil, 2 Periskop aynaları tuzak konumunu ayarlamak için kullanın. Ayrıca boncuk konumunu ilk ayna açısını değiştirerek değiştirdiyseniz, ışın yönünü ikinci ayna karşılık gelen açısını değiştirerek telafi. X konumunu sadece (her ayna için 1 vida) düzelttikten sonra Y konumu (her ayna için 1 vida) düzeltmek.
  18. Gerekirse, boncuk odak gözlemlemek için 2nd teleskop objektif konumunu ayarlayın.
  19. Gerekirse, görüntü ortalanmış boncuk için Periskop aynaları açısını ayarlayın.

3. araç arayüz oluşturma

Not: Resim 3 Ulusal aletleri (NI) kart bağlantıları genel bir düzen verir.

  1. Çıkış kartı (NI-9263) Şasi (cDAQ-9178) ilk yuvaya takýn. Not diğer modelleri NI kartları en az 2 analog çıkış ve 3 analog giriş ile kullanılabilir.
  2. Giriş kartı (NI-9215) Şasi ikinci yuvaya takýn.
  3. İlk galvanometre analog için bağlamak AO0 ve analog giriş AI0 BNC kablo ile çıktı. Not bir T bağdaştırıcısı 2 BNC kabloları birine bağlanmak için kullanılabilir. Galvanometre sürücü kurulu pimlerinden yerelleştirmek için galvanometre el kitabına bakın.
  4. Aynı şekilde, ikinci galvanometre AO1 ve AI1 bağlayın.
  5. PFI1 tetikleyici inç çekim (denetleyici) geri takın.
  6. PFI0 kamera ateşten ve AI2 bağlayın.
  7. AI3 tetikleyici dışında çekim (denetleyici) geri takın.
  8. Çekim denetleyicisi ayarlarını değiştirmek. Seçim doğrulamak ve sonraki parametreye geçirmek için "Seç" butonuna basın ve parametre değerleri değiştirmek için okları kullanın. "Zaman açık s" parametresi için 000.000, 000.000 için "kapalı zaman s", "mod" tek ve dahili izin ver çekim kontrolünü "tetik" "Etkinleştir" düğmesine basarak koymak.
  9. QtCreator (https://www.qt.io/, özgür yorum--dan indirilen) açın.
    Not: QtCreator c++'ta Optik cımbız yazılım geliştirmek için kullanılan Integrated Development Environment olduğunu. Qt kitaplığını burada widget oluşturmak için kullanılır.
  10. (Qt kod dosyaları sağlanan) OT.pro dosyasını açın. Bu eylem proje açılır. Kullanılan değişim giriş ve çıkış NI kartı (ler) göre AOGenerator.cpp dosyasında adı.
  11. Derleyip OT yazılımı çalıştırın.

4. boncuk optik tuzak pozisyonla kalibrasyonu

  1. Kalibrasyon film kaydı
    1. 1 µL 500 nm kırmızı floresan boncuk cam küvet koymak, sonra 10 mL distile su ile küvet doldurmak. Şekil 4 küvet gözlem bağlamda bir görünüm verir.
    2. Küvet piezoelektrik sahnede düzeltmek.
    3. Algılama amaç suda dips küvet Z konumunu ayarlayın.
    4. Kızılötesi lazeri açın ve güç W. 1'e ayarlayın
    5. Görüntü alma yazılımı üzerinde açın.
    6. Zaman atlamalı görüntüleri elde etmek için çekim hızı, kazanç, iki resim, sayı-in imge elde edilebilir ve lazer güç arasındaki süreyi seçin. Boncuk ile Optik cımbız kalibrasyon için aydınlatma lazer Not (561 nm) gerekli değildir. Kızılötesi lazer tarafından indüklenen 2-foton etkisi kapana kısılmış bir boncuk floresans heyecanlandırmak için yeterli olacaktır.
    7. Optik cımbız ev yapımı yazılımını başlatın.
    8. Bir daire izlemek için Optik cımbız parametrelerini ayarlamak. Sinusoidal, nbPeriod 1, genlik 0,5 V, faz olarak 0.0 rad, 250 samp/sn, 1000, Waveform1 parametreleri (galvo 1) olarak bufferSize 0.0 V, dalga formu 2 parametreleri (galvo 2) ofset Sinusoidal, nbPeriod 1, genlik 0,5 V, faz 1.57 rad, uzaklık 0,0 V SamplingRate ayarlamak.
    9. "AI parametreleri" onay kutusunu ve bunun için "bekle"... kutusu.
    10. Resim alma (500 ya da 1000 görüntüleri 10 kare/sn gibi bir yüksek kare hızı ile) başlatın.
    11. Optik cımbız "Oluşturma!" push düğmesine basarak geçin.
    12. En az iki tam daire tamamlamak ve Optik cımbız un basarak "oluşturma!" tarafından durdurmak kapana kısılmış boncuk izin düğmesini.
    13. Resim alma durdurmak. Not bir TIFF film ve bir metin dosyasına galvanometre gerilimleri ile varsayılan olarak oluşturulur "C:/TEMP /" klasörü (özel bir konum belirtmediyseniz). Not ilişkili veri dosyaları ile birkaç kalibrasyon filmler gerekirse oluşturulabilir.
      1. Boncuk daire tam değilse, daire yörünge sırasında kaybolur. Belki de hızı çok yüksektir. Örnekleme hızı OT yazılımında azaltarak azaltmak. Veya kırmızı lazer işaretçisi kızılötesi lazer, lazer amaç dışında bütün daire yörünge sırasında geliyor kontrol edin. Eğer değilse, galvanometre aynalar objektif lens geri odak düzlemi ile Birleşik değil. Galvanometreler geri odak düzlemi yeniden hizalama adımları 2.5 adımından başlangıç amacı ile ilgili olarak konumunu düzeltin.
    14. Genlikleri sıfır olarak ayarlayın ve bir düzeltme pozisyonda bir boncuk yakalamak için lazer geçiş. Bir dönüm noktası tuzak konuma yerleştirin.
  2. Pozisyon ilişkilendirme görüntü analizi ile
    1. MATLAB açın, kalibrasyon klasörüne gidin ve (Matlab kod dosyalarında sağlanan) "position2tension" komut dosyasını çalıştırın. Bu komut dosyası galvanometre gerilimleri optik tuzak konumuna çevirerek ilişkilendirme işlevi hesaplar.
    2. Kalibrasyon film sayısı kullanılacak seçin. Birkaç film iki dikey elips gibi farklı yörüngeleri ile seçilebilir. Genel olarak, dairesel bir yörünge ile bir tek kalibrasyon film yeter.
    3. İlk ve son görüntü sağlamak numaraları iletişim kutusunda (film başına bir iletişim kutusu), diziler net yörünge ve iyi sinyal-gürültü oranı ile.
    4. Her film için satın alma sırasında voltaj içeren metin dosyasının yolunu belirtin. Komut dosyasını okur ve her resim için iki galvanometreler ortalama gerilim hesaplar unutmayın.
    5. Karşılık gelen kalibrasyon film yolunu belirtin.
      Not: Komut dosyası altpiksel çözünürlüğü her çerçeve için boncuk boncuk için bir 2D Gauss özel işlevler ve MTT26çıkarılan işlevleri kullanarak yaklaştırarak algılar. Boncuk yörünge gösteren bir grafik görüntüler.
    6. Herhangi bir kötü algılanan noktası (aykırı) tıklatarak ortadan kaldırmak.
    7. İlişkilendirme x için eşleme onay ve hesaplanan ve komut dosyası tarafından görüntülenen y lazer pozisyonlar tamamlanmıştır. Bir sürü eksik değerleri (beyaz bölgelerde harita) ise, bir daha iyi sinyal-gürültü oranı, ile yeni bir kalibrasyon film ile işlemi yinelemek veya / ve galvanometreler yavaş hızına sahip.
      Not: Bu görüntüler ve ilişkilendirme değerleri otomatik olarak görüntü adı convertFct.mat ile aynı klasörde kaydedilir.

5. montaj Drosophila embriyo27

  1. 25 ° C'de inkübe bir kafes, Drosophila embriyo toplamak
  2. Plaka içeriği bir elekten geçen Maya kaldırmak (gözenek boyutu yaklaşık 100 µm olmalıdır).
  3. Embriyo 45 için (% 2.6 sodyum hipoklorit) % 100 çamaşır suyu ile yıkayın s koryon kaldırmak için.
  4. Embriyo 2 min için su ile yıkayın.
  5. Embriyo bir agar yastık bir fırça ile koymak.
  6. İstenen sahne göre yaklaşık 10 embriyo seçin ve embriyo bir pike veya nemli bir fırça ile hizalayın.
    Not: Hizalama faiz (algılama amaç mümkün olduğunca yakın ilgi bölgesi) bölge göre yapılmalıdır.
  7. Bir elmas-işaretleme kalemi, bir cam slayt 10 x 20 x 1 mm3bir parça kesti.
  8. Kesilmiş parça bir tarafında tutkal ekleyin ve 20 için kuru izin s.
  9. Kesilmiş parça çevirin ve embriyo slayt arasındaki sınırda sopa, çizgi üzerinde konumlandırın.
  10. Bu hazırlık içinde örnek sahibinin yüklemek ve küvet içinde yerleştirin. Şekil 4 küvet gözlem bağlamında bir görünüm verir.
  11. Küvet piezoelektrik sahneye koydu.

6. deney Vivo içinde yakalama

  1. Hücre kişiler bindirme — salınımları (Şekil 5)
    1. Doku ilgi konumunu bulmak.
      Not: hangi kaderin etiketlenir sinekler kullanarak bir uçağın adherens kavşak çalışması gerekiyorsa yararlı olabilir.
    2. Tuzak pozisyon (Simgesel Yapı 4.1.14 adımda ayarla) hedef Kavşağı'nın orta nokta devam piezo sahne kullanarak.
    3. İletişim hattına dik salınımlar elde etmek için tuzak parametrelerini ayarlamak. Bu aşamalar sıfır ayarlayın. Genlikleri ayarla içinde X ve Y yönde bir hareket iletişim hattına dik var. Genlik genellikle 0,1 V olmalıdır.
    4. Satın alma (ile hızlı kare hızı, 10 fps gibi) başlatın.
    5. "Üretme!" push düğmesine basarak Optik cımbız geçin.
    6. Ne zaman bitmiş, cımbız ve stop resim alma geçiş. Artık bir film ve satın alma sırasında galvanometre voltaj içeren bir metin dosyası belirtilen klasörde görünmesi gerekir.
    7. Hücre kişiler bindirme — çekme-yayın (Şekil 6)
    8. Doku ilgi konumunu bulmak.
    9. Onun orta nokta genellikle 1 µm tuzak pozisyon (Simgesel Yapı 4.1.14 adımda ayarla) uzak olması piezo sahne kullanarak hedef kavşak taşıyın.
    10. Genlikleri sabit bir tuzak için 0 olarak ayarlayın.
    11. Resim alma (10 kare/sn gibi bir hızlı kare hızı ile) başlatın.
    12. "Üretme!" push düğmesine basarak Optik cımbız geçin.
    13. İstenen süreden sonra tuzak geçiş ve rahatlama için gerçekleşmesi bekleyin.
    14. Resim alma durdurmak. Artık bir film ve satın alma sırasında galvanometre voltaj içeren bir metin dosyası belirtilen klasörde görünmesi gerekir.
  2. Yarı otomatik kymograph üretimi ve arabirim pozisyon tespiti.
    1. Matlab komut penceresinde (4b) kalibrasyon prosedürü sırasında oluşturulan ilişkilendirme harita yük: load('convertFct.mat'). Bu fx ve fy değişkenleri sağlar.
    2. Matlab komut penceresinde autokymo(fx,fy), Matlab kod dosyaları sağlanan çalıştırın. Bu işlev bir kymograph lazer yörünge boyunca oluşturmak ve her çerçeve için altpiksel çözünürlük ile temas hattı konumunu algılamak için amaçtır.
    3. Voltaj değerleri içeren prompted metin dosyası yolu seçin.
    4. Analiz edilecek film ilk ve son kare numaralarını seçin.
    5. TIFF film dosyası seçin. İki yeni rakamlar görüntülenir: ilki kymograph bir görüntüsüdür. İkinci bir iletişim hattı ve lazer konumlarını, görüntü numarası karşı algılama bir grafiktir.
      Not: Örnek konumunu ve lazer görüntü numarası (matlab rakam, jpg), kymograph (TIFF resim) ve kymograph karşı pozisyon lazer pozisyon (TIFF resim) ile temsil eden grafik işlevini kaydeder. Sürekli tuzak deneyler için kymograph örneğin ImageJ kullanarak el ile yapılması gerekiyor. Kymograph arabirimden tespiti sonra yapılabilir aynı algoritmayı kullanarak.

7. mekanik ölçüleri

  1. Sertlik ve gerilim ölçümleri
    1. Bir salınım deney (adım 6.1) ve zaman atlamalı film karşılık gelen Analizi (adım 6.3) gerçekleştirin.
    2. Arabirim pozisyon Arsa Equation 1 tuzak pozisyon bir fonksiyonu olarak Equation 3 Matlab Arsa işlev veya yazılım komplo herhangi bir veri kullanarak.
      Not: Bu yaklaşık doğrusal olmalıdır.
    3. Bir doğrusal gerçekleştirmek uygun, Matlab "ezfit" ücretsiz araç kutusu veya uygun izin herhangi bir yazılım kullanarak. Sığdır'ın yamaç tersini ortalama oranı sağlar Equation 5 .
    4. Hangi küçük deformasyonlar ve bir ikinci derece Denklem için bindirme, potansiyel varsayarak tarafından verilir belirgin bükme sertlik arabirimin tahminleri gerçekleştirmek Equation 6 . Equation 7 tuzak sertlik olduğunu (bkz. Adım 8 tuzak sertlik kalibrasyon için).
    5. Tahminler23tanımlanabilir gerginlik gerçekleştirin:
      Equation 8.
  2. Rheological ölçümleri
    1. Çekme yayın deneyler (adım 6.2) ve karşılık gelen analiz (adım 6.3) gerçekleştirmek
    2. Özel rheological modeli ile elde edilen eğrisi uygun.

8. tuzak sertlik kalibrasyonu

Not: Mutlak kuvvetleri belirlenmesi tuzak sertlik arabirimleri hakkında bilgi gerektirir. Bu bir iki adım prosedür yoluyla boncuklar kullanılarak erişilebilir.

  1. Sitozol viskozite belirlenmesi
    1. Embriyo halocarbon yağda yerleştirin ve floresan polistren boncuk (1:1, 000 hisse senedi seyreltme, 0,46 µm çapı)23,27ile mikroenjeksiyon Kur kullanarak enjekte.
    2. Mikroskop altında enjekte embriyo yerleştirin.
    3. Parça hareketlerini tek boncuk sitozol içinde buldum. Ortalama kare deplasman (yörüngeleri > 100 boncuk çok sayıda kullanmak) boncuk ayıklayın. Boncuk difüzyon sabiti üzerinden ortalama kare deplasman eğimini belirler. Difüzyon sabiti viskozite Stokes-Einstein denklemle ilgili, sitozol etkili viskozite anlamak. Erken embriyo yaklaşık 3,5 Pa.s viskozite bildirilen23' tür.
  2. Boncuk üzerinde tuzak sertlik tayini
    1. Tuzak sitozol Optik cımbız ile tek boncuklar.
    2. Boncuk kademeli bir biçimde 0.5 µm tarafından ayrılmış iki tuzak pozisyonlar arasında hareket etme
    3. Boncuklar üzerinde tuzak sertlik katsayısı ve diğer tam bir tuzak konumdan boncuk gevşeme zamanı arasındaki oran olarak belirleyin.
      Not: Katsayısı olan Equation 9 , nerede Equation 10 olduğunu (8,1) belirlenen viskozite ve Equation 13 boncuk RADIUS. Gevşeme zamanı Matlab veya uygun izin herhangi bir yazılım kullanarak boncuk konumunu üstel uyuyor elde edilir. Tipik tuzak sertlik 120 ±50 pN.µm-1 200 mW lazer uyarma, değerleridir.
  3. Hücre arabirimde tuzak sertlik tayini
    1. Temas hattında lazer odak ve (olarak detaylı adım 6) saptırmak. Deformasyon genlik ölçmek. Bu temsili bir ortalama elde etmek için birkaç kişi satırlarında yinelenmelidir.
    2. Üretilen deformasyon iletişim hatları karşı itti boncuk tarafından indüklenen karşılaştırın. Deformasyon tuzak sertlik ters orantılı olduğundan, hücre kişiler üzerinde tuzak sertlik anlamak.
      Not: Tuzak sertlik hücre ilgili kişiler genellikle bu daha küçük boncuk (0,46 µm çapı) 2 - için 3 - kat bulundu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 5 tuzak sinüsoidal bir hareketi koyarak elde edilen deneysel verileri gösterir. Tuzak bir saptırma arabirimin adıyla 3 ardışık arabirimi pozisyonlar (Şekil 5A)23gösterilen 3 anlık görüntüleri tarafından örneği oluşturur. Kaydedilmiş film bir kymograph (Şekil 5B) oluşturmak için kullanılan ve daha fazla her çerçeve için x yön boyunca bir Gauss kullanılarak altpiksel çözümleme arabirimiyle pozisyon uygun belirlemek için analiz edilir. Küçük deformasyonlar rejiminde, tuzak ve arabirim pozisyonlar orantılıdır (Şekil 5C). Bu tuzak (Şekil 5 d) göre arabirimi saptırma genliği erişim arabirimi gerginlik veya sertlik verir (bkz. Adım 7.1).

Şekil 6 gösterir elde edilen deneysel veriler çekme gerçekleştirerek deneyler serbest bırakın. Optik tuzak orta nokta doğru tuzak pozisyon (Şekil 6A)24saptırmak arabirimi neden olan iki hücre arasındaki arayüzü uzak yaklaşık 1 µm anahtarlanır. Tuzak sonra istediğiniz süreyi sonra kapanır. Her çerçeve için x yön boyunca Gauss kullanarak yeniden uyuyor, pozisyon xm (Şekil 6B) arabiriminin kymographs (Şekil 6C) elde edilir. Ortaya çıkan grafik onaylanmadığına karar rheological modelleri, örneğin, Maxwell modeli (Şekil 6D) karşılaştırılabilir.

Figure 1
Şekil 1: Optik cımbız (kırmızı yol) kurulumunun şematik kombine hafif levha mikroskopla. Bu rakam Bambardekar, K. ve ark. değiştirildi 23. Aydınlatma birimi ve algılama birimi tarafından oluşan hafif levha mikroskop anlatılan daha önce25. Optik cımbız düzeninin kırmızı bölümüne karşılık: kızılötesi lazer optik bir çekim ve örnek tuzak konumunu kontrol 2 galvanometreler geçmektedir. 1-fold bir teleskop aralarında konjugasyon tutmak için 2 galvanometreler arasında yer alıyor. Sonra bir teleskop 2.5-fold ışın tarafından boyutunu artırır ve Periskop mikroskop yüksekliğini getiriyor. Kızılötesi lazer Dikroik ayna sayesinde mikroskop algılama amacı girer. Optik öğeler arasındaki önemli mesafeler doğrudan şekilde verilir. Son lens arasındaki mesafe (odak uzaklığı 500 mm) ve amacın arka diyafram 500 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Ev yapımı değiştirilmiş demiryolu Dikroik ayna ve sıcak ayna tutan. Mikroskop Dikroik ayna demiryolu kızılötesi lazer girişine izin vermek için sol taraftaki kesilmiş oldu. Dikroik ayna kızılötesi ışık yansıtır ve görünür ışık (floresan) iletir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: bağlantı NI kartları için araçların. AO: çıkışı, analog AI: analog giriş, AO0 ve AI0 galvo1 için bağlı olan, AO1 ve AI1 galvo2 için bağlı olan, PFI0 kamera, AI2 yangına bağlı ve PFI1 tetikleyici çekim için bağlı ve AI3 tetiği çekim dışarı bağlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: örnek sahibi gözlem bağlamda. Bu rakam Chardès, C., arkdeğiştirildi. 25. embriyo üzerinde cam coverslip immobilize. Slayt örnek sahibi tarafından düzenlenmektedir. Örnek sahibi piezoelektrik sahne alanı'na sabit sahibi tarafından tutulan cam küvet eklenir. Hafif levha yatay ve embriyo tarafından gelen aydınlatır. Algılama objektif lens yukarıdaki örneğini dikeydir ve küvet dips.

Figure 5
Şekil 5: arabirim tuzak sinüsoidal hareketi tarafından dayatılan saptırma. Bu rakam Bambardekar, K. ve ark23değiştirildi. (A) tuzak taşınır arabirimine sinusoidally dik. Tuzak ve arabirim pozisyonlar xt ve xm, sırasıyla vardır. Doğru kapı aynası arabirimin farklı pozisyonlarda üç resimleri göster. Lazer tuzak pozisyon sarı bir ok ucu tarafından işaretlenir. Arabirimi bir membran işaretleyici (GAP43::mcherry) ile etiketlenmiş. (B) Kymograph (arabirimine dikey) tuzak hareketin yönü tarafından tanımlanan eksen boyunca (dönem 5 = s). (C) temsilcisi Arsa saptırma tuzak (kırmızı düz çizgi) ve arabirim pozisyonlar (siyah düz çizgi) gösterilen zaman karşı. (D) arabirimi pozisyon tuzak pozisyon bir fonksiyonu olarak lazer salınım kaç döngüsü sırasında (genlik = 0.5 µm, dönem 2 = s). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: arabirim saptırma çekme-yayın deneylerde. Bu rakam Serge, A., ve diğerlerideğiştirildi. 24. (A) tuzak arabirimi orta noktasını mesafelerine, açık, sonra tekrar kapalı. (B) tuzak ve arabirim pozisyonlar xt ve xm, sırasıyla vardır. Kymographs x yönüne temas hattı'nın orta noktasına dik boyunca oluşturulur. (C) Kymograph bir çekme-yayın deneme. Hücre kişiler ile Utrophin::GFP etiketli. (D) temsilcisi Arsa saptırma karşı tuzak (noktalı kırmızı/yeşil çizgiler) ve arabirim konumunu (siyah düz çizgi) gösteren saat. Düz kırmızı çizgiyi Maxwell benzeri rheological modeli24kullanılarak elde bir uyum gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Takıma giren film 1: Deneme tweezing. Piksel boyutu = 194 nm, 10 kare/sn, tuzak salınım dönemi 2 = s, Labelling: Gap43::mCherry. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optik cımbız mutlak mekanik ölçümler doğrudan gelişmekte olan embriyonik epitel içinde non-invaziv bir şekilde gerçekleştirmek için izin verir. Bu anlamda, invaziv ve göreli ölçüler, manyetik kuvvetler, enjeksiyonları gerektiren sağlamak veya güçlü varsayımlara dayanır kesmesi zorla ve aynı zamanda göreceli sağlayan lazer ablasyon gibi diğer yöntemler üzerinde avantajları sunar ölçümleri.

İletişim kuralı birkaç kritik adımları içerir. İlk olarak, objektif lens renk sapmalarını ve lazer tuzağı "aşağı" nesne iter gösterebilir gibi IR lazer görüntüleme düzlemde boncuk tuzakları kontrol etmek önemli ve sonunda o (adım 2.18) için doğru. İkinci olarak, yöntem hücre ilgili kişilerin konum ölçüleri üzerinde dayanır. Böylece bir yüksek karşıtlık floresan işaretçisi kullanmak önemlidir.

Objektif lens ve lazer ışınının kalitesini etkili bindirme için kritiktir. Objektif lens sayısal diyafram 1.0 aşmalıdır. Bindirme etkisiz ise, lazer ışını objektif lens arka diyafram doldurduğuna emin olun.

Bizim yöntem bazı sınırlamaları ile geliyor. İlk olarak, bu ne tam olarak optik bindirme için destek sağlar net değil. Kırılma indisi bir uyumsuzluk algıladı rağmen belirlenecek Aslına kalır. Mutlak ölçümlerde ilgileniyorsanız pasif microrheology deneyleri ve boncuk üzerinde tuzak sertlik kalibrasyonu gerektirir gibi ikinci, kalibrasyon işlemi biraz sıkıcı olabilir. Hücre kişiler üzerinde sertlik kalibrasyonu tabi deneysel belirsizlik olduğunu tanımak önemlidir: sadece sitozol, ama hücre kişiler yakınındaki ölçülebilir boncuk üzerinde tuzak sertlik ölçümleri dayanır. Üçüncü olarak, belli değil nasıl çok yönlü Optik cımbız olabilir. Onlar Drosophila embriyo hücrelerinde deforme mümkün olmasına rağmen diğer dokulara daha yüksek gerilim veya (gibi bir manikür gidiş) daha zor erişim sunmak ve bu nedenle daha az mükellef optik tweezing için.

Optik kuvvetleri küçüktür (< pN birkaç onlarca) ve böylece sert veya çok gerildi yapısı deforme için yetersiz olabilir. Büyük parçacıklar manyetik cımbız muhtemelen bu durumda daha etkili olacaktır.

Biz burada hafif levha mikroskop için Optik cımbız kaplin açıklanan ama Optik cımbız mikroskoplar, bir epifluorescence veya confocal dönen disk mikroskop gibi diğer türleri için birleştiğinde olabilir. IR bindirme lazer giriş içine mikroskop mikroskop yapılandırmasına göre değişir. Esas olarak görüntüleme ve optik manipülasyon için yolları birleştirmek için bir Dikroik ayna eklemek olanağı gerektiren. Çoğu mikroskobu şirket bu kombinasyon sağlayan modüler aydınlatma sistemleri, bir iki katlı modülü öneriyorum.

Geliştirmek veya teknik yükseltmek için birkaç yol tarifi adlı biri yok. Lazer ikamet süresi çeşitli kademelerde arasında bölmek için bir olasılık var ya da daha fazla kullanmak için çeşitli tuzaklar üretmek için holografik teknikleri, gelişmiş. Bu hedef hücreleri veya hücre kişiler üzerinde daha karmaşık kuvvet desenleri oluşturmak için izin verebilir. Başka bir gelişme neden saptırma ve tuzak konumunu arasında gerçek zamanlı geribildirim tasarlamak için olabilir. Bu deneyler uygulanan kuvvet deney boyunca sabit tutulur uygun sürünme izin verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser bir FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (için s.-Tayback) tarafından desteklenmiştir. Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-10-INBS-04-01, «Yatırımlar gelecek için») tarafından desteklenen Fransa-BioImaging altyapı anıyoruz. Biz Brice Detailleur ve Claude Moretti PICSL-FBI altyapı teknik destek için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW IPG Laser YLM-10-LP-SC including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser
Ø1/2" Optical Beam Shutter Thorlabs SH05
Small Beam Diameter Galvanometer Systems Thorlabs GVS001 1 for X displacement, 1 for Y displacement
1D or 2D Galvo System Linear Power Supply Thorlabs GPS011 galvanometers power supply
2 lenses f = 30 mm Thorlabs LB1757-B relay telescope between 2 galva
Lens f = 200 mm Thorlabs LB1945-B 2.5X telescope
Lens f = 500 mm Thorlabs LB1869-B 2.5X telescope
Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes Thorlabs KCB1E Periscope
Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style Thorlabs LG1
45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror Edmund Optics #64-470
Multiphoton-Emitter HC 750/S AHF HC 750/SP
CompactDAQ Chassis National Instruments cDAQ-9178
C Series Voltage Output Module National Instruments NI-9263 Analog output module
C Series Voltage Input Module National Instruments NI-9215 Analog input module
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids ThermoFisher Scientific F8812 calibration beads
C++ (Qt) home made optical tweezers software developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
  2. Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  3. Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).
  4. Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
  5. Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
  6. Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
  7. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  8. Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
  9. Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  10. Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
  11. Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
  12. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
  13. Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
  14. Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
  15. Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
  16. Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
  17. Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
  18. Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
  19. Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
  20. Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
  21. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
  22. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  23. Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  24. Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
  25. Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
  26. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  27. Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 141 hafif levha mikroskobu Optik cımbız kuvvet ölçümleri hücre mekaniği in vivo görüntüleme Drosophila embriyo
Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız <em>Drosophila</em> embriyo sondalama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chardès, C., Clement, R.,… More

Chardès, C., Clement, R., Blanc, O., Lenne, P. F. Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (141), e57900, doi:10.3791/57900 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter