Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College/CUNY

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

Abstract

זה פרוטוקול, קרינה פלואורסצנטית ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) צביעת משמשים כדי לעקוב אחר שינויים לוקליזציה subcellular חלבון; בפרט, התקה גרעיני תחת חום להדגיש תנאי. חלבונים מגיבים אותות בהתאמה עד חיצוניים ופנימיים. מנגנון משותף היא לשנות לוקליזציה subcellular שלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לעקוב אחר לוקליזציה חלבון שלא דורש נוגדן, תיוג רדיואקטיבי או מיקרוסקופ קונפוקלי. במאמר זה, משמש GFP כדי לתייג את היעד חלבון טקרמ-1 ב- C. elegans, חבר של משפחת חלבונים (CLICs) של ערוץ תאיים כלוריד כולל יונקים CLIC4. קו הטרנסגניים translational משולב טקרמ-1::gfp (עם מקדם מכירות ו רצף הגן המלא) נוצרה על ידי שינוי, γ-קרינה, stably מבטא את הגן gfp. מחקרים אחרונים הראו כי על עומס חום, סטרס חמצוני לא, 1::GFP טקרמ מצטבר בגרעין. חופפים את האות ה-GFP עם מבנה הגרעינים והן את דאפי אותות מאשר את השינויים לוקליזציה subcellular טקרמ-1 תחת לחץ... פרוטוקול זה מציג שתי שיטות קיבוע שונות דאפי מכתים: קיבוע אתנול, קיבוע אצטון. פרוטוקול מכתימים דאפי שהוצגו במאמר זה הוא מהיר ויעיל ושומר את האות ה-GFP והן את השינויים subcellular לוקליזציה של חלבון. שיטה זו דורשת רק מיקרוסקופ זריחה עם Nomarski, מסנן FITC מסנן דאפי. היא מתאימה עבור הגדרה מעבדה קטנה, סטודנט לתואר ראשון מחקר, מחקר תלמיד תיכון וכיתות ביוטכנולוגיה.

Introduction

שינוי של לוקליזציה subcellular חלבון הוא מנגנון משותף בתגובה לאותות פנימיים או חיצוניים כגון עומס חום, הרעבה, סטרס חמצוני, אפופטוזיס, זירחון חלבונים ועוד. לדוגמה, עומס חום גורם שייך FOXO הדף היומי-16 רוברטסונית גרעיני1,2, ואת החלבון BCL-2 פרו-אפופטוטיים להיפגע שההצעה translocates המיטוכונדריה עם מותו המקבל איתות3,4. טכניקות שונות זמינים לזהות שינויים אלה. שילוב של סופג המערבי ובידוד מבחינה ביוכימית subcellular מבנים (למשל, המיטוכונדריה או הגרעינים) טוב להשיג את המטרה3. עם זאת, זה דורש של נוגדנים ספציפיים נגד החלבון עניין. לפיכך, נוגדן ומבוססת הופך המפתח להצלחה. גישה חלופית היא תווית שונה מבנים subcellular או organelles עם סמנים שונים כגון חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP), חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), חלבון פלורסצנטיות צהוב (YFP) mCherry, ולאחר בינתיים תווית החלבון של עניין עם סמנים אחרים. לאחר מכן, לבחון אותם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי למקם את מטרות5,6. איזוטופים רדיואקטיביים הינם בחירה חלופיים עבור תיוג חלבונים היעד וכן ואז זיהוי שלהם לוקליזציה subcellular7. עם זאת, שיטה זו מחייבת הכשרה מתאימה וטיפול פסולת רדיואקטיבית. בנסיבות כגון חוסר נוגדנים ספציפיים, העדר של סמן ראוי, או את scarceness של ציוד כגון מיקרוסקופ קונפוקלי, גישה אלטרנטיבית צריך להיחשב. כדי לזהות חלבונים גרעיניים התקה, זה מושך רק לסמן את היעד החלבונים עם סמן, כתם גרעינים עם הכימית כימית 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מאז זה רק דורש מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה.

Immunolabeling C. elegans עם נוגדנים הוא מאתגר בשל החדירות הנמוכה של קליפת או את הקוטיקולה סילוק המקיפים את החיה. בינתיים, מאז C. elegans חלבונים מתבדרת באופן משמעותי מן orthologs חוליות שלהם, כמה חברות מסחריות לספק C. elegans עם מוצרים ספציפיים. . קשה לי מעבדה קטנה ליצירת נוגדנים C. elegans עבור עצמם. חוקרים בקהילה מרבים להשתמש חלבונים מתויג כסמני להפגין ביטוי חלבון לוקליזציה או הגן. מאמר זה משתמש טקרמ-1::GFP בתור דוגמה לאתר חלבון התקה גרעיני תחת מתח חום8. משולב translational טקרמ-1::gfp לתוך הגנום בעלי חיים משמש לבטא stably את הגן עם gfp פיוז'ן. המחקר הראה שכי טקרמ-1 מתבטאת המעי, לגוף החומה שרירים אחרים מבני subcellular8. פרוטוקול זה מדגים כיצד לסנכרן תולעים. כדי השלב הרביעי זחל (L4), לבצע חום מתח הניסוי, ואת התנהגות דאפי מכתים, אתנול קיבעון, קיבוע אצטון, הדמיה במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פתרונות

  1. NGM צלחות
    1. בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל', הוסף דור 3 של NaCl, 17 גרם אגר, 2.5 גר' Peptone 975 מ ל dH2O. כיסוי הפה + בקבוקי שתייה צידניות עם רדיד אלומיניום. אוטוקלב. הבקבוק עבור 50 דק לצנן את זה 20-30 דקות.
    2. לאחר מכן להוסיף פתרונות סטיריליים: 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל אתנול, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 25 מ של 1 מ' KPO4 (pH 6.0) מאגר. מערבולת הפתרונות לערבב אותם היטב.
    3. באמצעות מתקן נוזלי, לוותר על הפתרון NGM צלחות פטרי 60 מ מ. מילוי הלוחות 2/3 מלא של אגר. לאחסן אותם לאוויר ב 4 ° C לשימוש עתידי.
  2. 1 מ'-KPO-4 -מאגר (pH 6.0)
    1. להמיס g 10.832PO ח'4 ו- g 3.56 של K2HPO4 dH2O, ולאחר מכן לכוונן את עוצמת הקול סה כ 100 מ. אוטוקלב הפתרון למשך 15 דקות.
  3. M9
    1. להמיס דור 3 ח'2PO4, 6 גר' נה2HPO4ו- 5 גר' NaCl dH2O, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, ולכוונן את העוצמה הכוללת כדי 1 ל'
  4. µg 10/mL דאפי
    1. להוסיף 1 µL של 10 מ"ג/מ"ל של דאפי לתוך µL 999 של dH2O.
  5. 95% אלכוהול (v/v)
    1. למדוד 95 מ"ל של 100% אלכוהול ומוסיפים מים מזוקקים כדי לכוונן את העוצמה עד 100 מ"ל.
  6. 30% אצטון (v/v)
    1. להוסיף 30 מ של אצטון dH2O ולכוונן את העוצמה סה כ 100 מ.

2. עומס חום

  1. ליצור קו מערך extrachromosomal עם מבנה translational של היעד גנים9,10. לחלופין, להשיג קווים אלה מן את Caenorhabditis גנטיקה מרכז (CGC), שהינו משאב ציבורי למחקר C. elegans , או מעבדת מחקר שפורסמו בעבר.
  2. לשלב את הקווים extrachromosomal הגנום על ידי חשיפת תולעים קרינה-γ Rad 3,8009. לאחר מכן, בחר את הקווים stably ביטוי כך כל בעל חיים מבטא סמן חלבון כגון GFP או רולר.
  3. כדי להסיר מוטציות שנוצרו במהלך הקרינה, outcross לפחות 2 שורות x. להשתמש הקו הטרנסגניים כדי לזהות שינויים דפוס ביטוי חלבון תחת לחץ.
  4. הכינו צלחות תולעת NGM כפי שמתואר בשלב 1.1. פסים של שיבוט OP50, התרבות החיידקים בתוך נוזל ציר LB בן לילה. זרע צלחות NGM עם נוזלי OP50 תרבות, דגירה הצלחות בחממה 37 ° C בלילה כדי לגדל דשא חיידקים כמקור מזון לתולעים לקרר את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש.
  5. לגדול הקו הטרנסגניים ב- 20 ° C ללא רעב במשך לפחות 2 דורות לפני וזמינותו מתח חום.
  6. לבחור 8-10 בוגרים gravid (רחם מלא ביצים) צלחת תולעת חדש, אז תן להם להטיל ביצים במשך כ- 3-5 h ולהסיר כל המבוגרים הצלחות.
  7. כדי לסנכרן את התולעים, תן את הביצים בוקעות ולגדול הזחלים עבור-48 שעות. כדי השלב הרביעי (L4) זחל. לבחון את מבנה הפות שלהן (מבנה חצי ירח) כדי לזהות את הבמה (איור 1, חץ) L411.
  8. מקום צלחות תולעת עם הזחלים L4 חממה 35 ° C עבור 2 – 5 h להשיג עומס חום. מקום מד חום כדי למדוד במדויק את הטמפרטורה בחממה.

3. דאפי מכתים

  1. קיבוע אתנול
    1. להוסיף 10 µL של המאגר M9 במרכז של זכוכית.
    2. לבחור את התולעים בהלם-חום מהשלב 2.8 ולשים אותם לתוך המאגר M9 בשקופית זכוכית.
      1. לחלופין, לשטוף את הצלחת עם M9, centrifuge זה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולמחוק את תגובת שיקוע. הוסף את התולעים לשקופית זכוכית.
    3. השתמש רקמה רכה כדי לנקז את הנוזל העודף. . זהירות מהמדרגה תחת מיקרוסקופ ויבתר...
    4. להוסיף 10 µL של אלכוהול 95% על התולעים, ייבש אותן בחוץ. לצפות בתהליך תחת מיקרוסקופ ויבתר, אל תתנו לחיות לתפוס יבש מדי. מיד לאחר האתנול התאדו מן החיות, המשך לשלב הבא.
      הערה: אתנול מתאדה מהר מאוד.
    5. חזור על שלב 3.1.4 פעמיים כך התולעים הם קבועים.
      הערה: זה נורמלי עבור בעלי החיים להיראות כהה יותר, מעוותת.
    6. להוסיף 10 µL של דאפי (10 µg/mL) את התולעים. מיד לכסות אותם עם coverslip ויסגור את השקופית הכוללת ג'ל לק שקוף.
    7. להציג את החיות לאחר כ 10 דקות על ידי קרינה פלואורסצנטית המיקרוסקופ.
  2. קיבוע אצטון (גישה אלטרנטיבית)
    1. לשטוף את הצלחת בהלם-חום משלב 2.8 עם M9, centrifuge זה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של dH2O, לאסוף את צניפה, ולמחוק את תגובת שיקוע.
    2. להוסיף 400 µL של 30% אצטון עבור 15 דקות צנטריפוגה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים את תגובת שיקוע. השתמש µL 500 של dH2O לרחוץ את החיות 2 x. למחוק את תגובת שיקוע.
    3. להוסיף 200 µL של דאפי (10 µg/mL), או 4 x כמות האחסון של התולעים הכולל, בצינור למשך 15 דקות.
    4. צנטריפוגה ב x 1000 g עבור 1 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. לשטוף את צניפה 2 x עם 500 µL של dH2O. למקם את התולעים בשקופיות זכוכית, לכסות אותם עם coverslips, לאטום את השקופית הכוללת ג'ל לק שקוף, ולבחון את החיות תחת מיקרוסקופ זריחה.

4. מיקרוסקופיים הדמיה

  1. הפעל את מקור האור UV ומיקרוסקופ זריחה. הפעל את המחשב מחובר המיקרוסקופ.
  2. לטעון את השקופית על המיקרוסקופ זריחה. השתמש עדשה המטרה צריכת חשמל נמוכה (10 X) כדי לאתר את התולעים, להגדיל את כוח ההגדלה 400 X ולהתמקד הדגימה.
  3. פתח את התוכנה המצורפת עם המיקרוסקופ. לחץ על "רכישת" בתפריט; לחץ על "המצלמה" ובחר את המצלמה מחוברת המיקרוסקופ; פעולה זו מאפשרת המצלמה שנבחר לתקשר עם התוכנה.
    הערה: מיקרוסקופים שונים עשויים להשתנות במבצע.
  4. תחת אותו "רכישת", לחץ על "רב-ממדי רכישה". פעולה זו פותחת חלון חדש של ניווט "רב-ממדי רכישה". לחץ על לחצן "רב-ערוצי", והם יופיעו כל הערוצים הזמינים.
  5. בחר כחול, ירוק, DIC (התערבות דיפרנציאלית חדות) כדי לבחון את הדגימה. בחלון הניווט "רב-ממדי רכישה", להשאיר את "כחול-דאפי", "גרין-GFP", וערוצי "גריי-DIC", "Nomarski" לחץ לחיצה ימנית על ערוצים אחרים, כגון "אדום-rhodamine" ו- "שדה לבן בהיר", לסגור אותם.
  6. ראשית, למדוד את זמן החשיפה לכל ערוץ:
    1. שמאל לחץ בערוץ 'בלו-דאפי' כדי לבחור אותו ולאחר מכן לחץ על "מדד" על מנת לקחת את תמונת חיים תחת בערוץ דאפי עם הזמן חשיפה אוטומטית. יופיע חלון חדש עם תמונת בשידור חי.
    2. בצד שמאל של החלון תמונות בשידור חי, כוונן באופן ידני את זמן החשיפה במידת הצורך להפוך את התמונה כרצונכם.
    3. לבסוף, לחץ על "אישור" בחלון התמונה בשידור חי. פעולה זו מגדירה את זמן החשיפה תחת בערוץ דאפי.
  7. חזור על צעד 4.6 הערוצים האחרים, "ירוק-GFP" ו- "גריי-DIC", "Nomarski", כדי להגדיר את זמני חשיפה עבור ערוצים אלה.
  8. בחלון הניווט "רב-ממדי רכישה", לחץ על "התחל" כדי לאסוף באופן אוטומטי תמונות 3 תחת 3 ערוצים שונים לפי סדר (ראה לעיל) עם פעמים חשיפה ספציפי כפי שנקבע.
  9. כדי לשמור את הקובץ, ללכת לתפריט הראשי, לחץ על "קובץ" ואז על "שמירה בשם". קלט שם הקובץ ואת שם התיקיה. שמור את הקובץ כתבנית קובץ ברירת המחדל כדי לשמר מידע הדמיה מפורטת לשימוש עתידי.
  10. כדי לייצא את הקובץ בתבניות אחרות:
    1. ללכת "קובץ" ולחץ על "ייצוא". פעולה זו תפתח את חלון הגדרות ייצוא.
    2. להגדיר שם קובץ ותיקיה. בדוק "ליצור תיקיית פרויקט" טוב יותר לארגן את הנתונים. התוכנה גם מאפשרת למשתמש לציין 4 אפשרויות אחרות: "צור מיזוג תמונות", "השתמש צבע לתמונות ערוץ", "שימוש ערוץ שמות", "תמונה ממוזג בלבד".
    3. בחרו סוג הקובץ הרצויה מהתפריט הנפתח, כגון "טיף", "BMP", "PSD", או "JPG" וסוגים אחרים. ואז לחץ על "התחל" כדי לייצא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלבונים תאיים ערוץ כלוריד (לחץ על כד) הם חלבונים רב תכליתי מאוד נשמרים על פני מינים12. הרבה מחקרים מראים כי CLICs לווסת לחץ הסלולר autophagy, אפופטוזיס, carcinogenesis, אנגיוגנזה, התגובה החיסונית מולדת מקרופאג מערכת בתרבית של13,14,15,16 ,17. ישנם שני ולחץ כדי לירות homologs C. elegans: טקרמ-1 וסיפורה ה-4. מחקר שנערך שלנו הראה שאת טקרמ-1 מווסת את ניהול מתח בעלי חיים8. אנו משולב בונה translational טקרמ-1::gfp לתוך הגנום בעלי חיים, יצירת קווי מהונדס, אשר stably אקספרס ג'ין טקרמ-1 עם GFP כסמן (איור 2A ו- 2B). תחת עומס חום, 1::GFP טקרמ מצטבר בגרעין באזור המעי מאז האות GFP חזקה חופף מבנה גרעין (איור 2 C -E). כדי לוודא ההתאמה subcellular, דאפי מכתים שימש גישה כתם הגרעינים. באמצעות אתנול קיבוע דאפי מכתימים מראה ברור האטומים בגוף בעלי החיים (איור 3B). אצטון קיבוע גם משיגה תוצאות דומות (איור 3E). האותות GFP, דאפי חופפים לאשר כי טקרמ-1::GFP אכן שנצבר הגרעינים באזור המעי (איור 3C, F).

Figure 1
איור 1: תמונות של רבע זחל (L4) שלב C. elegans תחת הגדלה שונות כוחות. (א) 63 X, X (B) 115 ו- (ג) 400 X יכולת הגדלה. חצים הצבע על הפות של תולעת L4; הערה מבנה חצי ירח. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר בכל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תחת עומס חום, שמצטבר טקרמ-1::GFP הגרעינים של המעי. (א) Normaski תמונה של אזור המעי לפני הלם חום. (B) אות GFP חזק נצפתה באזור instestinal לפני הלם חום. (ג) Normaski תמונה של אזור המעי לאחר הלם חום (חיצים הצבע על הגרעינים של האזור מעיים). (ד) אות GFP חזק מצטבר לאחר הלם חום. (ה) חופפים תמונות של ה-GFP, Normaski. כל התמונות נלקחים עם יכולת הגדלה X 400. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר בכל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: טרנסלוקציה גרעיני טקרמ-1::GFP יש אישור מאת דאפי מכתים. (א-ג) באמצעות אתנול קיבוע עבור צביעת דאפי. (D-F) באמצעות אצטון קיבוע עבור צביעת דאפי. A ו- D, צבע ירוק מראה אות GFP באזור המעי. B ו- E, הצבע הכחול מראה הגרעינים מאת דאפי מכתים. C ו- F מראים חופפים תמונות של ה-GFP, דאפי, Normaski. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר בכל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור משלים: קיבוע אצטון משמרת את הדגימה של 60 יום לאחר קיבוע אצטון, אותות ה-GFP, דאפי מהן נצפות עדיין. (א) ירוק מיועד GFP. (B) כחול זה לאות דאפי. (ג) חופפים תמונות של ה-GFP, דאפי, DIC. כל התמונות נלקחים יכולת הגדלה X 400 מתחת. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה הציג שיטה מהירה ויעילה כדי לוודא שינויים subcellular חלבון של הציטופלסמה את הגרעין. הביטוי חלבון הוצג על ידי היתוך GFP, בעוד המבנה גרעין אומתה על ידי דאפי מכתים (איור 3). מאז immunostaining C. elegans חלבונים הוא מאתגר, הגרסא subcellular המקומית חלבון C. elegans רוב מאופיינים על-ידי תיוג אותם עם סמן חלבונים כמו GFP, לאז, mCherry ואחרים18,19 , 20 , 21. במאמר זה, שימש gfp כדי לתייג את ג'ין היעד טקרמ-1 כדי להדגים לוקליזציה הסלולר שלה חלבון. כדי לוודא ההתאמה גרעינית, דאפי מכתים שימש. בשתי שיטות חלופיות הוצגו על ההכתמה דאפי. שניהם ביעילות הראה גרעין חזק תולעים בתוך מסגרת זמן עבודה הגון (פחות מ 1 h). הקיבעון אתנול מתאים אוסף מדגם קטן כגון תצפית איכות (איסוף תולעים פחות מ- 50). מניעת התולעים ייבוש לחלוטין הוא המפתח. ברגע 95% אלכוהול מתאדה מן התולעים, המשך לשלב הבא מיד. הקיבעון אצטון מתאים אוסף דגימה בקנה מידה גדול כגון ניתוח כמותי (איסוף חיות יותר מ-50). עם זאת, בשל הצעדים מרובים לרחוץ את המדגם, הדגימה כמה יאבדו. לכן, מומלץ מאוד בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, שומרים על תולעים רבים ככל האפשר. ברגע שהם חתומים, שקופיות הנובע אצטון קיבוע ניתן לאחסן במשך שבוע ב 4 º C.

פרוטוקול זה ניתן לכוונן לחלבונים אחרים מעניינים לעקוב אחר שינויים לוקליזציה subcellular. בנוסף עומס חום המובאת כאן, מבחני הלחץ אחרים יכול להיות מוערך, כגון סטרס חמצוני, מתכות כבדות מתח, הגבלות דיאטטיות ואחרים. שינוי לוקליזציה subcellular חלבון יכול להיבדק גם על ידי שינוי הרקע הגנטי של החלבון עניין. למשל, הקו הטרנסגניים ניתן חצה על הרקע של מוטציה שונים, כך ניתן לזהות את האינטראקציה הגנטית הרומן. גם יכול להיות מיושם התערבות ב RNA (RNAi) כדי להפיל גנים ספציפיים לחקור את השינוי לוקליזציה subcellular חלבון שנוצר. יישומים אלה הם עניין גבוהה כדי לזהות רכיבים רגולטוריות הרומן. עבור חלבון לא ידוע, התנאים ניסיוני השונים צריך להיבדק, כגון ריכוז ריאגנט הבדיקה, משך הזמן דחק, בשלבים התפתחותיים ספציפי של התולעים. במחקר שלנו, ניסינו משכי זמן שונים, בין 30 דקות ל- 5 שעות, וטמפרטורות מתח של חום שונות. הלם חום ב 35 ° C עבור 3 h מדגים בבירור חלבון גרעיני התקה.

יישומים נוספים של דאפי מכתים לכלול הבחינה של תהליך מיוזה מיטוזה תולעים, במיוחד ב germline תאים22,23,24,25, ספירה של מספר גרעינים ב של מוטציות גנטיות רקע20,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש ריהצהל.

Acknowledgments

זנים C. elegans השתמשו במחקר זה התקבלו ממרכז גנטיקה Caenorhabditis, אשר נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים - Office של תשתית תוכניות מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי NIH: 1R03AG048578-01 Jun ליאנג, הנטר-CCRG 1501 Jun ליאנג ולאחר PSC-הנטר 66184-00 44 ו-45 67248-00 Jun ליאנג. אנו מודים קאתי סבג-דאן בטובך לחלוק לה מרחב מעבדה. כל התמונות פלורסצנטיות נאספו במתקן הליבה במכללת קווינס. אנו מודים וויליאם ג'יי רייס על הערותיו על כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
  2. Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
  3. Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
  4. Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
  5. Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
  6. Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
  7. Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
  8. Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
  9. Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  10. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  11. Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  12. Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
  13. Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
  14. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
  15. Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
  16. He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
  17. Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
  18. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
  19. Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
  20. Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
  21. Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
  22. Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
  23. Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
  24. Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
  25. Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).
  26. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  27. Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).

Tags

ביולוגיה גיליון 137 עומס חום לוקליזציה subcellular לשנות לוקליזציה גרעינית חלבון פלורסצנטיות ירוק דאפי מכתים קיבוע אתנול קיבוע אצטון
גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. … More

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter