Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Påvisning af Protein subcellulært lokalisering af grøn fluorescens Protein Tagging og 4', 6-Diamidino-2-phenylindole farvning i Caenorhabditis elegans

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College/CUNY

Summary

Denne protokol demonstrerer, hvordan man spore en protein nukleare translokation under varmestress ved hjælp af en grøn fluorescens protein (NGL) fusion protein som en markør og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvning. DAPI farvning protokol er hurtig og bevarer normal god landbrugspraksis og protein subcellulært lokalisering signaler.

Abstract

I denne protokol, en grøn fluorescens protein (NGL) fusion protein og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvning bruges til at spore protein subcellulært lokalisering ændringer; især en nuklear translokation under en varme stress tilstand. Proteiner reagerer tilsvarende til ydre og indre signaler. En fælles mekanisme er at ændre sin subcellulært lokalisering. I denne artikel beskrives en protokol for at spore protein lokalisering, der ikke kræver et antistof, radioaktive mærkning eller en Konfokal mikroskop. I denne artikel bruges normal god landbrugspraksis tagge target proteinet EKSKL-1 i C. elegans, medlem af chlorid intracellulære kanal proteiner (CLICs) familie, herunder pattedyr CLIC4. En integreret translationel ekskl-1::gfp transgene linje (med en promotor og en fuld gensekvens) var lavet af transformation og γ-stråling, og udtrykker stabilt genet og normal god landbrugspraksis. Nyere forskning viste, at ved varmestress, ikke oxidativt stress, EKSKL-1::GFP ophobes i kernen. Overlappende normal god landbrugspraksis signal med både kerner struktur og DAPI signaler bekræfter EKSKL-1 subcellulært lokalisering ændringer under stress. Denne protokol udgør to forskellige fiksering metoder for DAPI farvning: ethanol fiksering og acetone fiksering. DAPI farvning protokollen præsenteret i denne artikel er hurtig og effektiv og bevarer både normal god landbrugspraksis signal og protein subcellulært lokalisering ændringer. Denne metode kræver kun et fluorescens mikroskop med Nomarski, et FITC-filteret og en DAPI filter. Det er velegnet til en lille laboratorium indstilling, bachelor studerende forskning, high school studerende forskning og bioteknologi klasseværelser.

Introduction

En ændring af protein subcellulært lokalisering er en fælles mekanisme som reaktion på interne eller eksterne signaler som varmestress, sult, oxidativ stress, apoptose, protein fosforylering, og andre. For eksempel, inducerer varmestress FOXO medlem DAF-16 nukleare translokation1,2, og den pro-apoptotiske BCL-2 protein bud translocates til mitokondrier ved modtagende død signalering3,4. Der findes forskellige teknikker til at opdage disse ændringer. En kombination af western blotting og biokemisk isolere subcellulært strukturer (fx, mitokondrier eller kerner) kunne godt nå mål3. Det kræver dog et specifikt antistof mod protein af interesse. Således, en veletableret antistof bliver nøglen til succes. En alternativ fremgangsmåde er at mærke forskellige subcellulært strukturer eller organeller med forskellige markører som grønne fluorescens protein (NGL), røde fluorescens protein (RFP), gul fluorescens protein (YFP) og mCherry, og i mellemtiden label protein af interesse med andre markører. Derefter skal overholde dem under en Konfokal mikroskop til at lokalisere mål5,6. Radioaktive isotoper er en alternativ valg for mærkning target proteiner og derefter opdage deres subcellulært lokalisering7. Denne metode kræver imidlertid korrekt træning og håndtering af radioaktivt affald. Under omstændigheder som manglen på en bestemt antistof, mangel på en ordentlig markør eller sjældenhed af udstyr såsom en Konfokal mikroskop skal en alternativ tilgang overvejes. For at identificere et protein nukleare translokation, er det attraktivt at kun mærke mål proteiner med en markør og at pletten kerner med kemisk reagens 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) da dette kun kræver en regelmæssig fluorescens mikroskop.

Immunolabeling C. elegans med antistoffer er udfordrende på grund af lav permeabilitet af enten æggeskallen eller kollagen neglebånd omkring dyret. I mellemtiden, da C. elegans proteiner er væsentligt forskellige fra deres hvirveldyr orthologs, et par kommercielle virksomheder giver C. elegans med specifikke produkter. Det er svært for en lille laboratorium til at generere C. elegans antistoffer for sig selv. Forskere i Fællesskabet bruger ofte mærket proteiner som markører til at demonstrere en protein lokalisering eller gene expression. Denne artikel bruger EKSKL-1::GFP som et eksempel til at spore en protein nukleare translokation under varme stress8. En integreret translationel ekskl-1::gfp til det animalske genom bruges til stabilt express gen med normal god landbrugspraksis fusion. Forskning har vist, at ekskl-1 udtrykkes i tarmen, kroppen væggen muskel og andre subcellulært strukturer8. Denne protokol demonstrerer, hvordan du synkroniserer orme til den fjerde larve (L4) fase, udføre en varme stress eksperiment, og adfærd DAPI farvning, ethanol fiksering, acetone fiksering og imaging under en regelmæssig fluorescens mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. løsninger

  1. NGM plader
    1. I en 2 L Erlenmeyerkolbe, tilsættes 3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g af pepton og 975 mL dH2O. dækker mundingen af kolben med aluminiumsfolie. Autoklave kolbe i 50 min. afkøles det for 20-30 min.
    2. Derefter tilføje steriliseret løsninger: 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL af 5 mg/mL kolesterol i ethanol, 1 mL 1 M MgSO4og 25 mL 1 M KPO4 (pH 6.0) buffer. Swirl løsninger for at bland dem godt.
    3. Ved hjælp af en flydende dispenser, dispensere NGM løsning til 60 mm Petri plader. Fyld plader 2/3 fuld af agar. Gemme dem i en lufttæt beholder ved 4 ° C til fremtidig brug.
  2. 1 M KPO4 buffer (pH 6.0)
    1. At opløse 10.83 g af KH2PO4 og 3.56 g K2HPO4 i dH2O og derefter justere det samlede rumfang på 100 mL. Autoklave løsning for 15 min.
  3. M9
    1. Opløs 3 g KH2PO,4, 6 g Na2HPO4og 5 g NaCl i dH2O, tilsættes 1 mL 1 M MgSO4, og justere det samlede volumen til 1 L.
  4. 10 µg/mL DAPI
    1. Tilføj 1 µL af 10 mg/mL DAPI til 999 µL af dH2O.
  5. 95% alkohol (v/v)
    1. Måle 95 mL 100% alkohol og tilsættes destilleret vand for at justere lydstyrken til 100 mL.
  6. 30% acetone (v/v)
    1. Der tilsættes 30 mL acetone til dH2O og justere det samlede rumfang på 100 mL.

2. varmestress

  1. Generere en extrachromosomal array linje med en translationel konstruktion af target gener9,10. Alternativt, få sådanne linjer fra Caenorhabditis genetik Center (CGC), som er en offentlig ressource for C. elegans forskning, eller fra en tidligere udgivne forskningslaboratorium.
  2. Integrere de extrachromosomal linjer i genomet ved at udsætte orme til 3.800 Rad γ-stråling9. Vælg derefter linjerne stabilt udtrykt, således at hvert dyr udtrykker en markør protein som en normal god landbrugspraksis eller roller.
  3. Hvis du vil fjerne mutationer genereret i løbet af strålingen, krydses linjer på mindst 2 x. Brug denne transgene linje til at opdage protein udtryk mønster ændringer under stress.
  4. Forberede NGM orm plader, som beskrevet i trin 1.1. Streak en OP50 klon og kultur bakterier i flydende LB bouillon natten over. Frø, NGM plader med flydende OP50 kultur og inkuberes plader i et 37 ° C inkubator natten til at vokse en bakterier græsplæne som en fødekilde for orme. Køle ned plader ved rumtemperatur i mindst 30 min før brug.
  5. Vokse transgene linjen ved 20 ° C uden sult for mindst 2 generationer forud for varme stress assay.
  6. Vælge 8-10 unge fælderne voksne (livmoderen fyldt med æg) til en ny orm plade, så lad dem lægge æg for omkring 3-5 h og fjerne alle voksne fra pladerne.
  7. Hvis du vil synkronisere orme, lad æg udklækkes og vokse larver for ca 48 timer til den fjerde larve (L4) fase. Undersøge deres vulva struktur (en halvmåne) for at identificere L4 fase (figur 1, pil)11.
  8. Sted ormen plader med L4 larver i en 35 ° C inkubator for 2-5 h at opnå varmestress. Placere et termometer i inkubator til at præcist at måle temperaturen.

3. DAPI farvning

  1. Ethanol fiksation
    1. Tilføje 10 µL af M9 buffer i midten af et glas dias.
    2. Vælge de varme-chokeret orme fra trin 2.8 og læg dem i M9 buffer på glas dias.
      1. Alternativt, vaske af pladen med M9, centrifugeres det ved 1.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur, og supernatanten. Tilføje orme til glas dias.
    3. Brug en blød væv til at dræne overskydende væske. Se dette trin under et dissekere mikroskop.
    4. Tilsæt 10 µL af 95% alkohol på orme og lad dem lufttørre. Se proces under et dissekere mikroskop, og lad ikke de dyr, der får alt for tørre. Umiddelbart efter ethanolen er fordampet fra dyrene, fortsætte til næste trin.
      Bemærk: Ethanol fordamper meget hurtigt.
    5. Gentag trin 3.1.4 to gange så at ormene er faste.
      Bemærk: Det er normalt for dyr til at se mørkere og forvrænget.
    6. Tilsæt 10 µL af DAPI (10 µg/mL) til ormene. Straks dække dem med et coverslip og forsegle diaset med gennemsigtig neglelak gel.
    7. Se dyrene efter ca 10 min på et fluorescens mikroskop.
  2. Acetone fiksering (en alternativ tilgang)
    1. Vaske den varme-chokeret plade fra trin 2.8 med M9, centrifugeres det ved 1.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur, og supernatanten. Vaske pellet med 1 mL af dH2O, indsamle pellet, og supernatanten.
    2. Tilføj 400 µL 30% acetone i 15 min. der centrifugeres ved 1.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur og supernatanten. Bruge 500 µL af dH2O for at vaske dyr 2 x. Supernatanten.
    3. Tilføje 200 µL af DAPI (10 µg/mL), eller 4 x mængden af den samlede orme volumen, i røret i 15 min.
    4. Der centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min og supernatanten. Vaske pellet 2 x med 500 µL af dH2O. placere ormene på glas dias, dækker dem med coverslips, forsegle dias med gennemsigtig neglelak gel og observere dyr under et fluorescens mikroskop.

4. mikroskopisk billeddannelse

  1. Drej på UV-lyskilde og et fluorescens mikroskop. Tænde computeren tilsluttet mikroskop.
  2. Indlæse diaset på fluorescens mikroskop. Bruge en energibesparende mål linse (10 X) til at finde orme, øge forstørrelse magt til 400 X og fokusere på modellen.
  3. Åbn softwaren, der leveres med mikroskop. Klik på "Køb" i menuen. Klik på "Kamera" og vælg kamera tilsluttet mikroskop; Dette giver mulighed for det valgte kamera til at kommunikere med softwaren.
    Bemærk: Forskellige mikroskoper kan variere i drift.
  4. Under den samme "tilegnelse", klik på "Flerdimensionale erhvervelse". Dette åbner et nyt "Flerdimensionale erhvervelse" navigationsvindue. Klik på knappen "Multichannel", og alle tilgængelige kanaler vises.
  5. Vælge blå, grøn og DIC (differential interferens kontrast) at observere modellen. I vinduet "Flerdimensionale erhvervelse" navigation forlade den "Blå-DAPI", "Grøn-normal god landbrugspraksis" og "Grå-DIC", "Nomarski" kanaler på; Højreklik på andre kanaler, såsom "Rød-rodamin" og "hvid-lyse felt", at lukke dem.
  6. Først, måle eksponeringstid for hver kanal:
    1. Venstre-klik på "Blå-DAPI" kanal for at markere det og derefter klikke på "Foranstaltning" for at tage et levende billede under DAPI kanal med et automatiseret eksponeringstid. Et nyt vindue med en live-billedet vises.
    2. På den venstre side af vinduet levende billede, manuelt justere eksponeringstiden, hvis det er nødvendigt at gøre billedet som ønsket.
    3. Endelig skal du klikke på " "OK "i vinduet levende billede. Dette angiver eksponeringstid under DAPI kanal.
  7. Gentag trin 4.6 for de andre kanaler, "Green-NGL" og "Grå-DIC", "Nomarski", til at konfigurere eksponeringstider for disse kanaler.
  8. "Flerdimensionale erhvervelse" navigation i vinduet, klikke på "Start" at automatisk indsamle 3 billeder under de 3 forskellige kanaler i rækkefølge (se ovenfor) med specifikke eksponeringstider som sæt.
  9. Hvis du vil gemme filen, gå til Hovedmenu, klik på "File" og derefter på "Gem som". Inputfilen navn og navnet på mappen. Gem filen som standard filformat til at bevare den detaljerede tænkelig information for fremtidig reference.
  10. Eksportere filen i andre formater:
    1. Gå til "File" og klik på "Export". Dette vil åbne en eksport indstilling vindue.
    2. Angiv filnavnet og mappe. Tjek organisere "Opret et projekt mappe" for bedre at kunne dataene. Softwaren også tillader brugeren at angive 4 andre indstillinger: "Generer fusionerede billeder", "Bruger farve til billeder kanal", "Brug kanal navne", og "Kun fusioneret billede".
    3. Vælge en ønskede filtype fra drop-down menu, som "TIF", "BMP", "PSD", eller "JPG" og andre typer. Klik derefter på "Start" for at eksportere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Chlorid intracellulære kanal proteiner (CLIC) er multifunktionelle proteiner, der er særdeles bevaret på tværs af arter12. Megen forskning viser at CLICs regulere cellulære stress, autophagy, apoptose, carcinogenese, angiogenese og makrofag medfødte immunrespons i pattedyr system13,14,15,16 ,17. Der er to CLIC homologs i C. elegans: ekskl-1 og exc-4. Vores seneste undersøgelse viste, at ekskl-1 regulerer dyrenes stress management8. Vi integreret en translationel ekskl-1::gfp konstruktion i en animalsk genom og lavet transgene linjer, som stabilt express gen ekskl-1 med en normal god landbrugspraksis som markør (figur 2A og 2B). Under varmestress ophobes EKSKL-1::GFP i kernen i tarm regionen da den stærkt normal god landbrugspraksis signal overlapper med kernen struktur (figur 2 C -E). For at bekræfte den subcellulært lokalisering, blev DAPI farvning brugt som en metode til at plette kerner. Bruge ethanol fiksering for DAPI farvning viser klart kerner i dyrets (figur 3B). Acetone fiksering også opnår lignende resultater (figur 3). De overlappende normal god landbrugspraksis og DAPI signaler bekræfte at EKSKL-1::GFP faktisk akkumuleret i kerner i tarm-regionen (figur 3 c, F).

Figure 1
Figur 1: Billeder af en fjerde larve (L4) fase C. elegans under forskellige forstørrelse beføjelser. (A) 63 X, (B) 115 X, og (C) 400 X forstørrelse magt. Pilene peger på vulva af en L4 orm; Bemærk half-moon struktur. Skalalinjen = 100 µm i alle billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Under varmestress, EKSKL-1::GFP ophobes i kerner af tarmen. (A) Normaski billede af en tarm regionen før varme chok. (B) et stærkt signal om normal god landbrugspraksis konstateredes i regionen instestinal før varme chok. (C) Normaski billede af intestinal region efter heat shock (pile peg på kerner i tarm-regionen). (D) et stærkt signal om normal god landbrugspraksis ophobes efter varme chok. (E) overlappende billede af normal god landbrugspraksis og Normaski. Alle billeder er taget med 400 X forstørrelse magt. Skalalinjen = 50 µm i alle billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: EKSKL-1::GFP nukleare translokation er bekræftet af DAPI farvning. (A-C) Bruge ethanol fiksering for DAPI farvning. (D-F) Bruge acetone fiksering for DAPI farvning. I A og Dviser grøn farve normal god landbrugspraksis signal i tarm regionen. I B og Eviser blå farve kerner af DAPI farvning. C , og F viser overlappende billeder af normal god landbrugspraksis, DAPI og Normaski. Skalalinjen = 50 µm i alle billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur: Acetone fiksering bevarer prøven og 60 dage efter acetone fiksering, normal god landbrugspraksis og DAPI signaler er stadig observerbare. (A) Green er for normal god landbrugspraksis. (B) blå er for DAPI signal. (C) overlappende billede af normal god landbrugspraksis, DAPI og DIC. Alle billeder er taget under 400 X forstørrelse magt. Skalalinjen = 50 μm. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel præsenteres en hurtig og effektiv metode til at kontrollere protein subcellulært ændringer fra cytoplasmaet til kernen. Protein udtryk var vist af en normal god landbrugspraksis fusion, mens kernen struktur blev bekræftet af DAPI farvning (figur 3). Da immunfarvning C. elegans proteiner er udfordrende, de fleste C. elegans protein subcellulært lokaliseringer er karakteriseret ved at kode dem med markør proteiner som normal god landbrugspraksis, Laz, mCherry og andre18,19 , 20 , 21. i denne artikel, normal god landbrugspraksis blev brugt til at tag mål gen ekskl-1 for at vise sin protein cellulære lokalisering. For at bekræfte den nukleare lokalisering, blev DAPI farvning brugt. To alternative metoder blev præsenteret for DAPI farvning. Effektivt viste begge stærke kerner i worms inden for et anstændigt arbejde tidsramme (mindre end 1 time). Ethanol fiksering er velegnet til en lille prøve samling som en kvalitet observation (indsamling mindre end 50 orme). Forhindrer orme i tørring helt er nøglen. Når 95% alkohol fordamper fra ormene, fortsætte til næste trin straks. Acetone fiksering er velegnet til en storstilet stikprøven samling som en kvantitativ analyse (indsamle over 50 dyr). Men på grund af flere trin i vask stikprøven, nogle modellen bliver tabt. Således er det stærkt anbefales at omhyggeligt fjernes supernatanten og fastholde så mange orme som muligt. Når de er lukkede, kan dias som følge af acetone fiksering opbevares i en uge ved 4 ° C.

Denne protokol kan tilpasses andre proteiner af interesse at spore ændringer, subcellulært lokalisering. Ud over den varmestress præsenteres her, kunne andre stress assays vurderes, oxidativ stress, heavy metal stress, kosten restriktioner og andre. Protein subcellulært lokalisering ændring kunne også undersøges ved at ændre den genetiske baggrund af protein af interesse. Eksempelvis kan linjen transgene krydsede ind i en anderledes mutant baggrund, således at den nye genetiske interaktion kan identificeres. RNA-interferens (RNAi) kunne også anvendes til at vælte specifikke gener og undersøge den resulterende protein subcellulært lokalisering ændring. Disse programmer er af stor interesse at identificere nye lovgivningsmæssige komponenter. For en ukendt protein, bør forskellige eksperimentelle betingelser testes, såsom test reagens koncentrationerne, varighed af den stress, og de specifikke udviklingsmæssige stadier af orme. I vores undersøgelse prøvede vi forskellige varigheder, fra 30 min til 5 h, samt forskellige varme stress temperaturer. En heat shock ved 35 ° C til 3 h viser klart en protein nukleare translokation.

Yderligere anvendelser af DAPI farvning omfatte undersøgelse af meiose og mitose i orme, især i kønscelleoverførsel celler22,23,24,25, og en optælling af antallet af kerner i en genetiske mutant baggrund20,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at erklære.

Acknowledgments

C. elegans stammer anvendes i denne undersøgelse blev indhentet fra byens Caenorhabditis genetik, som støttes af National Institutes of Health - Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang og PSC-CUNY 66184-00 44 og 67248-00 45 til Jun Liang. Vi takker Cathy vild-Dunn for venligst deler hendes laboratorium plads. Alle fluorescens billeder blev indsamlet på Queens College Core facilitet. Vi takke William J. Rice for hans kommentarer til manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
  2. Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
  3. Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
  4. Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
  5. Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
  6. Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
  7. Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
  8. Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
  9. Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  10. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  11. Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  12. Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
  13. Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
  14. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
  15. Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
  16. He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
  17. Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
  18. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
  19. Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
  20. Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
  21. Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
  22. Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
  23. Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
  24. Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
  25. Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).
  26. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  27. Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).

Tags

Biologi sag 137 varmestress subcellulært lokalisering ændre nukleare lokalisering grønne fluorescens protein DAPI farvning ethanol fiksering acetone fiksation
Påvisning af Protein subcellulært lokalisering af grøn fluorescens Protein Tagging og 4', 6-Diamidino-2-phenylindole farvning i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. … More

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter