Summary
Questo protocollo viene illustrato come monitorare una traslocazione nucleare della proteina sotto stress da calore utilizzando una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) come indicatore e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Il protocollo di colorazione DAPI è veloce e preserva i segnali di localizzazione sottocellulare della proteina e GFP.
Abstract
In questo protocollo, una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione vengono utilizzati per tenere traccia delle modifiche di localizzazione sottocellulare della proteina; in particolare, una traslocazione nucleare sotto un caldo sottolineare condizione. Le proteine reagiscono segnali corrispondentemente a interni ed esterni. Un meccanismo comune è quello di cambiare la sua localizzazione subcellulare. Questo articolo descrive un protocollo per tenere traccia di localizzazione della proteina che non richiede un anticorpo, etichettatura radioattivo o un microscopio confocale. In questo articolo, GFP consente di contrassegnare la proteina bersaglio EXL-1 in c. elegans, un membro della famiglia di proteine (CLICs) dei canale intracellulare cloruro, compresi mammiferi CLIC4. Una linea transgenica integrato traslazionale exl-1::gfp (con un promotore e una sequenza genica completo) nasce dalla trasformazione e γ-radiazione e stabilmente esprime il gene e la gfp. Recenti ricerche hanno dimostrato che al momento lo stress da calore, non ossidativo, EXL-1::GFP si accumula nel nucleo. Sovrapposizione del segnale GFP con sia la struttura di nuclei e il DAPI segnali conferma i cambiamenti di localizzazione subcellulare EXL-1 sotto stress. Questo protocollo presenta due metodi di fissazione diversi per colorazione DAPI: fissazione dell'etanolo e acetone fissazione. Il protocollo di colorazione DAPI presentato in questo articolo è veloce ed efficiente e conserva sia il segnale GFP e i cambiamenti di localizzazione sottocellulare della proteina. Questo metodo richiede solo un microscopio a fluorescenza con Nomarski, un filtro FITC e un filtro DAPI. È adatto per un ambiente piccolo laboratorio, la ricerca di studente universitario, ricerca degli studenti di liceo e aule di biotecnologie.
Introduction
Un cambiamento della localizzazione sottocellulare della proteina è un meccanismo comune in risposta ai segnali interni o esterni come lo stress da calore, fame, stress ossidativo, apoptosi, fosforilazione della proteina e altri. Ad esempio, lo stress da calore induce un membro FOXO DAF-16 traslocazione nucleare1,2e la proteina BCL-2 pro-apoptotica che Bid trasloca i mitocondri ricevente morte segnalazione3,4. Esistono diverse tecniche rilevare queste modifiche. Una combinazione di western blotting e biochimicamente isolare strutture subcellulari (ad es., i mitocondri o i nuclei) ben potrebbe raggiungere l' obiettivo3. Tuttavia, esso richiede un anticorpo specifico contro la proteina di interesse. Così, un anticorpo consolidato diventa la chiave per il successo. Un approccio alternativo è quello di etichettare diverse strutture subcellulari o organelli con i vari indicatori quali proteina di fluorescenza verde (GFP), proteina di fluorescenza rossa (RFP), proteina di fluorescenza gialla (YFP) e mCherry e nel frattempo etichettare la proteina di interesse con altri marcatori. Poi, li osserviamo al microscopio confocale per localizzare i bersagli5,6. Gli isotopi radioattivi sono una scelta alternativa per l'etichettatura di proteine bersaglio e quindi rilevare la loro localizzazione subcellulare7. Tuttavia, questo metodo richiede un'adeguata formazione e gestione delle scorie radioattive. In circostanze come la mancanza di un anticorpo specifico, l'assenza di un indicatore adeguato, o della scarsità di attrezzature come un microscopio confocale, un approccio alternativo deve essere considerato. Per identificare una traslocazione nucleare della proteina, è attraente solo contrassegnare proteine bersaglio con un pennarello e macchia i nuclei con il reagente chimico 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) poiché questo richiede solo un microscopio a fluorescenza regolari.
Immunolabeling di c. elegans con anticorpi è impegnativo a causa della bassa permeabilità del guscio d'uovo o la cuticola collagena che circonda l'animale. Nel frattempo, dato che le proteine di c. elegans sono significativamente divergenti da loro ortologhi di vertebrati, alcune aziende commerciali forniscono c. elegans con prodotti specifici. È difficile per un piccolo laboratorio generare anticorpi di c. elegans per se stessi. Ricercatori della comunità spesso utilizzano proteine etichettate come marcatori per illustrare un'espressione di gene o localizzazione della proteina. In questo articolo utilizza EXL-1::GFP ad esempio per tenere traccia di una traslocazione nucleare della proteina sotto lo stress di calore8. Un integrato traslazionale exl-1::gfp nel genoma animale viene utilizzata per esprimere stabilmente il gene con la fusione di gfp . La ricerca ha indicato che exl-1 è espresso nell'intestino, parete del corpo muscolare e altre strutture subcellulari8. Questo protocollo viene illustrato come sincronizzare i vermi per il quarto stadio larvale (L4), eseguire una fissazione dell'etanolo esperimento e la condotta DAPI macchiatura, di calore lo stress, fissazione di acetone e imaging sotto un microscopio a fluorescenza regolari.
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Protocol
1. soluzioni
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Piastre di NGM
- In un matraccio di Erlenmeyer 2L, aggiungere 3 g di NaCl, 17 g di agar, 2,5 g di Peptone e 975 mL di dH2O. copertura della bocca del pallone con foglio di alluminio. Autoclave la beuta per 50 min raffreddarlo per 20 – 30 min.
- Quindi aggiungere soluzioni sterilizzate: 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL in etanolo, 1 mL di 1 M MgSO4e 25 mL di tampone di 1 M KPO4 (pH 6.0). Agitare le soluzioni per mescolare bene.
- Usando un erogatore liquido, dispensare la soluzione NGM a piastre di Petri di 60 mm. Riempire le piastre 2/3 pieno di agar. Riporli in un contenitore a tenuta d'aria a 4 ° C per un uso futuro.
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Tampone di 1m KPO4 (pH 6.0)
- Sciogliere 10,83 g di KH2PO4 e 3,56 g di K2HPO4 in dH2O, quindi regolare il volume totale a 100 mL. Sterilizzare in autoclave la soluzione per 15 min.
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M9
- Sciogliere 3 g di KH2PO4, 6 g di Na2HPO4e 5 g di NaCl in dH2O, aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4e regolare il volume totale a 1 L.
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10 µ g/mL DAPI
- Aggiungere 1 µ l di 10 mg/mL DAPI in 999 µ l di dH2O.
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alcol al 95% (v/v)
- Misura 95 mL di alcole a 100% e aggiungere acqua distillata per regolare il volume a 100 mL.
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30% di acetone (v/v)
- Aggiungere 30 mL di acetone a dH2O e regolare il volume totale a 100 mL.
2. lo Stress da calore
- Generare una riga di matrice extracromosomico con un costrutto traslazionale di geni target9,10. In alternativa, ottenere tali linee da Caenorhabditis Genetics Center (CGC), che è una risorsa pubblica per la ricerca di c. elegans , o da un laboratorio di ricerca precedentemente pubblicata.
- Integrare le linee extracromosomico il genoma esponendo vermi a 3.800 Rad γ-radiazione9. Quindi, selezionare le righe stabilmente espresse affinché ogni animale esprime una proteina marker come un GFP o un rullo.
- Per rimuovere le mutazioni generate durante l'irradiazione, outcross le linee almeno 2 x. Utilizzare questa linea transgenica per rilevare cambiamenti di modello di espressione della proteina sotto stress.
- Preparare piastre worm NGM come descritto al punto 1.1. Inoculare un clone OP50 ed i batteri in brodo LB liquido della coltura durante la notte. Seme le piastre NGM con liquido OP50 cultura e incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C durante la notte a crescere un prato di batteri come fonte di cibo per i vermi. Raffreddare le piastre a temperatura ambiente per almeno 30 min prima dell'uso.
- Crescere la linea transgenica a 20 ° C senza fame per almeno 2 generazioni precedenti il test di stress di calore.
- Prendere 8-10 giovani adulti gravid (utero pieno di uova) per una nuova piastra di vite senza fine, poi lasciate li depongono le uova per circa 3 – 5 h e rimuovere tutti gli adulti dalle piastre.
- Per sincronizzare i vermi, lasciare che le uova si schiudono e crescere le larve per circa 48 h alla quarta fase larvale (L4). Esaminare la loro struttura di vulva (una struttura di mezzaluna) per identificare la L4 fase (Figura 1, freccia)11.
- Posizionare le piastre di vite senza fine con le larve L4 in un incubatore a 35 ° C per 2 – 5 h per raggiungere lo stress da calore. Posizionare un termometro nell'incubatore per misurare con precisione la temperatura.
3. DAPI macchiatura
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Fissazione dell'etanolo
- Aggiungere 10 µ l di buffer di M9 al centro di un vetrino.
- Prendere i vermi calore-scioccato dal passaggio 2.8 e metterli nel buffer M9 su vetrino.
- In alternativa, lavare la piastra con M9 e centrifugare a 1.000 x g per 1 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Aggiungere i vermi sul vetrino.
- Usare un tessuto soffice per drenare liquidi in eccesso. Guarda questo passaggio sotto un microscopio per dissezione.
- Aggiungere 10 µ l di alcol al 95% sui vermi e lasciarli asciugare all'aria. Osservare il processo sotto un microscopio per dissezione e non lasciare che gli animali troppo asciutto. Immediatamente dopo l'etanolo evaporato dagli animali, procedere al passaggio successivo.
Nota: Etanolo evapora molto velocemente. - Ripetere il punto 3.1.4 due volte affinché i vermi sono fissi.
Nota: È normale per gli animali a guardare più scura e distorta. - Aggiungere 10 µ l di DAPI (10 µ g/mL) per i vermi. Immediatamente coprire con un vetrino coprioggetto e sigillare la diapositiva con gel smalto trasparente.
- Mostra gli animali dopo circa 10 minuti su un microscopio a fluorescenza.
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Fissazione di acetone (approccio alternativo)
- Lavare la piastra di calore-scioccato dal passaggio 2.8 con M9 e centrifugare a 1.000 x g per 1 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Lavare la pallina con 1 mL di dH2O, raccogliere il pellet e scartare il surnatante.
- Aggiungere 400 µ l di acetone 30% per 15 min. Centrifugare a 1.000 x g per 1 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Utilizzare 500 µ l di dH2O per lavare gli animali 2 x. Scartare il surnatante.
- Aggiungere 200 µ l di DAPI (10 µ g/mL), o 4 volte la quantità di volume ai vermi totale, nel tubo per 15 min.
- Centrifugare a 1.000 x g per 1 min e scartare il surnatante. Lavare la pallina 2 x con 500 µ l di dH2O. Posizionare le viti senza fine sulle lastre di vetro, coprire con coprioggetti, sigillare la diapositiva con gel smalto trasparente e osservare gli animali sotto un microscopio a fluorescenza.
4. microscopica Imaging
- Accendere la sorgente di luce UV e un microscopio a fluorescenza. Accendere il computer collegato al microscopio.
- Caricare la diapositiva il microscopio di fluorescenza. Utilizzare un obiettivo di bassa potenza (10x) per individuare i vermi, aumentare la potenza di ingrandimento 400x e mettere a fuoco il campione.
- Aprire il software fornito con il microscopio. Fare clic su "Acquisizione" nel menu; fare clic su "Camera" e selezionare la telecamera collegata al microscopio; in questo modo la telecamera selezionata di comunicare con il software.
Nota: Microscopi diversi possono variare in funzione. - La stessa "acquisizione", fare clic su "Acquisizione multidimensionale". Questo apre una nuova finestra di navigazione di "Acquisizione multidimensionale". Fare clic sul pulsante "Multicanale", e verranno visualizzati tutti i canali disponibili.
- Scegliere DIC (contrasto differenziale di interferenza) per osservare il campione, verde e blu. Nella finestra di navigazione "Acquisizione multidimensionale", lasciare il "Blue-DAPI", "Green-GFP" e "Grigio-DIC", "Nomarski" canali pulsante destro del mouse su altri canali, come "Rosso-rodamina" e "White-bright field", di chiuderle.
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In primo luogo, misurare il tempo di esposizione per ogni canale:
- Sinistro del mouse il canale "Blue-DAPI" per selezionarlo e quindi fare clic su "Misura" al fine di prendere un'immagine dal vivo sotto il canale DAPI con il tempo di esposizione automatica. Apparirà una nuova finestra con un'immagine live.
- Sul lato sinistro della finestra immagine live, regolare manualmente il tempo di esposizione se necessario per rendere l'immagine come desiderato.
- Infine, clicca su " "OK "nella finestra immagine live. Questo imposta il tempo di esposizione sotto il canale DAPI.
- Ripetere il passaggio 4.6 per gli altri canali, "Green-GFP" e "Grigio-DIC", "Nomarski", per impostare i tempi di esposizione per quei canali.
- Nella finestra di navigazione "Acquisizione multidimensionale", cliccare su "Start" per raccogliere automaticamente 3 immagini sotto i 3 canali diversi in ordine (Vedi sopra) con tempi di esposizione specifici come set.
- Per salvare il file, andare al menu principale, clicca su "File" poi su "Save as". Nome del file di input e il nome della cartella. Salvare il file come il formato di file predefinito per preservare le informazioni dettagliate di imaging per riferimento futuro.
-
Per esportare il file in altri formati:
- Andare su "File" e fare clic su "Esporta". Si aprirà una finestra di impostazione di esportazione.
- Impostare il nome del file e cartella. Verifica "Creare una cartella di progetto" per meglio organizzare i dati. Il software permette inoltre all'utente di specificare 4 altre opzioni: "Immagini Generate fuse", "Utilizzare il colore per le immagini del canale", "Utilizza nomi di canale" e "Merged image solo".
- Scegliere un tipo di file desiderato dal menu a discesa, ad esempio "TIF", "BMP", "PSD", o "JPG" e altri tipi. Quindi fare clic su "Start" per esportare.
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Representative Results
Proteine canale intracellulare di cloruro (clicca) sono proteine multifunzionali che sono altamente conservate tra specie12. Molta ricerca dimostra che CLICs regolare stress cellulare, l'autofagia, apoptosi, carcinogenesi, l'angiogenesi e la risposta immunitaria innata del macrofago in13,sistema mammifero14,15,16 ,17. Ci sono due CLIC omologhi in c. elegans: exl-1 ed exc-4. Il nostro studio recente ha mostrato che exl-1 regola lo stress degli animali gestione8. Abbiamo integrato un costrutto traslazionale exl-1::gfp in un genoma animale e creato linee transgeniche, che esprimono stabilmente gene exl-1 con un GFP come indicatore (Figura 2A e 2B). Sotto lo stress da calore, EXL-1::GFP si accumula nel nucleo della regione intestinale poiché il forte segnale GFP si sovrappone con la struttura di nucleo (Figura 2 C -E). Per confermare la localizzazione subcellulare, colorazione DAPI è stato utilizzato come un approccio a macchiare i nuclei. Mediante fissazione dell'etanolo per i DAPI colorazione spettacoli chiari nuclei nel corpo animale (Figura 3B). Fissazione di acetone inoltre raggiunge i risultati simili (Figura 3E). I segnali sovrapposti di GFP e DAPI confermano che EXL-1::GFP infatti accumulato nei nuclei della regione intestinale (Figura 3, F).
Figura 1: Immagini di una quarta larvale (L4) tappa di c. elegans sotto poteri di ingrandimento diverse. (A) 63 (C) X e (B) 115 X 400 X potere di ingrandimento. Frecce indicano verso la vulva di un verme di L4; Nota struttura di mezzaluna. Barra della scala = 100 µm in tutte le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sotto stress da calore, EXL-1::GFP si accumula nei nuclei delle intestino. (A) Normaski immagine di una regione intestinale prima di scossa di calore. (B) un forte segnale GFP è stato osservato nella regione instestinal prima di scossa di calore. (C) Normaski immagine di regione intestinale dopo shock termico (punto di frecce ai nuclei della regione intestinale). (D) un forte segnale GFP si accumula dopo shock termico. (E) sovrapposta a GFP e Normaski. Tutte le immagini sono prese con potere di ingrandimento X 400. Barra della scala = 50 µm in tutte le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: traslocazione nucleare EXL-1::GFP è confermata dalla macchiatura DAPI. (A-C) Uso fissazione dell'etanolo per colorazione DAPI. (D-F) Usando la fissazione acetone per colorazione DAPI. In A e D, colore verde Mostra il segnale GFP nella regione intestinale. In B ed E, colore blu Mostra i nuclei macchiando di DAPI. C e F Visualizza immagini sovrapposte di GFP, DAPI e Normaski. Barra della scala = 50 µm in tutte le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare: Acetone fissazione conserva l'esemplare e 60 giorni dopo la fissazione acetone, GFP e DAPI segnali sono ancora osservabili. (A) verde è per GFP. (B) blu è per segnale DAPI. (C) sovrapposta a GFP, DAPI e DIC. Tutte le immagini sono prese potere di ingrandimento inferiore a 400 X. Barra della scala = 50 μm. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo articolo presenta un metodo veloce ed efficiente per verificare cambiamenti sottocellulare della proteina dal citoplasma al nucleo. L'espressione della proteina è stata indicata da una fusione di GFP, mentre la struttura di nucleo è stata verificata da DAPI macchiatura (Figura 3). Dato che immunostaining proteine di c. elegans è impegnativo, la maggior parte localizzazione cellulare della proteina di c. elegans sono caratterizzati da loro tagging con le proteine marker come GFP, Laz, mCherry e altri18,19 , 20 , 21. in questo articolo, gfp è stato utilizzato per contrassegnare il gene bersaglio exl-1 al fine di dimostrare la sua localizzazione cellulare della proteina. Per confermare la localizzazione nucleare, colorazione DAPI è stato utilizzato. Sono stati presentati due metodi alternativi per la colorazione DAPI. Entrambi hanno mostrato in modo efficiente i nuclei forti a worms entro un lasso di tempo di lavoro decente (meno di 1 h). La fissazione dell'etanolo è adatta per un piccolo campionario come un'osservazione di qualità (raccogliendo meno di 50 vermi). Impedisce l'essiccazione completamente i vermi è la chiave. Una volta che il 95% di alcol evapora da vermi, procedere al passaggio successivo immediatamente. La fissazione di acetone è adatto per un campionario su larga scala, ad esempio un'analisi quantitativa (raccolta di oltre 50 animali). Tuttavia, a causa di più passaggi di lavaggio del campione, alcuni esemplari andranno perse. Pertanto, si consiglia vivamente di attentamente rimuovere il supernatante e mantenere come vermi come possibile. Una volta che sono sigillati, diapositive derivanti dalla fissazione di acetone possono essere conservati per una settimana a 4 ° C.
Questo protocollo può essere regolato ad altre proteine di interesse per tenere traccia delle modifiche della localizzazione subcellulare. Oltre alla sollecitazione di calore qui presentata, potrebbero essere valutati altri dosaggi di stress, come stress ossidativo, allo stress da metalli pesanti, le restrizioni dietetiche e altri. Cambiamento di localizzazione sottocellulare della proteina potrebbe essere esaminato anche modificando il background genetico della proteina di interesse. Per esempio, la linea transgenica può essere attraversata nello sfondo di un mutante differenti, così che l'interazione genetica romanzo può essere identificato. Interferenza del RNA (RNAi) poteva essere applicata anche per abbattere i geni specifici e per studiare il cambiamento di localizzazione sottocellulare della proteina risultante. Queste applicazioni sono di grande interesse per identificare nuovi componenti regolatori. Per una proteina sconosciuta, varie condizioni sperimentali devono essere testate, quali la concentrazione di reagente test, la durata del tempo lo stress e le fasi di sviluppo specifiche dei vermi. Nel nostro studio, abbiamo provato diverse durate, da 30 min a 5h e diverse temperature di stress. Una scossa di calore a 35 ° C per 3 h dimostra chiaramente una traslocazione nucleare della proteina.
Applicazioni aggiuntive di colorazione DAPI includono l'esame del processo di meiosi e mitosi in vermi, soprattutto nel germline cellule22,23,24,25e un conteggio del numero di nuclei in un sfondo20,26,27. del mutante genetico
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
I ceppi di c. elegans utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal centro Caenorhabditis genetica, che è sostenuto dal National Institutes of Health - ufficio programmi delle infrastrutture di ricerca (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501-Jun Liang e PSC-CUNY 66184-00 44 e 45 67248-00 a Jun Liang. Grazie Cathy Savage-Dunn per gentilmente condividere il suo spazio di laboratorio. Tutte le immagini di fluorescenza sono stati raccolti a Queens College Core Facility. Ringraziamo William J. Rice per i suoi commenti sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
References
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