Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

Published: July 24, 2018 doi: 10.3791/57932
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Agronomy and Horticulture and Center for Plant Science Innovation, University of Nebraska-Lincoln, 2USDA-ARS, Wheat, Sorghum and Forage Research Unit, University of Nebraska-Lincoln East Campus

Summary

חפירה של שורשי צמחים מן השדה, כמו גם עיבוד של דגימות לתוך endosphere, rhizosphere ואדמה מתוארים בפירוט, כולל הפקת דנ א ושיטות ניתוח הנתונים. נייר זה נועד לאפשר מעבדות אחרות שימוש בטכניקות אלה לצורך המחקר של קרקע, endosphere, rhizosphere microbiomes.

Abstract

מחקרים microbiome צמחים ואדמה הופכים יותר ויותר חשוב להבנה שמיקרואורגניזמים התפקידים לשחק את התפוקה החקלאית. מטרתו של כתב יד זה נועד לספק פירוט כיצד לדגום קרקע, rhizosphere ו- endosphere של ניסויי שדה משוכפל ולנתח שינויים שעלולות להתרחש בקהילות מיקרוביאלי סוג הדגימה, טיפול וכתוצאה צמח גנוטיפ במהירות. הניסוי נעשה שימוש כדי להדגים שיטות אלה מורכב חלקות השדה משוכפל המכיל שני, טהור, חמים-העונה עשבי (ושכנותיה virgatum ו gerardii זקניים) ותערובת נמוך-המגוון דשא (א gerardii, Sorghastrum נטויה, , Bouteloua curtipendula). בקצרה, צמחים הם חפרו, מגוון רחב של השורשים הם לחתוך להציב במאגר פוספט ואני מזועזע ואז לאסוף את rhizosphere. שורשים מובאים למעבדה על קרח, משטח לעקר עם אקונומיקה, אתנול (EtOH). Rhizosphere הוא מסונן, מרוכז על ידי צנטריפוגה. חפירות ארכיאולוגיות מהאדמה סביב כדור הבסיס להציב לתוך שקיות פלסטיק, הובאו למעבדה שבו כמות קטנה של אדמה נלקח DNA עקירות. ה-DNA שחולצו מן השורשים, קרקע, rhizosphere, ואז מוגבר עם צבעי יסוד האזור V4 של הגן rRNA מטוסי אף-16. Amplicons הם וסודרו, ואז נותחו בכלים לביואינפורמטיקה גישה פתוחה. שיטות אלה לאפשר לחוקרים לבדוק איך הקהילה מיקרוביאלי גוניות משתנה בשל סוג הדגימה, טיפול, ולשתול גנוטיפ. באמצעות שיטות אלו יחד עם מודלים סטטיסטיים, התוצאות נציג מדגימים ישנם הבדלים משמעותיים בקהילות מיקרוביאלית של שורשים, rhizosphere אדמה. השיטות המובאות כאן מספקים ערכה מלאה של צעדים כיצד לאסוף דגימות שדה בודד, לחלץ, לכמת, להגביר, רצף ה-DNA, לנתח את הקהילה מיקרוביאלי גיוון והרכב במשפטי שדה משוכפלת.

Introduction

מחקר Microbiome יש השלכות חשובות על הבנה וטיפול האקולוגית תהליכים כגון מזין רכיבה על אופניים, תחלופת חומר אורגני, לבין פיתוח או עיכוב של אדמת פתוגנים1,2. המחקר בתחום זה מחזיקה גם פוטנציאל גדול עבור הבנת ההשפעות של אדמה חיידקים על הפרודוקטיביות של קהילות צמחים טבעית ו- agroecosystems. אמנם ישנם מחקרים רבים התמקדו microbiome אדמה ב הטבעיות, דבר פחות התמקדו צמח חיידקים rhizosphere ו- endosphere agroecosystems3. בנברסקה, החקלאות חולש על הנוף על פני חלקים גדולים של המדינה, ביצוע המחקרים של קרקעות אלה איפה בחקלאות הגידולים גדלים נושא חיוני למחקר. מטרת המאמר שיטות היא להעניק חוקרים ערכה רגילה של פרוטוקולים כדי לתאר את החיידקים המצויים agroecosystems, כדי לקבוע כיצד שורשי צמחים לשנות את הקהילות מיקרוביאלית ב rhizosphere ו endosphere, בסופו של דבר להבין את הפונקציות שהחיידקים האלה לשחק את התפוקה ובריאות הצמח בקרקע.

השיטה המוצגת כאן שונה במקצת מן שננקטו על-ידי אחרים4,5 ב כי הנייר הזה מכוון למידה אילו חיידקים נמצאים אך ורק בתוך הבסיס, איך הם שונים חיידקים מיד מחוץ לשורש rhizosphere. רצף אמפליקון השתמשו במחקר זה מזהה את taxa חיידקים הנמצאים לדנ ומאפשר לחוקרים כדי לקבוע כיצד הקהילות לשנות בהתאם סוג הדגימה או טיפול. לאחד ההבדלים העיקריים בין פרוטוקול זה פרוטוקול דומה מאוד בשימוש על-ידי. Lundberg et al. 6 הוא כי במקום sonication, פרוטוקול זה משתמש עיקור משטח עם אקונומיקה, אתנול כדי להסיר את rhizosphere מן השורשים. אחרים החלו להשתמש בו גם משטח עיקור ביעילות7,8,9,10. שיטות אלה אינן יתרון יותר מאשר שיטות אחרות, אך שונה במקצת. שיטות אלה מתאימים במיוחד בשביל ניסויי שדה גדול משום עם מספיק אנשים ניתן לעיבוד חלקות השדה מעל 150 ליום, אשר מוסיפה עד בערך 450 דוגמאות כאשר לחלקו ל endosphere, rhizosphere ואדמה. כתב יד זה מתאר בפירוט את שיטות השתמשו כדי לדגום בשדה, לעבד את החומר במעבדה, לחלץ, רצף ה-DNA, ומספק סקירה קצרה של צעדים כדי לנתח את הנתונים המתקבלים רצף.

Protocol

1. שדה תיאור אתר

  1. מתארות אתרים ניסויי שדה בתקופות אוסף. לקבוע את המיקום של השדה (קו רוחב, אורך וגובה) המשתמשים ב- GPS.
  2. תאר את עומק הדגימה, זמן הדגימה, מרקם הקרקע.
  3. גורמים סביבתיים תפקיד חשוב בעיצוב קהילות מיקרוביאלי. להקליט מידע היסטוריים כגון הטמפרטורה השנתית מרושע, כמות המשקעים השנתית, זרעים של שנים קודמות, פרקטיקות חרישה, שיטת ההפריה, והיסטוריה של אתר שדה. תחנות מזג אוויר אוטומטי או התקנים אחרים שימושיים להקליט את כמות ממטרים יומית ואת הטמפרטורה על פני העונה הגוברת.

2. איסוף ועיבוד של אדמה, Rhizosphere השורש שדה דגימות

  1. החפירה של צמחים.
    1. תווית של פאן לשטוף ואת הדלי עם פתק נדבק המכיל מידע על החומר צמח מתחננות שיטעמו. כוללים מידע כגון מספר מגרש, צמח גנוטיפ, זנים של צמחים. לשאת את הדלי עם תוויות לעלילה, להשאיר את המחבת שטיפת-הוקמה תחנת העבודה בשטח.
    2. פירס אדמה עם חפירה לעומק של 30 ס מ כדי לחתוך את כל השורשים הצדדיים להחזיק את הצמח בקרקע. נפח הוא 18 ס"מ3. באופן אקראי לבחור ולאסוף שני צמחים לכל מגרש של אזורים שונים בתוך העלילה.
    3. חפירת שורשי הצמח על-ידי מינוף האת ולמקם את הכדור השורש בדלי עם תוויות. להחזיר את הדלי עם תוויות עם הכדור השורש שנחפרו תחנת העבודה בשטח. לחתוך את וזורקים ביומסה הצמח מעל פני הקרקע.
  2. הסרת אדמה מן השורשים ואוסף של אדמת בצובר.
    1. לנער שורשים באופן ידני להסיר אדמה או להשתמש בשמו או כף יד ההגה כדי להסיר את הקרקע מן השורשים. טלטול את השורשים מספיקה להסיר את אדמת בקרקעות מאוד החולי. יש ללבוש כפפות ולמקם שורשים ליד תחנת עיבוד.
    2. לאחר טלטולים השורשים, הנפח של הקרקע יהיה לשטוף את המחבת. לערבב את האדמה במחבת לשטוף, לפרק את כל רגבי אדמה עם כף יד ההגה. במקום מדגם של קרקע ללא תשלום של פסולת לתוך שכותרתו, 17.7 x 19.5 ס מ רוכסן תיק אחסון מקום במקום קריר או על קרח.
  3. אוסף של שורשים ו- rhizosphere.
    1. באמצעות מספריים גיזום מעוקר ב 70% EtOH, בלו מגוון של שורשים, כ 4-6 שורשים לכל צמח ואת כל שורש בסביבות 9-12 ס"מ אורך. למקם את השורשים נכרת (חיתוך לפי הצורך כדי להתאים) צינור שכותרתו 50 מ ל המכילה 35 מ של בלוק, מאגר פוספט (2פו ' NaH 6.33 g/L '4, 8.5 g/L נה2HPO4 נטול מים, pH = 6.5, 200 חומרים פעילי שטח µl/L).
      הערה: חומרים פעילי שטח (ראה טבלה של חומרים) נוספה לאחר autoclaving המאגר פוספט. אמצעי האחסון של הכדור השורש, הבסיס באורכים משתנים בהתאם צמח גיל, מיני צמחים.
    2. לנער צינורות למשך 2 דקות לשחרר את rhizosphere מפני השטח של השורשים. עם מלקחיים מעוקר ב 70% EtOH, הסר השורשים באמצעות הרכבת התחתית, חשופה בקצרה על נייר מגבות, ולמקם חדש, שכותרתו שפופרת 50 מ ל. הניחו שניהם הצינור המכיל את rhizosphere ואחד המכיל שורשים על קרח.

3. עיבוד של שדה דגימות למעבדה

  1. עיקור משטח של שורשים אחרי אוסף שדה.
    הערה: לבצע עיקור פני בהקדם האפשרי לאחר שחזר מן השדה. אם זה לא אפשרי על פני השטח לעקר את השורשים באותו יום, לאחסן שורשים ב 4 ° C עד תטופל.
    1. להוסיף כ 35 מ ל 50% אקונומיקה + 0.01% Tween 20-50 מ ל שורש צינורות שנאספו בשטח. לנער צינורות 50 מ ל 30 עד 60 שניות. יוצקים את 50% מלבין ולהוסיף 35 מ ל 70% EtOH. לנער עוד 30 עד 60 שניות.
    2. יוצקים את 70% EtOH ולהוסיף 35 מיליליטר מים סטרילי, הנדסה גנטית. לנער במשך דקה אחת. חזור למים לשטוף פעמיים נוספות.
      הערה: כדי להבטיח שטיפול פני שטח עיקור שלנו מספיקה, מצופה דגימות מים רינס האחרון ואנו נצפתה אין התפתחות של חיידקים (עמ' וואנג, שלא פורסמו נתונים, 2014). חוקרים אחרים בחנו ליעילות עיקור השורש באמצעות שיטות דומות9,10.
    3. כתם יבש שורשים על מגבות נייר נקי. להשתמש במגבת נייר נקיה עבור כל דגימה.
      הערה: מגבות נייר לעקר לפני השימוש. אנחנו לא לעקר את מגבות הנייר שלנו. עם זאת, אנחנו להשתמש במגבת נייר 1 עבור דגימה ולשמור על מגבות עטוף עד בשימוש.
    4. שימוש סטרילי מלקחיים ומספריים גיזום, לחתוך את השורשים כ 5 מ מ חתיכות ומקום לחתוך שורשים צינור חרוטי נקי, שכותרתו 15 מ"ל. חנות דגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
  2. עיבוד rhizosphere דגימות.
    1. לנער 50 מ ל צינורות המכיל דוגמאות rhizosphere מן השדה resuspend המדגם כולו. באמצעות מסננת סטרילית, 100-מיקרומטר-רשת תא (ראה טבלה של חומרים), מסנן הדגימה resuspended לתוך צינור 50 מ ל.
    2. Centrifuge הצינורות ב 3000 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. ומיד יוצקים את וזורקים את תגובת שיקוע.
    3. מקום rhizosphere כדורי הצינורות 50 מ על קרח. להוסיף 1.5 מ של מאגר פוספט סטרילי (ללא חומרים פעילי שטח) כדורי rhizosphere ו מערבולת להשעות.
    4. Pipet הנוזל על תנאי לתוך צינור microfuge נקי, שכותרתו, 2 מ"ל. ספין צינורות ב g x 15,871 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. מיד יוצקים את תגובת שיקוע, מסננים את הצינורות על מגבות נייר נקי.
    5. אחסן את כדורי ב-20 ° C עד עיבוד נוסף.
      הערה: השלבים 3.2.2 - 3.2.4 נעשים כדי להקטין את גודל צינור מדגם לאחסון. . זה שטח נוסף יעיל כדי לאחסן את הצינורות 2 mL קטן יותר בהשוואה הצינורות 50 מ.
  3. עיבוד דגימות. אדמה בשביל ניתוח הדנ א החילוץ ואדמה.
    1. בעזרת מרית מתכת סטרילי, למלא צינור נקי, שכותרתו mL 2 כ דור 3 של אדמה להפקת DNA. הימנע כל חתיכות שורש קטן ופסולת. חנות זו דגימת האדמה ב-20 ° C. שטיפה מרית מתכת ב 70% EtOH בין כל דגימה.
    2. במחבת נקייה לרחיצת, רוקן את התיק של אדמה לתוך מוערמים הנפות (ראה טבלה של חומרים), מסננת גדולה יותר על גבי מסננת קטנה יותר, באופן ידני ניפוי הקרקע דרך שתי הנפות. להשתמש במברשת לנקות היטב את הנפות בין הדגימות.
    3. להפריש 100 עד 125 גר' sieved אדמה בשקית רוכסן 17.7 x 19.5 ס מ אדמה עתידיות physicochemical וניתוח מרקם. מקם את שקי אדמה ב 4 ° C לאחסון לטווח קצר.
  4. עיבוד דגימות. אדמה בשביל לחות הקרקע.
    1. טרה שקית נייר חומה שכותרתו בקנה מידה. למדוד 40 עד 45 גר' אדמת sieved לשקית נייר חום. להקליט את המשקל של שקית נייר חום, אדמה על גליון נתונים, במקום שקיות בתנור ייבוש מוגדר כ- 55-60 ° C.
    2. לאחר 72 שעות, הסר את התיקים של תנור ייבוש. לאפשר את התיקים אדמה מגניב במשך לפחות 30 דקות ולאחר מכן לשקול.
    3. כדי להקליט את המשקל, להקרע לגודל אפס ולמקם את שקיות נייר חומות בסולם. לחשב את אחוז לחות הקרקע עבור כל דגימה באמצעות הנוסחה:
      Equation
      הערה: השיטה לחות הקרקע היא של קלוג תחנת ארוך המונח אקולוגי המחקר הביולוגי (לתר KBS). KBS לתר מספק מגוון רחב של פרוטוקולים הוקמה עבור חוקרים באתר שלהם (https://Lter.kbs.msu.edu/).

4. הכנת הבסיס מעובד דוגם עבור ה-DNA עקירות.

  1. לטחון חומר הבסיס קפואים כך המדגם היא הומוגנית.
    1. יוצקים חנקן נוזלי גביע פלסטיק עם שפכטלים נקי, נקי ומכתש לשמור דגימות קפוא לאורך כל תהליך שחיקה.
    2. למקם את הרקמה קפוא המליטה, לטחון עם איחדו לתוך אבקה. כל העת להוסיף חנקן נוזלי ברחבי טחינת לשמור דגימות קפוא.
    3. השתמש במרית כדי למקם את הקרקע רקמת צינור נקי, שכותרתו 2 מ"ל. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.

5. הפקת דנ א של אדמת ודוגמאות Rhizosphere בתבנית 96-ובכן

  1. דגימות. אדמה טעינת לוחות 96-ובכן.
    1. נגב את אזור העבודה עם אקונומיקה EtOH ו 1%-70%. ללבוש כפפות מעבדה במהלך שלבים אלה. להסיר הדגימות. אדמה אחסון-20 ° C, אפשר להפשיר בתוך דלי קרח.
    2. הסר את המכסה mat איטום צלחת החילוץ 96-ובכן זה מסופק עם הקיט מיצוי הדנ א. הנח את מכסה mat איטום בין 2 מגבוני נייר כדי להישאר נקייה בזמן אינו בשימוש. כדי למנוע זיהום, להשתמש PCR 8-ובכן דבק רצועות כדי לכסות את 12 עמודות של צלחת 96-ובכן החילוץ.
    3. להקרע סטרילי השקילה-משפך (גודל SM) בקנה מידה ולשקול את 200 עד 250 מ"ג של אדמה.
      הערה: אלה funnels סטרילי משוטחים בצד אחד, אז המשפך מניח שטוח בקנה מידה. המשפך הוא מלא אדמה והניח ישירות לתוך באר. טכניקה זו מונע האובדן של דגימות, ממזער את זליגת, ומונעת זיהום צולב.
    4. כדי לחשוף את הבאר הראשונה של צלחת החילוץ, בזהירות להרים את רצועת דבק, המקום צווארה של שוקלים מלא-המשפך לתוך המתאים. ובכן, ובעדינות מדריך את דגימת קרקע לתוך הבאר המתאים. להחליף רצועת דבק כדי לכסות את הבאר.
    5. חזור על תהליך זה עבור כל טוב של הצלחת, באמצעות משפך חדש, סטרילי עבור כל דגימה עד הלוח מלא. השאר אחד טוב ריק כפקד ריק של החילוץ.
      הערה: אחד טוב נשאר ריק על כל צלחת החילוץ כדי לשמש פקד שלילי (ריק). . זה שולט על מזהמים שעשויות להיות ערכת ריאגנטים11.
    6. התקן חזרה את מכסה mat איטום על הצלחת החילוץ ולאחסן את הצלחת ב-20 ° C עד מוכן להפקת DNA.
  2. טעינה בדגימות rhizosphere 96-ובכן לוחות.
    1. הסר את הדגימות rhizosphere אחסון-20 ° C ואפשר להפשיר בתוך דלי קרח.
    2. בצע את שלב 5.1.2 לעיל כדי להכין את הצלחת החילוץ של ה-DNA.
    3. מקום מגבון נייר נקי בקנה מידה ולאחר מכן להקרע מרית מתכת סטרילי בסולם. השתמש המרית בקפידה ולהוציא חלק בגדר rhizosphere של צינורית הדגימה. לחזור המרית קנה המידה, שוקלים בין 200 ל-250 מ ג מדגם rhizosphere.
    4. בזהירות להרים את הרצועה דבק כדי לחשוף את הבאר הראשונה של צלחת החילוץ, זווית המרית מלא לתוך הבאר, לגרד את החומר rhizosphere לתוך הבאר המתאים עם קיסם סטרילי.
    5. לשטוף את מרית מתכת במים, ואחריו 70% EtOH בין הדגימות. חזור על תהליך זה עבור כל טוב של הצלחת עד הצלחת התמלאה, עוזב אחד טוב ריק כפקד ריק של החילוץ.
  3. הפקת דנ א מ rhizosphere וקרקע בפורמט 96-ובכן.
    1. תמצית קרקע ומי rhizosphere הדנ א באמצעות ערכת אופטימיזציה עבור אדמה (ראה טבלה של חומרים), ע פ הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: אנו משתמשים ערכה ספציפית זו כדי לבודד קרקע ומי rhizosphere DNA בגלל היכולת של ריאגנטים קניינית כדי להסיר חומצה רקבובי, מעכבי PCR עוצמה אחרים שנמצאו בקרקע.
  4. כימות הדנ א.
    1. לכמת 4 ריכוזי לתקני באמצעות ערכת ודוגמאות 92 (ראה טבלה של חומרים; סטנדרטים כלולים), על-פי הפרוטוקול של היצרן.
    2. לכמת את הדגימות 4 הנותרים הוסרו מן הלוח כדי להכיל את וולס בסטנדרטים ארבע באמצעות ערכת (ראה טבלה של חומרים), על-פי הפרוטוקול של היצרן.

6. הפקת דנ א מן השורש דוגם בתבנית 96-ובכן.

  1. טעינת בסיס דגימות לוחות 96-ובכן.
    1. נגב את אזור העבודה עם אקונומיקה EtOH ו 1%-70%. ללבוש כפפות במהלך שלבים אלה.
    2. לשמור דגימות שורש הקרקע מוקפאת. בכל עת על-ידי הצבת דגימות בתוך דלי קרח יבש.
    3. מילוי גביע פלסטיק עם חנקן נוזלי ומניחים microspatulas בתמיסה המשפכים סטרילי השקילה-(גודל XSM) במיכל פלסטיק כדי להתקרר.
    4. הסר את המכסה mat איטום החובט חרוז החילוץ 96-ובכן מסופק עם הקיט, במקום זה בין 2 מגבוני נייר כדי לשמור נקי כאשר אינו בשימוש.
      הערה: הגירסה המתקדמת של הקיט הזה, שוחרר לאחר הזמן שנוכל לבצע עקירות הדנ א הללו, מחייב את המשתמש לספק את הצלחות חרוז החילוץ. את הטבלה של חומרים, יש לנו המפורטים קטלוג של ספק המידע הדרוש כדי להזמין פריטים אלה.
    5. כדי למנוע זיהום, להשתמש PCR 8-ובכן דבק רצועות כדי לכסות את 12 עמודות של צלחת 96-ובכן החילוץ.
    6. מניחים את הצלחת חרוז החילוץ על קרח יבש לשמור דגימות הבארות קפוא.
    7. בזהירות הרם רצועת דבק כדי לחשוף את הבאר הראשונה של צלחת החילוץ, למקם את צווארה של השקילה-המשפך מלא לתוך הבאר המתאים וכיצד להוסיף 3 כפות מרית רקמת השורש הקרקע. להחליף רצועת דבק כדי לכסות את הבאר.
      הערה: האדמה ואת rhizosphere הם הקרת על הקרח לפני שקילה, ואילו חומר צמחי מתנהל קפוא. רקמת הצמח קפוא, במיוחד בכמויות קטנות, קשה שוקלים בקנה מידה ללא מפשיר. שוקלים בדיקות נעשו על הקרקע רקמת השורש כדי לקבוע כמה כפות מרית היו מספיקות. שימו לב כי היצרן של הקיט אינה דורשת כמות מדויקת של רקמות אך ממליצה בסביבות 50 מ ג. סוגי צמחים שונים מדגם ישתנו, המשתמש יהיה צורך לקבוע את הכמות המתאימה.
    8. חזור על תהליך זה עבור כל טוב של הצלחת עד הלוח מלא.
    9. לאחסן את הצלחת ב-20 ° C עד מוכן להפקת DNA.
  2. הפקת דנ א של רקמת השורש.
    1. תמצית ה-DNA באמצעות ערכת אופטימיזציה עבור צמחים (ראה טבלה של חומרים) ע פ הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: אנו משתמשים ערכה זו כי היא תוכננה במיוחד עבור רקמות הצמח להשיג את היבול המרבי של הדגימות שורש. שלא כמו אדמת, rhizosphere, החומצה רקבובי מזהמים אחרים הם פחות בעיה עבור רקמת השורש.
  3. לכמת את ה-DNA כמו שלב 5.4.

7. הגברה, קביעת רצף ה-DNA מבודדות.

  1. להגביר את האזור V4 של הגן 16 עם הוכחה קריאה פולימראז (ראה טבלה של חומרים) כפי שמתואר Gohl. et al. 12 דגימות ברקוד עם תחל יצירת אינדקסים שונים, בריכה לפני רצף. רצף בשיטות המתוארות על ידי Gohl et al12 באמצעות תהליך ה-PCR שלב שני עם V4 תחל (1 קובץ משלים).
    הערה: חלק מהשיטות עבור השלבים הבאים מתוארים בפרטים במקום12,13,14 , ולכן לא יפורט כאן. עבור הדגימות שורש, הרשות הפלסטינית חוסמי נוספו כדי להפחית את כמות DNA פלסטידה מוגבר של רקמת הצמח, אשר בעבר היה לתאר באופן מלא15. שני פקדים שימשו רצף, פקד שלילי אשר כללה את החילוץ צלחת ריקה פקדים (ראה הערה לאחר שלב 5.1.5), קהילה מדומה של אוכלוסיה הידוע של DNA חיידקי (ראה טבלה של חומרים) אשר שימש חיובי שליטה.
    הערה: ברוב המקרים, ערכות ריאגנט MiSeq v3 משמשים במצב סוף לזווג בסיס 2 X 300. במשך הדגימות כתב יד זה, שימש את 2500 HiSeq אילומינה במצב מהיר עם 250 מצב מדגמים מזווגים-סיום (2 x 250). כל המדגם היו רציף באותו הנתיב.
  2. לעבד את הנתונים רצף דרך צינור עבור ניתוחים הקהילה מיקרוביאלית (USEARCH v9.2.64, QIIME v1.9.1, RStudio v3.4.3 16).
    1. הכנת רצף נתונים באמצעות USEARCH17.
      הערה: USEARCH זמין באינטרנט עם הנחיות מלאות (https://www.drive5.com/usearch/).
    2. Demultiplex רצף נתונים באמצעות אינדקס קריאות או ברקודים להקצות אילומינה מקריאה דגימות.
    3. למזג את קריאות לזווג-סוף לקבל רצף קונצנזוס. השתמש בפקודה: usearch-fastq_mergepairs * R1*.fastq-relabel @ - fastq_maxdiffs 10 - fastq_minmergelen 230 - fastq_maxmergelen 320 - fastq_pctid 80 - fastqout merged.fq.
      הערה: הפרמטרים מוגדרים באמצעות הפניה USEARCH את ספר ההדרכה.
    4. הסר תחל את רצף הנתונים כדי למנוע ההחלפות ברצף פריימר, אשר עלולה להיגרם על ידי התגובה ה-PCR. השתמש בפקודה: usearch-fastx_truncate merge.fq - stripleft 19 - כן, בטוח 20 - fastqout stripped.fq.
    5. לסנן רצף נתונים כדי להסיר את הקריאות באיכות נמוכה ולשמור רצפים יחידה מבצעית בטקסונומיה (OTU) באיכות גבוהה. השתמש בפקודה: usearch-fastq_filter stripped.fq-filtered.fa - fastaout fastq_maxee 1.0.
  3. צור אוטוס ב- USEARCH.
    1. לבצע את dereplication כדי לזהות את ערכת הרצפים OTU הייחודיים. השתמש בפקודה: usearch-fastx_uniques filtered.fa - fastaout uniques.fa - sizeout...-relabel Uniq.
    2. אשכול אוטוס עם דמיון רצף 97 – 100% כדי לייעד את אוטוס ייחודי. השתמש בפקודה: usearch-cluster_otus uniques.fa - minsize 2 - אוטוס otus.fa-relabel Otu.
      הערה: שלב זה משלבת גם הסרת singletons מ אוטוס באשכולות והסרה של כימרות רצף נתונים.
    3. צור טבלת OTU USEARCH. השתמש בפקודה: usearch-usearch_global stripped.fq - db otus.fa-לנטישה פלוס - מזהה 0.97 - otutabout otutable.txt.
      הערה: פקודה זו יוצרת טבלה עם מספר הקריאות (סעיפים) של כל אוטוס עבור כל דגימה. הטבלה OTU משמש צעדים במורד הזרם כולל שפע דיפרנציאלית ניתוחים וניתוחים גיוון מיקרוביאלי. דוגמה OTU טבלה מוצג באיור משלימה 2.
    4. לבצע ניתוח rarefaction QIIME v1.9.1 18.
      הערה: עקומת rarefaction מחושבת באמצעות הטבלה OTU כדי לקבוע אם העומק של הרצף דוגם כראוי הקהילה מיקרוביאלי. דוגמה של עקומות rarefaction מוצגים משלימה באיור3.
    5. לבצע ניתוח של גיוון אלפא18. להשתמש alpha_rarefaction.py QIIME v1.9.1 כדי לחשב את המגוון של הקהילה חיידקים בתוך כל דגימה.
      הערה: ניתוח זה חישוב מדדי המגוון כמו שאנון19, סימפסון20ו Chao121.
    6. התנהגות18,22ניתוח גיוון בטא. שימוש ב- script פיתון: beta_diversity_through_plots.py במטריצת dissimilarity v1.9.1 בריי – קרטיס QIIME.
      הערה: ניתוח זה משווה הרכב הקהילה מיקרוביאלי בין הדגימות.
    7. לבצע ניתוחים סטטיסטיים בין קבוצות. השתמש מטריצות מרחק מחושב עבור שימוש בפונקציה אדוניס, anova החבילה טבעוני23 v2.4.5 RStudio16PERMONOVA. לערוך ניתוח הקנוני של ניתוח נקודות הציון העיקריות (CAP) באמצעות הפונקציה capscale בחבילה טבעוני. הצג באופן חזותי נתונים באמצעות ggplot2 החבילה24 v2.2.1 ב RStudio.

Representative Results

התוצאות נציג שהוצגו בכתב יד זה בא מתוך אתר שדה נוסדה בשנת 2012 לחווה חטיבת המחקר של החקלאות אוניברסיטת נברסקה לינקולן ליד מיד, נברסקה לפני הניסוי, האתר כבר הצליח כמו סיבוב תירס-סויה . האתר המחקר ממוקם על שלושה סוגים שונים של קרקעות, אך הנתונים נותחו כאילו כל השינויים במאפייני הקרקע נמדד בשל הטיפולים שהוטלו.

אתר שדה הכיל שני, טהור, עומד של switchgrass (virgatum פ קורות חיים ליברטי) ו bluestem גדול (gerardii א), כמו גם תערובת עשב נמוך-המגוון המכילה bluestem גדול, indiangrass (ס' נטויה) ו- (גראמה sideoats 'בבוט' נולד ב- curtipendula). החלקות דשא חמים-העונה שלוש היו בעיצוב בלוק שלם אקראי ששוכפל שלוש פעמים. מקונן לתוך שלוש החלקות דשא שונים היו שני טיפולי הפריה חנקן (N), אשר היו 56 (N1) ו- (N2) 112 ק ג N חה-1 של אוריאה יישומית. בזמן microbiome הדיגום בסוף עונת הצמיחה, הכיל 8.0 ± 1.1 (זאת אומרת ± SD) ppm החנקני החלקות מופרית עם 112 ק ג N חה-1 ו- 6.8 ± 0.7 (ממוצע + SD) ppm החנקני החלקות מופרית עם 56 ק ג N חה-1. החלקות היו כבר מופרית פעם בשנה. הדשא חמים-עונת מגרשים נקבעו חלקות הראשי (8000 מ'2) ו- N טיפולים היו החלקות פיצול (4000 מ'2). Bluestem גדול היה נזרע כמו תערובת 50: 50 של "בוננזה" 'מכרה זהב', Indiangrass היה נזרע כמו תערובת 50: 50 של 'הצופים' 'לוחם'. החלקות ניטעו בשנת 2012, היישום N הראשון התרחש באביב 2013.

הקרקע ואת שורש דגימה נערך ב- 15 בספטמבר 2014. העבודה המתוארות להלן נערכה על שדה זה הוקם מגרש המפוצל עיצוב אקראי עם שלושה משכפל (איור 1). העומק הממוצע רצף של כל הדגימות עבור endosphere היו כדלקמן: 4871 rhizosphere (זאת אומרת ± SD), ± 5711: אדמת, ± 14684 40726: 38184 ± 9043. אחד המקורות הגדולים ביותר של וריאציה בניסויים אלה, בשיטות המתוארות, ההבדל בקהילות חיידקים שנמצאו בין סוגי מדגם (איור 2). בערכת נתונים ייצוגית זו, rhizosphere ואת אדמת להיראות יותר דומים בהרכב אחד לשני מאשר endosphere (איור 2 א). עם זאת, היו גם מאוד משמעותי (p = 0.001) הבדלים בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין rhizosphere לבין אדמה (איור 2B). וריאציית הכולל היוו בניסויים אלה נותחו על ידי סוג המדגם היה 26%.

ניתוח גיוון אלפא הראה כי הקהילות מיקרוביאלית endosphere היו נמוכות במדגם גיוון לעומת קרקע ו rhizosphere (איור 3). ההבדלים המשמעותיים היחידים בשונות בין המינים דשא בתא כלשהו היו בין הדגימות endosphere של bluestem גדול switchgrass, עם switchgrass שיש מגוון מינים חיידקים גבוה משמעותית (איור 3). הניתוח השפע היחסי (איור 4) מדגיש את הדומיננטיות של פרוטאובקטריה ואחריו Actinobacteria בכל סוגי הדגימה. אדמת ו rhizosphere גם נשלטים על ידי Acidobacteria ו- Chloroflexi , ואילו endosphere היה שפע יחסי גדול יותר Bacteriodetes.

בניסוי זה, הצמחים גדלו עם שתי כמויות שונות של דשן N, ולכן ניתחנו את הנתונים כדי לקבוע היו תופעות הטיפול. השפעות הטיפול היוו 12% וריאציית הכולל אך לא היו שונים באופן משמעותי למרות ב ההסמכה שני הטיפולים נראים שונים (איור 5). זה מדגיש את החשיבות של ניתוחים סטטיסטיים עבור אלה datasets ולא בדיקה ויזואלית או פסקי דין איכותי.

הבדלים בהשפעה הצמח microbiome של רקמות הצמח וקרקע היו visualized באמצעות שיטה המאולץ של ההסמכה. הבדלים סטטיסטיים היו נחושים באמצעות ניתוח PERMANOVA כדי לבדוק אם משתנים מסוימים, כמו מינים, לגרום בהרכב הקהילה חיידקים שונים באופן משמעותי בין הדגימות. כאשר כל סוגי דגימה נותחו יחד, הבדל מאוד משמעותי נמצאה בהרכב הקהילה מיקרוביאלית עקב מיני צמחים (איור 6). בניסוי זה, הסכום של וריאציה מהיבול על-ידי מיני צמחים היה 6.7%. לבסוף, כל סוג הדגימה נותחו בנפרד כדי לקבוע אשר של סוגי דגימה עלול לדחוק את האפקט מינים צמח משמעותית. רק ב endosphere היה הבדל מאוד משמעותי (p = 0.001) בין היצירות הקהילה מיקרוביאלית של מינים שונים (איור 7). סוגי דגימה אחרים, האפקט מינים לא היה משמעותי כאשר מנותח בנפרד. Endosphere, הווריאציה אחוז עקב מינים היה 27%, ואילו זה היה נמוך ב- rhizosphere (18%) וקרקע (15%). זה מדגיש עוד יותר את חשיבות ניתוח בנפרד כל סוג הרקמה.

Figure 1
איור 1: דוגמה של עיצוב ניסיוני שדה. תכנון ניסויי שדה הממחישות עיצוב בלוק שלם אקראי שהפקידים של אתר שדה הממוקם ב אוניברסיטת נברסקה לינקולן מחקר נברסקה המזרחי ומרכז סיומת של יד מיד, נברסקה לקבלת תיאור מלא באתר בסעיף התוצאות. N1 היא הנמוכה (56 ק ג N חה אוריאה-1 ) ו- N2 (112 ק ג N חה אוריאה-1 ) הוא הקצב חנקן גבוה יותר היה מוחל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: בטא גיוון ניתוח משווה את ההרכב מיקרוביאלית סוגי דגימה שונים כולל endosphere, rhizosphere מהאדמה הדגימה עשב רב שנתי בשנת 2014- הניתוח בוצע באמצעות סקריפט פיתון ב QIIME1.9.1 כדי לייצר המטריקס dissimilarity קרטיס בריי. ניתוח נקודות הציון העיקריות (PCoA) המבוסס על המטריצה dissimilarity בריי קרטיס היה מדמיין ב- RStudio. PCoA1 ו- PCoA2 לציין את השונות הראשון והשני בגודלו מוסברת על ידי הניתוח PCoA. ניתוח סטטיסטי PERMANOVA בוצעה כדי לקבוע את המשמעות בין סוגי מדגם, ו p הערך מוצג בפינה הימנית העליונה. לכל סמל ספרתית מייצגים את הקהילה כולה מיקרוביאלי עבור כל דגימה. (א) סוגי מדגם Endosphere, rhizosphere ואדמה נותחו ביחד. כל הדגימות 87 היו לשאוף כדי רצפים 486 לדגימה. (B) Rhizosphere וקרקע נותחו ביחד. כל הדגימות 59 היו דליל עם רצפי 8231. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אלפא גיוון ניתוח באמצעות שאנון אינדקס עבור כל המינים endosphere, rhizosphere, אדמת. הניתוח בוצע באמצעות סקריפט פיתון ב QIIME1.9.1. Rarefaction נעשה עבור endosphere, rhizosphere, סוגי קרקע מדגם בהתאמה עם רצפי 486, 17154, 8231 לדגימה. תיבות מציינות את percentiles 25 ו-75 (רביעונים הראשון והשלישי). הקו האופקי בתוך התיבה מציינת את החציון ואת האדום בנוסף מציג את הממוצע. . שפם להציג את טווח הנתונים למעט ליניאריים (אשר מוצגים כנקודות שחורות) שנפל פי 1.5 יותר מאשר את טווח בין רבעוני (n = 6 עבור כל דגימה. אלא בשביל גראמה sideoats לערבב איפה n = 5). האינדקס שאנון של כל חמישה מינים endosphere היו נמוכות יותר הן rhizosphere והן אדמה. מבחן-פרמטרית של סכום דרגה Wilcoxon שימש כדי לקבוע את המשמעות בין המינים, רק הבדלים משמעותיים בין המינים הוצגו על גבי הארגזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: השפע היחסי על רמת מערכה ב endosphere, rhizosphere, ו אדמה. דוגמאות נותחו כדי להשוות בין השפע של חיידקים phyla בין סוגי מדגמים שונים (n = 29 לכל סוג הדגימה). הניתוח בוצע באמצעות סקריפט פיתון ב QIIME1.9.1 מן הטבלה OTU. הצבעים השונים בתוך תרשים העוגה מציינות את phyla. האחוז מציין שפע יחסי של כל מערכה ב כל סוג הדגימה. המידע מערכה היה להן ביאורים באמצעות Ribosomal מסד נתונים פרוייקט מסווג (RDP)25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ניתוח באמצעות טיפול כגורם מגבילה בין כל סוגי דגימה. ניתוח הקנוני של נקודות הציון העיקריות (CAP) ניתוח בוצע כדי לקבוע אם היו הבדלים בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין הטיפולים. הטיפול N, n = 42 עבור N1 (56 ק ג N חה-1) ו- n = 45 עבור N2 (112 ק ג N חה-1). המטריצה dissimilarity קרטיס בריי נוצר באמצעות סקריפט פיתון ב QIIME1.9.1. ניתוח שווי בהתבסס על המטריצה dissimilarity קרטיס בריי נעשה על ידי הגבלת הטיפול כגורם ב- RStudio. PERMANOVA ניתוח בוצע כדי לקבוע אם היו הבדלים טיפול משמעותי, ואת הערך p מוצג בפינה הימנית העליונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ניתוח באמצעות מיני צמחים כגורם מגבילה בין כל סוגי דגימה. הניתוח נערך כדי לקבוע אם היו הבדלים בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין מינים בכל סוגי הדגימה. תיאום קואורדינטות העיקרי וניתוח כובע של כל סוגי דגימה (endosphere, rhizosphere ואדמה) עשו שימוש במטריצה dissimilarity קרטיס בריי. המטריצה dissimilarity קרטיס בריי נוצר באמצעות קובץ ה-script פיתון ב- QIIME1.9.1. ניתוח שווי בהתבסס על המטריצה dissimilarity קרטיס בריי נעשה על ידי המגביל את מיני צמחים כגורם ב- RStudio. ניתוח סטטיסטי PERMANOVA בוצעה כדי לקבוע את המשמעות בין מיני צמחים, ו P הערך מוצג בפינה הימנית העליונה. לכל סמל ספרתית מייצג את הקהילה כולה מיקרוביאלי עבור הדגימה. n = 18 עבור כל המינים בכל סוגי דגימה פרט n = 15 המיקס גראמה sideoats. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: דוגמה של ניתוח שווי שימוש מינים כגורם מגבילה עבור כל סוג הדגימה בנפרד. תיאום קואורדינטות העיקרי וניתוח כובע של כל סוג הדגימה (endosphere, rhizosphere ואדמה) באמצעות מטריצת dissimilarity קרטיס בריי. כל סוג המדגם היה דליל 486, 17154 של קריאות 8231 לדגימה בהתאמה ב endosphere, rhizosphere ו אדמה. מינים שימש כגורם כדי להגביל את ההסמכה. ניתוח סטטיסטי PERMANOVA בוצעה כדי לקבוע את המשמעות בין מינים בסוג כל דגימה, ו p הערך מוצג בפינה הימנית העליונה. לכל סמל באיור מייצג את הקהילה כולה מיקרוביאלי עבור כל דגימה. גודל המדגם הוא n = 29 לכל סוג הדגימה, n = 6 עבור כל מיני צמחים לכל סוג הדגימה חוץ המיקס גראמה sideoats (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בשיטות המתוארות בכתב היד צריך לאפשר למדענים בקלות להכנס לתחום metagenomics אדמה וצמח. במהלך השנים, אנו יש מעודן השיטות שלנו מאז ביצוע הניסוי המתואר בכתב היד. שינוי אחד הוא כי עכשיו מראש מתייגים צינורות לפני היציאה לשדה מדגם. המעבדה שלנו משתמשת מערכת barcoding תווית מדפסת. המדפסת תווית לא רק חוסך זמן כאשר תיוג צינורות, אבל גם הופך את הכל קל יותר לאתר, לזהות כראוי את דגימות ללא הגחמות של כתב היד האנושית. נקודה קריטית נוספת היא שאנחנו מנסים לעבד את החומר לאחר שהבאת אותו בחזרה מן השדה בהקדם האפשרי. אנו שואפים להקפיא את הקרקע המשמש עבור ניתוח הדנ א, לעקר, להקפיא את השורשים, לסנן ואת להקפיא את rhizosphere תוך 12 עד 36 שעות לאחר שחזר מן השדה. ההליכים מיצוי הדנ א הם ממושך עם שלבים רבים, במיוחד עבור קרקע ומי rhizosphere, כך רכשנו רובוט (Flex השלדג, ThermoFisher), זה ממזער את הידיים בזמן הפרוטוקולים הפקת דנ א, מפחיתה טעויות אנוש הנובעות עשוי להיות מוצג. ומשפר את עקביות תשלימו אצוות של אדמה, שורשים או rhizosphere מעובדים. כאשר עובדים עם חומר צמחי חשוב להחליט על סוג הבסיס שילמדו או לקחת מגוון סוגי שורש כדי לקבל "מדגם מייצג". שמירה על שורשים, משאיר במצב קפוא כאשר ניצוח של עקירות הדנ א הוא חשוב, כמו זה להבטיח שיש אין זיהום צולב בין דגימות בשעת מילוי צלחות מיצוי הדנ א 96-ובכן. גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא המספר של משכפל שישמש בעת תכנון שדה ניסויים ושימוש מלא אקראי עיצוב במידת האפשר26. בשל השתנות השדה גבוהה זה יהיה חייב להיות מספר גדול של משכפל כדי לזהות הבדלים קטנים. לבסוף, מתוך הניסיון שלנו זה חיוני כדי לוודא קרקעות אינם רטובים מדי בעת סטטורי השורשים. אם קרקעות רוויים עם מים זה מבולגן לא רק לעבוד עם, אך זה גם מאוד קשה כדי להגדיר את rhizosphere וכדי להסיר את הקרקע מן השורשים.

שינוי אחד שהתבצע מוקדם מאוד במהלך הפיתוח של שיטות אלה היה במקום רועד הצינורות ביד כדי לשחרר את rhizosphere שלנו לשדרג vortexers מופעל על ידי גנרטור גז כדי להקל את עבודת השדה ועוד סטנדרטית במונחים של הזמן ואת אופן כל שפופרת היה נסער. מגבלה אחת של הגישה רצף אמפליקון היא הרזולוציה טקסונומי של התוצאות הוא מוגבל אוטוס רבים הם לא ידועים או היחיד הידוע ברמת המשפחה או סוג. תחום המחקר מתפתח במהירות רבה ולכן חשוב להיות מודעים גישות חדשות ומתפתחות, במיוחד עבור ניתוח נתונים זה עשוי לשפר את הרזולוציה של התוצאות.

פרוטוקולים אלה הם רק עבור הלומדים חיידקים, ארכאונים, לא פטריות. השימוש של תחל שונים עבור הגברה יאפשר לחקר קהילות פטרייתי שימוש באותו DNA דגימות27,28. שיטות אלה אינם דורשים הרכישה של כמויות גדולות של ציוד כי השיטות ניתן לפשט. השיטות נתאר כאן הם בעיקר לקביעת "מי זה שם", אך השדה מתפתח במהירות לתוך שואל שאלות חשובות על הפונקציה, אשר שניתן לטפל בהן באמצעות רובה רצף שיטות, בידוד ו בדיקת הפונקציונליות של חיידקים, או רצף הגנום כולו מיקרוביאלי.

התוצאות נציג להדגיש את ההבדלים בקהילות חיידקים העלולים להתגלות בשיטות המתוארות. ההבדלים ההלחנה באמצעות הגישה בטא-המגוון של ניתוח נתונים22, הוצגו בין סוגי מדגם. ההבדלים האלה נצפו בבירור במחקרים רוב אחרים כאשר endosphere, rhizosphere ואדמה מכילה קהילות חיידקים ייחודי3. המדד לגיוון שאנון מחושב כדי לקבוע את השפע ואת שויון של המין מיקרוביאלי מתנה בתוך כל מיני צמחים endosphere, rhizosphere, וכן קרקע. כפי שמוצג במחקר זה ובמקומות רבים אחרים, גיוון אלפא הוא הגבוה ביותר האדמה, להקטין מעט ב- rhizosphere, ואז להקטין באופן משמעותי5,3,endosphere29. תוצאות אלו מצביעות על השיטות המתוארות כאן מתאימים לזיהוי שינויים ההלחנה ב endosphere, rhizosphere, ו אדמה.

הדומיננטיות של פרוטאובקטריה הוא ממצא נפוץ במחקרים על endosphere וקרקע30,31,32. Endosphere יש בדרך כלל מגוון התחתון של מינים חיידקים עם השפע היחסי גבוה יותר פרוטאובקטריה. זה שוב מדגיש כי התוצאות כאן הן נציג ממצאים אחרים בספרות. ההשפעות הטיפול במחקר זה היו לא שונה באופן משמעותי, שתי סיבות הגדולות עשויים להיות כי ההבדלים המוטלים על-ידי הטיפולים לא היו גדולים מספיק כדי ליצור וריאציה מספיק כדי לזהות כי דגימה זו נעשה בסוף עונת, כאשר השדות אולי היו מספיק זמן כדי לשלוף את החנקן לרמות דומות, וזה מה נמדד בסוף עונת הצמיחה. במחקר אחר באמצעות שיעורי ההפריה דומה לאורך תקופה ארוכה יותר של זמן, רק יחסית שינויים קטנים בהרכב של microbiome היו נמדדו33. מחקרים אחרים הראו שינויים בקהילות פטרייתי והן חיידקי עקב חנקן-דשן-34,-35.

מיני צמחים ידועים לשחק תפקידים בקביעת שלהם microbiomes3,32,36 , הבדלים קטנים אפילו וריאציה הקהילה מיקרוביאלי הוכחו בין צמחים שונים אחרים בתוך אחד המינים37. במחקר זה, נמצא הבדל משמעותי בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין מיני צמחים. כל סוגי מדגם זה הופיעה שיש switchgrass הרכב מיקרוביאלי ברורים ביותר, אבל ההבדלים בין המינים היו רק משמעותי סטטיסטית ב endosphere. הרכב הקהילה rhizosphere הפכה משמעותית אם משכפל נוסף היו זמינות לניתוח.

שדה משולב, מעבדה, והפרוטוקולים אנליטי המתוארים כאן מספקות שיטה חזקה לימוד השפעת גורמים שונים איך ההרכב של הקהילות מיקרוביאלי קרקעות, rhizosphere, את endosphere של השורשים36. יש הרבה מאוד עבודה באזור של הלומדים microbiomes, במיוחד בשטחים חקלאיים. שאלות חשובות לגבי איך התשואות שונו על-ידי microbiome הקרקע טרם להיות הובהר באופן מלא. אפילו את השאלות הבסיסיות ביותר לגבי איך היבול סבבים להשפיע על אדמת microbiome, איך התזמון משנה את microbiome, מתח איך והאביוטיים הפיצולים של microbiome, כיצד סוג הקרקע אינטראקציה עם גורמים אלה כדי לשנות את microbiome, ולבדוק אם קיימים יוניברסל חיידקים מסוימים יבולים או אזורים של ארה ב הם כל שאלות פתוחות. שיטות אלה יהיה גם שימושי עבור מחקרים אפידמיולוגיים לזהות את הנוכחות ואת ההתמדה של חיידקים פתוגניים, ומוצלח. אופק עתידי אחר ששיטות אלה יהיה להתחיל שילוב ה-DNA בשיטות המתוארות כאן עם הצמח, חיידק ה-RNA, מטבוליט נתונים. שיפור נוסף ובדיקות של משתנים נוספים יהיה חשוב עבור נוספים מיטוב של פרוטוקולים אלה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

הפיתוח של כתב יד זה נתמך על ידי המרכז EPSCoR של קרן המדע הלאומי השורש, Rhizobiome חדשנות פרס אויה (oia)-1557417.... איסוף הנתונים נתמכה על ידי קרנות של אוניברסיטת נברסקה, מינהל המחקר החקלאי ופיתוח על ידי מענק הפתח של משרד החקלאות. אנחנו גם תמיכה של משרד החקלאות-ARS ומסכים העניקה תמיכה חקלאות, מזון המחקר יוזמת תחרותי מענק מס 2011-68005-30411 של משרד החקלאות המכון הלאומי של מזון וחקלאות להקים ולנהל את שדות אלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 12955-4 Extraction kit for soil and rhizosphere
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 13496-4 Extraction kit for roots
D-Handle Digging shovel, 101 cm L Fiskars 9669
Rapid Tiller, 40 cm L Truper 34316
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm Ziploc NA
Cooler Any NA
Wash pan Any NA
Plastic bucket Any NA
Gloves (work and lab) Any NA
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-8FS
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-4FS
portable generator Honda brand works well NA
Sterile cell strainers 100 μm mesh size Fisher Scientific 22-363-549
NaH2PO4·H2O VWR 0823
Na2HPO4 VWR 0404
Silwet L-77 Lehman Seeds VIS-30 Surfactant
Autoclaves Any NA
Drying Oven Any NA
Scale Any Any
Bleach CLOROX - household strength NA
Tween 20 Any NA
Liquid Nitrogen Any NA
Dry Ice pellets Any NA
Ethanol Any NA
11 cm precision fine point tweezers Fisher 17456209
18 cm Straight point specimen forceps VWR 82027-436
13.5 cm Pruning Scissors Fiskars 9921
2 mL tube Any NA
15 mL PP conical tube MIDSCI C15B
50 mL PP conical tube MIDSCI C50B
Ultrapure water Millipore-sigma Milli-Q Integral, Q-POD
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854 For DNA quantification of removed samples
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 For DNA quantification
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates Corning 3631
pPNA PCR Blocker PNA Bio PP01-50
mPNA PCR Blocker PNA Bio MP01-50
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing BEI Resources HM782D
Adhesive 8 well-strips for plates VWR 89134-434
Stainless steel beads, 3.2 mm dia Next Advance SSB32
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) CoStar 3959
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere TWD Tradewinds, INC ASWF1SPK
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf TWD Tradewinds, INC ASWFXSCS
Genie 2 Digital Vortex Scientific Industries SI-0236
Vortex adapter for 50 mL tubes Scientific Industries SI-H506
Mortar (100 mL) and pestle Any NA
Metal micro-spatula VWR 80071-672
Disposable antistatic microspatulas VWR 231-0106
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) Duro 18402
5424 Centrifuge for 2 mL tube Eppendorf 22620461
Centrifuge for 96-well plate Sigma4-16S 81510
Centrifuge rotor for 50 mL tubes Sigma4-16S 12269 - Biosafe
KAPA HiFi DNA polymerase Kapa Biosystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
  2. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
  3. Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7 (1), 15019 (2017).
  4. White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).
  5. Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).
  6. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  7. Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).
  8. Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).
  9. Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).
  10. Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
  12. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  15. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  16. RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
  17. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).
  18. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  19. Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
  20. Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
  21. Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
  22. Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).
  23. Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
  24. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
  25. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
  26. Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
  27. O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).
  28. Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).
  29. Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349 (6250), 860-864 (2015).
  30. Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
  31. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  32. Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).
  33. Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).
  34. Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5 (7), e11915 (2010).
  35. Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).
  36. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  37. Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 137 Microbiome שורש rhizosphere endosphere אדמה חיידק פרוטוקולים
בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh,… More

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter