Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

عزل وتحليل المجتمعات الميكروبية في التربة، رهيزوسفيري، وجذور في تجارب الأعشاب المعمرة

doi: 10.3791/57932 Published: July 24, 2018

Summary

ويرد بالتفصيل، بما في ذلك أساليب تحليل البيانات واستخراج الحمض النووي التنقيب عن جذور النباتات من الحقل وكذلك تجهيز العينات في اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة. تم تصميم هذه الورقة لتمكين مختبرات أخرى لاستخدام هذه التقنيات لدراسة التربة واندوسفيري وميكروبيوميس رهيزوسفيري.

Abstract

الدراسات ميكروبيومي النبات والتربة أصبحت متزايدة الأهمية لفهم لعب أدوار الكائنات الحية المجهرية في الإنتاجية الزراعية. والغرض من هذه المخطوطة هو تقديم تفاصيل عن كيفية أخذ عينات التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري من تجارب ميدانية منسوخة بسرعة وتحليل التغيرات التي قد تحدث في المجتمعات الميكروبية بسبب نوع العينة والعلاج الوراثي النباتي. التجربة المستخدمة لإثبات هذه الأساليب يتكون من قطع المجال المنسوخ نسخاً متماثلاً التي تحتوي على اثنين، نقية، الأعشاب الموسم الحار (دخن عصوي و لحية الرجل) وخليط عشب منخفضة-التنوع () أ (الرجل، سورغاستروم منحنى، و كورتيبيندولا بوتيلوا). بإيجاز، هي المستخرجة من النباتات، وهي قطع مجموعة متنوعة من الجذور ووضعها في المخزن المؤقت للفوسفات، واهتزت ثم جمع في رهيزوسفيري. وجلبت جذور المختبر على الجليد والسطح للتعقيم مع التبييض والايثانول (EtOH). تصفية رهيزوسفيري وتتركز بالطرد المركزي. التربة المستخرجة من جميع أنحاء الكرة الجذر هو وضعها في أكياس من البلاستيك وأحضر إلى المختبر عندما تؤخذ كمية صغيرة من التربة لاستخراج الحمض النووي. الحمض النووي المستخرج من الجذور والتربة رهيزوسفيري وتضخيم ثم مع الإشعال لمنطقة V4 الجينات الرنا الريباسي 16S. أمبليكونس متسلسلة، ثم تحليلها بأدوات المعلوماتية الحيوية الوصول المفتوح. هذه الطرق تسمح للباحثين لاختبار مدى تنوع المجتمع الميكروبي وتكوين يختلف نظراً لنوع العينة، والعلاج، والنباتات التركيب الوراثي. وتبين النتائج الممثل استخدام هذه الأساليب جنبا إلى جنب مع النماذج الإحصائية، هناك اختلافات كبيرة في المجتمعات الميكروبية من الجذور ورهيزوسفيري، والتربة. الأساليب المقدمة هنا تقديم مجموعة كاملة من خطوات لكيفية جمع العينات الميدانية وعزل، استخراج، قياسها كمياً، وتضخيم، وتسلسل الحمض النووي، وتحليل تنوع المجتمع الميكروبي وتكوينها في التجارب الميدانية المنسوخة نسخاً متماثلاً.

Introduction

البحث ميكروبيومي آثار هامة لفهم ومعالجة عمليات النظام الإيكولوجي مثل المغذيات ركوب الدراجات، ودوران المواد العضوية، وتنمية أو تثبيط للتربة مسببات الأمراض1،2. هذا المجال من البحوث أيضا يحمل إمكانيات كبيرة لفهم آثار جراثيم التربة على الإنتاجية للمجتمعات النباتية الطبيعية والنظم الإيكولوجية الزراعية. وبينما هناك العديد من الدراسات التي ركزت على ميكروبيومي التربة في النظم الإيكولوجية الطبيعية، أقل قد ركزت على الميكروبات رهيزوسفيري واندوسفيري النباتات في النظم الإيكولوجية الزراعية3. ويهيمن على الزراعة في ولاية نبراسكا، المناظر الطبيعية عبر أجزاء كبيرة من الدولة، وإجراء الدراسات الخاصة بهذه التربة حيث تزرع محاصيل هامة زراعياً موضوعا حيويا للبحوث. الهدف من هذه الورقة أساليب تزويد الباحثين بمجموعة موحدة من البروتوكولات لوصف الميكروبات الموجودة في النظم الإيكولوجية الزراعية، لتحديد كيفية تعديل جذور النباتات المجتمعات الميكروبية في رهيزوسفيري واندوسفيري، وفي نهاية المطاف فهم المهام التي تقوم هذه الميكروبات في إنتاجية التربة النباتية والصحة.

الطريقة المعروضة هنا يختلف قليلاً عن الأساليب المستخدمة من قبل الآخرين4،5 في أن هذه الورقة تهدف إلى التعلم الميكروبات التي حصرا داخل الجذر وكيف تختلف عن الميكروبات فورا خارج الجذر في رهيزوسفيري. تسلسل amplicon المستخدمة في هذه الدراسة تحدد الأنواع الميكروبية التي وجدت في عينات الحمض النووي، ويسمح للمحققين لتحديد كيفية تغيير المجتمعات المحلية اعتماداً على نوع العينة أو العلاج. أحد الاختلافات الرئيسية بين هذا البروتوكول وبروتوكول مماثل جداً يستخدمها ندبرغ et al. 6 أنه بدلاً من سونيكيشن، يستخدم هذا البروتوكول التعقيم السطحية مع التبييض والايثانول لإزالة رهيزوسفيري من الجذور. آخرون أيضا استخدام التعقيم السطحية فعالية7،،من89،10. هذه الأساليب ليست أكثر فائدة من الأساليب الأخرى، ولكن مختلفة قليلاً. هذه الأساليب مناسبة خاصة لتجارب ميدانية كبيرة مع عدد كاف من الناس أنه من الممكن عملية قطع حقل ما يزيد على 150 يوميا، التي تضيف ما يصل إلى حوالي 450 العينات عند تقسيمه إلى اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة. هذه المخطوطة يصف بالتفصيل الأساليب المستخدمة في عينة في الميدان وتجهيز المواد في المختبر، واستخراج وتسلسل الحمض النووي، ويقدم عرضاً موجزاً للخطوات اللازمة لتحليل تسلسل البيانات الناتجة.

Protocol

1-حقل وصف الموقع

  1. وصف المواقع الميدانية التجريبية خلال فترات جمع. تحديد موقع الحقل (خط العرض وخط الطول والارتفاع) باستخدام نظام تحديد المواقع.
  2. وصف عمق أخذ العينات ووقت أخذ العينات، ونسيج التربة.
  3. العوامل البيئية دوراً هاما في تشكيل المجتمعات الميكروبية. تسجيل المعلومات المتعلقة بالمناخ مثل سنوي متوسط درجة الحرارة وهطول الأمطار السنوي، تناوب المحاصيل في السنوات السابقة، ممارسات الحرث وأسلوب التسميد، والتاريخ في موقع حقل. محطات الطقس التلقائية أو غيرها من الأجهزة مفيدة لتسجيل الأمطار اليومية ودرجة الحرارة أكثر موسم النمو.

2-جمع وتجهيز التربة، رهيزوسفيري، وعينات المجال الجذر

  1. أعمال الحفر للنباتات.
    1. تسمية عموم الغسيل ودلو مع مذكرة لزجة تحتوي على معلومات حول المواد النباتية أخذ عينات. تتضمن معلومات مثل رقم قطعة الأرض والنباتات التركيب الوراثي والأنواع النباتية. حمل دلو تسمية للمؤامرة وترك عموم المياه والصرف الصحي في محطة العمل المتبعة في الميدان.
    2. بيرس التربة مع مجرفة بعمق 30 سم قطع أي من الجذور الجانبية عقد النبات في التربة. الحجم التقريبي هو 18 سم3. عشوائياً اختيار وجمع النباتات اثنين كل قطعة أرض من مناطق مختلفة داخل هذه المؤامرة.
    3. حفر جذور النباتات عن طريق الاستفادة مجرفة ووضع الكرة الجذر في دلو المسمى. إحضار دلو المسمى مع الكرة الجذر المستخرجة مرة أخرى إلى محطة العمل في الميدان. قطع وتجاهل الكتلة الأحيائية النباتية سطحي.
  2. إزالة التربة من مجموعة من التربة السائبة والجذور.
    1. اهتزاز الجذور إزالة التربة يدوياً أو استخدام بأسمائها أو تيلر اليد لإزالة التربة من الجذور. هز الجذور غير كافية لإزالة التربة في تربة رملية جداً. ارتداء القفازات ووضع الجذور بالقرب من محطة المعالجة.
    2. وسوف يكون الجزء الأكبر التربة بعد تهز الجذور، في عموم المياه والصرف الصحي. مزيج التربة في عموم الغسيل وتفريق أي دفنا التربة مع تيلر اليد. ضع عينة التربة خالية من الحطام إلى 17.7 × 19.5 سم سحاب حقيبة تخزين مسماة، ومكان في مكان بارد أو على الجليد.
  3. جمع الجذور ورهيزوسفيري.
    1. استخدام مقص التقليم للتعقيم في 70% EtOH، المكوس مجموعة متنوعة من الجذور، حوالي 4 إلى 6 جذور كل مصنع وكل جذر حوالي 9-12 سم في الطول. ضع جذور قصت (القطع حسب الحاجة لتناسب) في أنبوب 50 مل مسماة التي تحتوي على 35 مل من المخزن المؤقت فوسفات يعقم، (6.33 غرام/لتر نة2بو4، 8.5 غرام/لتر Na2هبو4 اللامائى، ودرجة الحموضة = 6.5، 200 ميليلتر/لتر الفاعل).
      ملاحظة: الفاعل (انظر الجدول للمواد) أضيفت بعد التعقيم العازلة الفوسفات. وحدة التخزين الجذر الكرة وأطوال الجذر تختلف حسب عمر النبات والأنواع النباتية.
    2. اهتز أنابيب لمدة 2 دقيقة للإفراج عن رهيزوسفيري من على سطح أرض الجذور. مع الملقط تعقيم في 70% EtOH، إزالة الجذور من الأنبوب، وصمة عار بإيجاز على المناشف الورقية، ووضع في جديد، يسمى أنبوب 50 مل. ضع كل أنبوب يحتوي على رهيزوسفيري والذي يحتوي على جذور على الجليد.

3-تجهيز الحقل عينات في المختبر

  1. التعقيم السطحي للجذور بعد الجمع الميداني.
    ملاحظة: إجراء التعقيم السطحي أقرب بعد عودته من الميدان. إذا كان من غير الممكن السطح تعقيم الجذور في نفس اليوم، وتخزين الجذور في 4 درجات مئوية حتى تتم معالجتها.
    1. إضافة حوالي 35 مل من التبييض 50% + 0.01 ٪ توين 20 إلى 50 مل الجذر الأنابيب التي جمعت في الحقل. اهتز أنابيب 50 مل لمدة 30 إلى 60 ثانية. من أجل إيقاف التبييض 50% وإضافة 35 مل من 70% EtOH. اهتزاز لآخر 30 إلى 60 ثانية.
    2. من أجل إيقاف 70% EtOH وإضافة 35 مل الماء المعقم وعالي النقاوة. اهتزاز لمدة 1 دقيقة. تكرار الماء يغسل مرتين أخريين.
      ملاحظة: لضمان العلاج لدينا من التعقيم السطحية كافية، نحن مطلي بعينات مياه الشطف الأخير ولاحظ أي نمو للبكتيريا (P. وانغ، بيانات غير منشورة، عام 2014). جربت غيرها من المحققين لكفاءة التعقيم الجذر باستخدام أساليب مماثلة9،10.
    3. لطخة الجذور الجاف على مناشف ورقية نظيفة. استخدم منشفة ورقية نظيفة لكل عينة.
      ملاحظة: يمكن تعقيم مناشف ورقية قبل الاستخدام. ونحن لا تعقيم لدينا مناشف ورقية. ولكننا استخدام منشفة ورقية 1 كل عينة وإبقاء مناشف ملفوفة حتى استخدامها.
    4. استخدام الملقط العقيمة ومقص التقليم، قطع الجذور إلى حوالي 5 ملم قطعة ومكان قطع جذور في أنبوب مخروطي نظيفة، المسمى 15 مل. تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى مواصلة معالجتها.
  2. تجهيز عينات رهيزوسفيري.
    1. اهتز أنابيب 50 مل تحتوي على عينات رهيزوسفيري من الميدان إلى ريسوسبيند العينة كاملة. استخدام مصفاة خلية العقيمة، 100-ميكرون (انظر الجدول للمواد)، مرشح عينة ريسوسبينديد في أنبوب 50 مل جديدة.
    2. الطرد المركزي هذه الأنابيب في ز x 3000 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. فورا من أجل إيقاف وتجاهل المادة طافية.
    3. ضع كريات rhizosphere في أنابيب 50 مل على الجليد. إضافة 1.5 مل من الفوسفات العقيمة المخزن المؤقت (بدون السطح) إلى الكريات رهيزوسفيري ودوامه بتعليق.
    4. بيبيت السائل مع وقف التنفيذ في أنبوب [ميكروفوج] نظيفة، المسمى، 2 مل. تدور أنابيب في 15,871 س ز 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فورا من أجل إيقاف المادة طافية واستنزاف الأنابيب على مناشف ورقية نظيفة.
    5. تخزين الكريات في-20 درجة مئوية حتى مواصلة معالجتها.
      ملاحظة: الخطوات 3.2.2-3.2.4 تتم لتقليل حجم أنبوب عينة للتخزين. أنها مساحة أكثر كفاءة لتخزين أنابيب 2 مل أصغر مقارنة بالأنابيب 50 مل.
  3. تجهيز عينات التربة لتحليل التربة واستخراج الحمض النووي.
    1. باستخدام ملعقة معدنية عقيمة، ملء أنبوب نظيفة، المسمى 2 مل مع حوالي 3 غرام تربة لاستخراج الحمض النووي. تجنب أي قطعة صغيرة من الجذر والحطام. تخزين هذه عينة التربة عند-20 درجة مئوية. شطف ملعقة معدنية في 70% EtOH بين كل عينة.
    2. في عموم المياه نظيفة والصرف الصحي، إفراغ الكيس من التربة إلى مكدس ثقب سيتا (انظر الجدول للمواد)، منخل أكبر على رأس غربال أصغر، ومنخل التربة يدوياً من خلال ثقب سيتا على حد سواء. استخدم فرشاة لتنظيف بعناية في ثقب سيتا بين العينات.
    3. جانبا ز 100 إلى 125 من التربة ينخل في كيس 17.7 × 19.5 سم انغلق المستقبل التربة الفيزيائية وتحليل النسيج. وضع الأكياس التربة في 4 درجات مئوية للتخزين القصير الأجل.
  4. تجهيز عينات التربة لرطوبة التربة.
    1. تغليف كيس من ورق بني مسمى على نطاق. قياس ز 40 إلى 45 من التربة ينخل في كيس ورق بني. تسجيل وزن كيس من الورق البنى والتربة على ورقة بيانات وتعيين مكان أكياس في فرن تجفيف إلى 55-60 درجة مئوية.
    2. وبعد 72 ساعة، وإزالة الأكياس من فرن التجفيف. تسمح الحقائب التربة لتبرد لمدة 30 دقيقة على الأقل ثم تزن.
    3. لتسجيل الوزن، تغليف الجدول إلى صفر ووضع أكياس الورق البنى بالمقياس. حساب النسبة المئوية لرطوبة التربة لكل عينة باستخدام الصيغة:
      Equation
      ملاحظة: الأسلوب رطوبة التربة من "الشركة محطة طويلة الأجل الإيكولوجية البحوث البيولوجية" (لتير KBS). لتير التليفزيوني يقدم مجموعة واسعة من البروتوكولات المعمول بها للباحثين على موقعة على الإنترنت (https://Lter.kbs.msu.edu/).

4-إعداد المعالجة الجذرية عينات لاستخراج الحمض النووي.

  1. طحن المواد المجمدة الجذر حيث تكون العينة متجانسة.
    1. صب النتروجين السائل في كوب بلاستيك مع ملاعق نظيفة وفي تنظيف الهاون والمدقة الاحتفاظ بعينات مجمدة طوال عملية طحن.
    2. ضع الأنسجة المجمدة في قذائف الهاون وطحن مع المدقة في مسحوق ناعم. إضافة النيتروجين السائل في جميع أنحاء طحن الاحتفاظ بعينات مجمدة بشكل مستمر.
    3. استخدام ملعقة لوضع أرضية الأنسجة في أنبوب نظيف، المسمى 2 مل. مخزن في-80 درجة مئوية.

5-استخراج الحمض النووي من التربة وعينات Rhizosphere في شكل جيد 96

  1. تحميل عينات التربة في لوحات 96-جيدا.
    1. مسح أسفل مساحة العمل مع التبييض EtOH و 1% 70%. ارتداء قفازات المختبر خلال هذه الخطوات. إزالة عينات التربة من تخزين-20 درجة مئوية، والسماح لذوبان الجليد في دلو الجليد.
    2. إزالة الغطاء حصيرة الختم من لوحة 96-بئر استخراج التي يتم توفيرها مع مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي. ضع غطاء حصيرة الختم بين مناديل ورقة 2 للحفاظ على نظافة في حين لا تكون قيد الاستعمال. لتجنب التلوث، واستخدام لاصق 8-بئر بكر شرائط لتغطية الأعمدة 12 لوحة استخراج 96-جيدا.
    3. تغليف معقمة تزن-قمع (SM الحجم) على نطاق وتزن من 200 إلى 250 ملغ تربة.
      ملاحظة: يتم تسطيح هذه مداخل العقيمة على جانب واحد، حيث القمع يضع شقة على نطاق. القمع مليئة بالتربة ووضعها مباشرة في بئر. هذا الأسلوب يتجنب الخسارة في عينات ويقلل من الانسكاب، ويمنع التلوث عبر.
    4. للكشف عن أول بئر لاستخراج صفيحة، بعناية أرفع الشريط اللاصق، مكان الرقبة من شغلها تزن-القمع في المناسبة كذلك، ودليل عينة التربة بلطف في البئر المناسبة. استبدال قطاع لاصقة لتغطية البئر.
    5. كرر هذه العملية لكل بئر من اللوحة، استخدام قمع الجديدة، والعقيمة لكل نموذج حتى يتم تعبئة اللوحة. ترك واحدة فارغة أيضا كعنصر تحكم فارغ استخراج.
      ملاحظة: أحد جيدا فارغاً في كل لوحة الاستخراج بمثابة عنصر تحكم سلبية (فارغة). وهذا يتحكم للملوثات التي قد تكون موجودة في مجموعة الكواشف11.
    6. استبدال الغطاء حصيرة الختم على لوحة استخراج وتخزين اللوحة في-20 درجة مئوية حتى جاهزة لاستخراج الحمض النووي.
  2. تحميل عينات rhizosphere في لوحات 96-جيدا.
    1. إزالة عينات رهيزوسفيري من تخزين-20 درجة مئوية، والسماح لذوبان الجليد في دلو الجليد.
    2. اتبع الخطوة 5.1.2 أعلاه لإعداد لوحة استخراج الحمض النووي.
    3. وضع مسح ورقة نظيفة على نطاق، ثم تغليف ملعقة معدنية معقمة بالمقياس. استخدام الملوق ليستخرج بعض بيليه رهيزوسفيري من أنبوب عينة بعناية. العودة الملعقة للمقياس وتزن ما بين 200 و 250 ملغ من العينة رهيزوسفيري.
    4. رفع قطاع لاصقة للكشف عن أول بئر لاستخراج لوحة، زاوية ملعقة شغلها في البئر، وكشط قبالة المواد رهيزوسفيري في البئر المناسبة مع مسواك عقيمة بعناية.
    5. شطف ملعقة معدنية في المياه، تليها 70% EtOH بين العينات. كرر هذه العملية لكل بئر من اللوحة حتى يتم تعبئة اللوحة، ترك واحدة فارغة أيضا كعنصر تحكم فارغ استخراج.
  3. استخراج الحمض النووي من عينات رهيزوسفيري والتربة في شكل 96-جيدا.
    1. استخراج التربة و rhizosphere الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات محسنة للتربة (انظر الجدول للمواد)، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      ملاحظة: نحن نستخدم هذه المجموعة المحددة لعزل التربة و rhizosphere الحمض النووي بسبب قدرة الكواشف الملكية لإزالة الأحماض الدبالية ومثبطات PCR القوية الأخرى الموجودة في التربة.
  4. تقدير حجم الحمض النووي.
    1. قياس عينات 92 وتركيزات 4 معايير استخدام عدة (انظر الجدول للمواد؛ وترد المعايير)، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    2. تحديد حجم العينات 4 المتبقية التي تم إزالتها من اللوحة لاستيعاب الآبار للمعايير الأربعة باستخدام مجموعة أدوات (انظر الجدول للمواد)، ووفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

6-استخراج الحمض النووي من الجذر عينات في شكل 96-جيدا.

  1. تحميل عينات الجذر في لوحات 96-جيدا.
    1. مسح أسفل مساحة العمل مع التبييض EtOH و 1% 70%. ارتداء قفازات أثناء هذه الخطوات.
    2. الاحتفاظ بعينات الجذر الأرض المجمدة في جميع الأوقات عن طريق وضع العينات في دلو من الجليد الجاف.
    3. ملء كوب بلاستيك مع النتروجين السائل ومكان ميكروسباتولاس المكافحة الساكنة والعقيمة تزن-مداخل (حجم إكسسم) في كوب البلاستيك لتبرد.
    4. إزالة غطاء حصيرة الختم من لوحة حبة 96-بئر الاستخراج التي يتم توفيرها مع كيت ووضعه بين مناديل ورقة 2 للحفاظ على نظافة في حين لا تكون قيد الاستعمال.
      ملاحظة: يتطلب الإصدار الأحدث من هذه المجموعة، صدر بعد الوقت أجرينا هذه استخراج الحمض النووي، المستخدم لتوريد لوحات حبة الاستخراج. لدينا في الجدول للمواد، سرد معلومات الكتالوج المورد بحاجة إلى ترتيب هذه العناصر.
    5. لتجنب التلوث، واستخدام لاصق 8-بئر بكر شرائط لتغطية الأعمدة 12 لوحة استخراج 96-جيدا.
    6. مكان لوحة حبة الاستخراج على الثلج الجاف للاحتفاظ بعينات في الآبار المجمدة.
    7. رفع قطاع لاصقة بعناية للكشف عن أول بئر لاستخراج لوحة ووضع الرقبة من شغلها تزن-القمع في البئر المناسبة وإضافة 3 ملعقة المجارف أنسجة الجذر الأرض. استبدال قطاع لاصقة لتغطية البئر.
      ملاحظة: التربة ورهيزوسفيري هي مذاب على الجليد قبل وزنها، بينما يتم وزن المواد النباتية المجمدة. الأنسجة النباتية المجمدة، لا سيما كميات صغيرة، من الصعب أن تزن على نطاق دون ذوبان الجليد. وزن اختبارات أجريت على أنسجة الجذر الأرض لتحديد كم ملعقة المجارف كانت كافية. لاحظ أن الشركة المصنعة لهذه المجموعة لا تتطلب مقدار دقيق من الأنسجة ولكن يوصي حوالي 50 ملغ-تختلف أنواع العينات النباتية المختلفة وسوف يحتاج المستخدم لتحديد المبلغ المناسب.
    8. كرر هذه العملية لكل بئر من اللوحة إلى اللوحة مليئة.
    9. تخزين اللوحة في-20 درجة مئوية حتى جاهزة لاستخراج الحمض النووي.
  2. استخراج الحمض النووي لانسجة الجذر.
    1. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة الأمثل للنباتات (انظر الجدول للمواد) يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      ملاحظة: نحن نستخدم هذه المجموعة التي تم تصميمها خصيصا للأنسجة النباتية لتحقيق أقصى غلة من العينات الجذر. وخلافا للتربة ورهيزوسفيري، الأحماض الدبالية والملوثات الأخرى أقل من مشكلة لانسجة الجذر.
  3. تحديد كمية الحمض النووي كما في الخطوة 5، 4.

7-التضخيم وتسلسل الحمض النووي المعزولة.

  1. تضخيم منطقة V4 المورثة 16S مع دليل على قراءة بوليميراز (انظر الجدول للمواد) كما هو موضح في جول et al. 12 عينات الباركود مع الإشعال الفهرسة المختلفة وتجمع أمام التسلسل. تسلسل باستخدام الأساليب الموضحة جول وآخرون12 استخدام عملية PCR خطوة اثنين مع V4 الإشعال (تكميلية ملف 1).
    ملاحظة: بعض الأساليب ليتم وصف هذه الخطوات في التفصيل في مكان آخر من12،،من1314 ولذلك لن يكون وصفها هنا. للعينات الجذر، أضيفت محصرات السلطة الوطنية الفلسطينية الحد من كمية الحمض النووي البلاستيديه يضخم من الأنسجة النباتية، التي سبق وصفها تماما15. تم استخدام عنصري تحكم في تسلسلها، عنصر تحكم سلبية التي شملت استخراج لوحة فارغة عناصر التحكم (راجع الملاحظة بعد الخطوة 5.1.5)، وجماعة صورية سكان المعروفة من الحمض النووي البكتيري (انظر الجدول للمواد) التي بمثابة إيجابية عنصر التحكم.
    ملاحظة: في معظم الحالات، يتم استخدام v3 "مجموعات كاشف مسك" في وضع نهاية إقران قاعدة 2 × 300. للعينات في هذه المخطوطة، استخدمت 2500 هيسيق إيلومينا في الوضع السريع مع الوضع الزوجي-نهاية (2 × 250) 250. كانت متسلسلة كل عينة في الممر نفسه.
  2. عملية تسلسل البيانات من خلال خط أنابيب لتحليلات المجتمع الميكروبي (v9.2.64 أوسيارتش و v1.9.1 كيم RStudio v3.4.3 16).
    1. إعداد تسلسل البيانات باستخدام أوسيارتش17.
      ملاحظة: أوسيارتش متاح على الإنترنت مع التعليمات الكاملة (https://www.drive5.com/usearch/).
    2. ديمولتيبليكس تسلسل البيانات باستخدام مؤشر ما يلي أو الرموز الشريطية لتعيين ما يلي إيلومينا للعينات.
    3. دمج يقرأ إقران نهاية للحصول على تسلسلات توافق الآراء. استخدم الأمر: أوسيارتش-fastq_mergepairs * R1*.fastq-ريلابيل @-fastq_maxdiffs 10-fastq_minmergelen 230-fastq_maxmergelen 320-fastq_pctid 80-فاستقوت merged.fq.
      ملاحظة: يتم تعيين المعلمات من خلال الرجوع إلى دليل التعليمات أوسيارتش.
    4. إزالة في كبسولة تفجير من تسلسل البيانات لتجنب استبدالات في تسلسل التمهيدي، الذي قد يكون بسبب برد فعل PCR. استخدم الأمر: أوسيارتش-fastx_truncate merge.fq-ستريبليفت 19-20 ستريبرايت-فاستقوت stripped.fq.
    5. تصفية البيانات التسلسل لإزالة ما يلي منخفضة الجودة والحفاظ على تسلسل وحدة تصنيفية التشغيلية (أسامة) ذات جودة عالية. استخدم الأمر: أوسيارتش-fastq_filter stripped.fq-filtered.fa-فاستاوت fastq_maxee 1.0.
  3. توليد OTUs في أوسيارتش.
    1. أداء ديريبليكيشن التعرف على مجموعة فريدة من نوعها أسامة متواليات. استخدم الأمر: أوسيارتش-fastx_uniques filtered.fa-فاستاوت uniques.fa-سيزيوت-ريلابيل Uniq.
    2. OTUs الكتلة مع تشابه التسلسل 97 – 100% لتعيين OTUs فريدة من نوعها. استخدم الأمر: أوسيارتش-cluster_otus uniques.fa-منزيزي 2-otus otus.fa-ريلابيل أسامة.
      ملاحظة: تتضمن هذه الخطوة أيضا إزالة وحدانية من OTUs متفاوت المسافات وإزالة للتركيبات من تسلسل البيانات.
    3. إنشاء جدول بأسامة في أوسيارتش. استخدم الأمر: أوسيارتش-usearch_global stripped.fq otus.fa-db-حبلا زائد-معرف 0.97-أوتوتابوت otutable.txt.
      ملاحظة: هذا الأمر ينشئ جدولاً بعدد القراءات (التهم) لجميع OTUs لكل عينة. يتم استخدام جدول أسامة للخطوات المتلقين للمعلومات بما في ذلك التحليلات التفاضلية وفرة وتحليلات التنوع الميكروبي. مثال لجدول أسامة يرد في الشكل الإضافي 2.
    4. إجراء تحليل المطروح في كيم v1.9.1 18.
      ملاحظة: يحسب المنحنى الاستنفاد باستخدام الجدول أسامة لتحديد ما إذا كان عمق التسلسل صحيح عينات المجتمع الميكروبية. مثال للاستنفاد تظهر المنحنيات في تكميلية الشكل 3.
    5. إجراء تحليل تنوع ألفا18. استخدام alpha_rarefaction.py في كيم v1.9.1 لحساب تنوع المجتمع الميكروبي داخل كل عينة.
      ملاحظة: يحسب هذا التحليل مؤشرات التنوع مثل شانون19و20من سيمبسون Chao121.
    6. إجراء بيتا تنوع تحليل18،22. استخدام البرنامج النصي بايثون: beta_diversity_through_plots.py كيم v1.9.1 براي – كورتيس الاختلاف مصفوفة.
      ملاحظة: هذا التحليل يقارن تكوين المجتمع الميكروبي بين العينات.
    7. إجراء التحليلات الإحصائية بين المجموعات. استخدام مصفوفات المسافة المحسوبة لاستخدام الدالة أدونيس و anova في v2.4.523 حزمة النباتي في رستوديو16بيرمونوفا. إجراء تحليل الكنسي لتحليل الإحداثيات الرئيسية (CAP) باستخدام الدالة كابسكالي في الحزمة النباتي. تمثيل البيانات باستخدام حزمة ggplot224 v2.2.1 في رستوديو.

Representative Results

الممثل النتائج المعروضة في هذه المخطوطة تأتي من موقع حقل أنشئت عام 2012 في "المزرعة شعبة بحوث الزراعة" جامعة نبراسكا-لينكولن قرب ميد، وقد أديرت كرسبوندنس قبل التجربة، الموقع كتناوب ذرة-فول الصويا . يقع موقع الدراسة على ثلاثة أنواع مختلفة من التربة، ولكن تم تحليل البيانات كما لو كانت كافة التغييرات في خصائص التربة المقاسة بسبب العلاجات المفروضة.

موقع الحقل الواردة اثنين، نقية، ويقف switchgrass (P. عصوي الحرية السيرة الذاتية) وبلويستيم الكبيرة (ألف-الرجل)، فضلا عن خليط عشب منخفضة-التنوع الذي يحتوي على بلويستيم كبيرة وإينديانجراس (منحنى س.) و 'التل' سيديواتس grama ( باء-كورتيبيندولا). وكانت ثلاث قطع العشب الموسم الحار في تصميم كتلة كاملة عشوائية التي تم تكرارها ثلاث مرات. متداخلة في قطع الحشائش المختلفة الثلاثة كانوا اثنين العلاجات التسميد النيتروجين (N)، التي كانت 56 (N1) و 112 (N2) كجم ن ها-1 من اليوريا التطبيقية. في وقت أخذ العينات ميكروبيومي في نهاية موسم النمو، نترات جزء في المليون (يعني ± SD) 8.0 ± 1.1 التربة الواردة في قطع الأرض المخصبة مع 112 كجم ن ها-1 و 6.8 ± 0.7 (يعني + SD) نترات جزء في المليون في قطع الأرض المخصبة مع 56 كجم N-1هكتار. وقد تم القطع المخصبة مرة واحدة في سنة. العشب الموسم الحار-عينت المؤامرات مؤامرات الرئيسي (8000 م2) وعلاجات ن تم تقسيم قطع الأرض (4000 م2). بلويستيم كبيرة وكان المصنف كمزيج 50: 50 من 'الصفقة' و 'منجم ذهب' وكان المصنف إينديانجراس كمزيج 50: 50 من 'كشافة' و 'المحارب'. قطع الأراضي زرعت في عام 2012، وتطبيق ن أول حدث في ربيع عام 2013.

وأجرى في 15 سبتمبر 2014 التربة والعينات الجذر. وأجرى العمل الموصوف أدناه في حقل الذي أنشئ كتصميم تجارب معشاة تقسيم الأرض مع ثلاثة replicates (الشكل 1). التسلسل متوسط عمق جميع العينات اندوسفيري على النحو التالي: ± 5711 4871 (يعني ± التنمية المستدامة)، رهيزوسفيري: 40726 ± 14684، التربة: 38184 ± 9043. واحدة من أكبر مصادر التباين في هذه التجارب، باستخدام الأساليب المذكورة، هو الفرق في المجتمعات الميكروبية التي وجدت بين أنواع العينة (الشكل 2). في مجموعة البيانات هذه التمثيلية، يبدو أن يكون أكثر مماثلة في تكوينها لبعضها البعض من اندوسفيري (الشكل 2A) رهيزوسفيري والتربة. ومع ذلك، كانت هناك أيضا كبيرة جداً (p = 0.001) الاختلافات في تكوين المجتمع الميكروبي بين رهيزوسفيري والتربة (الشكل 2). التباين الكلي تمثل في هذه التجارب التي تم تحليلها حسب نوع العينة كان 26 في المائة.

وأظهر تحليل التنوع ألفا أن المجتمعات الميكروبية في اندوسفيري كانت أقل في التنوع عينة مقارنة بالتربة ورهيزوسفيري (الشكل 3). وكانت الاختلافات الهامة الوحيدة في التنوع بين الأنواع العشب في أي حجرة بين العينات اندوسفيري من بلويستيم الكبيرة و switchgrass، مع وجود تنوع الأنواع الميكروبية أعلى بكثير (الشكل 3) switchgrass. ويبرز التحليل الوفرة النسبية (الشكل 4) هيمنة بروتيوباكتيريا تليها أكتينوباكتيريا في جميع أنواع العينات. التربة ورهيزوسفيري أيضا يهيمن عليها أسيدوباكتيريا و تشلوروفليكسي في حين اندوسفيري وفرة نسبية أكبر من باكتيريوديتيس.

في هذه التجربة، كانت تزرع النباتات مع اثنين من كميات مختلفة من الأسمدة ن و لذلك قمنا بتحليل البيانات لتحديد ما إذا كانت هناك آثار العلاج. آثار العلاج تمثل 12% التباين الكلي ولكن لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا على الرغم من أن في سيامة المعالجتين تبدو مختلفة (الشكل 5). وهذا يبرز أهمية التحليلات الإحصائية لمجموعات البيانات هذه بدلاً من التفتيش البصري أو الأحكام النوعية.

كانت تصور الاختلافات تحت تأثير النبات في ميكروبيومي لانسجة النبات والتربة باستخدام طريقة مقيدة للتنسيق. تم تحديد الاختلافات الإحصائية استخدام تحليل بيرمانوفا لاختبار ما إذا كان متغيرات محددة، مثل الأنواع، يؤدي إلى تكوين المجتمع الميكروبي تختلف اختلافاً كبيرا بين العينات. عندما تم تحليل جميع أنواع العينة معا، وجد اختلاف كبير جداً في تكوين المجتمع الميكروبية نتيجة للأنواع النباتية (الشكل 6). وكان مقدار التباين واستأثرت بالأنواع النباتية في هذه التجربة، 6.7%. أخيرا، وقد تم تحليل كل نوع عينة على حدة لتحديد أي من أنواع العينة قد تكون القيادة أثر الأنواع النباتية الهامة. فقط في اندوسفيري كان هناك اختلاف كبير جداً (p = 0.001) بين تركيبة المجتمع الميكروبي للأنواع النباتية المختلفة (الشكل 7). في أنواع العينات الأخرى، أثر الأنواع لم يكن مهما عند تحليلها على حدة. في اندوسفيري، كانت نسبة التباين بسبب الأنواع 27 في المائة، بينما كان أقل في رهيزوسفيري (18 في المائة) والتربة (15%). كذلك تبرز الأهمية لتحليل كل نوع من أنواع الأنسجة على حدة.

Figure 1
رقم 1: مثال لتصميم الميدانية التجريبية. تصميم الميدانية التجريبية مما يدل على تصميم التجارب المعشاه ذات كتلة كاملة في ثلاث نسخ الموقع الحقل الموجود في جامعة نبراسكا-لينكولن شرق نبراسكا البحوث والمركز ملحق بالقرب من ميد، كرسبوندنس للحصول على وصف كامل الموقع راجع المقطع النتائج. N1 هو المنخفض (56 كجم ن ها اليوريا-1 ) و N2 (112 كجم ن ها اليوريا-1 ) هو أعلى معدل النتروجين التي تم تطبيقها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل التنوع بيتا مقارنة تكوين الجراثيم في أنواع العينات المختلفة بما في ذلك اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة من العينات الحشائش المعمرة في 2014. أجرى التحليل استخدام برنامج نصي بايثون في QIIME1.9.1 لإنتاج مصفوفة الاختلاف براي-كورتيس. وكان تصور الإحداثيات الرئيسية تحليل (بكوا) استناداً إلى مصفوفة الاختلاف كورتيس براي في رستوديو. PCoA1 و PCoA2 تبين الفرق أول وثاني أكبر وأوضح التحليل بكوا. وأجرى التحليل الإحصائي بيرمانوفا لتحديد الأهمية بين أنواع العينات، وقيمة p يظهر في الركن الأيمن العلوي. كل رمز في الأرقام التي تمثل المجتمع الميكروبي لكل عينة. (أ) تم تحليل أنواع العينة اندوسفيري ورهيزوسفيري والتربة معا. جميع العينات 87 كانت النظرة إلى تسلسل 486 كل عينة. (ب) وجرى تحليل عينات التربة ورهيزوسفيري معا. كانت النظرة جميع العينات 59 مع تسلسل 8231. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: تحليل التنوع ألفا باستخدام مؤشر شانون لكل نوع من الأنواع في اندوسفيري ورهيزوسفيري والتربة- أجرى التحليل استخدام برنامج نصي بايثون في QIIME1.9.1. وقد تم ذلك الاستنفاد اندوسفيري ورهيزوسفيري، وأنواع التربة العينة على التوالي مع تسلسل 486 و 17154 و 8231 كل عينة. تشير خانات إلى مقاييس النسبة المئوية 25 و 75 (quartiles الأول والثالث). الخط الأفقي داخل المربع يدل على الوسيط والأحمر بالإضافة إلى تبين يعني. شعرات تظهر مجموعة البيانات باستثناء القيم المتطرفة (التي تظهر كنقاط سوداء) التي سقطت أكثر من مرة ونصف نطاق المجال (n = 6 لكل عينة إلا سيديواتس grama مزيج حيث n = 5). الفهرس شانون من جميع الأنواع الخمسة في اندوسفيري كانت أقل من رهيزوسفيري والتربة. استخدم اختبار مجموع الرتب الرتبي عدم حدودي تحديد الأهمية بين الأنواع وعرضت فقط اختلافات كبيرة بين الأنواع أعلى المربعين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الوفرة النسبية على مستوى الأسرة في اللغات في اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة- تم تحليل عينات لمقارنة وفرة يعج الميكروبية بين أنواع مختلفة من العينات (n = 29 لكل نوع من أنواع العينة). أجرى التحليل استخدام برنامج نصي بايثون في QIIME1.9.1 من الجدول أسامة. تدل الألوان المختلفة داخل المخطط الدائري يعج. ويشير إلى النسبة المئوية الوفرة النسبية للأسرة في كل اللغات في كل نوع من أنواع العينة. كان المشروح المعلومات الأسرة في اللغات باستخدام المصنف (RDP) "مشروع قاعدة البيانات ريبوسومال"25. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: التحليل باستخدام العلاج كعامل مقيد بين جميع أنواع العينة. أجرى التحليل المتعارف عليه من تحليل الإحداثيات الرئيسية (CAP) لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات في تكوين المجتمع الميكروبي بين العلاجات. لكل معاملة N، n = 42 ل N1 (56 كجم ن هكتار-1) و n = 45 ل N2 (112 كجم ن هكتار-1). مصفوفة الاختلاف براي-كورتيس ولدت استخدام برنامج نصي بايثون في QIIME1.9.1. أجرى تحليل كاب استناداً إلى مصفوفة الاختلاف براي-كورتيس بتقييد معاملة كالعامل في رستوديو. تم إجراء تحليل بيرمانوفا لتحديد ما إذا كانت الاختلافات في المعاملة كانت كبيرة، وقيمة p يظهر في الركن الأيمن العلوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: التحليل باستخدام الأنواع النباتية كعامل مقيد بين جميع أنواع العينة. تم إجراء تحليل لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات في تكوين المجتمع الميكروبي بين الأنواع النباتية في جميع أنواع العينات. تنسيق الإحداثيات الرئيسية وتحليل عملية النداءات الموحدة لجميع أنواع العينات (اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة) تم القيام به باستخدام مصفوفة الاختلاف براي-كورتيس. مصفوفة الاختلاف كورتيس براي تم إنشاؤها باستخدام البرنامج النصي بيثون في QIIME1.9.1. أجرى تحليل كاب استناداً إلى مصفوفة الاختلاف براي-كورتيس بتقييد أنواع النباتات كالعامل في رستوديو. وأجرى التحليل الإحصائي بيرمانوفا لتحديد الأهمية بين الأنواع النباتية، وقيمة P يظهر في الركن الأيمن العلوي. كل رمز في الأرقام التي تمثل المجتمع الميكروبي لهذه العينة. n = 18 لكل الأنواع في جميع أنواع العينة باستثناء n = 15 لمزيج grama سيديواتس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: مثال لتحليل الغطاء استخدام الأنواع كعامل مقيد لكل نوع نموذج فردي. التنسيق الرئيسي تنسيق وتحليل الحد الأقصى لكل نوع العينة (اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة) باستخدام مصفوفة الاختلاف براي-كورتيس. وكان النظرة كل نوع العينة إلى 486 و 17154 8231 على ما يلي كل عينة على التوالي في اندوسفيري، ورهيزوسفيري، والتربة. الأنواع كالعامل للحفاظ التنسيق. وأجرى التحليل الإحصائي بيرمانوفا لتحديد الأهمية بين الأنواع النباتية في كل نوع العينة، وقيمة p يظهر في الركن الأيمن العلوي. ويمثل كل رمز في الشكل الميكروبية المجتمع بأسره لكل عينة. حجم العينة n = 29 لكل نوع العينة، n = 6 لكل نوع من الأنواع النباتية في كل نوع من أنواع العينة باستثناء مزيج grama سيديواتس (n = 5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الأساليب الموصوفة في هذه المخطوطة ينبغي تمكين العلماء من دخول مجال ميتاجينوميكس التربة والنبات بسهولة. على مر السنين، ونحن قد صقل أساليب عملنا منذ إجراء التجربة المبينة في هذه المخطوطة. تغيير واحد هو أن لدينا الآن قبل تسمية أنابيب قبل الذهاب إلى الحقل إلى نموذج. لدينا مختبر يستخدم نظام المتوازية وطابعه تسمية. الطابعة التسمية ليس فقط يوفر الوقت عندما وسم أنابيب، ولكن أيضا يجعل كل شيء أسهل لتعقب وتحديد عينات دون تقلبات كتابة اليد البشرية بشكل صحيح. نقطة هامة أخرى أن نحاول معالجة المواد بعد إعادته إلى الوراء من الميدان بأسرع. ونحن نهدف إلى تجميد التربة المستخدمة لتحليل الحمض النووي وتعقيم وتجميد الجذور، وتصفية وتجميد rhizosphere في غضون 12 إلى 36 ساعة بعد عودته من الميدان. إجراءات استخراج الحمض النووي مطولة مع العديد من الخطوات، خاصة بالنسبة للتربة ورهيزوسفيري، حتى يمكننا شراء روبوت (فليكس الرفراف، ثيرموفيشير) أن يقلل من الأيدي في الوقت المحدد للبروتوكولات استخراج الحمض النووي، ويقلل من الأخطاء البشرية التي قد تكون أدخلت، ويعمل على تحسين الاتساق في طريقة مختلفة تتم معالجة دفعات من التربة أو الجذور rhizosphere. عند العمل مع المواد النباتية من المهم اتخاذ قرار بشأن نوع الجذر لدراستها أو اتخاذ مجموعة متنوعة من أنواع الجذر للحصول على "عينة". الحفاظ على الجذور ويترك في حالة مجمدة عند إجراء عمليات استخراج الحمض النووي أمر هام، كما هو ضمان وجود لا تلوث الصليب بين نماذج عند ملء لوحات استخراج الحمض النووي 96-جيدا. عامل مهم آخر للنظر هو عدد replicates التي سيتم استخدامها عند تصميم التجارب الميدانية واستخدام كامل العشوائية التصميم حيثما أمكن26. بسبب تقلب الحقل عالية قد يلزم أن يكون عدد كبير من replicates للكشف عن الفروق الصغيرة. وأخيراً، من تجربتنا من الضروري للتأكد من أن لا تكون التربة رطبة جداً عند حفر الجذور. إذا كانت التربة المشبعة بالماء فليس فوضوي للعمل مع، ولكن كما أنها صعبة للغاية لتحديد رهيزوسفيري وإزالة التربة من الجذور.

تعديل واحد التي تم إجراؤها في وقت مبكر أثناء تطوير هذه الأساليب كانت موحدة بدلاً من المصافحة بالأنابيب من جهة الإفراج عن رهيزوسفيري نحن بالترقية إلى فورتيكسيرس بواسطة مولد غاز لتسهيل العمل في الميدان، وأكثر من حيث الوقت والطريقة أن كل أنبوب تم تحريكها. واحد الحد من نهج التسلسل أمبليكون هو أن القرار التقسيمي للنتائج في كثير من الأحيان محدودة و OTUs العديد من المعروف غير معروف أو فقط على مستوى الأسرة أو جنس. هذا الحقل من البحث يتطور بسرعة ولذلك فمن المهم أن يكون على بينه من النهج الجديدة والنامية، خاصة بالنسبة لتحليل البيانات التي قد تعزز قرار النتائج.

هذه البروتوكولات فقط لدراسة البكتيريا والعتيقات، وليس من الفطريات. استخدام كبسولة تفجير مختلفة للتضخيم سيسمح لدراسة المجتمعات الفطرية باستخدام عينات الحمض النووي نفسه27،28. هذه الأساليب لا تحتاج إلى شراء كميات كبيرة من المعدات لأنه يمكن تبسيط الأساليب. أساليب يصف لنا هنا هي أساسا لتحديد "من هناك"، ولكن المجال يتطور بسرعة إلى طرح أسئلة هامة عن وظيفة، والتي قد تكون موجهة باستخدام أساليب تسلسل بندقية، والعزلة، واختبار الأداء الوظيفي ل الميكروبات، أو تسلسل الجينوم الميكروبية كلياً.

نتائج الممثل تسليط الضوء على الاختلافات في المجتمعات الميكروبية التي يمكن تحديدها باستخدام الأساليب المذكورة. استخدام نهج تنوع بيتا ل تحليل البيانات22، ظهرت الاختلافات التركيبية بين أنواع العينات. لوحظت هذه الفرق الواضح في معظم الدراسات الأخرى حيث تحتوي على المجتمعات الميكروبية فريدة من نوعها3اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة. وتم حساب مؤشر التنوع شانون لتحديد وفرة وسيفيد من الأنواع الميكروبية الموجودة داخل كل نوع من الأنواع النباتية في اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة. كما هو موضح في هذه الدراسة، وفي بلدان أخرى كثيرة، أعلى في التربة، وتناقص قليلاً في رهيزوسفيري وثم تناقص إلى حد كبير في5،3،اندوسفيري29التنوع ألفا. تشير هذه النتائج إلى أن الأساليب الموصوفة هنا مناسبة لتحديد التغييرات التركيبية في اندوسفيري، رهيزوسفيري، والتربة.

هيمنة بروتيوباكتيريا استنتاج مشترك في دراسات بشأن اندوسفيري والتربة30،،من3132. وقد اندوسفيري عموما تنوع الأنواع الميكروبية أقل مع وفرة نسبية أعلى من بروتيوباكتيريا. وهذا يؤكد مرة أخرى أن النتائج هنا هي الممثل للنتائج الأخرى في الأدب. آثار العلاج في هذه الدراسة لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا، وقد يكون سببان رئيسيان لذلك أن الاختلافات تفرضها العلاجات لم تكن كبيرة بما يكفي لتوليد الاختلاف كافية للكشف عن وأن هذه العينات قد تم في النهاية زراعة الموسم، عندما الحقول قد يكون وقتاً كافياً لرسم أسفل النيتروجين إلى مستويات مماثلة، وما تم قياسه في نهاية الموسم الحالي. في دراسة أخرى باستخدام معدلات التسميد مماثلة على مدى فترة أطول من الزمن، إلا نسبيا كانت التغييرات الصغيرة في تكوين ميكروبيومي قياس33. وأظهرت دراسات أخرى التغييرات في المجتمعات الفطرية والبكتيرية على حد سواء بسبب الأسمدة النيتروجينية34،35.

الأنواع النباتية معروفة للعب دور في تحديد ما ميكروبيوميس3،،من3236 ، وأثبتت الاختلافات الصغيرة حتى في المجتمع الميكروبي الاختلاف بين الأنماط الجينية النباتية المختلفة داخل 37من نوع واحد. في هذه الدراسة، وجد اختلاف كبير في تكوين المجتمع الميكروبي بين الأنواع النباتية. في جميع أنواع عينة يبدو أن switchgrass تكوين الجراثيم الأكثر متميزة، بل كانت الفروق بين الأنواع فقط يعتد به إحصائيا في اندوسفيري. تكوين المجتمع رهيزوسفيري قد أصبحت كبيرة إذا ما توفرت replicates أكثر للتحليل.

الميدان مجتمعة، ومختبر، والبروتوكولات التحليلية المذكورة هنا توفر طريقة فعالة لدراسة تأثير عوامل مختلفة كيف تكوين المجتمعات الميكروبية في التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري من جذور36. وهناك قدر كبير من العمل يتعين القيام به في مجال دراسة ميكروبيوميس، لا سيما في المجالات الزراعية. أسئلة هامة حول كيف يتم تبديل المحاصيل قبل ميكروبيومي التربة لم يتم توضيحها تماما. حتى الأسئلة الأساسية فيما يتعلق بكيفية تأثير تناوب المحاصيل ميكروبيومي التربة، وكيف يغير توقيت ميكروبيومي، والإجهاد اللاأحيائية كيف يغير ميكروبيومي، كيف نوع التربة ويتفاعل مع هذه العوامل إلى تغيير في ميكروبيومي، وما إذا كانت هناك العالمي الميكروبات في بعض المحاصيل أو مناطق من الولايات المتحدة الأمريكية هي جميع الأسئلة المفتوحة. هذه الأساليب ستكون مفيدة للدراسات الوبائية لتحديد وجود واستمرار وجود البكتيريا المسببة للأمراض ومفيدة أيضا. سوف يكون آخر الأفق المستقبلي لهذه الأساليب لبدء دمج الحمض النووي الأساليب الموصوفة هنا مع النباتات والميكروبات والجيش الملكي النيبالي والبيانات المستقلب. تحسينات إضافية واختبار أكثر المتغيرات ستكون هامة لمزيد من التحسين من هذه البروتوكولات.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تطوير هذه المخطوطة يدعمه مركز ابسكور مؤسسة العلوم الوطنية للجذر وجائزة الابتكار رهيزوبيومي المكتب-1557417. وأيد عملية جمع البيانات بأموال من جامعة نبراسكا-لينكولن والبحوث الزراعية والتنمية ومنحة هاتش من وزارة الزراعة. ونعترف أيضا الدعم من وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية وقدمت الدعم الزراعة والأغذية البحوث مبادرة تنافسية منحة رقم 2011-68005-30411 من وزارة الزراعة المعهد الوطني للأغذية والزراعة لإنشاء وإدارة هذه الحقول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 12955-4 Extraction kit for soil and rhizosphere
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 13496-4 Extraction kit for roots
D-Handle Digging shovel, 101 cm L Fiskars 9669
Rapid Tiller, 40 cm L Truper 34316
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm Ziploc NA
Cooler Any NA
Wash pan Any NA
Plastic bucket Any NA
Gloves (work and lab) Any NA
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-8FS
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-4FS
portable generator Honda brand works well NA
Sterile cell strainers 100 μm mesh size Fisher Scientific 22-363-549
NaH2PO4·H2O VWR 0823
Na2HPO4 VWR 0404
Silwet L-77 Lehman Seeds VIS-30 Surfactant
Autoclaves Any NA
Drying Oven Any NA
Scale Any Any
Bleach CLOROX - household strength NA
Tween 20 Any NA
Liquid Nitrogen Any NA
Dry Ice pellets Any NA
Ethanol Any NA
11 cm precision fine point tweezers Fisher 17456209
18 cm Straight point specimen forceps VWR 82027-436
13.5 cm Pruning Scissors Fiskars 9921
2 mL tube Any NA
15 mL PP conical tube MIDSCI C15B
50 mL PP conical tube MIDSCI C50B
Ultrapure water Millipore-sigma Milli-Q Integral, Q-POD
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854 For DNA quantification of removed samples
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 For DNA quantification
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates Corning 3631
pPNA PCR Blocker PNA Bio PP01-50
mPNA PCR Blocker PNA Bio MP01-50
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing BEI Resources HM782D
Adhesive 8 well-strips for plates VWR 89134-434
Stainless steel beads, 3.2 mm dia Next Advance SSB32
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) CoStar 3959
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere TWD Tradewinds, INC ASWF1SPK
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf TWD Tradewinds, INC ASWFXSCS
Genie 2 Digital Vortex Scientific Industries SI-0236
Vortex adapter for 50 mL tubes Scientific Industries SI-H506
Mortar (100 mL) and pestle Any NA
Metal micro-spatula VWR 80071-672
Disposable antistatic microspatulas VWR 231-0106
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) Duro 18402
5424 Centrifuge for 2 mL tube Eppendorf 22620461
Centrifuge for 96-well plate Sigma4-16S 81510
Centrifuge rotor for 50 mL tubes Sigma4-16S 12269 - Biosafe
KAPA HiFi DNA polymerase Kapa Biosystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
  2. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15, (10), 579-590 (2017).
  3. Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7, (1), 15019 (2017).
  4. White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28, (1), 22-29 (2015).
  5. Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, (8), E911-E920 (2015).
  6. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  7. Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7, (6), 819-827 (2005).
  8. Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47, (1), 23-33 (2009).
  9. Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77, (17), 5934-5944 (2011).
  10. Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
  12. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34, (9), 942-949 (2016).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79, (17), 5112-5120 (2013).
  14. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6, (8), 1621-1624 (2012).
  15. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10, (10), 999-1002 (2013).
  16. RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
  17. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10, (10), 996-998 (2013).
  18. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, (5), 335-336 (2010).
  19. Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
  20. Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
  21. Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
  22. Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1, (1), 3-8 (2008).
  23. Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
  24. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
  25. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
  26. Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
  27. O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71, (9), 5544-5550 (2005).
  28. Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84, (1), 3-20 (2014).
  29. Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349, (6250), 860-864 (2015).
  30. Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
  31. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, (12), E2450-E2459 (2017).
  32. Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115, (6), E1157-E1165 (2018).
  33. Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91, (12), 3463-3470 (2010).
  34. Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5, (7), e11915 (2010).
  35. Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18, (5), 1338-1351 (2016).
  36. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  37. Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, (16), 6548-6553 (2013).
عزل وتحليل المجتمعات الميكروبية في التربة، رهيزوسفيري، وجذور في تجارب الأعشاب المعمرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).More

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter