Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi

doi: 10.3791/57932 Published: July 24, 2018

Summary

Kazı alanından bitki köklerinin yanı sıra endosphere, rizosferde ve toprak içine örnekleri işleme DNA ekstraksiyon ve veri analiz yöntemleri de dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu kağıt bu teknikleri toprak, endosphere ve rizosferde microbiomes çalışma için kullanmak diğer laboratuvarlar sağlamak için tasarlanmıştır.

Abstract

Bitki ve toprak microbiome çalışmalar rolleri mikroorganizmaların tarımsal verimlilik oynamak anlamak için giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu yazının amacı hızla toprak, rizosferde ve endosphere çoğaltılmış alan çalışmaların örnek ve örnek türü, tedavi ve bitki genotip nedeniyle mikrobiyal toplumlarda ortaya çıkabilecek değişiklikleri analiz konusunda ayrıntı sağlamaktır. Bu yöntemleri göstermek için kullanılan deney ve çoğaltılmış alan araziler iki, saf, içeren sıcak-sezon çimenler oluşur (Panicum virgatum ve Andropogon gerardii) ve düşük-çeşitlilik ot karışımı (A. gerardii, Sorghastrum nutans, ve Bouteloua curtipendula). Kısaca, bitkiler kazılan, kökleri çeşitli kesmek ve fosfat tampona yerleştirildikten ve rizosferde toplamak için sarsıldı. Kökleri buz ve çamaşır suyu ve etanol (alkol) ile sterilize yüzey üzerinde Laboratuvar götürülür. Rizosferde filtre ve Santrifüjü tarafından yoğunlaşmıştır. Kök topu çevresinde kazılan topraktan plastik torbalar içine yerleştirilir ve laboratuara toprak az miktarda DNA çekimi için nerelere getirdi. DNA kökleri, toprak ve rizosferde çıkarılan ve V4 bölge 16S rRNA gen için astar ile güçlendirilmiş. Amplicons sıralı sonra açık erişim Biyoinformatik araçları ile analiz. Bu yöntemler araştırmacılar nasıl mikrobiyal topluluk çeşitlilik ve kompozisyon örnek türü nedeniyle, tedavi, değişeceğini test etmek izin ve genotip bitki. İstatistiksel modeller yanı sıra bu yöntemleri kullanarak, temsilcisi sonuçları kökleri, rizosferde ve toprak mikrobiyal toplumlarda önemli farklılıklar göstermektedir. Burada sunulan yöntemleri alan örnekler toplamak, ayırma, ayıklamak, ölçmek, yükseltmek ve DNA dizisi adımlar komple bir kümesini sağlar ve mikrobiyal topluluk çeşitlilik ve çoğaltılmış alan denemeler bileşiminde analiz.

Introduction

Microbiome araştırma anlama ve besin bisiklet, organik madde devir oranı ve geliştirme veya toprak patojenleri1,2inhibisyonu gibi ekosistem süreçleri değiştirmek için önemli sonuçları vardır. Bu alanda araştırma da toprak mikroplar doğal bitki toplulukları ve agroecosystems verimliliği üzerine etkileri anlamak için büyük bir potansiyele sahiptir. Doğal ekosistemler toprak microbiome odaklı olması birçok çalışma olmakla birlikte, daha az sayıda bitki rizosferde ve endosphere mikroplar agroecosystems3üzerinde odaklanmıştır. Nebraska'da, tarım tarım önemli bitkileri araştırma için hayati bir konu nerede yetişir bu topraklar çalışmaları yapma devletin büyük parçalar arasında manzara hakim. Bu yöntemleri kağıt amacı araştırmacılar agroecosystems içinde mevcut mikroplar nasıl bitki kökleri mikrobiyal topluluklar rizosferde ve endosphere ve sonunda değiştirmek belirlemek için açıklamak için iletişim kuralları standart kümesi sağlamaktır Bu mikropların toprak sağlık ve bitki verimlilik oynamak işlevleri anlamak.

Burada sunulan Yöntem biraz diğerleri bu kağıt hangi mikrop öğrenme hedefleniyor4,5 ' te yalnızca iç kök ve nasıl onlar mikrop hemen dışında kök dizininde farklı tarafından kullanılan yöntemleri farklıdır rizosferde. Bu çalışmada kullanılan amplicon sıralama DNA örneğinde buldu mikrobiyal özellikleri tanımlar ve müfettişler nasıl topluluklar örnek türü veya tedavi bağlı olarak değiştiğini belirlemek izin verir. Bu iletişim kuralı ve Lundberg vd tarafından kullanılan bir çok benzer iletişim kuralı arasındaki önemli farklar biri 6 sonication yerine, bu iletişim kuralını yüzey sterilizasyon çamaşır suyu ve etanol ile rizosferde kökleri kaldırmak için kullanmasıdır. Diğerleri de etkili bir şekilde yüzey sterilizasyon kullandık7,8,9,10. Bu yöntemler biraz farklı ama diğer yöntemlere göre daha avantajlı değildir. Yeterli sayıda kişi ile endosphere, rizosferde ve toprak bölümlenmiş seçtiğinizde yaklaşık 450 örnekleri kadar ekler günlük 150'den fazla alan araziler işlemek mümkündür çünkü bu yöntemler özellikle de büyük sahada yapılan deneyler için uygundur. Bu el yazması alanında örnek, laboratuvar malzeme işlemek, hulâsa ve DNA dizisi için kullanılan yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar ve sonuç sıralama verileri çözümlemek için adımları kısa bir genel bakış sağlar.

Protocol

1. alan Site açıklaması

  1. Deneysel alan siteler koleksiyon dönemlerde açıklar. Alan (Enlem, boylam ve yükseklik) konumunu belirlemek GPS kullanarak.
  2. Örnekleme derinliği, örnekleme zaman ve toprak doku açıklanmaktadır.
  3. Çevresel faktörler mikrobiyal topluluklar şekillenmesinde önemli rol oynarlar. Yıllık ortalama sıcaklık, yıllık yağış, önceki yılların ürün rotasyonu, toprak işleme uygulamaları, gübreleme yöntemi ve Tarih Alanı sitesinin gibi iklim bilgiler kaydedilir. Otomatik hava istasyonları veya diğer cihazlar günlük yağış ve sıcaklık büyüyen sezon boyunca kaydetmek yararlı olur.

2. toplama ve toprak, rizosferde ve kök alan örnekleri işleme

  1. Bitkilerin kazı.
    1. Bir yıkama pan ve kova ile tatmak için bitki ilgili bilgiler içeren yapışkan not ile etiketleyin. Genotip bitki ve tür bitki Arsa numarası gibi bilgileri içerir. Arsa etiketli kova taşımak ve alanında kurulan istasyonunda yıkama pan geride.
    2. Toprak bitki toprak holding yan köklerin herhangi bir kesim için 30 cm derinliğe bir kürek ile pierce. Yaklaşık birim 18 cm3' tür. Rasgele seçmek ve arsa içinde farklı alanlardan Arsa başına iki bitkiler toplamak.
    3. Bitki kökleri küreği yararlanarak kazı ve etiketli kovaya kök topu yerleştirin. Etiketli kova kazılan kök topu ile iş istasyonu alanında geri getirmek. Kesilmiş ve yerüstü bitki biyokütle atın.
  2. Topraktan kökleri ve toplu toprak topluluğu olarak kaldırılması.
    1. El ile toprak kaldırmak veya bir kürek ve el tiller toprak kökleri kaldırmak için kullanabileceğiniz için kökleri sallamak. Kökleri sallayarak toprak çok kumlu topraklarda kaldırmak yeterli olur. Eldiven giymek ve kökleri işleme İstasyonu yakınında yer.
    2. Kökleri sallayarak sonra toprak toplu yıkama tavada olacak. Toprak yıkama tavada karıştırın ve herhangi bir toprak parçaları varken el tiller bölmek. Enkaz içine bir etiketli, 17,7 x 19,5 cm fermuar saklama çantası ve serin bir yerde veya buz üzerinde ücretsizdir toprak örneği yerleştirin.
  3. Kökleri ve rizosferde topluluğu.
    1. 70 yılında sterilize budama makası kullanarak % alkol, kökleri, yaklaşık 4-6 kökleri bitki başına ve her kök yaklaşık 9-12 cm uzunluğunda çeşitli tüketim. Eksize kökleri (kesme sığacak şekilde gerektiği gibi) autoclaved, fosfat tampon 35 mL içeren bir etiketli 50 mL tüp içinde yer (6.33 g/L NaH2PO4, 8,5 g/L Na2HPO4 susuz, pH 6.5, = 200 µl/M yüzey aktif).
      Not: Yüzey aktif ( Tablo malzemelerigörmek) sonra ısıyla fosfat tampon eklenmiştir. Birimin kök topu ve kök uzunlukları bitki yaş ve bitki türü bağlı olarak farklılık gösterir.
    2. Tüpler kökleri yüzeyinden rizosferde serbest bırakmak 2 dk için salla. % 70'sterilize forseps ile alkol, Tüp, leke kısaca kökleri üzerinde kağıt havlu ve yeni bir yer kaldır etiketli 50 mL tüp. Her ikisini rizosferde ve bir buz üzerinde kökleri içeren içeren tüpü yerleştirin.

3. alan işlenmesini laboratuvarda örnekler

  1. Alan koleksiyonu sonra yüzey sterilizasyon kökleri.
    Not: en kısa zamanda tarladan döndükten sonra yüzey sterilizasyon gerçekleştirin. Yüzeye mümkün değilse kökleri aynı gün içinde sterilize, kökleri işlenen kadar 4 ° C'de depolayın.
    1. Yaklaşık 35 50 mL kök tüpler için ara 20 alanında toplanan mL % 50 çamaşır suyu + % 0,01 ekleyin. 50 mL tüpler için 30 ila 60 saniye sallamak. % 50 çamaşır suyu dökün ve %70 35 mL ekleyin alkol. Sallamak için 30 ila 60 saniye daha.
    2. Kapalı % 70 pour alkol ve 35 mL steril, ultrasaf su ekleyin. Sallamak 1 dakika. Su yıkama iki kez daha tekrarlayın.
      Not: bizim yüzey sterilizasyon tedavi yeterli olduğundan emin olmak için biz son durulama suyu örnekleri kaplama ve bakterilerin (s. Wang, yayınlanmamış veriler, 2014) hiçbir büyüme gözlendi. Diğer araştırmacılar benzer yöntemleri9,10kullanarak kök sterilizasyon verimlilik için test ettik.
    3. Kökleri kuru temiz kağıt havlu üzerinde leke. Her örnek için bir temiz kağıt havlu kullanın.
      Not: Kağıt havlu kullanmadan önce sterilize. Bizim kağıt havlu sterilize etmek değil. Ancak, örnek başına 1 kağıt havlu kullanın ve havlu kullanana kadar sarılı tutun.
    4. Steril forseps ve budama makası, kökleri kesilmiş yaklaşık 5 mm parça ve yer kullanılarak kökleri bir temiz, etiketli 15 mL konik tüp kesme. Örnekleri-80 ° c daha fazla işlenen kadar saklayın.
  2. İşleme rizosferde örnekleri.
    1. Tüm örnek resuspend alanından rizosferde örnekleri içeren 50 mL tüpler sallamak. Steril, 100 µm gözenekli hücre süzgeç kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), filtre yeni 50 mL tüp içine resuspended örnek.
    2. 3000 x g oda sıcaklığında 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi. Hemen kapalı dökün ve süpernatant atın.
    3. Rizosferde granül 50 mL tüpler buz koyun. 1.5 mL steril fosfat tampon (olmadan yüzey aktif) rizosferde granül ve girdap askıya almak için ekleyin.
    4. Damlalıklı askıya alınan sıvı temiz, etiketli, 2 mL microfuge tüp içine. Tüpler, 15,871 x g oda sıcaklığında 2 min için spin. Hemen süpernatant dökün ve temiz kağıt havlu üzerine boruları drenaj.
    5. Granül-20 ° c daha fazla işlenen kadar saklayın.
      Not: Adımları 3.2.2 - 3.2.4 örnek tüp boyutu depolama için azaltmak için yapılır. Daha fazla alan 50 mL tüpler kıyasla daha küçük 2 mL tüpler depolamak için verimli olduğunu.
  3. Toprak örnekleri DNA ekstraksiyon ve toprak analizi için işleme.
    1. Steril bir metal spatula kullanarak, bir temiz, etiketli 2 mL tüp ile yaklaşık 3 g toprak DNA ekstraksiyon doldurun. Herhangi bir küçük kök parçaları ve enkaz önlemek. Bu toprak örneği-20 ° C'de depolayın Durulama metal spatula % 70 alkol her örnek arasında.
    2. Temiz yıkama tavada, çanta boş toprak (bkz. Tablo reçetesi) yığılmış elekler daha küçük elek üstünde daha büyük elek ve el ile toprak her iki elek elek. Dikkatle elekler örnekleri arasında temizlemek için bir fırça kullanın.
    3. Bir kenara 100-125 g süzülen toprak gelecekteki toprak fizikokimyasal ve doku analizi için bir 17,7 x 19,5 cm fermuarlı torbaya koyun. Kısa süreli depolama için 4 ° C'de toprak torbaları koyun.
  4. Toprak nemi için toprak örnekleri işleme.
    1. Dara etiketli kahverengi kağıt torba bir ölçekte. 40-45 g süzülen toprak kahverengi kağıt torba ölçmek. Kahverengi kağıt torba ve toprak bir veri sayfası ağırlığı kaydetmek ve 55-60 ° C'ye bir kurutma fırın çantalarda yer ayarla
    2. 72 saat sonra çantaları kurutma Fırından çıkarın. En az 30 dakika serin ve daha sonra tartmak toprak çanta izin.
    3. Ağırlığı kaydetmek için ölçek sıfıra Dara ve kahverengi kağıt torba ölçek üzerinde yerleştirin. Toprak nemi formülü kullanarak her örnek için yüzdesini hesaplamak:
      Equation
      Not: Kellogg biyolojik İstasyonu uzun vadeli ekolojik araştırma (KBS LTER) toprak nem yöntemidir. KBS LTER araştırmacılar kendi web sitesinde (https://Lter.kbs.msu.edu/) için çok çeşitli kurulan iletişim kuralları sağlar.

4. işlenmiş kök hazırlanması DNA çekimi için örnekler.

  1. Örnek homojen olması dondurulmuş kök malzeme eziyet.
    1. Sıvı azot temiz spatula ile plastik bir ölçek ve temiz harç ve taşlama süreci boyunca donmuş örnekleri tutmak için havaneli dökün.
    2. Donmuş doku havanda yerleştirin ve havaneli ile ince bir toz eziyet. Sürekli donmuş örnekleri tutmak için bileme boyunca sıvı azot ekleyin.
    3. Bir spatula bir temiz, etiketli 2 mL tüp içinde zemin dokusu eklemenizi sağlar. Mağaza-80 ° C'de

5. toprak ve 96-iyi biçimde rizosferde örnekleri DNA çıkarımı

  1. Toprak örnekleri 96-şey kalıplara yükleniyor.
    1. Çalışma alanının % 70 alkol ve % 1 çamaşır suyu ile aşağı silin. Bu adımları uyguladığınızda laboratuar eldivenleri. Toprak örnekleri-20 ° C depolama biriminden çıkarın ve nedense odamızda buz kovası içinde çözülme izin.
    2. DNA ekstraksiyon kit ile sağlanan bir 96-şey ayıklama plaka mühürleme mat kapağını çıkarın. Kullanılmadığı sırada temiz tutmak için 2 kağıt mendil arasında sızdırmazlık mat kapağını yerleştirin. 96-şey ayıklama plaka 12 sütunu kapsayacak şekilde kirlenmesini önlemek için yapışkanlı 8-şey PCR kullanın şeritler.
    3. Steril tartmak-huni (boyutu SM) bir ölçekte Dara ve 200-250 mg toprak tartın.
      Not: huni düz bir ölçekte bırakır böylece bu steril huniler bir tarafta düzleştirilir. Huni toprakla dolu ve doğrudan bir kuyunun içine yerleştirilir. Bu teknik örnekleri kaybını önler, dökülme en aza indirir ve çapraz bulaşma engeller.
    4. Ayıklama plaka ilk kuyusu ortaya çıkarmak, dikkatlice yapıştırıcı şerit yukarı kaldırın, yer dolu tartmak Huni içine uygun boyun iyi ve yavaşça Kılavuzu toprak örneği uygun kuyuya. İyi karşılamak için yapıştırıcı şerit değiştirin.
    5. Plaka, plaka doldurulana kadar her örnek için yeni, steril bir huni kullanarak her şey için bu işlemi yineleyin. Bir de bir ayıklama boş denetimi olarak boş bırakın.
      Not: Bir de bir negatif (boş) kontrol hizmet etmek için her ayıklama plaka üzerinde boş bırakılır. Bu kit reaktifler11' mevcut olabilir kirleticiler için denetler.
    6. Mühürleme mat kapağını çıkarma plaka üzerinde ve DNA ekstraksiyon için hazır kadar plaka-20 ° C'de depolayın.
  2. 96-şey kalıplara rizosferde örnekleri yükleniyor.
    1. Rizosferde örnekleri-20 ° C depolama biriminden çıkarın ve nedense odamızda buz kovası içinde çözülme izin.
    2. 5.1.2 DNA ekstraksiyon plaka hazırlamak için yukarıdaki adımı izleyin.
    3. Temiz kağıt mendil bir ölçekte yer, o zaman ölçeğinde bir steril metal spatula Dara. Bir örnek tüp rizosferde Pelet bazılarını dikkatlice kaşık için spatula kullanın. Spatula için ölçek döndürmek ve rizosferde örnek 200 ve 250 mg arasında tartmak.
    4. Ayıklama plaka ilk kuyusu ortaya çıkarmak, dolgulu spatula kuyunun içine açı ve steril bir kürdan ile uygun kuyuya rizosferde malzeme kazımak için yapıştırıcı şerit çýkýntýdan.
    5. Metal spatula % 70 oranında takip suda durulama alkol örnekleri arasında. Bir de bir ayıklama boş denetimi olarak boş bırakmak plaka doldurulur kadar plaka her şey için bu işlemi yineleyin.
  3. DNA ekstraksiyon 96-iyi biçimde rizosferde ve toprak örneklerinden.
    1. Özü toprak ve en iyi duruma getirilmiş bir kit için rizosferde DNA'yı kullanarak toprak (bkz. Tablo reçetesi) üretici protokol sonrası.
      Not: Özel reaktifler Hümik asit ve toprakta bulunan diğer güçlü ÇSYİ inhibitörleri çıkarılması yeteneğini nedeniyle toprak ve rizosferde DNA izole etmek için belirli bu seti kullanın.
  4. DNA miktar.
    1. 92 örnekleri ve 4 bir seti kullanarak standartları konsantrasyonları ölçmek ( Tablo reçetesi; görmek standartlar dahil), üretici protokolüne göre.
    2. Kuyular için bir seti kullanarak dört standartları karşılamak için plaka sıradan kaldırıldığını kalan 4 örnekleri ölçmek (bkz. Tablo reçetesi) üretici protokolüne göre.

6. çıkarma DNA'ın kök 96-şey biçiminde örnekler.

  1. Kök örnekleri 96-şey kalıplara yükleniyor.
    1. Çalışma alanının % 70 alkol ve % 1 çamaşır suyu ile aşağı silin. Bu adımları uyguladığınızda eldiven.
    2. Her zaman yanında duvar ilanı örnekleri bir demet Kuru buz ile dondurulup yere kök örnekleri tutmak.
    3. Bir plastik ölçek sıvı azot ile doldurun ve soğumasını plastik kabı antistatik microspatulas ve steril tartmak-Hunileri (boyutu XSM) yer.
    4. Kit ile sağlanan 96-şey ayıklama boncuk plaka mühürleme mat kapağını çıkarın ve kullanımda iken temiz tutmak için 2 kağıt mendil arasında yerleştirin.
      Not: Ayıklama boncuk plakaları sağlamak kullanıcı serbest bırakmak bu DNA çekimi gerçekleştirilen zaman sonraki bu seti daha yeni sürümünü gerektirir. Malzemeler tablo, biz bu ürünleri sipariş etmek için gerekli satıcı Katalog bilgileri listeledik.
    5. 96-şey ayıklama plaka 12 sütunu kapsayacak şekilde kirlenmesini önlemek için yapışkanlı 8-şey PCR kullanın şeritler.
    6. Kuru buz dondurulmuş wells örnekleri tutmak için ayıklama boncuk tabak yerleştirin.
    7. Dikkatlice yapıştırıcı şerit ayıklama plaka ilk kuyusu ortaya çıkarmak, dolgulu tartmak-huni boyun uygun kuyunun içine yerleştirin ve 3 spatula kaşık toz toprak kök doku eklemek için yukarı kaldırın. İyi karşılamak için yapıştırıcı şerit değiştirin.
      Not: bitki materyali donmuş tartılır ise toprak ve rizosferde tartma önce buzda çözdürülen. Donmuş bitki doku, özellikle küçük miktarlarda, çözdürme olmadan bir ölçekte değerlendirmek zordur. Tartmak sınav kaç spatula kaşık toz yeterli olduğunu belirlemek için yere kök dokusu üzerinde bitmiş. Not kit üreticisine doku tam miktarını gerektirmez ancak yaklaşık 50 mg. farklı bitki örnek türleri değişir ve kullanıcının uygun miktarda belirlemeniz gerekir önerir.
    8. Plaka doldurulana kadar plaka her şey için bu adımları tekrarlayın.
    9. DNA ekstraksiyon için hazır kadar plaka-20 ° C'de depolayın.
  2. DNA ekstraksiyon kök doku.
    1. (Bkz: Malzemeler tablo) bitkiler için en iyi duruma getirilmiş bir seti kullanarak DNA ayıklamak üreticinin protokol sonrası.
      Not: Özellikle bitki doku kök örneklerinden en yüksek verimi elde etmek için tasarlanmış bu seti kullanın. Toprak ve rizosferde aksine, Hümik asit ve diğer kirletici bir sorunun kök doku düşüktür.
  3. Adım 5,4 olduğu gibi DNA ölçmek.

7. güçlendirme ve izole DNA sekanslama.

  1. 16S gen V4 bölgenin polimeraz okuma bir kanıt ile yükseltmek (Gohl ve ark. içinde açıklandığı gibi Malzemeleri tablogörmek) 12 barkod örnekleri farklı dizin oluşturma astar ve sıralama önce havuzu ile. Sıra V4 astar (ek dosya 1) ile iki adım PCR işlemiyle Gohl ve ark12 tarafından açıklanan yöntemleri kullanarak.
    Not: Bazı yöntemler aşağıdaki adımları açıklanmıştır için başka bir yerde12,13,14 detay ve bu nedenle burada açıklanacaktır değil. Kök örnekleri için PNA blokerler daha önce tam olarak açıklanan15olmuştur bitki doku güçlendirilmiş Plastit DNA miktarını azaltmak için eklenmiştir. İki denetim sıralama, bir negatif kontrol (bkz: Not-den sonra adım 5.1.5) çıkarma plaka boş denetimleri dahil kullanılmıştır ve bakteriyel DNA'ın bilinen bir nüfusun sahte bir topluluk olan olumlu olarak hizmet ( Tablo malzemelerigörmek) Denetim.
    Not: çoğu durumda, MiSeq reaktif kitleri v3 kullanılır 2 X 300 temel eşli son modunda. Bu makale örnekleri için Illumina HiSeq 2500 250 çiftli-bitiş (2 x 250) modu hızlı modda kullanıldı. Tüm örnek aynı şeritte sıralı.
  2. Mikrobiyal topluluk analizleri (USEARCH v9.2.64, QIIME v1.9.1 ve RStudio v3.4.3 16) için bir boru hattı üzerinden sıralama veri işlem.
    1. USEARCH17kullanarak sıralama verileri hazırlamak.
      Not: USEARCH online tüm talimatları (https://www.drive5.com/usearch/) ile kullanılabilir.
    2. Dizin okuma kullanarak sıralama veri demultiplex veya Illumina atamak için barkodlar örnekleri için okur.
    3. Fikir birliği serilerini almak için eşleştirilmiş uç okuma birleştirme. Komutunu kullanın: usearch-fastq_mergepairs * R1*.fastq-relabel @ - fastq_maxdiffs 10 - fastq_minmergelen 230 - fastq_maxmergelen 320 - fastq_pctid 80 - fastqout merged.fq.
      Not: Parametreleri USEARCH kullanım kılavuzu referans aracılığıyla ayarlanır.
    4. Astar tarafından PCR reaksiyon neden olabilir astar sekanslarında oyuncu değişikliği önlemek için sıralama verileri kaldırın. Komutunu kullanın: usearch-fastx_truncate merge.fq - stripleft 19 - stripright 20 - fastqout stripped.fq.
    5. Düşük kaliteli okuma kaldırmak ve yüksek kaliteli operasyonel taksonomik birimi (OTU) sıralarını korumak için sıralama verilere filtre uygulayın. Komutunu kullanın: usearch-fastq_filter stripped.fq-fastq_maxee 1.0 - fastaout filtered.fa.
  3. OTUs USEARCH içinde oluşturun.
    1. Dereplication benzersiz OTU sıraların kümesini tanımlamak için gerçekleştirin. Komutunu kullanın: usearch-fastx_uniques filtered.fa - fastaout uniques.fa - sizeout-Uniq etiketlemek.
    2. OTUs ile % 97-100 sıra benzerlik benzersiz OTUs belirtmek için küme. Komutunu kullanın: usearch-cluster_otus uniques.fa - minsize 2 - otus otus.fa-Otu etiketlemek.
      Not: Bu adımı de tek çocuk kümelenmiş OTUs üzerinden kaldırılması ve chimeras sıralama veri kaldırılmasını içerir.
    3. Bir OTU tablo USEARCH içinde oluşturun. Komutunu kullanın: usearch-usearch_global stripped.fq - db otus.fa-strand kimliği 0,97 - otutabout otutable.txt artı-.
      Not: Bu komut, her örnek için tüm OTUs (sayıları) okuma sayısı içeren bir tablo oluşturur. OTU tablo için aşağı akım adımları fark bolluk analizleri ve mikrobiyal çeşitlilik analizleri de dahil olmak üzere kullanılır. OTU tablo örnek tamamlayıcı şekilde 2 gösterilir.
    4. QIIME v1.9.1 18rarefaction analizde kuralları.
      Not: Rarefaction eğrisi nasıl yapılacağını derinliği düzgün mikrobiyal toplum örnekleri olup olmadığını belirlemek için OTU tablo kullanılarak hesaplanır. Örnek rarefaction eğrileri Tamamlayıcı şekil 3' te gösterilmektedir.
    5. Bir Alfa çeşitlilik Analizi18kuralları. Alpha_rarefaction.py QIIME v1.9.1 mikrobiyal toplum her örnek içinde çeşitlilik hesaplamak için kullanın.
      Not: Bu analiz çeşitlilik endeksleri Shannon19, Simpson20ve Chao121gibi hesaplar.
    6. Bir beta çeşitlilik Analizi18,22kuralları. Python komut dosyası kullanma: beta_diversity_through_plots.py QIIME v1.9.1 Bray-Curtis dagilimini matris içinde.
      Not: Bu analiz mikrobiyal topluluk kompozisyon örnekleri arasında karşılaştırır.
    7. Gruplar arasında istatistiksel analizler yapmak. PERMONOVA vegan paket23 v2.4.5 RStudio16adonis ve anova işlevi kullanılarak hesaplanan mesafe matrisleri kullanın. Vegan paketinde capscale işlevini kullanarak asıl koordinatları (CAP) analiz kurallı analizini. Ggplot2 paket24 v2.2.1 RStudio içinde kullanarak verileri görselleştir.

Representative Results

Mead yakınındaki Nebraska Üniversitesi Lincoln Tarım Araştırma Bölümü çiftliğinde 2012 yılında kurulan bir alan site temsilcisi sonuçları bu el yazması sunulan geliyorsun, ne önceden deneme, site için bir Mısır-soya dönme başarmıştı . Çalışma sitesi üç farklı topraklar üzerinde bulunan, ancak tüm değişiklikleri ölçülen toprak özellikleri'nde uygulanan tedaviler nedeniyle sanki verileri analiz edildi.

Alan site iki saf bulunan, switchgrass (P. virgatum cv Liberty) ve büyük bluestem (A. gerardii) yanı sıra büyük bluestem, indiangrass (S. nutans) ve 'Butte' sideoats grama () içeren bir düşük-çeşitlilik ot karışımı standları B. curtipendula). Üç sıcak-sezon çim araziler üç kez çoğaltılan bir randomize tam blok tasarımında vardı. Üç farklı çim araziler iç içe olduğunu 56 (N1) ve 112 (N2) kg N ha iki azot (N) döllenme tedaviler-1 uygulamalı üre vardı. Microbiome örnekleme büyüme mevsimi sonunda zaman bulunan toprak 8.0 ± 1.1 (ortalama ± SD) ppm nitrat parsellerde 112 kg N ha-1 ve 6.8 ± 0.7 (ortalama + SD) döllenmiş ppm nitrat parsellerde döllenmiş 56 kg N ha-1. Araziler yılda bir döllenmiş. Araziler ana araziler (8000 m2) ve N tedaviler belirlenmiş sıcak-sezon çim bölünmüş araziler (4000 m2) olduğunu. Büyük bluestem 'Bonanza' ve 'Altın madeni' bir 50: 50 karışımı tohumlari ve Indiangrass bir 50: 50 karışımı 'Keşif' ve 'Savaşçı' seçilir. Araziler 2012 yılında dikilmiştir ve 2013 ilkbaharında ilk N uygulama oluştu.

Toprak ve Kök örnekleme 15 Eylül 2014 gerçekleştirilmiştir. Aşağıda açıklanan çalışmaları üç çoğaltır (Şekil 1) ile split-Arsa randomize tasarım olarak ayarlanan bir alanda gerçekleştirilmiştir. Tüm örnekleri için endosphere aşağıdaki gibi ortalama sıralama derinliği: 4871 ± 5711 (ortalama ± SD), rizosferde: 40726 ± 14684, toprak: 38184 ± 9043. Açıklanan, yöntemleri kullanarak bu deneyler varyasyon büyük kaynaklarından biri olan mikrobiyal toplumlarda örnek türleri (Şekil 2) arasında bulunan farktır. Temsilcisi bu veri kümesinde, rizosferde ve toprak birbirlerine bileşiminde endosphere (Şekil 2A) daha fazla benzer görünüyor. Ancak, ayrıca vardı son derece önemli (p = 0.001) mikrobiyal topluluk kompozisyon rizosferde ve toprak (Şekil 2B) arasındaki farkları. Örnek türüne göre analiz bu deneyler için muhasebesi toplam değişim % 26 oldu.

Alfa çeşitlilik Analizi endosphere mikrobiyal topluluklarda örnek çeşitlilik toprak ve rizosferde (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında daha düşük olduğunu gösterdi. Büyük bluestem endosphere örnekleri ve anlamlı olarak daha yüksek mikrobiyal tür çeşitliliği (Şekil 3) olan switchgrass ile switchgrass arasında herhangi bir yerde çim türler arasında çeşitlilik tek önemli farklılıklar vardı. Göreli bereket analiz (Şekil 4) tüm örnek türlerinde evvel tarafından takip Proteobakteriler hakimiyeti vurgulamaktadır. Endosphere Bacteriodetesdaha büyük bir göreli bolluk vardı, ancak toprak ve rizosferde Ayrıca Acidobacteria ve Chloroflexi hakim.

Bu deneyde, bitkiler N gübre iki farklı tutarlarla yetiştirilmiştir ve bu nedenle tedavisinin etkileri olduğunu olup olmadığını belirlemek için veri analiz. Tedavisinin etkileri toplam değişim % 12'si için oluşturuyor ama yılında koordinasyon iki tedavileri farklı (Şekil 5) bak rağmen önemli ölçüde farklı değildi. Bu istatistiksel analizler bu veri kümeleri yerine görsel muayene veya nitel kararlar için önemini vurgular.

Microbiome bitki doku ve toprak bitki etkisinde farklılıkları koordinasyon kısıtlanmış bir yöntemini kullanarak görüntülenir. İstatistiksel farklar önemli ölçüde farklı mikrobiyal topluluk kompozisyon örnekleri arasında örneğin, belirli değişkenler neden olup olmadığını sınamak için bir PERMANOVA analizi kullanılarak belirlenmiştir. Ne zaman tüm örnek türleri birlikte analiz edildi, mikrobiyal topluluk kompozisyon bitki türleri (Şekil 6) nedeniyle son derece önemli bir fark bulundu. Bu deneyde, bitki türleri tarafından sorumluydu değişim miktarı % 6.7 oldu. Son olarak, her örnek türü tek tek hangi örnek türleri önemli bitki tür etkisi sürüş belirlemek için analiz edildi. Sadece endosphere içinde son derece önemli bir fark vardı (p = 0.001) farklı bitki türü (Şekil 7) mikrobiyal topluluk kompozisyonlar arasında. Diğer örnek türlerinde tür etkisi tek tek analiz zaman önemli değildi. Rizosferde (% 18) ve toprak (% 15) daha düşük ise endosphere türler nedeniyle yüzde değişim % 27'si oldu. Bu daha fazla doku türlerinin ayrı ayrı analiz önemini vurgular.

Figure 1
Şekil 1: deneysel alan tasarım örneği. Nebraska Üniversitesi Lincoln Doğu Nebraska araştırma ve uzantısı Center Mead, ne yanında yer alan sitenin nüsha randomize tam blok tasarımında gösteren deneysel alan tasarım Tam site açıklaması için sonuçlar bölümüne bakın. N1 olan en düşük (56 kg N ha-1 üre) ve N2 (112 kg N ha-1 üre) uygulanan yüksek azot oranıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Beta çeşitlilik Analizi endosphere, rizosferde ve topraktan çok yıllık çim örnekleme 2014 yılında da dahil olmak üzere farklı örnek türleri mikrobiyal bileşiminde karşılaştırarak. Bray-Curtis dagilimini matris üretmek için QIIME1.9.1 içinde bir Python komut dosyası kullanılarak analizi yapılmıştır. Bray-Curtis dagilimini matris üzerinde göre asıl koordinatları analiz (PCoA) RStudio içinde görüntülenmiştir. PCoA1 ve PCoA2 göre PCoA analiz açıkladı ilk ve ikinci en büyük farkı gösterir. PERMANOVA istatistiksel analiz örnek türleri arasında önemini belirlemek için gerçekleştirilmiş ve p değeri sağ üst köşede gösterilir. Her sembolün rakamlarla her örnek için tüm mikrobiyal toplum temsil eder. (A) Endosphere, rizosferde ve toprak örnek türleri birlikte analiz edildi. Tüm 87 örnekleri örnek başına 486 sıralarını rarefied. (B) birlikte rizosferde ve toprak örnekleri analiz edildi. Tüm 59 örnekleri 8231 sıralarıyla rarefied. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Alfa çeşitlilik Analizi her tür endosphere, rizosferde ve toprak için Shannon dizini kullanarak. Analiz QIIME1.9.1 içinde bir Python komut dosyası kullanılarak yapılmıştır. Rarefaction endosphere, rizosferde ve toprak örnek türleri sırasıyla her örnek için 486, 17154 ve 8231 serileri ile yapıldı. Kutuları gösterir 25 ve 75 testlerinde (birinci ve üçüncü Dörttebirlikler). Kutu içindeki yatay çizgi ortanca ve kırmızı gösterir artı ortalamasını gösterir. Bıyık göstermek 1.5 katından fazla interquartile aralığı düştü (hangi siyah noktalar gösterilir) aykırı hariç veri aralığını (n = 6 sideoats grama için nereye karıştırın dışında her örnek için n = 5). Endosphere tüm beş tür Shannon Dizin rizosferde ve toprak düşük. Non-parametrik Wilcoxon rank sum testi türler arasında önemini belirlemek için kullanılan ve yalnızca türler arasında önemli farklılıklar üstünde tepe-in belgili tanımlık boksör gösterildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: şube düzeyinde endosphere, rizosferde ve toprak göreli bereket. Örnekleri farklı örnekleri türleri arasında mikrobiyal kültürlenebilen bolluk karşılaştırmak için analiz (n = 29 her örnek türü için). Analiz OTU tablosundan QIIME1.9.1 içinde bir Python komut dosyası kullanılarak yapılmıştır. Pasta grafiği içinde farklı renkler kültürlenebilen göstermek. Her şube her örnek türü göreli bolluk yüzdesini gösterir. Şube bilgileri ribozomal veritabanı projesi Sınıflandırıcısı (RDP)25kullanarak açıklama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: tedavi tüm örnek türleri arasında kısıtlayan faktör analizi. Asıl koordinatları (CAP) analiz kurallı analiz mikrobiyal topluluk kompozisyon tedaviler arasında farklılıklar olduğunu olup olmadığını belirlemek için gerçekleştirildi. Her N tedavisi, n için 42 için N1 = (56 kg N ha-1) ve n = 45 için N2 (112 kg N ha-1). Bray-Curtis dagilimini matris içinde QIIME1.9.1 bir python komut dosyası kullanarak oluşturulmuştur. Bray-Curtis dagilimini matris üzerinde dayalı CAP analiz faktör RStudio olarak tedavi sınırlama tarafından yapıldı. PERMANOVA analiz tedavi farklılıklar anlamlıdır p değeri sağ üst köşede gösterilir olup olmadığını belirlemek için gerçekleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: bitki türleri tüm örnek türleri arasında kısıtlayan faktör analizi. Analiz mikrobiyal topluluk kompozisyon tüm örnek türlerinde bitki türleri arasında farklılıklar olduğunu olup olmadığını belirlemek için yapılmıştır. Asıl koordinatları koordinasyon ve her türlü örnek (endosphere, rizosferde ve toprak) CAP analiz yapılan bir Bray-Curtis dagilimini matrisi kullanarak. Bray-Curtis dagilimini matris QIIME1.9.1 içinde Python komut dosyası kullanılarak oluşturuldu. Bray-Curtis dagilimini matris üzerinde dayalı CAP analiz faktör olarak RStudio bitki türleri sınırlama tarafından yapıldı. PERMANOVA istatistiksel analiz bitki türleri arasında önemini belirlemek için gerçekleştirilmiş ve P değeri sağ üst köşede gösterilir. Her sembolün rakamlarla bu örnek için tüm mikrobiyal toplum temsil eder. n = n dışındaki tüm örnek türleri içinde her tür için 18 = 15 sideoats grama karışımı için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: türler kısıtlayan faktör olarak her örnek türü için ayrı ayrı kap analizi örneği. Asıl koordinat koordinasyon ve her örnek türü (endosphere, rizosferde ve toprak) CAP Analizi Bray-Curtis dagilimini matrisi kullanarak. Her örnek türü 486, 17154 ve endosphere, rizosferde ve toprak içinde sırasıyla örnek başına 8231 okuma rarefied. Türler faktör olarak koordinasyon sınırlamak için kullanıldı. PERMANOVA istatistiksel analiz her örnek türü bitki türleri arasında önemini belirlemek için gerçekleştirilmiş ve p değeri sağ üst köşede gösterilir. Her sembolün şekildeki her örnek için tüm mikrobiyal toplum temsil eder. Örnek boyutudur n 29 için her örnek türü, n = = 6 sideoats grama mix hariç her örnek türü her bitki türü için (n = 5). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu el yazması açıklanan yöntemler bilim adamları kolayca toprak ve bitki metagenomics alana girmek izin vermesi gerekir. Yıllar boyunca, biz bu el yazması açıklanan deney beri bizim yöntemleri iyileştirdiyseniz. Biz şimdi tüpler için örnek alana dışarı çıkmadan önceden etiket bu bir değişimdir. Laboratuarımızın barkodlama sistemi ve bir etiket yazıcısı kullanır. Etiket yazıcısının sadece ne zaman etiketleme tüpler, ama aynı zamanda daha kolay izlemek ve doğru örnekleri olmadan insan el yazma kaprisleri tanımlamak için her şeyi yapar zaman kazandırır. Başka bir kritik nokta bu geri alandan en kısa zamanda getirdikten sonra malzeme işlemek çalışıyoruz olduğunu. DNA analizi için kullanılan toprak dondurmak, sterilize ve kökleri, donma ve filtre ve tarladan döndükten sonra 12-36 saat içinde rizosferde dondurmak hedefliyoruz. Biz DNA ekstraksiyon protokolleri için zamanında eller en aza indirir, tanıttı insan hatası azaltır bir robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) satın böylece DNA ekstraksiyon yordamları adım, özellikle için toprak ve rizosferde, uzun, ve tutarlılık içinde çok farklı geliştirir toplu toprak, kökleri veya rizosferde işlenir. Bitki materyali ile çalışırken belirlenmesi için ya da bir "temsilcisi örnek" almak için kök türü almak kök türüne karar vermek önemlidir. Kökler ve DNA çekimi iletken 96-şey DNA ekstraksiyon plakaları doldururken örnekleri arasında çapraz bulaşma olduğunu kontrol ettikten gibi önemli olduğunda donmuş bir durumda bırakır. Başka bir önemli faktör dikkate tasarımı sahada yapılan deneyler ve tam bir kullanarak tasarım mümkünse randomize kullanılacak çoğaltır sayısıdır26. Yüksek alan değişkenlik nedeniyle çok sayıda küçük farklılıkları algılamak için çoğaltır gerekli olabilir. Son olarak, deneyimlerimizden toprak kazı kökleri çok ıslak değildir emin olmak önemlidir. Toprak su ile doygun Eğer sadece çalışmak zor bir durum değil ama çok da rizosferde tanımlamak ve toprak kökleri kaldırmak için zordur.

Erken bu yöntemlerin geliştirilmesi sırasında yapılan bir değişiklik el ile çalışma alanı ve daha kolaylaştırmak için bir gaz jeneratör tarafından desteklenmektedir vortexers için yükseltilmiş rizosferde serbest bırakmak için tüpler sallayarak yerine açısından standart yapıldı. zaman ve şekilde her tüpün tedirgin. Amplicon sıralama yaklaşım bir sınırlama sonuçları taksonomik çözünürlüğe genellikle sınırlıdır ve birçok OTUs aile veya cins düzeyinde bilinmeyen veya yalnızca bilinen olmasıdır. Özellikle sonuçları çözünürlüğü artırabilir veri analizi için yeni ve gelişmekte olan yaklaşımlar haberdar olmak önemlidir bu alanda araştırma hızla gelişmektedir.

Bu sadece eğitim için bakteri ve Arkeler, değil mantar kurallarıdır. Amplifikasyon için farklı astar kullanılması mantar toplulukları aynı DNA örnekleri27,28kullanarak çalışma için izin verir. Yöntemleri basitleştirilmiş olabilir çünkü bu yöntemler satın alma donanımları büyük miktarda gerektirmez. Yöntemleri tarif biz burada esas olarak "kim var orada" belirlemek için ama alanını hızlı bir şekilde av tüfeği sıralama yöntemlerle, yalıtım ve işlevselliğini test ele alınması işlevi hakkında önemli soru sormayı içine gelişmektedir mikroplar veya sıralama bütün mikrobiyal genleri.

Temsilcisi sonuçları açıklanan yöntemleri kullanarak tanımlanan mikrobiyal topluluklar farklılıkları vurgulayın. Veri Analizi22bir beta-çeşitlilik yaklaşım kullanarak, kompozisyon farklılıklar arasında örnek türleri gösterilmiştir. Bu fark açıkça gözlemlenmiştir nerede endosphere, rizosferde ve toprak benzersiz mikrobiyal topluluklar3içeren diğer çoğu çalışmalarda. Shannon çeşitlilik Dizin bereket ve sakin endosphere, rizosferde ve toprak her bitki türü içinde mevcut mikrobiyal türlerin belirlemek için hesaplanır. Bu çalışma ve diğerleri gösterildiği gibi alfa çeşitlilik biraz rizosferde azalan ve sonra önemli ölçüde azalan içinde endosphere3,5,29topraktaki yüksek olur. Bu sonuçlar yöntem tanımlamak burada endosphere, rizosferde ve toprak kompozisyon değişiklikleri tanımlamak için uygun olduğunu gösteriyor.

Proteobakteriler hakimiyeti endosphere ve toprak30,31,32üzerinde çalışmalarda ortak bir bulgudur. Endosphere genel olarak daha düşük bir mikrobiyal türlerin çeşitliliğinin bakteridaha yüksek bir göreli bereket ile vardır. Bu tekrar sonuçları buraya diğer bulgular literatür temsilcisi olduğunu vurgular. Bu çalışmada tedavisinin etkileri önemli ölçüde farklı değildi ve bu iki önemli nedeni olabilir tedaviler tarafından dayatılan farklılıkları algılamak için yeterli varyasyon oluşturmak için yeterince büyük değildi ve bu örnekleme sonunda yapıldı Sezon ne zaman alanları olan ne sezon sonunda ölçüldü benzer seviyelere azot çekmek için yeterli zaman vardı olabilir, büyüyen. Daha uzun bir süre boyunca benzer fertilizasyon oranları kullanarak başka bir çalışmada sadece nispeten küçük değişiklikler microbiome bileşiminde ölçülen33edildi. Diğer çalışmalar değişiklikler nedeniyle Azot Gübre34,35mantar ve bakteri topluluklarda göstermiştir.

Onların microbiomes3,32,36 belirlenmesinde rol oynamak için bilinen bitki türleri ve farklı bitki genotip içinde arasında gösterdi mikrobiyal topluluk varyasyon bile küçük farklılıklar bir tek tür37. Bu çalışmada, mikrobiyal topluluk kompozisyon önemli bir fark bitki türleri arasında bulundu. Tüm örnek türlerinde göründüğü en farklı mikrobiyal kompozisyon switchgrass vardı ama türler arasındaki farklar sadece içinde endosphere istatistiksel olarak anlamlı değildi. Rizosferde topluluk kompozisyon daha fazla çoğaltır çözümlemesi için kullanılabilir Eğer önemli hale gelebilir.

Kombine alan, laboratuvar ve analitik protokoller burada açıklanan ne kadar farklı faktörler etkisi çalışmak için güçlü bir yöntem mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri36endosphere bileşimi sağlar. Büyük bir microbiomes, özellikle tarım alanlarındaki eğitim alanında yapılması gereken işler var. Nasıl verimleri toprak microbiome tarafından değiştirilmiş hakkında önemli sorular henüz tam aydınlatılmamıştır gerekiyor. Nasıl ürün rotasyonu etkisi toprak microbiome, nasıl microbiome zamanlama değiştirir, nasıl abiyotik stres ile ilgili bile en temel soru değiştirir microbiome microbiome değiştirmek için bu faktörler ile toprak tipi etkileşir nasıl ve olup olmadığını bazı bitkileri veya bölgelerde ABD'nin evrensel mikroplar tüm açık sorular vardır. Bu yöntemler aynı zamanda varlığı ve sebat yararlı ve patojenik bakterilerin tanımlamak epidemiyolojik çalışmalar için faydalı olacaktır. Başka bir gelecek horizon bu yöntemler için DNA yöntem tanımlamak burada bitki ve mikrop RNA ve metaboliti veri ile entegre başlatmak için olacak. Ek iyileştirme ve daha fazla değişkenlerinin test bu protokollerin duruma getirilmesi için daha da önemli olacaktır.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu el yazması geliştirilmesi kök ve Rhizobiome Yenilik Ödülü OIA-1557417 Ulusal Bilim Vakfı EPSCoR Merkezi tarafından desteklenir. Veri toplama fonları Nebraska Üniversitesi-Lincoln, Tarımsal Araştırma ve geliştirme ve USDA bir Hatch hibe tarafından desteklenmiştir. Biz de USDA ARS desteğinden kabul ve destek tarım ve gıda araştırma girişimi rekabetçi Grant No 2011-68005-30411 tarafından kurmak ve bu alanları yönetmek için USDA Ulusal Enstitüsü Gıda ve tarım sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 12955-4 Extraction kit for soil and rhizosphere
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 13496-4 Extraction kit for roots
D-Handle Digging shovel, 101 cm L Fiskars 9669
Rapid Tiller, 40 cm L Truper 34316
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm Ziploc NA
Cooler Any NA
Wash pan Any NA
Plastic bucket Any NA
Gloves (work and lab) Any NA
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-8FS
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-4FS
portable generator Honda brand works well NA
Sterile cell strainers 100 μm mesh size Fisher Scientific 22-363-549
NaH2PO4·H2O VWR 0823
Na2HPO4 VWR 0404
Silwet L-77 Lehman Seeds VIS-30 Surfactant
Autoclaves Any NA
Drying Oven Any NA
Scale Any Any
Bleach CLOROX - household strength NA
Tween 20 Any NA
Liquid Nitrogen Any NA
Dry Ice pellets Any NA
Ethanol Any NA
11 cm precision fine point tweezers Fisher 17456209
18 cm Straight point specimen forceps VWR 82027-436
13.5 cm Pruning Scissors Fiskars 9921
2 mL tube Any NA
15 mL PP conical tube MIDSCI C15B
50 mL PP conical tube MIDSCI C50B
Ultrapure water Millipore-sigma Milli-Q Integral, Q-POD
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854 For DNA quantification of removed samples
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 For DNA quantification
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates Corning 3631
pPNA PCR Blocker PNA Bio PP01-50
mPNA PCR Blocker PNA Bio MP01-50
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing BEI Resources HM782D
Adhesive 8 well-strips for plates VWR 89134-434
Stainless steel beads, 3.2 mm dia Next Advance SSB32
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) CoStar 3959
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere TWD Tradewinds, INC ASWF1SPK
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf TWD Tradewinds, INC ASWFXSCS
Genie 2 Digital Vortex Scientific Industries SI-0236
Vortex adapter for 50 mL tubes Scientific Industries SI-H506
Mortar (100 mL) and pestle Any NA
Metal micro-spatula VWR 80071-672
Disposable antistatic microspatulas VWR 231-0106
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) Duro 18402
5424 Centrifuge for 2 mL tube Eppendorf 22620461
Centrifuge for 96-well plate Sigma4-16S 81510
Centrifuge rotor for 50 mL tubes Sigma4-16S 12269 - Biosafe
KAPA HiFi DNA polymerase Kapa Biosystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
  2. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15, (10), 579-590 (2017).
  3. Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7, (1), 15019 (2017).
  4. White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28, (1), 22-29 (2015).
  5. Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, (8), E911-E920 (2015).
  6. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  7. Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7, (6), 819-827 (2005).
  8. Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47, (1), 23-33 (2009).
  9. Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77, (17), 5934-5944 (2011).
  10. Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
  12. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34, (9), 942-949 (2016).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79, (17), 5112-5120 (2013).
  14. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6, (8), 1621-1624 (2012).
  15. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10, (10), 999-1002 (2013).
  16. RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
  17. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10, (10), 996-998 (2013).
  18. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, (5), 335-336 (2010).
  19. Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
  20. Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
  21. Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
  22. Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1, (1), 3-8 (2008).
  23. Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
  24. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
  25. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
  26. Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
  27. O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71, (9), 5544-5550 (2005).
  28. Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84, (1), 3-20 (2014).
  29. Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349, (6250), 860-864 (2015).
  30. Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
  31. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, (12), E2450-E2459 (2017).
  32. Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115, (6), E1157-E1165 (2018).
  33. Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91, (12), 3463-3470 (2010).
  34. Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5, (7), e11915 (2010).
  35. Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18, (5), 1338-1351 (2016).
  36. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  37. Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, (16), 6548-6553 (2013).
Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).More

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter