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Biology

マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/57934
Automatic Translation
1, 1
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Université Catholique de Louvain

Summary

ここでは、マウスの鼻の潜在的な差を測定するためのプロトコルを提案する.テストは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子など上皮性ナトリウム チャネル膜イオン輸送の機能を定量化します。嚢胞性線維症の新規治療法の有効性を評価するために貴重です。

Abstract

鼻の潜在的な違いのテストは、ほぼ三十年の嚢胞性線維症 (CF) の診断で支援するために使用されています。それは弱毒、CF、人生の後半は、通常診断の oligo またはモノラル症候性形態、輸精管、特発性慢性膵炎、アレルギー性の先天性両側欠如など CF 関連疾患の場合に有用であると証明されています気管支肺アスペルギルス症と気管支拡張症。Cf. 適応マウスのテストの対象となる治療戦略への応答を定量化するバイオ マーカーは挑戦と関連死亡を伴なうことができる臨床および前臨床設定のテストを使用されています。本稿では、鼻カテーテルその場で持続灌流を維持するために必要な麻酔の十分な深さをについて説明します。それは鼻の灌流ソリューションの気管支吸引を避けるために措置を一覧表示します。動物の完全な回復と麻酔を急速に反転につながる、麻酔薬の解毒剤の併用投与を含むテストの終わりに動物のケアについても説明します。CF および野生型マウスから得られた代表的なデータは、CF と CF 非差別のテストを表示します。完全に、ここで説明したプロトコルにより削減しながら同じ動物の複数のテストと同様、自発的に呼吸マウス上皮細胞の塩化物およびナトリウム トランスポーターの機能的状態の信頼性の高い計測テスト関連死亡率。

Introduction

ほぼ三十年の電気潜在的な違い (PD) 測定は、遠位気道1の代表者として、鼻の粘膜で表される膜イオン輸送体の機能の状態を評価して使用されています。細胞膜に局在する両方多動的テスト2,3、鼻 PD により嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) と上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) 活動の機能解剖と上皮細胞、気道表面の水和反応で重要な役割を発揮します。鼻の PD テストの主要な臨床応用は、CF、欧州諸国で出生数 2,500 のうち 1 の平均発生率と白人の人口で最も一般的な致命的な遺伝疾患の診断で支援するためにです。テストは長い減衰、oligo またはモノラル症候性フォーム、人生の後半は、通常診断 CF と輸精管、特発性慢性膵炎、アレルギー性の先天性両側欠如など CF 関連疾患の診断に有用証明しました。気管支肺アスペルギルス症と気管支拡張症4。最近では、基本的な「CFTR の治療の変調の clinometric 評価欠陥5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,,1516は CF の新しい治療法の臨床試験に鼻の pd を使用しました。臨床設定でテストは、新しい CF ターゲット療法18,19,20,21の生物活性の調査を許可するようにマウス17に適応されています。マウスの技術はデリケート、齧歯動物および人間の間鼻の領域のサイズの種に関連した解剖学的差異と主にげっ歯類における nasofacial 領域からの感覚入力の重要な役割に基づいてます。訓練を受け、熟練のオペレーター、専用装置および供給を必要があります。

CF は外分泌腺の多全身性疾患、慢性呼吸器疾患患者の臨床像を支配します。環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を符号化する遺伝子で突然変異によって引き起こされる-CFTR 塩化物チャネル22を規制。までに、2,000 以上 CFTR の遺伝子変異は識別された23をされています。最も一般的な変異24,25CF の対立遺伝子のほぼ 90% は、(F508del CFTR) 蛋白質のポリペプチドの鎖の位置 508 にフェニルアラニンの削除に対応しています。CFTR 蛋白質は、純粋なオーミック小さなコンダクタンス塩化物チャネルです。CFTR が他輸送のメカニズム、特に、ENaC26,27を調節するかなりの証拠があります。不良電解質輸送の削減 CFTR 依存塩化コンダクタンス増加 ENaC 依存性ナトリウム コンダクタンスは、CF 上皮細胞の特徴です。電気化学の勾配優遇塩化物フラックスとイソプロテレノール (細胞内 cAMP を増加させる β アドレナリン作動薬) やフォルスコリン (アデニルに応えて縮小または廃止再分極によって元の欠陥を反映します。シクラーゼ アゴニスト、臨床使用のために承認されない)。後者の欠陥は、鼻の粘膜 (より否定的な PD) とアミロライド、ENaC28を阻害する利尿薬に対する反応の亢進の基底過分極に反映されます。

CF マウス モデルは CF 研究で頻繁に使用されているし、CF 病理解剖で非常に貴重されています。今日では、少なくとも 15 のモデルは記述されている29、3 つのうち、最も臨床的に関連する F508del の突然変異30,31,32のホモをされています。これら 3 系統30ロッテルダムのエラスムス大学で開発されたの 1 つは約 20 年間大学カトリック大学・ デ ・ ルーヴァン (UCL の) 研究室で使用されています。Cftrtm1Eurモデル30 CF 病の中期多臓器の病態を検討し、新しい治療戦略18,19,20の有効性をテストするのには非常に有用であることを証明しています。 21。中または後早期に多数の問題が発生する (< 24 h) マウスの鼻の PD テスト。本稿では、鼻潅流ソリューションの気管支吸引を避けるために、鼻カテーテルその場で持続灌流とメジャーの維持に必要な麻酔の十分な深さを説明します。テストの終わりに動物の世話、説明などの動物の完全な回復と麻酔を急速に反転につながる麻酔薬の解毒剤の併用投与もします。完全に、これらの手順は、自発的に呼吸マウス、テスト関連の減らされた死亡率と同じ動物でテストを繰り返しで信頼性の高い測定を許可します。鼻の PD テスト、CF と野生型マウスから得られた代表的なデータは表示され説明.

マウス鼻 PD テスト プロトコルは 3 つのセッションで報告: 評価と管理、試験中に、前後。事前テストの評価と管理は、ダブル ルーメン鼻カテーテル ・連続鼻灌流用のソリューションの準備のプロトコルは詳細で説明されます。評価および管理部分がテスト、中には実験のセットアップとマウスの処理は細かく解剖しました。最後に、動物の回復を改善するために、テストの最後に動物の管理を説明します。

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Protocol

研究は、研究 (CEE n ° 86/609) 動物用欧州共同体規則に一致して UCL (2017/UCL/MD/015) の動物研究の倫理委員会によって承認されました。調査官は、動物実験の科学的な目的に使用される動物の保護に関する指令 2010年/63/EU 欧州議会及び理事会 2010 年 9 月 22 日の次の修飾されています。

1. 事前テストの評価と管理

  1. ダブル ルーメン鼻カテーテルを準備します。
    注: 鼻カテーテルはダブル ルーメン キャピラリー チューブ、ソリューション、持続灌流に使用されている 1 つのルーメンとして行われます、なり他の測定として 1 つのチャネルします。
    1. ポリエチレン管 (内径 2.0 mm; 3.0 mm 外径; の部分、20 センチぐらいの中央部を加熱します。図 1) (10-15 秒) を引っ張るために十分に柔らかくなるまでガス ・ バーナーの炎で。
    2. 離れて適切な長さ (~ 15 cm) と鼻プローブ (図 1b) の外径 (~0.1 mm) の非常に薄いキャピラリー チューブを取得する 2 つの端を引き出します。
    3. きれいと純粋なエタノールと 2 つこのような毛細血管を脱脂、テープ (図 1c) でそれらを結合、接着剤、シアノアクリ レート系接着剤を使用して一緒にそれら。
    4. かみそりの刃や約 8 cm (図 1d) のダブル ルーメン カテーテルの最適な長さを取得するメスとプローブの余分な長さを切り取る。
    5. 透過性を確認する両方のルーメンを通して水を注入します。
    6. 先端から 5 mm でマークを適用します。
      注: プローブが挿入され、鼻孔にマークまですべての測定は、鼻腔内の同じサイトに作られています。
    7. ドライ ボックスにダブル ルーメン カテーテルを格納します。
      注: こと使用される 6 - 10 回テスト直後に適切に洗浄する場合です。
  2. クリーム色のミックスを準備します。
    1. 電解質クリームと飽和 3 M KCl 溶液 (ボリューム/)、1:1 の比率で小さな空気の泡の形成を回避する優しく混ぜます。
      注: クリーム色のミックスは、図 1に示すよう銀/塩化銀電極、測定および参照電極橋を構築する使用は。

Figure 1
図 1: プローブの電極とブリッジで。図は前に、(a) と暖房と引っ張って (b)、(c) ダブル ルーメン カテーテル (d)、シリコーン チューブ コネクタ (e)、(f) 電極の 2 つの毛細血管部分を接合テープ後にポリエチレン管を示します。画像の鮮明さ、コネクタはクリーム色のミックスで満たされているではないです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ソリューション ラベル ソリューションの概要
A 基底緩衝塩類溶液
B 塩素フリー バッファー塩溶液
C 10-2 M アミロライド原液
D フォルスコリン 10-3 M 原液

表 1: 在庫、マウスの鼻の PD のテストのためのソリューションです。

塩 mM 分子の重量 グラム/L
塩化ナトリウム (NaCl) 135 58.44 7,889
塩化カルシウム二水和物 (CaCl2.2H2O) 2.25 147 0.331
マグネシウム塩化物水和物 (MgCl2.6H2O) 1.2 203.3 0.244
リン酸水素二カリウム (K2HPO4) 2.4 174.2 0.418
リン酸二水素カリウム (KH2PO4) 0.4 136.1 0.054

テーブル 2: 基底の組成は、食塩 (ストック溶液) をバッファリングします。

  1. ソリューションを準備します。
    1. 実験的プロトコル (表 1) に必要な 4 つの貯蔵液を準備します。
      1. (原液 A 基底バッファー溶液を調製します。表 2)・塩素フリー バッファー溶液 (ストック溶液 B;表 3)室温で純粋な水に塩を混ぜて。7.4 (範囲 7.0 7.6) の pH、低い pH に 1 N の HCl を上げる 1 N NaOH を使用して pH を調整します。(275 mOsm/L) 溶液の浸透圧の変化を確認します。
      2. 6 ヶ月 3 ヶ月またはの冷凍ペットボトルの 4 ° C でラベル付きのガラス瓶に格納します。
      3. 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) を準備するには、10 mL の純水にアミロライド塩酸の 26.6 mg を追加します。70 ° C で 5 ~ 10 分の混合物を熱します。アミロライドは光に敏感で、ソリューション C 暗いコンテナーにしてください。コンテナーにラベルを付けるし、最大 3 カ月の 4 ° C で保存します。
      4. 24.36 mL 純水にフォルスコリン 10 mg を追加して 10-3 M フォルスコリン ソリューション (原液 D) を準備します。フォルスコリン原液の 0.1 mL 因数をラベル付けし、6 ヶ月の-20 ° C で保存します。
  2. A1、B1、B2 の新鮮なソリューションを準備 (表 4)。
    1. 新鮮なソリューション A1 を準備 (基底のバッファリングされた塩水プラス10-4 M アミロライド) 基底塩溶液 (原液 A) 10 mL を入手して 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) の 0.1 mL を追加します。コンテナーにラベルを付けるし、準備の 24 h 内で使用します。
    2. 新鮮なソリューション B1 準備 (塩化バッファー ソリューションプラス10-4 M アミロライド) 塩素フリー バッファー塩溶液 (原液 B) 10 mL を入手して 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) の 0.1 mL を追加します。コンテナーをラベルし、準備の 24 時間以内に使用します。
    3. 新鮮なソリューション B2 準備 (塩素フリー バッファー塩水プラス10-4 M アミロライドと 10-5 M フォルスコリン) 塩素フリー バッファー塩溶液 (原液 B) 10 mL を入手して 10-2 M 0.1 mL を追加アミロライド ソリューション (原液 C)、10-3 M フォルスコリン液 (原液 D) 0.1 mL です。コンテナーをラベルし、準備の 2 時間以内に使用します。
塩 mM 分子の重量 グラム/L
グルコン酸ナトリウム (ナトリウム塩) 135 218.1 29,444
グルコン酸カルシウム (無水粉末) 2.2 430.4 0.947
硫酸マグネシウム七水和物 (MgCl2.6H2O) 1.2 246.5 0.296
リン酸水素二カリウム (K2HPO4) 2.4 174.2 0.418
リン酸二水素カリウム (KH2PO4) 0.4 136.1 0.054

表 3: 塩化物自由の組成はバッファー溶液 (ストック溶液 B) です。

Figure 2
図 2: 鼻粘膜の血流中のマウスの位置。図 (a) 加熱パッド、電圧計 (b)、後肢 (c) 近 (d)、遠位 (e) アウトレットの蠕動性ポンプ枕 (f)、皮下のスペースに挿入された参照電極とベッドシーツ (g)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

2. 評価・ テスト時の管理

  1. 実験のセットアップを準備します。
    1. 低体温症を防ぐためには、テストの前後に生理温測定のセットアップ (18.8 x 37.5 cm; ための 1 つを維持 2 つの加熱パッドを使用します。図 2)、およびもう片方が (15.5 × 15.5 cm) ボックスの動物が回復テストの終わりに置かれます。
    2. データ メモリ高入力インピー ダンスに接続してデータ収集用のソフトウェアを搭載するコンピューターに切り替える (> 1012Ω) と高解像度 (0.1 mV) 電圧計 (図 2b)。
    3. 電極を電圧計に接続します。図 2cに示すように、鼻カテーテルと、後肢で皮下のスペースに挿入されたカテーテルに否定的な電極に肯定的な測定電極を接続します。
    4. クリーム色のミックスで一緒に電極の先端を浸しなさい。初期の電極のオフセット値を確認します。場合は、値が (±) 2 mV より大きい電極を拒否 (理想的には 0 mV)。
    5. 蠕動性ポンプに切り替え、ポンプ チューブの挿入位置を図 2に示すようします。
    6. バイアル鼻潅流 (図 2d) 選択した液ポンプ チューブの近位のコンセントに接続します。鼻カテーテル (図 2e) の血流腔ポンプ チューブの遠位部のコンセントに接続します。
    7. 10 μ L ピペット チップ電解質クリーム ミックスで 1 つ鼻カテーテル内腔を埋めます。シリコーン チューブ コネクタ (図 1e) カテーテルの適応、クリーム色のミックスでコネクタを埋める、コネクタ (図 1f) の肯定的な電極を挿入します。測定電極ブリッジのオフセット値を確認します。(±) 2 mV よりも大きい場合、値は、ブリッジを拒否 (理想的には 0 mV)。
    8. 新鮮なソリューション A1 で 2 番目鼻カテーテル内腔を埋めます。A. 逆蠕動性ポンプの方向 10 に対応する鼻カテーテルの長さに合わせてソリューションを含むバイアルに鼻腔カテーテルの先端を浸し灌流の s。
      注: これにより、10 の基底の PD 値の記録 s アミロライドを適用する前に。参照電極 (図 1) のコネクタ内のクリーム色のミックスで鼻カテーテルの先端を浸しなさい。
  2. マウス イベントを処理を開始します。
    1. 腹腔内 (ip) ルート17で注入する麻酔薬の正確な線量を計算するマウスの重量を記録します。
    2. 麻酔導入を促進するために腹腔内麻酔前投薬 (0.45 x 10 mm) 26 G 針を使用して注入: 5 mg/mL ミダゾラムの 50 μ L の固定投与量。5 分待ちます。
    3. 麻酔のミックスを準備 (フェンタニル、メデトミジン、ドロペリドール 0.05、0.40、および 20 mg/kg の濃度で最終的な体重、それぞれと 0.375 μ g の用量固定でクロニジン) できるように最適な安定した麻酔深度 (ステージ III、平面 2)17.腹腔内、麻酔ミックス量を注入し、クロニジンのボリュームを挿入します。
      注: 15 分後マウスが眠っていると麻酔は少なくとも 30 分間続くことができます。
    4. ように 3 cm 幅 '枕' (図 2f) マウスの頭のためのサポートとして (図 2、) の加熱パッドの上の部分をカバーする組織を吸収するシートを折る。
    5. 組織 ('ベッド シート'; を吸収するシートを加熱パッドをカバーします。図 2g). その加熱パッド背中でマウスを置きます。手足と尻尾 (図 2) をテープします。
    6. 後肢肢の皮下の空間参照の静脈のカテーテル (図 1g) を挿入します。針を除去し、シリコン チューブ コネクタ (図 1e、2 c) を適応します。
    7. カテーテルを記入し、コネクタ クリームをミックスし、コネクタ (図 1f) に否定的な電極を挿入します。
    8. 任意変位を防ぐために、必要に応じてテープでカテーテルと電極を固定します。参照電極とブリッジの配置後、IV カテーテルのコネクタ内部電極クリーム ミックスで鼻カテーテルの先端を浸すことによって測定電極ブリッジのオフセット値をもう一度確認します。(理想的には (±) 2 mV 以下) 安定した最終的なオフセット値を記録します。
    9. 空き ('枕' (図 2f) と 'ベッド シート'; 組織を吸収の 2 つの部分の間に加熱パッドを「優しい」テープでマウスの耳を修正します。(図 2g))。目に触れることがなくヒゲ (硬い毛が鼻の穴近くの成長) を修正します。
    10. 口腔内から流体を吸収するには、舌横に (図 3、) の移動し、ろ紙 (パイプ; の先のとがった芯を挿入図 3b) 口の中に約 1 cm。液不足灌流の鼻孔を吸収するには、フィルター紙 ('ハンカチ'; の 2 番目の部分を配置します。図 3c) は、鼻の先端で開催。
    11. 口の内側と接触して鼻カテーテルの先端を配置することによって上皮の可能性の肯定的な制御の値を確認します。
      注: 読み取りは安定と-10 間の範囲をする必要があります mV と-20 mV。
    12. 鼻から mm 6 ヒント繊細な最大 4 - 1 つの鼻孔に鼻カテーテルを紹介微細鉗子と良い直接照明の下でそれを保持しています。
      注: 最大の安定したベースライン PD 値17,20を与える位置に中間の鼻コンチャに鼻 PD カテーテルがあります。
    13. 麻酔薬の注射後 5 分軽く傾斜加熱パッド下に動物の頭部約 30 °。最大の基底の PD 値を監視します。
    14. それが約 30 の期間にわたって安定したが s、10 μ L の一定の速度で、鼻の粘膜を灌開始/分、連続 4 バッファー ソリューション (A、A1、B1、B2)。10 のための最初のソリューション (ステップ 1.3.1.1) を灌流 s と各次のソリューション (手順 1.4) 5 分または安定した値に達するまで。フォルスコリンの過渡応答の起動時に下がってフォルスコリン (B2) を灌を停止します。
    15. 記録データの 1 秒間隔を選択します。灌流を開始時にデータの記録を開始します。コンピューターの画面に時間の関数としてデータを表示します。
    16. 停止データ キャプチャ ソリューション B2 による血液灌流の終わりに。スプレッドシート ファイルとしてデータを保存します。
    17. 最終的なオフセット値を減算して正しいデータ。

Figure 3
図 3: 場所の鼻カテーテルとフィルター ペーパー加熱パッドの上でマウスの位置。図では、横 ()、パイプ (b) とハンカチ (c) を入れて舌を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

3. 事後テストの評価と管理

  1. 加熱パッドからマウス ボタンを離します。
  2. 'ベッド シート' マウスで鼻を拭く (図 2g)。
  3. ナロキソン、競争力のあるモルヒネ拮抗薬で、アチパメゾール、メデトミジン特定の解毒剤 (2 mg/kg 体重) の固定投与量 (4 μ g) から成る麻酔拮抗薬のミックスを腹腔内注入します。
  4. 完全復旧、通常 1 ~ 2 時間後に観察されるまで [回復] ボックスより小さい加熱パッドにマウスを置きます。
    注: UCL 研究室で約 10% 死亡率、主にソリューションのテスト中に鼻腔内灌流の bronchoaspiration に関連が観察される性別や遺伝子型に関係なく。

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Representative Results

CF に特徴的なイオン輸送の異常を説明するために鼻の PD 測定を行った F508del CF マウスと野生型制御のブリュッセル コロニーから FVB/129 の遺伝的背景の上で説明したプロトコルに従うCftrtm1Eurマウス30。この臨床的に関連するモデルでは、最も一般的なと最も深刻な F508del CFTR 変異23,24,25のいずれかをかくまっては最高の現在利用可能な CF マウス モデル30,31、 32。

生後 4 ヶ月の雌マウスの F508del CF の突然変異のホモ接合体と年齢と性別をマッチさせた野生型の littermate を取得、鼻の代表的な PD トレースは図 4のとおりです。テストの最初の 2 つのフェーズでは、ソリューション、A1、後者含むアミロライドを灌によって ENaC の機能の状態を調べた。CFTR (とフォルスコリンの不在で代替塩化トランスポーター) の機能の状態は、ENaC の貢献残ったアミロライドによってブロックされたときテストの最後の 2 つの段階で評価しました。

F508del CF マウスで増加アミロライド応答と共に偏基準値 (より否定的な PDmax は、野生型マウスの値と比較して) が観測されました。両方の結果は、CFTR 関連 ENaC 過活動を反映しています。、より一貫した応答両方で大幅に削減再分極電気化学の勾配塩化物フラックスとフォルスコリン、トータルの塩化反応をここで名前の追加に好ましいが観察されました。野生型マウスにおけるフォルスコリン応答の大きさが小さいにもかかわらず (-3 mV)、CF の応答は通常は鈍化、CFTR の機能喪失と一貫性のあります。

Figure 4
図 4-代表的な鼻 PD トレースします。ホモ接合体の通常のマウス (A) と (C と D) 鼻の PD パラメーターで得られた個々 の値と共に F508del CFTR 変異 (B) のホモ接合体マウスからの鼻代表の PD なる敷き。PDmax: 最大ベースライン安定値。アミロライド応答: 基底による鼻粘膜の血流の始まり、終わりに鼻の PD の値の差バッファー アミロライド (ソリューション A1) を含む塩のソリューション。塩化物自由応答: 最後に、塩素フリーで鼻粘膜の血流の初めに鼻の PD の値の差バッファー塩水プラス アミロライド (ソリューション B1)。フォルスコリンの応答: 最後に、塩素フリーで鼻粘膜の血流の初めに鼻の PD の値の差バッファー塩溶液に加えフォルスコリンとアミロライド (ソリューション B2)。合計塩化応答: ゼロ塩化灌流で最後の 2 つのパラメーターの合計を得た。矢印は、ソリューション、鼻孔に灌流の変化を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

麻酔薬の解毒剤は、テストの完了後も 45 分までは、麻酔の時間を短縮するため、テストの最後に適用されました。後遺症なし、動物の回復が発生したと、彼らは、同じプロトコルが適用された 7 日の間隔後に再度テストされました。同じ鼻孔は、両方のテスト中に探検されました。2 番目のテストの例として、2 つのテストの各鼻 PD パラメーターのペアの違いは、図 5のとおりです。以前に報告された35試験間違いは、無に近い、特に塩化物の全応答、CFTR 依存性クロライド輸送、CF の欠陥の機能状態を反映しています。

Figure 5
図 5-鼻 PD パラメーターの個々 の値。ホモ接合体の通常のマウス (A) と一緒に 2 番目と対応するパラメーターごとに最初のテスト (t1) のペアの違い F508del CFTR 変異 (B) のホモ接合体マウスで実行される 2 番目のテスト (t2) で得られた値。PDmax: 最大ベースライン安定値。アミロライド応答: 基底による鼻粘膜の血流の始まり、終わりに鼻の PD の値の差バッファー アミロライド (ソリューション A1) を含む塩のソリューション。塩化物自由応答: 最後に、塩素フリーで鼻粘膜の血流の初めに鼻の PD の値の差バッファー塩水プラス アミロライド (ソリューション B1)。フォルスコリンの応答: 最後に、塩素フリーで鼻粘膜の血流の初めに鼻の PD の値の違いバッファー塩溶液に加えフォルスコリンとアミロライド (ソリューション B2)。合計塩化応答: ゼロ塩化灌流で最後の 2 つのパラメーターの合計を得た。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ソリューション ラベル ソリューションの概要
A1 基底 10-4 M アミロライド プラス塩溶液 (A) のバッファー
B1 10-4 M アミロライド プラス塩溶液 (B) をバッファー塩素フリー
B2 塩素フリー バッファー 10-5 M フォルスコリン 10-4 M アミロライド プラス塩溶液 (B)

表 4: マウスの鼻の PD テスト用新鮮なソリューションの一覧です。

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Discussion

本稿の目的は、自発的に呼吸マウス イオン運送者、主に CFTR と ENaC の整合性をテストするために必要な時間の長さのためのソリューションの持続灌流の下鼻の PD を測定するための適切なプロトコルを記述するためです。プロトコルのすべての手順は、フル動物の回復と良い品質と再現性のあるデータを確保するため慎重に最適化されています。特定、重要な手順で麻酔の評価と管理、適正な動物、中およびテスト後のケアします。

ここで平面 2 カクテルの混合物を適用することによって達成することができる麻酔への露出の III 期使用17を示した前の研究は負の変力作用効果と瞬き、瞳孔とペダルの不在で通常呼吸と関連回収反射。麻酔の深さのこのレベルで鼻カテーテル保管できる場で鼻腔の持続灌流と測定電極の橋として使用するため良い耐性を持つ。また、参照電極の橋として皮下の空間におけるカテーテルの挿入は、痛みの反応または有害な影響の兆候がない続いた。齧歯動物で動作の制御の nasofacial 地域からの感覚入力の重要な役割に対して-à-に対して脅威を含む、外部の状況は、十分な深さの麻酔を鼻腔内に動作しているときに特に挑戦します。連続鼻血流ではなくネブライザーは、いくつかマウス研究33,34鼻 PD テストを実行に適用されています。ただし、このメソッドは繰り返し削除および鼻のプローブの reinsertions により、信頼性の低い結果に します。実際には、マウスの鼻粘膜20のセル型の非均一な分布により鼻孔内の同じ位置にプローブの先端の位置を変更するは、重要です。また、ソリューション、特に塩素フリーのソリューションの変更への応答は急速に血流が中断されたとき消えます。

呼吸の阻止につながるソリューションの気管支吸引はプロシージャの重要な制限で、テストの死亡率の主要な原因。いくつかの重要な措置は、それを防止する、動物の背側の側臥位、軽くその頭を下方に傾斜など、口腔と鼻腔17から余分な水分を吸収を目指します。動物の完全な回復と麻酔の急速かつ可逆的レベルは、テストの最後に麻酔薬の解毒剤を適用することによって保証されます。ここで提示されたプロトコルでは、自発的にマウスの呼吸と同じ動物でテストを繰り返しで信頼性の高い計測をことができます。統計的有意性35を得るために必要なマウスの数と、3 r を遵守することへの影響 (交換、調整および削減) 実験手順36で動物のルールを使用します。マウスのように人間、テスト間のばらつきが最も少ない発見されていることを示唆する塩化物の全対応それ新しい CF の治療戦略の有効性を検出する最も信頼性の高い鼻 PD パラメーターとして。CF マウスにおける塩化物の全応答の測定誤差はお mV35以下に示されました。言い換えれば、とき F508del CF マウス、塩化物の全応答の違いで薬物 CFTR 訂正の生物活性を評価薬剤関連の改善効果の 95% のチャンスがないと治療 2 より大きい存在下で mV を示します。

代表的なトレースのデータ解釈 CF と野生型マウス18,19,20,21,35の間で区別する鼻の PD テストの方法を示し、示していますF508del CF エラスムス マウス モデル30は、典型的な臨床のイオン輸送の異常に関して人間の鼻の粘膜を模倣します。しかし、動物モデルで残留塩化コンダクタンスは検出可能な残留の F508del「CFTR 機能または代替の非 CFTR 依存性クロライド チャネルの貢献からの結果。2 つの設定のいくつかの主な違いを扱うを意味して臨床に臨床から CF 研究の結果を翻訳します。CF のマウス表現型弱毒呼吸器症候群が表示されます。一緒に実際に衛生的な障壁と特権の条件でマウス モデルを収容する複数の治療法の不在はまた違い37に貢献します。ここで豚38,39に合わせられた変動の非常に少ない35とそれを示していますで説明したプロトコルとフェレット モデル40。以前の研究では、実験的なプロトコルは非 CFTR 依存、塩化カルシウム活性化の貢献の可能性を探索する、代替塩化トランスポーターの阻害剤によるマウスの鼻粘膜の血液灌流を含むによって変更されました。チャンネル18。テストは、β ENaC 過剰発現マウス モデル41、42CF 肺疾患を模倣するように設計のナトリウム輸送の研究に使用されています。将来は、さらにテストのアプリケーションと考えられる ATP12A、CFTR 独立した H+など、他のトランスポーターの研究-ポンプ蛋白質が人間およびブタで表現は存在しないマウス気道43。完全に、ここで説明したプロトコル上皮の機能状態の信頼性の高い計測にマウス、テスト関連の減らされた死亡率と同じ動物で複数のテストを自発的に呼吸の塩化物およびナトリウムのトランスポーターをことができます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者が原稿を批判的に編集教授 j. Lebacq をありがちましょう。Cftrtm1Eur (F508del CFTR (FVB/129) のホモ接合体マウスは欧州経済共同体が欧州の連携アクション EU FP6 の嚢胞性線維症の研究のためのサポートと、エラスムス MC、ロッテルダム、オランダによって開発されました。LHHM-CT-2005-018932。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45x10 mm) intraperitoneal injection

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生物学、問題 137、嚢胞性線維症、CFTR、ENaC、鼻の電位差、イオン輸送、病気のマウスモデル、治療効果、診断のバイオ マーカー
マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い
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Beka, M., Leal, T. Nasal Potential… More

Beka, M., Leal, T. Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice. J. Vis. Exp. (137), e57934, doi:10.3791/57934 (2018).

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