Summary
Qui, presentiamo un protocollo per misurare la differenza di potenziale nasale nei topi. Il test quantifica la funzione dei trasportatori transmembrana di ioni come il regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica e il canale epiteliale del sodio. È utile per valutare l'efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica.
Abstract
Il test di differenza potenziale nasale è stato utilizzato per quasi tre decenni per aiutare nella diagnosi di fibrosi cistica (CF). Ha dimostrato di essere utile nei casi di attenuato, forme oligo - o mono-sintomatici di CF solitamente diagnosticata tardi nella vita e dei disordini da CF come assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti, pancreatite cronica idiopatica, allergica aspergillosi broncopolmonare e bronchiectasie. Nelle impostazioni sia cliniche e precliniche, il test è stato utilizzato come biomarcatore per quantificare le risposte di strategie terapeutiche mirate per adattamento cfr la prova di un mouse è impegnativo e può comportare una mortalità associata. Questo articolo descrive la profondità adeguata dell'anestesia necessaria per mantenere un catetere nasale in situ per la perfusione continua. Esso elenca le misure per evitare la Bronco-aspirazione di soluzioni irrorati nel naso. Descrive anche la cura degli animali alla fine del test, inclusa l'amministrazione di una combinazione di antidoti dei farmaci anestetici, che conduce rapidamente invertendo l'anestesia con il recupero completo degli animali. Dati rappresentativi ottenuti da un CF e uno spettacolo di selvaggio-tipo mouse che il test discrimina tra CF e non CF. Complessivamente, il protocollo qui descritto consente misurazioni affidabili della condizione funzionale di trasportatori trans-epiteliale di cloruro e sodio nei topi di respirare spontaneamente, nonché prove multiple nello stesso animale, riducendo relative ai test mortalità.
Introduction
Per quasi tre decenni, electrical potenziali misure di differenza (PD) sono state utilizzate per valutare lo stato funzionale dei trasportatori ionici transmembrana espressa a mucosa nasale, come rappresentante del vie aeree distali1. Come una dinamica multistep prova2,3, nasale PD consente una dissezione funzionale del regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) ed epiteliale del sodio (ENaC) canale attività, entrambi localizzati alle membrane apicali di le cellule epiteliali ed esercitare ruoli critici in idratazione superficiale della via aerea. Le principale applicazione clinica del test PD nasale è di assistere nella diagnosi della fibrosi cistica, la malattia genetica mortale più comune nelle popolazioni caucasiche con un'incidenza media di 1 su 2.500 nascite nei paesi europei. Il test ha da tempo dimostrato utile nella diagnosi di forme attenuate, oligo - o mono-sintomatico della fibrosi cistica diagnosticata solitamente più tardi nella vita e dei disordini da CF come assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti, pancreatite cronica idiopatica, allergica aspergillosi broncopolmonare e bronchiectasie4. Più recentemente, valutazione clinometrica della modulazione terapeutica di base canale CFTR difetto5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 ha fatto uso del PD nasale in studi clinici di nuove terapie CF. In ambito preclinico, il test è stato adattato per il mouse17 per consentire indagini la bioattività del nuovo CF terapie target18,19,20,21. Nei topi, la tecnica è delicata, basato sulle differenze anatomiche relative specie nella dimensione della regione nasale tra roditori ed esseri umani e principalmente sul ruolo essenziale di input sensoriali dalla regione Solci in roditori. Richiede operatori qualificati e specializzati, apparecchiature dedicate e forniture.
CF è una malattia multi-sistemica delle ghiandole esocrine, in quale malattia respiratoria cronica domina il quadro clinico. La malattia è causata da mutazioni nel gene che codifica il monofosfato di adenosina ciclico (cAMP)-regolato cloruro CFTR canale22. Ad oggi, più di 2.000 mutazioni CFTR sono state identificate23. La più comune mutazione24,25, trovato in quasi il 90% degli alleli CF, corrisponde a un'eliminazione di fenilalanina in posizione 508 della catena polipeptidica della proteina (F508del-CFTR). La proteina CFTR è un canale del cloro di conduttanza piccolo puramente ohmico. C'è anche una notevole prova che CFTR regola altri meccanismi di trasporto, in particolare, ENaC26,27. Trasporto difettoso dell'elettrolito, compreso ridotta conduttanza di cloruro CFTR-dipendente e aumentata conduttanza di sodio ENaC-dipendente, è un segno distintivo del epithelia del CF. Il difetto ex viene riflessa da una ripolarizzazione ridotta o abolita in risposta a un efflusso cloruro gradiente elettrochimico che favorisce e l'aggiunta di isoprenalina (un agonista β-adrenergici che aumenta cAMP intracellulare) o forskolin (un adenilato agonista di ciclasi, non approvato per uso clinico). Il difetto di quest'ultimo si riflette un hyperpolarization basale della mucosa nasale (un PD più negativa) e una risposta aumentata di amiloride, un farmaco diuretico che blocca ENaC28.
Modelli murini CF sono stati usati frequentemente nella ricerca CF e sono stati preziosi in patologia CF di dissezione. Al giorno d'oggi, almeno quindici modelli sono stati descritti29, di cui tre sono omozigoti per il31,30,di mutazione F508del più clinicamente rilevante32. Uno di questi tre ceppi30, sviluppato all'Università Erasmus di Rotterdam, è stato utilizzato per quasi 20 anni in laboratorio Université catholique de Louvain (UCL). Il Cftrtm1Eur modello30 ha dimostrato di essere molto utile per studiare la patofisiologia multiorgan della malattia CF e per testare l'efficacia di nuove strategie terapeutiche18,19,20, 21. Numerosi problemi possono verificarsi durante o presto dopo (< 24h) il test di PD nasale nei topi. In questa carta, la profondità adeguata dell'anestesia richiesta per mantenere un catetere nasale in situ per aspersione continua e misure per evitare la Bronco-aspirazione di soluzioni irrorati nel naso sono descritti. La cura degli animali alla fine del test è descritta, compreso la gestione di una combinazione di antidoti di farmaci anestetici, che conduce rapidamente invertendo l'anestesia con il recupero completo degli animali. Complessivamente, queste procedure consentono misure affidabili in topi di respirare spontaneamente, ridotta mortalità relative ai test e ripetendo il test nello stesso animale. Dati rappresentativi ottenuti dal test PD nasale in un CF e in un selvaggio-tipo mouse sono mostrati e discussi.
Il protocollo di test PD nasale murino è segnalato in tre sessioni: valutazione e gestione prima, durante e dopo la prova. Nel pre-test di valutazione e gestione, il protocollo di preparazione del catetere a doppio lume nasale e delle soluzioni utilizzate per aspersione nasale continua è descritto dettagliatamente. Durante la valutazione e gestione porzioni del test, la messa a punto sperimentale e la gestione del mouse viene sezionato minuziosamente. Infine, gestione dell'animale alla fine del test è descritto per migliorare il recupero pieno animale.
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Protocol
Gli studi e le procedure sono state approvate dal comitato etico per la ricerca sugli animali dell'UCL (2017/UCL/MD/015) e in accordo con le normative della Comunità europea per l'uso di animali nella ricerca (CEE n ° 86/609). Gli investigatori sono qualificati per la sperimentazione animale seguendo la direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010 sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.
1. pre-test di valutazione e gestione
- Preparare il catetere a doppio lume nasale.
Nota: Un catetere nasale è fatto come un tubo capillare di doppio lume, un lume viene utilizzato per la perfusione continua di soluzioni, e l'altra come una misura di canale.- Riscaldare la parte centrale di un pezzo, lunghe circa 20 cm di tubo in polietilene (diametro interno di 2,0 mm; diametro esterno mm 3,0; Figura 1 un) nella fiamma di un bruciatore a gas fino a quando è abbastanza morbido per la trazione (10-15 s).
- Tirare le due estremità per ottenere un tubo capillare molto sottile di lunghezza appropriata (~ 15 cm) e il diametro esterno (mm ~0.1) per la sonda nasale (Figura 1b).
- Pulire e sgrassare due tali capillari con etanolo puro, unirli con del nastro adesivo (Figura 1c) e incollarli con colla del cianoacrilato.
- Tagliare la lunghezza in eccesso delle sonde con una lametta o un bisturi per ottenere un'ottima lunghezza del catetere a doppio lume di circa 8 cm (Figura 1d).
- Iniettare l'acqua attraverso entrambi i lumi per verificare che essi siano permeabili.
- Applicare un marchio ad una distanza di 5 mm dalla punta.
Nota: La sonda è inserita all'altezza del marchio nella narice, affinché tutte le misurazioni sono effettuate presso il sito stesso all'interno della cavità nasale. - Conservare il catetere a doppio lume in una scatola asciutta.
Nota: Può essere usato 6 - 10 volte se opportunamente puliti immediatamente dopo il test.
- Preparare la miscela di crema.
- Mescolare delicatamente la crema dell'elettrolito e 3M KCl soluzione satura in un rapporto di 1:1 (volume/volume), evitando la formazione di minuscole bollicine d'aria.
Nota: Il mix panna viene utilizzato per costruire i ponti di elettrodo per la misurazione e il riferimento Ag/AgCl elettrodi, come illustrato nella Figura 1.
- Mescolare delicatamente la crema dell'elettrolito e 3M KCl soluzione satura in un rapporto di 1:1 (volume/volume), evitando la formazione di minuscole bollicine d'aria.
Figura 1 : Sonde con elettrodi e ponti. La figura illustra il tubo in polietilene prima (a) e dopo il riscaldamento e tirando (b), il nastro unendo le due parti capillare (c) del catetere a doppio lume (d), i connettori di tubo in silicone (e) e gli elettrodi (f). Per maggiore chiarezza di immagine, i connettori non sono stati riempiti con crema mix. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Etichetta di soluzione | Descrizione della soluzione |
| A | Soluzione salina tamponata basali |
| B | Cloruro di soluzione salina tamponata |
| C | Soluzione di riserva di amiloride 10-2 M |
| D | Soluzione di riserva di forskolin 10-3 M |
Tabella 1: Soluzione per il test di PD nasale nei topi.
| Sale | mM | Peso molecolare | g/L |
| Cloruro di sodio (NaCl) | 135 | 58,44 | 7.889 |
| Cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2h2O) | 2.25 | 147 | 0,331 |
| Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2.6h2O) | 1.2 | 203,3 | 0,244 |
| Fosfato dipotassico (K2HPO4) | 2.4 | 174,2 | 0.418 |
| Potassio fosfato monobasico (KH2PO4) | 0.4 | 136.1 | 0,054 |
Tabella 2: Composizione del basale soluzione salina (soluzione stock A) tamponata.
- Preparare le soluzioni.
- Preparare le quattro soluzioni stock richieste per il protocollo sperimentale (tabella 1).
- Preparare la soluzione tamponata basale (soluzione A; Tabella 2) e la soluzione tampone esente da cloruri (soluzione B; Tabella 3) mescolando i sali in acqua pura a temperatura ambiente. Regolare il pH a 7,4 (gamma 7.0-7.6) utilizzando 1 N NaOH per innalzare il pH, 1 N HCl a pH inferiore. Controllare l'osmolarità della soluzione (275 mOsm/L).
- Conservare in bottiglie di vetro con etichetta a 4 ° C per fino a 3 mesi o congelati in bottiglie di plastica per fino a 6 mesi.
- Preparare la soluzione di amiloride 10-2 M (soluzione C) aggiungendo 26,6 mg di amiloride cloridrato a 10 mL di acqua pura. Riscaldare la miscela per 5-10 minuti a 70 ° C. Come amiloride è sensibile alla luce, mantenere la soluzione C in un contenitore scuro. Etichettare il contenitore e conservare a 4 ° C fino a 3 mesi.
- Preparare la soluzione di forskolin di 10-3 M (soluzione D) con l'aggiunta di 10 mg di forskolin 24,36 ml di acqua pura. Etichettare le aliquote di 0,1 mL della soluzione madre forskolin e conservare a-20 ° C fino a 6 mesi.
- Preparare le quattro soluzioni stock richieste per il protocollo sperimentale (tabella 1).
- Preparare soluzioni fresche A1, B1 e B2 (tabella 4).
- Preparare soluzione fresca A1 (soluzione salina tamponata basale plus 10-4 M amiloride) ottenendo 10 mL di soluzione salina basale (soluzione stock A) e aggiungere 0,1 mL di soluzione di 10-2 M amiloride (soluzione C). Etichettare il contenitore e utilizzare entro 24 ore di preparazione.
- Preparare soluzione fresca B1 (cloruro tamponato soluzione plus 10-4 M amiloride) ottenendo 10 mL di soluzione salina tamponata esente da cloruri (soluzione B) e aggiungendo 0,1 mL di soluzione di 10-2 M amiloride (soluzione C). Etichettare il contenitore e utilizzare entro 24 ore dalla preparazione.
- Preparare soluzione fresca B2 (soluzione salina tamponata esente da cloruri plus 10-4 M amiloride e 10-5 M forskolin) ottenendo 10 mL di soluzione salina tamponata esente da cloruri (soluzione B) e aggiungere 0,1 mL di 10-2 M Amiloride soluzione (soluzione C) e 0,1 mL di soluzione di 10-3 M forskolin (soluzione D). Etichettare il contenitore e utilizzare entro 2 ore dalla preparazione.
| Sale | mM | Peso molecolare | g/L |
| Gluconato di sodio (sale monosodico) | 135 | 218,1 | 29.444 |
| Gluconato di calcio (polvere anidra) | 2.2 | 430.4 | 0.947 |
| Solfato di magnesio eptaidrato (MgCl2.6h2O) | 1.2 | 246.5 | 0.296 |
| Fosfato dipotassico (K2HPO4) | 2.4 | 174,2 | 0.418 |
| Potassio fosfato monobasico (KH2PO4) | 0.4 | 136.1 | 0,054 |
Tabella 3: Composizione di esente da cloruri tamponata (soluzione B).
Figura 2 : Posizione del mouse durante la perfusione della mucosa nasale. La figura illustra il dissipatore di calore (a), il voltmetro (b), l'elettrodo di riferimento inserito nello spazio sottocutaneo in un arto posteriore (c), prossimale (d) e il distale (e) Outlet della pompa peristaltica, il cuscino (f), e il lenzuolo (g). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. la valutazione e la gestione durante il Test
- Preparare la messa a punto sperimentale.
- Per prevenire l'ipotermia durante e dopo il test, utilizzare due cuscinetti di riscaldamento mantenuti a temperature fisiologiche, uno per il setup di misura (18,8 x 37.5 cm; Figura 2 una) e l'altra (15,5 x 15,5 cm) per la casella in cui l'animale sarà posto per recupero alla fine del test.
- Accendere il computer caricato con il software per l'acquisizione di dati collegati per l'impedenza di ingresso elevata di memoria dati (> 1012Ω) e ad alta risoluzione (0.1 mV) voltmetro (Figura 2b).
- Collegare gli elettrodi al voltmetro. Collegare l'elettrodo di misura positiva il catetere nasale e l'elettrodo di riferimento negativo al catetere inserito nello spazio sottocutaneo in un arto, come mostrato in Figura 2c.
- Immergere le punte degli elettrodi insieme nel mix panna. Controllare il valore di offset iniziale dell'elettrodo. Rifiutare gli elettrodi se il valore è maggiore di (±) 2 mV (idealmente 0 mV).
- Accendere la pompa peristaltica e inserire il tubo della pompa in posizione, come illustrato nella Figura 2.
- Collegare l'uscita prossimale del tubo pompa al flaconcino contenente la soluzione selezionata per aspersione nasale (Figura 2d). Collegare l'uscita distale del tubo pompa con il lumen perfusione del catetere nasale (Figura 2e).
- Riempire un lume del catetere nasale con elettrolita crema mix attraverso un puntale di 10 µ l. Adattare il catetere per un raccordo di tubo in silicone (Figura 1e), riempire il connettore con miscela di crema e inserire l'elettrodo positivo sul connettore (Figura 1f). Controllare il valore di offset del ponte elettrodo misura. Rifiutare i ponti, se il valore è maggiore di (±) 2 mV (idealmente 0 mV).
- Riempire il secondo lume del catetere nasale con la soluzione fresca A1. Immergere la punta del catetere nasale nel flaconcino contenente la soluzione r. Reverse la direzione della pompa peristaltica per riempire una lunghezza del catetere nasale corrispondente a 10 s di aspersione.
Nota: Questo permette di registrare i valori basali di PD per 10 s prima di applicare amiloride. Immergere la punta del catetere nasale nel mix crema all'interno del connettore dell'elettrodo di riferimento (Figura 1).
- Iniziare la manipolazione del mouse.
- Registrare il peso del mouse per calcolare la dose esatta degli anestetici deve essere iniettato dall'intraperitoneale (ip) percorso17.
- Utilizzando un ago da 26G (0.45 x 10 mm), iniettare premedicazione intraperitonealmente per promuovere l'induzione dell'anestesia: una dose fissa di 50 µ l di midazolam 5 mg/mL. Attendere 5 min.
- Preparare la miscela di anestetica (fentanil, medetomidina, droperidol alle concentrazioni finali di 0,05, 0.40 e 20 mg/kg di peso corporeo, rispettivamente e la clonidina alla dose fissa di 0,375 µ g) permettendo ottima e stabile la profondità dell'anestesia (fase III, piano 2)17 . Iniettare il volume di miscela di anestetico per via intraperitoneale e poi iniettare il volume di clonidina.
Nota: Dopo 15 min, il mouse dovrebbe essere addormentato e l'anestesia può durare per almeno 30 min. - Piegare un foglio di tessuto per fare un 3 cm ampia 'cuscino' (Figura 2f) che coprirà la parte superiore del rilievo di riscaldamento (Figura 2a) come supporto per il mouse testa di assorbire.
- Coprire il dissipatore di calore con un foglio di assorbimento del tessuto ('lenzuolo'; Figura 2 g). Posare il mouse sul dorso il termoforo. Nastro, gli arti e la coda (Figura 2).
- Inserire il catetere endovenoso di riferimento (Figura 1g) nello spazio sottocutaneo di un arto. Rimuovere l'ago e adattare il connettore del tubo in silicone (Figura 1e, 2C).
- Riempire il catetere e il connettore con panna Mescolare e inserire l'elettrodo negativo sul connettore (Figura 1f).
- Fissare il catetere e l'elettrodo con nastro adesivo, come richiesto per impedire qualsiasi spostamento. Dopo il posizionamento dell'elettrodo di riferimento e ponti, verificare nuovamente il valore di offset del ponte elettrodo misura immergendo la punta del catetere nasale nel mix elettrodo crema all'interno del connettore del catetere IV. Registrare il valore di offset finale stabile (idealmente meno (±) 2 mV).
- Difficoltà il mouse orecchie con nastro di "dolce" il dissipatore di calore in uno spazio libero tra i due pezzi di assorbimento del tessuto ('cuscino' (Figura 2f) e 'lenzuolo'; (Figura 2g)). Difficoltà le vibrisse (i peli rigidi cresce vicino alle narici) senza toccare gli occhi.
- Per assorbire il liquido dalla cavità orale, spostare la linguetta lateralmente (Figura 3un) e inserire uno stoppino aguzzo di carta da filtro (il ' tubo'; Figura 3 b) circa 1 cm in bocca. Per assorbire fluido esaurire la narice irrorata, posizionare un secondo pezzo di carta da filtro (il ' fazzoletto'; Figura 3 c) tenuto presso la punta del naso.
- Verifichi il valore di controllo positivo del potenziale epiteliale inserendo la punta del catetere nasale a contatto con l'interno della bocca.
Nota: La lettura deve essere stabile e intervallo tra -10 mV e -20 mV. - Tenendolo con una pinzetta e sotto buona illuminazione diretta, delicatamente introdurre il catetere nasale in una narice fino a 4 - 6 mm dal naso il suggerimento.
Nota: Il catetere nasale del PD si trova alla concha nasale centrale nella posizione che dà la massima linea di base stabile PD valore17,20. - 5 min dopo l'iniezione delle droghe anestetiche, inclinare delicatamente il dissipatore di calore di circa 30° con la testa dell'animale verso il basso. Monitorare il valore massimo di PD basale.
- Quando è stabile per un periodo di circa 30 s, inizio che irrora la mucosa nasale, a una velocità costante di 10 µ l / min, con le soluzioni tampone 4 (A, A1, B1, B2) in successione. Irrorare la prima soluzione (passo 1.3.1.1) per 10 s e ogni soluzione seguente (passo 1.4) per 5 minuti o fino a quando ha raggiunto un valore stabile. Fermare che irrora il forskolin (B2) quando la risposta transitoria forskolin comincia a calare.
- Selezionare un intervallo di 1 s per la registrazione dei dati. Avviare la registrazione dei dati al momento della partenza di aspersione. Visualizzare i dati in funzione di tempo sullo schermo del computer.
- Acquisizione dati stop alla fine della perfusione con soluzione B2. Salvare i dati come un file di foglio di calcolo.
- Dati corretti sottraendo il valore di offset finale.
Figura 3 : Posizione del mouse sul dissipatore di calore con il catetere nasale e la carta da filtro in luogo. La figura illustra la lingua mettere lateralmente, (a), il tubo (b) e il fazzoletto (c). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. valutazione e gestione post-prova
- Rilasciare il mouse dal termocuscino.
- Pulisciti il naso del mouse con il 'lenzuolo' (Figura 2g).
- Intraperitonealmente iniettare la miscela anestetica antagonista composta da una dose fissa (4 µ g) di naloxone, un antagonista competitivo morfina e atipamezolo, un antidoto specifico di medetomidina (2 mg/kg di peso corporeo).
- Posare il mouse sul pad riscaldamento più piccoli nella finestra di recupero fino al recupero completo, che solitamente si osserva dopo 1 o 2 h.
Nota: Nel laboratorio di UCL, circa il 10% mortalità, principalmente legate alla bronchoaspiration di soluzioni irrorato in cavità nasale durante il test, è osservato indipendentemente il sesso o il genotipo.
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Representative Results
Al fine di illustrare le anomalie del trasporto di ioni caratteristici in CF, nasale PD sono state effettuate seguendo il protocollo descritto in precedenza in un mouse F508del-CF e in un controllo di tipo selvatico del background genetico FVB/129 dalla colonia di Bruxelles CFTRtm1Eur topi30. Questo modello clinicamente rilevante, che harboring il più comune e uno dei più gravi F508del-CFTR mutazione23,24,25, è il migliore attualmente disponibile CF del mouse modello30,31, 32.
Rappresentante nasale tracciamenti di PD, ottenuti in un 4 - mese-vecchio femmina mouse omozigotico per la mutazione F508del-CF e in un'età e sesso-abbinato littermate di selvaggio-tipo, sono mostrati in Figura 4. Durante le prime due fasi del test, lo stato funzionale dell'ENaC è stato studiato irrorando le soluzioni A e A1, l'amiloride contenente quest'ultimo. Lo stato funzionale di CFTR (e dei trasportatori del cloruro alternativo in assenza di forskolin) è stato valutato durante le ultime due fasi del test, quando il contributo di ENaC è rimasto bloccato da amiloride.
Nel topo F508del-CF, sono stati osservati un valore basale hyperpolarized (un PDmax più negativa rispetto al valore del selvaggio-tipo mouse) insieme a una risposta aumentata amiloride; entrambi i risultati riflettono l'iperattività di ENaC CFTR-collegata. Più coerente, una ripolarizzazione drasticamente ridotta in risposta ad entrambi un gradiente elettrochimico favorevole all'efflusso di cloruro e aggiunta del forskolin, denominato qui risposta cloruro come totale, è stato osservato. Anche se la grandezza della risposta forskolin in topi wild-type è piccola (-3 mV), in CF, la risposta è solitamente smussata, coerente con la perdita di funzione CFTR.
Figura 4 -Rappresentante nasali tracciati di PD. Tracciati di PD nasali rappresentativi da un omozigote normale (A) ed un mouse omozigotico per la mutazione F508del-CFTR (B), insieme con i singoli valori ottenuti per i parametri di PD nasali (C e D). PDmax: valore di massima della linea di base stabile. Risposta di Amiloride: differenza tra i valori di PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con basale soluzione salina tamponata contenente amiloride (soluzione A1). Esente da cloruri risposta: differenza tra i valori di PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con esente da cloruri tampone soluzione salina plus amiloride (soluzione B1). Risposta di forskolin: differenza tra i valori di PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con esente da cloruri tampone soluzione salina plus forskolin e amiloride (soluzione B2). Risposta di cloruro totale: somma degli ultimi due parametri ottenuti sotto zero-cloruro di aspersione. Le frecce indicano le modifiche delle soluzioni irrorati nella narice. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Antidoti degli anestetici sono stati applicati alla fine delle prove, riducendo così la durata dell'anestesia, che può essere fino a 45 min di là di completamento del test. Come recupero degli animali si è presentato senza postumi, sono stati testati dopo un intervallo di sette giorni, quando lo stesso protocollo è stato applicato. La stessa narice è stata esplorata durante entrambe le prove. Esempi della seconda prova e accoppiato le differenze di ogni singolo parametro PD nasale tra i due test sono mostrate in Figura 5. Come precedentemente segnalato35, le differenze tra-test erano vicino a zero, in particolare per una risposta totale di cloruro, che riflette lo stato funzionale del trasporto del cloruro CFTR-dipendente, difettoso in CF.
Figura 5 -I singoli valori dei parametri di PD nasali. I valori sono stati ottenuti in una seconda prova (t2) eseguita in un omozigote normale (A) ed un mouse omozigotico della mutazione F508del-CFTR (B), insieme con le differenze accoppiate tra il secondo e il primo test (t1) per ogni parametro corrispondente. PDmax: valore di massima della linea di base stabile. Risposta di Amiloride: differenza tra i valori di PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con il basale soluzione salina tamponata contenente amiloride (soluzione A1). Esente da cloruri risposta: differenza tra i valori di PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con il cloruro-free tamponata soluzione salina plus amiloride (soluzione B1). Risposta di forskolin: differenza dei valori del PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con il cloruro-free tamponata soluzione salina plus forskolin e amiloride (soluzione B2). Risposta di cloruro totale: somma degli ultimi due parametri ottenuti sotto zero-cloruro di aspersione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Etichetta di soluzione | Descrizione della soluzione |
| A1 | Basali soluzione tampone salina (A) plus 10-4 M amiloride |
| B1 | Privo di cloruro soluzione tampone salina (B) plus 10-4 M amiloride |
| B2 | Esente da cloruri tampone soluzione salina (B) più di 10-4 M amiloride più di 10-5 M forskolin |
Tabella 4: Elenco delle soluzioni fresche per il test di PD nasale nei topi.
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Discussion
Lo scopo di questa carta è di descrivere un protocollo adeguato per misurare nasale PD sotto perfusione continua di soluzioni nei topi di respirare spontaneamente per un periodo di tempo necessario per verificare l'integrità dei trasportatori di ioni, principalmente CFTR ed ENaC. Tutti i passaggi del protocollo sono stati attentamente ottimizzati per garantire il recupero pieno animale e buona qualità e dati riproducibili. In particolari, critici i passaggi sono valutazione di anestesia e gestione adeguata posizione animale e cura durante e dopo il test.
Gli studi precedenti hanno mostrati che la fase III di esposizione anestetico, che può essere ottenuto applicando il cocktail composto di aereo 2 utilizzato qui17, è associato con la respirazione normale e con assenza di effetto inotropo negativo e di lampeggio, pupillare e pedale riflessi di ritiro. A questo livello di profondità anestetica, il catetere nasale può essere mantenuto in situ per aspersione continua della cavità nasale e per uso come un ponte dell'elettrodo di misura con buona tolleranza. Inoltre, inserimento del catetere nello spazio sottocutaneo, che serve come il ponte dell'elettrodo di riferimento, non è seguita da qualsiasi reazione dolorosa o segno di effetto nocivo. Nei roditori, il ruolo essenziale dell'input sensoriale della regione Solci nel controllo del comportamento di vis-à-vis una situazione esterna, tra cui una minaccia, rende adeguata profondità dell'anestesia particolarmente impegnativo quando si opera nella cavità nasale. Nebulizzazione invece di aspersione nasale continua è stato applicato per eseguire test di PD nasale in alcuni mouse studi33,34. Tuttavia, questo metodo porta a risultati non affidabili, a causa di ripetute rimozioni e reinsertions della sonda nasale. Infatti, a causa della distribuzione non omogenea di tipi delle cellule nella mucosa nasale del mouse20, riposizionare la punta della sonda nella stessa posizione nella narice è fondamentale. Inoltre, le risposte ai cambiamenti di soluzioni, in particolare esente da cloruri, svaniscono rapidamente quando viene interrotta la perfusione.
Bronco-aspirazione delle soluzioni che conduce all'arresto respiratorio è una limitazione fondamentale della procedura ed è la causa principale di mortalità del test. Diverse misure essenziali mirano a prevenirla, tra cui una posizione di decubito dorsale dell'animale, leggermente mantenendola con la testa verso il basso e assorbire l'eccesso di liquido dalla cavità orale e nasale17. È garantito un livello rapido e reversibile dell'anestesia con il recupero completo di animali applicando antidoti di droghe anestetiche alla fine del test. Il protocollo qui presentato consente misure affidabili in spontaneamente respirazione topi e ripetendo il test nello stesso animale. Ha un impatto sul numero di topi per ottenere la significatività statistica35 necessaria e il rispetto per le 3R (sostituire, affinare e ridurre) regole per animale utilizzano procedure sperimentali36. In esseri umani come in topi, la minima variabilità tra-test è stata trovata per risposta totale cloruro, suggerendo che esso come parametro PD nasale più affidabile per rilevare l'efficacia di nuove strategie terapeutiche CF. In topi CF, l'errore di misurazione della risposta totale cloruro è stato indicato per essere inferiore a ± 1.7 mV35. In altre parole, quando valutando la bioattività di una correzione della CFTR-droga in topi F508del-CF, una differenza tra risposta cloruro totale in assenza e in presenza di trattamento superiore a 2 mV indica il 95% di probabilità di un effetto di miglioramento di droga.
Interpretazione dei dati del rappresentante tracciamenti illustra la capacità del test PD nasale di discriminare tra CF e topi wild-type18,19,20,21,35 e dimostra che il modello di mouse Erasmus F508del-CF30 imita la mucosa nasale umana per quanto riguarda le anomalie del trasporto di ioni cliniche tipiche. Tuttavia, nel modello animale, una conduttanza di cloruro residuo è rilevabile, derivando da una funzione di F508del-CFTR residua o da un contributo di canali alternativi del cloro non CFTR-dipendente. Tradurre i risultati di ricerca CF da preclinici in ambienti clinici implica affrontare diverse differenze principali tra le due impostazioni. Il fenotipo CF del mouse Visualizza una sindrome respiratoria attenuata. L'assenza di terapie multiple insieme al fatto che il modello del mouse si trova in condizioni privilegiate con barriere igieniche anche contribuire alle differenze37. Il protocollo descritto qui mostra una variabilità molto bassa35 ed esso è stato adattato per il maiale38,39 e il furetto modelli40. In uno studio precedente, il protocollo sperimentale è stato modificato includendo perfusione della mucosa nasale del mouse con un inibitore dei trasportatori del cloruro alternativi, per esplorare il possibile contributo di cloruro di calcio-attivata non CFTR-dipendente canali18. Il test è stato utilizzato anche per studiare il trasporto del sodio nel β-ENaC overesprimenti mouse modello41, progettato per imitare CF-polmone malattia42. In futuro, ulteriori applicazioni del test potrebbero essere considerate per studiare altri trasportatori, quali il ATP12A, un CFTR-indipendente H+-pompa proteina espressa nell'uomo e nel maiale, ma assente in mouse airways43. Complessivamente, il protocollo descritto qui permette misurazioni affidabili della condizione funzionale di transepiteliale trasportatori sodio e cloruro in topi, ridotta mortalità relative ai test e prove multiple nello stesso animale che respirano spontaneamente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la Prof. ssa J. Lebacq per l'editing criticamente il manoscritto. CFTRtm1Eur (topi omozigoti F508del-CFTR (FVB/129) sono stati sviluppati dalla Erasmus MC, Rotterdam, Paesi Bassi, con il sostegno della Comunità economica europea azione di coordinamento europeo per la ricerca in fibrosi cistica EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
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