Summary
Здесь мы представляем протокол для измерения носовой разности потенциалов в мышах. Тест дает количественную оценку функции трансмембранных ионных транспортеров как регулятор трансмембранной проводимости кистозный фиброз и эпителиальных натриевых каналов. Это ценно для оценки эффективности новых терапий для муковисцидоз.
Abstract
Носовые потенциальных разница тест использовался для почти трех десятилетий для оказания помощи в диагностике кистозный фиброз (CF). Оказалось, чтобы быть полезным в случаях ослабленных, олиго - или моно симптоматическое форм CF, обычно диагностируется позднее в жизни и расстройств, связанных с CF, таких как врожденное отсутствие двусторонних семяпроводов, идиопатическим хроническим панкреатитом, аллергические аспергиллез бронхолегочной и бронхоэктазы. В доклинических и клинических параметров был использован тест как биомаркер для количественной оценки ответов на целевых терапевтических стратегий для адаптации CF. тест для мыши является сложной задачей и может повлечь за собой связанные смертности. Этот документ описывает адекватной глубины анестезии, необходимых для поддержания носовой катетер на месте для непрерывной перфузии. В нем перечислены меры во избежание бронхо стремление решений, увлажненную в нос. Он также описывает ухода за животными в конце теста, включая администрации комбинации антидотов анестетики, ведущих к быстро обратить вспять анестезии с полного восстановления животных. Репрезентативных данных, полученных из CF и одичал тип мыши показывает, что тест проводится дискриминация между CF и -CF. В целом протокол, описанные здесь позволяет надежных измерений функционального состояния транс эпителиальных хлорид и натрия транспортеров в спонтанно дыхание мышей, а также несколько тестов, в то же самое животное при одновременном снижении связанных с тест смертности.
Introduction
На протяжении почти трех десятилетий Электроизмерения потенциальных разницы (PD) были использованы для оценки функционального состояния трансмембранных ионных транспортеров, выраженных на слизистую оболочку носа, как представитель дистальных дыхательных путей1. Как многоэтапный динамического испытания2,3, носовые, PD позволяет функциональной рассечение муковисцидоз регулятор трансмембранной проводимости (МВТР) и активность канала (ENaC) эпителиальных натрия, оба локализованы в апикальной мембраны эпителиальные клетки и оказывают важную роль в гидратации поверхности сократимость миокарда. Основные клиническое применение носовой PD теста заключается в оказании помощи в диагностике CF, наиболее распространенным смертельным генетическое заболевание в кавказских популяциях с средняя распространенность 1 из 2500 родившихся в европейских странах. Испытание давно оказалась полезной в диагностике ослабленных, олиго - или моно симптоматическое форм CF, обычно диагностируется позднее в жизни и расстройств, связанных с CF, таких как врожденное отсутствие двусторонних семяпроводов, идиопатическим хроническим панкреатитом, аллергические аспергиллез бронхолегочной и бронхов4. Совсем недавно clinometric оценки терапевтических модуляции основных МВТР дефект5,6,,78,9,10,11 ,12,13,14,,1516 сделал использования носовое PD в клинических испытаниях новых терапий CF. В параметре доклинические, тест была адаптирована к мыши17 чтобы расследования отпорности новой CF целевой терапии18,19,,2021. В мышей техника деликатный, основанных на связанных видов анатомические различия в размерах носовой региона между грызунов и людьми и главным образом на важную роль сенсорные входы от регионе носогубные грызунов. Она требует подготовленных и квалифицированных операторов, специального оборудования и предметов снабжения.
CF это мульти системные расстройства экзокринных желез, в котором хронические респираторные заболевания доминирует клинической картины. Заболевание вызвано мутациями в гене кодирования циклический аденозинмонофосфат (лагерь)-регулируется МВТР хлорид канала22. На сегодняшний день, более чем 2000 МВТР мутации были определены23. Наиболее распространенными мутации24,25, в почти 90% CF аллелей, соответствует удаления фенилаланина в положении 508 полипептидной цепи белка (F508del-МВТР). МВТР белок является чисто омического небольшая проводимость хлорид канал. Существует также немало свидетельств того, что МВТР регулирует другие транспортных механизмов, в частности, ENaC26,27. Дефектные электролит транспорта, включая снижение проводимости хлорид МВТР зависимых и увеличение проводимости натрия ENaC зависимых, является отличительной чертой CF эпителия. Бывший дефект отражается уменьшить или ликвидировать реполяризации в ответ на электрохимических градиентов пользу хлорид измеряем и добавлением изопреналин (β-адренергическим агонистом, что увеличивает внутриклеточную лагерь) или форсколин (adenylate циклазы агонист, не разрешены для клинического использования). Последний дефект отражается базальной гиперполяризации слизистой оболочки носа (более негативные PD) и увеличение ответ на амилорид, мочегонный препарат, который блокирует ENaC28.
CF мыши модели часто использовались в исследованиях CF и неоценимое значение в рассекает CF патологии. В настоящее время по крайней мере пятнадцать модели были описаны29, три из которых являются гомозиготных для наиболее клинически значимых F508del мутации30,,3132. Один из этих трех штаммов30, разработанная в Университете Эразма в Роттердаме, был использован для почти 20 лет в лаборатории Лувен (UCL)-де-католический университет. МВТРtm1Eur модель30 оказался весьма полезным для изучения множественная Патофизиология болезни CF и проверить эффективность новых терапевтических стратегий18,19,20, 21. Могут возникнуть многочисленные проблемы, во время или после раннего (< 24 h) носовой PD тест у мышей. В этом документе описаны адекватной глубины анестезии, необходимых для поддержания носовой катетер на месте для непрерывной перфузии и меры во избежание бронхо стремление решений, увлажненную в нос. Также описан ухода за животными в конце теста, включая администрации комбинации антидотов анестетики, ведущих к быстро обратить вспять анестезии с полным восстановлением животных. Вообще эти процедуры позволяют надежных измерений в спонтанно дыхание мышей, снижение смертности, связанной с испытаний и повторяя тест в то же самое животное. Репрезентативных данных, полученных из носовой PD теста в CF и одичал тип мыши отображаются и обсуждены.
Мышиных носовой протокол испытаний на PD сообщается в рамках трех сессий: Оценка и управление до, во время и после испытания. В предварительной оценки и управления подробно описывается протокол подготовки двойной просвет носовой катетер и растворов, используемых для постоянно носовых перфузии. В ходе оценки и управления части теста скрупулезно рассекается экспериментальной установки и обработки мыши. Наконец управление животного в конце теста описано улучшить полный животных восстановления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования и процедуры были утверждены Этический Комитет для исследования животных UCL (2017/UCL/MD/015) и по согласованию с правилами Европейского сообщества для использования животных в научных исследованиях (CEE n ° 86/609). Следователи являются квалифицированными для экспериментов на животных после директивы 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета от 22 сентября 2010 по защите животных, используемых для научных целей.
1. Предварительная проверка, оценка и управление
- Подготовьте двойной просвет носовой катетер.
Примечание: Через носовой катетер производится как двойной люмен капиллярной трубки, один люмен, используются для непрерывного перфузии решений, и другой как измерения канала.- Нагрейте до центральной части кусок, около 20 см длиной, полиэтиленовые трубы (внутренний диаметр 2,0 мм, наружный диаметр 3,0 мм; Рисунок 1 ) в пламени газовой горелки до тех пор, пока он достаточно мягким для буксировки (10-15 сек).
- Вытяните двумя концами друг от друга для получения очень тонкие капилляр соответствующей длины (~ 15 см) и наружный диаметр (~0.1 мм) для носовой зонд (рис. 1б).
- Очистить и обезжирить два таких капилляров с чистого этанола, присоединиться к ним с лентой (рис. 1c) и склеить их вместе, используя Цианакрилатный клей.
- Отрежьте избыток длина штырей с лезвием бритвы или скальпеля для получения оптимальной длины двойной просвета катетера около 8 см (рис. 1d).
- Впрыскивают воду через оба люменов, чтобы убедиться, что они являются проницаемыми.
- Примените Марк на расстоянии 5 мм от кончика.
Примечание: Зонд вставляется до отметки в ноздрю, так что все измерения производятся в том же месте внутри носовой полости. - Храните двойной просвета катетера в сухой коробке.
Примечание: Это может быть используется 6 - 10 раз если надлежащим образом очищены сразу же после испытания.
- Приготовьте крем микс.
- Осторожно Смешайте электролита сливок и насыщенных 3 M несогретом растворе в соотношении 1:1 (объем/объем), избегая крошечные воздушных пузырьков.
Примечание: Крем смесь используется для построения мостов электродом для измерения и ссылка Ag/AgCl электродов, как показано на рисунке 1.
- Осторожно Смешайте электролита сливок и насыщенных 3 M несогретом растворе в соотношении 1:1 (объем/объем), избегая крошечные воздушных пузырьков.
Рисунок 1 : Зонды с электродами и мостиками. На рисунке показана полиэтиленовые трубы до (а) и после нагрева и потянув (b), ленты, присоединения две капиллярные части (c) двойной просвета катетера (d), силиконовые трубки разъемы (e) и электроды (f). Для ясности картины разъемы не были заполнены с крем микс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Label решения | Описание решения |
| A | Базальные буфферезированный раствор соли |
| B | Хлоридно свободный буфер солевой раствор |
| C | 10-2 M Амилорид Стоковый раствор |
| D | Стоковый раствор форсколин 10-3 M |
Таблица 1: Stock решение для носовой PD испытания на мышах.
| Соль | Мм | Молекулярная масса | g/L |
| Хлорид натрия (NaCl) | 135 | 58,44 | 7889 |
| Кальций хлористый (CaCl2.2H2O) | 2.25 | 147 | 0,331 |
| Гексагидрат хлорида магния (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 203.3 | 0.244 |
| Фосфат калия (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Дигидрофосфат калия (KH2PO4) | 0.4 | 136.1 | 0,054 |
Таблица 2: Состав базальной буфер солевой раствор (Стоковый раствор A).
- Подготовка решений.
- Подготовьте четыре фондовых решения, необходимые для экспериментальный протокол (Таблица 1).
- Подготовить базальной буфферезированный раствор (Стоковый раствор A; Таблица 2) и хлоридно свободный буфферезированный раствор (Стоковый раствор B; Таблица 3) путем смешивания соли в чистой воде при комнатной температуре. Скорректировать рН 7,4 (диапазон 7.0-7,6) с использованием 1 N NaOH для повышения рН, HCl 1 N до нижней pH. Проверьте осмолярности раствора (275 мОсм/Л).
- Хранить в обозначенные стеклянные бутылки на 4 ° C на срок до 3 месяцев или замороженные в пластиковые бутылки на срок до 6 месяцев.
- Приготовляют раствор Амилорид 10-2 M (Стоковый раствор C) путем добавления 26.6 мг Амилорид гидрохлорида 10 мл чистой воды. Нагреть смесь для 5 для 10 минут в 70 ° C. Как Амилорид чувствительны к свету, держите решение C в контейнере темно. Этикетке контейнера и хранить при 4 ° C на срок до 3 месяцев.
- Подготовка 10-3 M форсколин раствор (штока D) путем добавления 10 мг форсколин 24.36 мл чистой воды. Ярлык 0,1 мл аликвоты форсколин Стоковый раствор и хранить при температуре от-20 ° C до 6 месяцев.
- Подготовьте четыре фондовых решения, необходимые для экспериментальный протокол (Таблица 1).
- Подготовьте свежие решения A1, B1 и B2 (Таблица 4).
- Готовить свежий раствор A1 (базальный буфферезированный раствор соли плюс 10-4 M амилорид), получения 10 мл базальной солевого раствора (Стоковый раствор A) и добавив 0,1 мл раствора 10-2 M Амилорид (Стоковый раствор C). Пометить контейнер и использовать в течение 24 часов подготовки.
- Готовить свежий раствор B1 (хлорид буферизацией решение плюс 10-4 M амилорид), получения 10 мл хлоридно свободный буфферезированный раствор соли (Стоковый раствор B) и добавив 0,1 мл раствора 10-2 M Амилорид (Стоковый раствор C). Пометить контейнер и использовать в течение 24 часов с момента приготовления.
- Готовить свежий раствор B2 (амилорид хлоридно свободный буфферезированный раствор соли плюс 10-4 М и 10-5 M форсколин) по 10 мл хлоридно свободный буфферезированный раствор соли (Стоковый раствор B) получение и добавление 0,1 мл 10-2 M Амилорид раствор (запасов C) и 0,1 мл раствора 10-3 M форсколин (Стоковый раствор D). Пометить контейнер и использовать в течение 2 часов подготовки.
| Соль | Мм | Молекулярная масса | g/L |
| Глюконат натрия (соли натрия) | 135 | 218.1 | 29,444 |
| Кальций глюконат (безводный порошок) | 2.2 | 430.4 | 0.947 |
| Магния сульфата гептогидрата (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 246.5 | 0.296 |
| Фосфат калия (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Дигидрофосфат калия (KH2PO4) | 0.4 | 136.1 | 0,054 |
Таблица 3: Состав хлоридно свободный буферизации раствор (запасов B).
Рисунок 2 : Положение мыши при кровоснабжения слизистой оболочки носа. На рисунке показаны грелку (), вольтметр (b), электрод сравнения, вставляется в подкожной пространстве в задних конечностей (c), проксимальный (d) и дистальных точек (e) Перистальтический насос, подушки (f), и кровать листа (g). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. Оценка и управление во время выполнения теста
- Подготовка экспериментальной установки.
- Для предотвращения переохлаждения, во время и после испытания, используйте две грелки на физиологических температурах, один для измерительной установки (18,8 x 37,5 см; Рисунок 2 ), а другой (15,5 x 15,5 см) для окна, в котором будет уделяться животным для восстановления в конце теста.
- Включите компьютер загружается с помощью программного обеспечения для сбора данных, подключенных к данных памяти высокий входной импеданс (> 1012Ω) и высоким разрешением (0,1 МВ) вольтметр (рис. 2b).
- Подключите электроды к вольтметр. Подключите позитивные измерительного электрода к носовой катетер и отрицательное ссылка электрода к катетер, вставляется в подкожной пространстве в задних конечностей, как показано на рисунке 2c.
- Окуните концы электродов вместе в крем смеси. Проверьте значение смещения начальный электрода. Отклонить электродов, если значение больше, чем (±) 2 МВ (в идеале 0 mV).
- Включите насос перистальтический и вставьте трубу насоса в положение, как показано на рисунке 2.
- Соединить проксимальные выходе насоса трубки флакон, содержащий выбранное решение для носа перфузии (рис.d). Подключите дистальной выходе насоса трубки к перфузии просвет носовой катетер (eрис. 2).
- Заполните один просвет носовой катетер с электролитом крем смеси через наконечник пипетки 10 мкл. Адаптировать катетер к разъему силиконовой трубки (рис. 1e), заполнить соединитель с крем смеси и вставьте положительного электрода в разъеме (Рисунок 1f). Проверьте значение смещения мост измерительного электрода. Отклонить мосты, если значение больше, чем (±) 2 МВ (в идеале 0 mV).
- Заполните второй просвет носовой катетер с свежий раствор A1. Погрузите кончик носа катетер в флакон, содержащий решения A. обратное направление Перистальтический насос для заполнения Длина носовой катетер, соответствующий 10 s перфузии.
Примечание: Это позволяет запись базальной PD значения для 10 s перед применением амилорид. Погрузите кончик носа катетер в крем смеси внутри разъема электрод сравнения (рис. 1).
- Начните обработку мыши.
- Запишите вес мыши чтобы вычислить точную дозу анестетиков для инъекций маршрут внутрибрюшинного (ip)17.
- С помощью иглы 26G (0,45 x 10 мм), инъекционные премедикации внутрибрюшинно содействовать индукции анестезии: фиксированная доза 50 мкл мидазолама 5 мг/мл. Подождите 5 мин.
- Подготовить анестезии смесь (medetomidine, фентанил, Дроперидол на окончательный концентрации 0,05, 0,40 и 20 мг/кг массы тела, соответственно и клонидин в фиксированной дозы 0,375 мкг) позволяет оптимальное и стабильной глубины анестезии (этап III, плоскость 2)17 . Придать объем анестетика смеси внутрибрюшинно, а затем придать объем клонидином.
Примечание: После 15 мин, мышь должна быть спит и анестезия может длиться минимум 30 мин. - Сложите лист поглощающей ткани, чтобы сделать 3 см широкий «подушка» (Рисунок 2f), который будет охватывать как опора для головы мыши в верхней части электрогрелки(рисунок 2).
- Обложка грелку с листа поглощающей ткани («простыня»; Рисунок 2 g). Положите мыши на его обратно на грелку. Лента из конечностей и хвост (рис. 2).
- Вставьте ссылку внутривенного катетера (рис. 1g) в подкожной пространстве задние конечности. Извлеките иглу и адаптировать соединитель Трубки силиконовые (Рисунок 1e, 2 c).
- Заполните катетера и соединитель с крем смешать и вставить отрицательный электрод в разъеме (Рисунок 1f).
- Исправить катетера и электродом с лентой, необходимые для предотвращения любых перемещений. После размещения ссылки электрода и мостов проверьте значение смещения мост измерительного электрода снова путем окунать кончик носа катетер в электрод крем смеси внутри разъем IV катетера. Запись стабильной окончательное значение смещения (в идеале меньше (±) 2 МВ).
- Исправить мыши уши с «нежным» ленты на грелку в свободное пространство между двух кусков поглощающей ткани («подушка» (Рисунок 2f) и «простыня»; (Рисунок 2g)). Исправьте вибриссов (жесткой волос, растущих вблизи ноздри) не трогая глаз.
- Чтобы поглотить жидкости из полости рта, переместить язык сбоку (рис. 3) и вставьте указал фитиль фильтровальной бумаги («труба»; Рисунок 3 b) около 1 см в рот. Для поглощения жидкости исходе перфузии ноздрю, место второй кусок фильтровальной бумаги («носовой платок»; Рисунок 3 c) провел в кончик носа.
- Проверьте значение эпителиальных потенциал позитивного управления, поместив кончик носовой катетер при контакте с внутри рта.
Примечание: Чтение должно быть стабильным и составляет -10 МВ и -20 МВ. - Держа его тонкой пинцетом и под хорошее прямого освещения, деликатно ввести носовой катетер в одну ноздрю до 4 - 6 мм от носа наконечник.
Примечание: Носовой катетер PD расположен в средней носовой Конча на позиции, что дает максимальную стабильной базовой PD значение17,20. - 5 мин после инъекции анестетики, Аккуратно наклоните грелку около 30 ° с животное головой вниз. Контролировать максимальное значение базальной PD.
- Когда он устойчив в течение около 30 сек, начало, perfusing слизистой оболочки носа, с постоянной скоростью 10 мкл / мин, с 4 буферизации решения (A, A1, B1, B2) подряд. Perfuse первое решение (шаг 1.3.1.1) для 10 s и каждое следующее решение (шаг 1.4) для 5 минут или пока не будет достигнуто значение стабильной. Остановите perfusing форсколин (B2), когда ответ переходных форсколин начинает идти вниз.
- Выберите 1 s интервал для записи данных. Начните запись данных на момент начала перфузии. Отображать данные как функцию от времени на экране компьютера.
- В конце перфузии раствором B2 захвата стоп данных. Сохраните данные в формате электронной таблицы.
- Правильные данные путем вычитания окончательное значение смещения.
Рисунок 3 : Позиция мыши на грелку с носовой катетер и фильтр документы на месте. На рисунке показана язык положить боком (), труба (b) и платок (c). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
3. После тестирования, оценки и управления
- Отпустите кнопку мыши от грелки.
- Протрите нос мыши с «простыня» (Рисунок 2g).
- Придать внутрибрюшинно обезболивающий антагонист смесь состоит из фиксированной дозы (4 мкг), налоксон, антагонист конкурентных морфина и Атипамезола, medetomidine специфического антидота (2 мг/кг веса тела).
- Положите мыши на меньшие грелку в окне восстановления до полного восстановления, которая обычно наблюдается через 1-2 ч.
Примечание: В UCL лаборатории, около 10% смертности, главным образом связанных с bronchoaspiration решений, увлажненную в полости носа во время испытания, наблюдается независимо от пола или генотипа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того чтобы проиллюстрировать характерные ионного транспорта ненормальности в CF, носовые PD измерения проводились после протокол, описанных выше, в мыши F508del-CF и в элементе одичал тип генетический фон FVB/129 от Брюссельской колонии МВТР мышейtm1Eur 30. Этот клинически значимых модель, укрывательство наиболее распространенных и один из самых тяжелых F508del МВТР мутации23,24,25, является лучшим в настоящее время CF мыши модель30,31, 32.
Представитель носовой Прориси PD, полученным в 4 - месячного женского мыши гомозиготных F508del-CF мутации и возраста и пола соответствием одичал тип помёте, показаны на рисунке 4. В ходе первых двух этапов теста функциональное состояние ENaC был изучен perfusing решения, А и А1, последний содержащие амилорид. Функциональное состояние МВТР (и альтернативных хлорид транспортеров в отсутствие форсколин) была оценена на последних двух этапах теста, когда вклад ENaC по-прежнему заблокированы, амилорид.
В мыши F508del-CF наблюдались hyperpolarized базовое значение (более негативным PDmax по сравнению с одичал тип мыши значение) вместе с повышенной Амилорид ответ; Обе результаты отражают связанные МВТР ENaC гиперактивность. Более последовательно наблюдалось резкое снижение реполяризации в ответ на оба электрохимических градиент, благоприятные для измеряем хлорида и добавлением форсколин, названный здесь, как общая хлорид ответ. Несмотря на то, что масштабы форсколин ответ в мышах одичал тип небольшой (-3 МВ), в CF, ответ является обычно затуплены, в соответствии с потерей функции МВТР.
Рисунок 4 -Представитель носовой PD Прориси. Представитель носовой PD Прориси гомозиготных нормальные мыши (A) и мышь гомозиготных F508del-МВТР мутации (B), а также индивидуальные значения, полученные для носовой PD параметров (C и D). PDmax: максимальное базовых стабильное значение. Амилорид ответ: разница между значениями носовой PD в конце и в начале кровоснабжения слизистой оболочки носа с базальной буфер солевой раствор, содержащий Амилорид (решение A1). Хлоридно свободный ответ: разница между значениями носовой PD в конце и в начале кровоснабжения слизистой оболочки носа с хлоридно свободный буфер солевой раствор плюс Амилорид (раствор B1). Форсколин ответ: разница между значениями носовой PD в конце и в начале кровоснабжения слизистой оболочки носа с хлоридно свободный буфер солевой раствор плюс форсколин и Амилорид (раствора B2). Общая хлорид ответ: сумма двух последних параметров полученных под ноль хлорид перфузии. Стрелки указывают изменения решений, увлажненную в ноздрю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Противоядия анестетиков были применены в конце испытаний, тем самым уменьшая продолжительность анестезии, который может быть до 45 мин после завершения теста. Как восстановления животных произошло без последствий, они были протестированы снова после перерыва в семь дней, когда был применен тот же протокол. Же ноздрю была изучена в ходе обоих испытаний. На рисунке 5показаны примеры второго испытания и парных различия каждого отдельного параметра носовой PD между двумя испытаниями. Как сообщалось ранее35различия между тест были близки к нулю, в частности для ответа всего хлорид, отражающие функциональное состояние МВТР зависимых хлорид транспорта, дефектных в CF.
Рисунок 5 -Индивидуальные значения параметров носовой PD. Значения были получены в второго испытания (t2) в гомозиготной нормальные мыши (A) и мышь гомозиготных F508del-МВТР мутации (B), а также парные различия между второй и первый тест (t1) для каждого соответствующего параметра. PDmax: максимальное базовых стабильное значение. Амилорид ответ: разница между значениями носовой PD в конце и в начале кровоснабжения слизистой оболочки носа с базальной буфер солевой раствор, содержащий Амилорид (решение A1). Хлоридно свободный ответ: разница между значениями носовой PD в конце и в начале кровоснабжения слизистой оболочки носа с хлоридно свободный буфер солевой раствор плюс Амилорид (раствор B1). Форсколин ответ: разность значений носовой PD в конце и в начале кровоснабжения слизистой оболочки носа с хлоридно свободный буфер солевой раствор плюс форсколин и Амилорид (раствора B2). Общая хлорид ответ: сумма двух последних параметров полученных под ноль хлорид перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Label решения | Описание решения |
| А1 | Базальная буфер солевой раствор (A) плюс 10 Амилорид-4 M |
| B1 | Хлоридно свободный буфер солевой раствор (B) плюс 10 Амилорид-4 M |
| B2 | Хлоридно свободный буфер солевой раствор (B) плюс 10-4 M Амилорид плюс 10-5 M форсколин |
Таблица 4: Список свежих решений для носовой PD испытания на мышах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель этого документа заключается в описания надлежащей протокол для измерения носовой PD под непрерывной перфузии решений в спонтанно дыхание мышей для сколько времени требуется для проверки целостности ионных транспортеров, главным образом МВТР и ENaC. Все шаги протокола были тщательно оптимизированы для обеспечения полного животных восстановления и хорошее качество и воспроизводимость данных. В частности, критические шаги являются анестезии оценки и управления и надлежащей позиции животных и ухода во время и после испытания.
Предыдущие исследования показали, что самолет 2 этап III обезболивающий воздействия, которое может быть достигнуто путем применения коктейль смесь используется здесь17, ассоциируется с регулярного дыхания и отсутствие негативных инотропное действие и Блинк, ученический и педали Снятие рефлексов. На этом уровне глубины анестезии носовой катетер может храниться в месте для непрерывного перфузии носовой полости и для использования в качестве моста измерительного электрода с хорошей переносимостью. Кроме того введение катетера в подкожной пространстве, выступающей в качестве моста электрод сравнения, не последовал любые болезненные реакции или знак вредного эффекта. Грызунов важнейшую роль сенсорного ввода из носогубные региона в области контроля над поведением vis-à-vis внешней ситуации, включая угрозу, делает адекватной глубины анестезии, особенно сложной задачей при работе в носовой полости. Распыления вместо постоянно носовых перфузии был применен для выполнения носовой PD тест в некоторых исследованиях мыши33,34. Однако этот метод приводит к не надежные результаты, ввиду неоднократных абсорбции и reinsertions носовой зонд. На самом деле из-за не равномерное распределение типов клеток в слизистой носа мыши20, репозиционирования кончик зонда в том же месте в ноздрю имеет решающее значение. Кроме того ответы на изменения, в частности хлоридно свободный решения, быстро исчезают, когда прерывается перфузии.
Бронхо стремление решений, ведущих к дыхательное арестование критические ограничения процедуры и является главной причиной смертности теста. Некоторые основные меры направлены на предотвращение его, включая спинной пролежни позицию животного, слегка наклоняя ее вниз головой и поглощая избыток жидкости из полости рта и носа17. Быстрое и реверсивный уровень анестезии с полным восстановлением животных обеспечивается применение антидотов Анестетики в конце теста. Здесь представлены протокол позволяет надежных измерений в спонтанно дыхание мышей и повторяя тест в то же самое животное. Это влияет на количество мышей, необходимых для получения статистической значимости35 и на выполнении 3R (заменить, уточнения и уменьшить) использовать правила для животных в экспериментальных процедур36. В людей как в мышей низкие изменчивость между тест был обнаружен для ответа всего хлорид, предполагая, что его как наиболее надежный носовой PD параметр для выявления эффективности новой CF терапевтических стратегий. В CF мышей погрешность измерения всего хлорид ответ был показан будет меньше, чем ±1.7 МВ35. Другими словами, при оценке отпорности МВТР исправления наркотиков F508del-CF мышей, разница между общей хлорид ответ в отсутствие и при наличии лечения более 2 МВ указывает 95% вероятность повышения эффекта, связанных с наркотиками.
Интерпретация данных представитель Прориси иллюстрирует носовой теста PD способность различать между CF и мышах одичал тип18,19,20,,2135 и показывает, что Erasmus F508del-CF мыши модель30 имитирует человека слизистой оболочки носа в отношении типичных клинических ионного транспорта аномалии. Однако в животной модели остаточного хлорид проводимости обнаружению, обусловленные либо остаточная функция F508del МВТР или вклада альтернативных хлорид не зависящих МВТР каналов. Переводить результаты с CF исследований доклинических в клинических параметров предполагает заниматься несколько основных различий между двумя параметрами. CF фенотипу мыши отображает аттенуированные респираторного синдрома. Отсутствие нескольких терапии, а также тот факт, что модель мыши размещается в привилегированных условиях с гигиенической барьеры также способствуют различия37. Протокол описано здесь показывает очень низкой изменчивости35 и он был адаптирован к38,свиньи39 и хорька модели40. В предыдущем исследовании экспериментальный протокол был изменен путем включения кровоснабжения слизистой оболочки носа мыши с ингибитором альтернативных хлорид транспортеров, изучить возможный вклад не зависящих МВТР хлорид кальция активированный 18каналов. Тест также используется для изучения транспорт натрия в β-ENaC избытком мыши модель41, спроектирован, чтобы имитировать CF-легочными болезнями42. В будущем, дальнейшего применения теста может рассматриваться для изучения других перевозчиков, таких как ATP12A, H МВТР независимых+-насос белка, выраженные в человека и свиньи, но отсутствует в мыши airways43. В целом протокол, описанные здесь позволяет надежные измерения функционального состояния transepithelial хлорид и натрия транспортеров в спонтанно дыхание мышей, снижение смертности, связанной с испытаний и несколько тестов, в то же самое животное.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят профессор J. Lebacq за критически редактирования рукопись. МВТРtm1Eur (гомозиготных F508del-МВТР (FVB/129) мышах были разработаны Программа Erasmus MC, Роттердам, Нидерланды, при поддержке Европейской координации действий Европейского экономического сообщества для исследований в 6РП ЕС муковисцидоза LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
References
- Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
- Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
- Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
- Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
- Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
- Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
- Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
- Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
- Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
- Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
- Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
- De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
- Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
- Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
- Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
- Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
- Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
- Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
- Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
- Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
- Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
- Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
- Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
- Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
- Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
- Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
- Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
- Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
- Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
- Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
- Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
