Summary
Nous présentons ici un protocole permettant de mesurer la différence de potentiel nasale chez la souris. L’essai quantifie la fonction des transporteurs ioniques transmembranaires tels que le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique et le canal sodium épithélial. Il est utile d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements de la fibrose kystique.
Abstract
Le test de différence potentielle nasale a été utilisé depuis près de trois décennies pour aider dans le diagnostic de fibrose kystique (FK). Il s’est avéré utile dans les cas d’atténué, formes oligo - ou mono-symptomatique des FC généralement diagnostiquée plus tard dans la vie et de troubles liés au CF par exemple l’absence bilatérale congénitale des canaux déférents, pancréatite chronique idiopathique, allergique l’aspergillose broncho-pulmonaire et dilatation des bronches. Dans les paramètres cliniques et précliniques, le test a été utilisé comme un biomarqueur de quantifier les réponses aux stratégies thérapeutiques ciblées pour adapter CF. le test d’une souris est un défi et peut entraîner une mortalité associée. Cet article décrit la profondeur adéquate de l’anesthésie nécessaire pour maintenir un cathéter nasal in situ pour la perfusion continue. Il énumère les mesures pour éviter la broncho-aspiration de solutions perfusés dans le nez. Il décrit également les soins aux animaux à la fin de l’essai, y compris l’administration d’une combinaison d’antidotes des médicaments anesthésiques, menant à inverser rapidement l’anesthésie avec une récupération complète des animaux. Des données représentatives provenant d’un CF et une souris sauvage montrent que le critère discriminatoire entre FC et non-CF. Au total, le protocole décrit ici permet des mesures fiables de l’état fonctionnel des transporteurs de chlorure et de sodium trans épithélial spontanément des souris de respiration, ainsi que plusieurs essais chez le même animal tout en réduisant les liées aux tests mortalité.
Introduction
Depuis près de trois décennies, des mesures de différence (DP) potentiels électriques ont été utilisés pour évaluer l’état fonctionnel des transporteurs ioniques transmembranaires exprimée à la muqueuse nasale, comme représentant du distal airways1. Comme une dynamique multipas test2,3, nasal PD permettant une dissection fonctionnelle de la Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) et l’activité de sodium épithélial de canal (ENaC), tous deux localisés dans les membranes apicales de les cellules épithéliales et exercer un rôle important dans l’hydratation de surface des voies aériennes. L’application clinique majeure de l’essai de PD nasale est d’aider au diagnostic des FC, la maladie génétique mortelle plus courante dans les populations caucasiennes avec une fréquence moyenne de 1 sur 2 500 naissances dans les pays européens. Le test s’est avéré bien utile dans le diagnostic des formes oligo - ou mono-symptomatique atténué, FC généralement diagnostiquée plus tard dans la vie et de troubles liés au CF par exemple l’absence bilatérale congénitale des canaux déférents, pancréatite chronique idiopathique, allergique l’aspergillose broncho-pulmonaire et bronchectasie4. Plus récemment, clinometric évaluation de la modulation thérapeutique de la CFTR base défaut5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 a eu recours à la nasale PD dans les essais cliniques de nouvelles thérapies CF. Dans le paramètre préclinique, l’essai a été adaptée à la souris17 pour permettre l’enquête de la bioactivité des nouveaux CF cible thérapies18,19,20,21. Chez les souris, la technique est délicate, basé sur des différences anatomiques espèces liées à la taille de la région nasale entre les rongeurs et les humains et principalement sur le rôle essentiel des inputs sensoriels de la région de nasofacial chez les rongeurs. Elle exige des opérateurs formés et qualifiés, les équipements dédiés et les fournitures.
CF est une affection multisystémique des glandes exocrines, dans lequel une maladie respiratoire chronique domine le tableau clinique. La maladie est causée par des mutations du gène codant l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc)-régis CFTR chlorure canal22. A ce jour, plus de 2 000 CFTR mutations ont été identifiées23. Le plus commun mutation24,25, dans près de 90 % des allèles CF, correspond à une suppression de la phénylalanine en position 508 de la chaîne polypeptidique de la protéine (F508del-CFTR). La protéine CFTR est un canal chlorure de conductance petit purement ohmique. Il y a aussi des preuves considérables que CFTR régule d’autres mécanismes de transport, en particulier, ENaC26,27. Transport de l’électrolyte défectueux, y compris réduite conductance de chlorure CFTR-dépendante et conductance accrue du sodium ENaC-dépendant, est une caractéristique des épithéliums CF. L’ancien vice se traduit par une repolarisation réduite ou supprimée en réponse à la fois un efflux de chlorure favorisant gradient électrochimique et ajout de l’isoprénaline (un agoniste β-adrénergique qui augmente l’AMPc intracellulaire) ou la forskoline (une adénylate cyclase agoniste non approuvé pour l’usage clinique). Le défaut de ce dernier se traduit par une hyperpolarisation basale de la muqueuse nasale (une duree plus négative) et une réponse accrue à l’amiloride, un diurétique qui bloque l’ENaC28.
Modèles de souris CF ont été fréquemment utilisés dans la recherche de CF et ont été inestimables dans la pathologie de la CF de dissection. De nos jours, au moins quinze modèles ont été décrits29, dont trois sont homozygotes pour les plus cliniquement pertinentes F508del mutation30,31,32. Un de ces trois souches30, développé à l’Université Erasmus de Rotterdam, a été utilisé pendant près de 20 ans dans le laboratoire Université catholique de Louvain (UCL). Le Cftrtm1Eur modèle30 s’est avéré pour être très utile pour étudier la physiopathologie multiviscérale de maladie CF et de tester l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques18,19,20, 21. Plusieurs problèmes peuvent survenir au cours ou au début après (< 24h) le test de PD nasal chez les souris. Dans cet article, nous décrivons la profondeur adéquate de l’anesthésie nécessaire pour garder un cathéter nasal in situ pour perfusion continue et les mesures pour éviter la broncho-aspiration de solutions perfusés dans le nez. Les soins aux animaux à la fin de l’essai estégalement également décrite, notamment l’administration d’une combinaison d’antidotes des médicaments anesthésiques, menant à inverser rapidement l’anesthésie avec une récupération complète des animaux. Au total, ces procédures permettent des mesures fiables en spontanément respiration souris, réduction de la mortalité liées aux tests et recommencer l’essai chez le même animal. Des données représentatives provenant de l’essai de PD nasale dans un CF et une souris de type sauvage sont montrées et discutées.
Le protocole d’essai des PD nasal murin est signalé en trois sessions : évaluation et la gestion avant, pendant et après l’essai. Dans l’évaluation de pré-test et la gestion, le protocole de préparation du cathéter double lumière nasale et des solutions pour perfusion nasale continue est décrit en détail. Au cours de l’évaluation et des portions de la gestion de l’essai, expérimental et la manipulation de la souris est minutieusement disséqué. Enfin, gestion de l’animal à la fin de l’essai est décrite afin d’améliorer la récupération complète animale.
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Protocol
Les études et les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique pour la recherche sur les animaux de l’UCL (2017/UCL/MD/015) et en accord avec le règlement de la Communauté européenne pour l’utilisation des animaux en recherche (CEE n° 86/609). Les enquêteurs sont qualifiés pour l’expérimentation animale suite à la Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.
1. pré-tester Assessment and Management
- Préparer le cathéter nasal double lumière.
Remarque : Une sonde nasale est faite comme un tube capillaire de double lumière, une lumière étant utilisé pour la perfusion continue de solutions, et l’autre comme une mesure de canal.- Chauffer la partie centrale d’une pièce, environ 20 cm de long, du tube en polyéthylène (2,0 mm de diamètre intérieur ; 3,0 mm de diamètre extérieur ; Figure 1 un) dans la flamme d’un brûleur à gaz jusqu'à ce qu’il est assez mou pour tirer (10-15 s).
- Séparer les deux extrémités pour obtenir un tube capillaire très mince de longueur appropriée (~ 15 cm) et de diamètre extérieur (~0.1 mm) pour la sonde nasale (Figure 1b).
- Nettoyer et dégraisser les deux ces capillaires avec de l’éthanol pur, se joindre à eux avec du ruban adhésif (Figure 1c) et coller à l’aide de colle cyanoacrylate.
- Coupez l’excédent de longueur des sondes avec une lame de rasoir ou un scalpel pour obtenir une longueur optimale du cathéter double lumière d’environ 8 cm (Figure 1d).
- Injecter de l’eau à travers les deux lumières pour vérifier qu’ils sont perméables.
- Apposer une marque à une distance de 5 mm de l’extrémité.
Remarque : La sonde est insérée jusqu'à la marque dans la narine, afin que toutes les mesures sont effectuées sur le même site à l’intérieur de la cavité nasale. - Stocker le cathéter double lumière dans une zone sèche.
Remarque : On utilisé 6 - 10 fois si convenablement nettoyées immédiatement après l’essai.
- Préparer le mélange de crème.
- Mélanger délicatement la crème de l’électrolyte et 3M KCl solution saturée dans un rapport de 1:1 (volume/volume), en évitant la formation de minuscules bulles d’air.
Remarque : Le mélange pour crème est utilisé pour construire les ponts d’électrode pour la mesure et la référence des électrodes Ag/AgCl, tel qu’illustré à la Figure 1.
- Mélanger délicatement la crème de l’électrolyte et 3M KCl solution saturée dans un rapport de 1:1 (volume/volume), en évitant la formation de minuscules bulles d’air.
Figure 1 : Des sondes avec des électrodes et des ponts. La figure illustre le tube de polyéthylène avant (a) et après chauffage et tirant (b), la bande reliant les deux parties capillaires (c) du cathéter double lumière (d), les raccords de tube de silicone (e) et les électrodes (f). Pour une clarté d’image, les connecteurs n’ont pas été remplis avec le mélange pour crème. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Étiquette de solution | Description de la solution |
| A | Solution saline tamponnée basale |
| B | Sans chlorure solution saline tamponnée |
| C | 10-2 M amiloride solution mère |
| D | Solution mère de la forskoline 10-3 M |
Tableau 1 : Solution de Stock pour le test de PD nasale chez les souris.
| Sel | mM | Poids moléculaire | g/L |
| Chlorure de sodium (NaCl) | 135 | 58.44 | 7 889 |
| Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2.2H2O) | 2.25 | 147 | 0,331 |
| Hexahydrate de chlorure de magnésium (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 203,3 | 0,244 |
| Phosphate dipotassique (K2HPO4) | 2.4 | 174,2 | 0,418 |
| Phosphate monopotassique (KH2PO4) | 0,4 | 136.1 | 0,054 |
Tableau 2 : Composition basale de la solution saline (solution stock A) tamponnée.
- Préparer les solutions.
- Préparer les quatre solutions requises pour le protocole expérimental (tableau 1).
- Préparer la solution tampon basale (solution mère A ; Le tableau 2) et la solution tampon sans chlorure (solution mère B ; Le tableau 3) en mélangeant les sels dans l’eau pure à la température ambiante. Ajuster le pH à 7,4 (gamme 7.0-7.6) à l’aide de NaOH N 1 pour élever le pH, 1 N HCl à pH plus bas. Vérifier l’osmolarité de la solution (275 mOsm/L).
- Stocker dans des bouteilles de verre étiquetées à 4 ° C pour 3 mois ou congelées dans des bouteilles en plastique jusqu'à 6 mois.
- Préparer la solution d’amiloride 10-2 M (solution mère C) en ajoutant 26,6 mg de chlorhydrate d’amiloride à 10 mL d’eau pure. Chauffer le mélange pendant 5 à 10 minutes à 70 ° C. Comme l’amiloride est sensible à la lumière, garder la solution C dans un récipient sombre. Étiqueter le contenant et conserver à 4 ° C pendant 3 mois.
- Préparer la solution de la forskoline M 10-3 (solution mère D) en ajoutant 10 mg de forskoline à 24,36 mL d’eau pure. Étiquette de 0,1 ml de la solution mère de la forskoline et conserver à-20 ° C jusqu'à 6 mois.
- Préparer les quatre solutions requises pour le protocole expérimental (tableau 1).
- Préparer des solutions fraîches A1, B1 et B2 (tableau 4).
- Préparer une solution fraîche A1 (solution saline tamponnée basale plus 10-4 M amiloride) en obtenant 10 mL de solution saline basale (solution stock A) et en ajoutant 0,1 mL de solution d’amiloride-2 M 10 (solution mère C). Étiqueter le contenant et l’utiliser dans les 24 heures de préparation.
- Préparer une solution fraîche B1 (chlorure tamponnée solution plus 10-4 M amiloride) en obtenant 10 mL de solution saline tamponnée d’expression sans chlorure (solution mère B) et en ajoutant 0,1 mL de solution d’amiloride-2 M 10 (solution mère C). Étiqueter le contenant et l’utiliser dans les 24 heures de préparation.
- Préparer une solution fraîche B2 (solution saline tamponnée sans chlorure plus 10-4 M amiloride et 10-5 M la forskoline) en obtenant 10 mL de solution saline tamponnée d’expression sans chlorure (solution mère B) et en ajoutant 0,1 mL de 10-2 M l’amiloride solution (solution mère C) et 0,1 mL de solution de la forskoline 10-3 M (solution mère D). Étiqueter le contenant et l’utiliser dans les 2 heures de préparation.
| Sel | mM | Poids moléculaire | g/L |
| Gluconate de sodium (sel monosodique) | 135 | 218.1 | 29 444 |
| Gluconate de calcium (anhydre poudre) | 2.2 | 430.4 | 0,947 |
| Heptahydrate de sulfate de magnésium (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 246,5 | 0,296 |
| Phosphate dipotassique (K2HPO4) | 2.4 | 174,2 | 0,418 |
| Phosphate monopotassique (KH2PO4) | 0,4 | 136.1 | 0,054 |
Tableau 3 : Composition de sans chlorure solution (solution mère B) tamponnée.
Figure 2 : Position de la souris pendant la perfusion de la muqueuse nasale. La figure illustre le coussin chauffant (un), le voltmètre (b), l’électrode de référence inséré dans l’espace sous-cutané dans une patte arrière (c), (d) et proximale du distales (e) prises de la pompe péristaltique, l’oreiller (f), et le lit de feuille (g). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
2. évaluation et la gestion pendant l’essai
- Préparer le montage expérimental.
- Pour prévenir l’hypothermie pendant et après le test, utilisez deux coussins chauffants, maintenus à température physiologique, un pour la configuration de mesure (18,8 x 37,5 cm ; Figure 2 un) et l’autre (15,5 x 15,5 cm) pour la zone dans laquelle l’animal sera placé pour la récupération à la fin de l’essai.
- Allumez l’ordinateur chargé avec le logiciel de capture de données connecté à l’impédance d’entrée élevée de mémoire données (> 1012Ω) et une résolution élevée (0,1 mV) voltmètre (Figure 2b).
- Connecter les électrodes du voltmètre. Connecter l’électrode de mesure positive à la sonde nasale et l’électrode de référence négative au cathéter inséré dans l’espace sous-cutané dans un membre postérieur, tel qu’illustré en Figure 2c.
- Tremper les pointes des électrodes dans le mélange de crème. Vérifiez la valeur de décalage initial d’électrode. Rejeter les électrodes si la valeur est supérieure à (±) 2 mV (idéalement 0 mV).
- Mettre en marche la pompe péristaltique et insérer le tube de la pompe en position, comme illustré à la Figure 2.
- Raccorder la sortie proximale du tube de la pompe dans le flacon contenant la solution retenue pour perfusion nasale (Figure 2d). Raccorder la sortie distale du tube de la pompe à la lumière de perfusion du cathéter nasal (Figure 2e).
- Remplir une lumière du cathéter nasal avec mélange d’électrolytes crème grâce à un embout de pipette de 10 µL. Adapter le cathéter à un connecteur de tube de silicone (Figure 1e), remplissez le connecteur avec le mélange de crème et insérer l’électrode positive dans le connecteur (Figure 1f). Vérifiez la valeur de décalage de pont électrode mesure. Rejeter les ponts si la valeur est supérieure à (±) 2 mV (idéalement 0 mV).
- Remplir la deuxième lumière du cathéter nasal de la solution fraîche A1. Tremper l’extrémité du cathéter nasal dans le flacon contenant la solution inverse d’a. la direction de la pompe péristaltique pour remplir une longueur du cathéter nasal correspondant à 10 s de perfusion.
Remarque : Ceci permet d’enregistrer les valeurs basales de PD pour 10 s avant d’appliquer l’amiloride. Tremper l’extrémité du cathéter nasal dans le mélange pour crème à l’intérieur du connecteur de l’électrode de référence (Figure 1).
- Commencer à manipuler la souris.
- Enregistrer le poids de la souris pour calculer la dose exacte d’anesthésiques à injecter par voie intrapéritonéale (ip)17.
- À l’aide d’une aiguille 26G (0,45 x 10 mm), injecter une prémédication par voie intrapéritonéale pour promouvoir l’induction de l’anesthésie : une dose fixe de 50 µL de midazolam 5 mg/mL. Attendre 5 min.
- Préparer le mélange anesthésique (fentanyl, médétomidine, dropéridol à la concentration finale de 0,05, 0,40 et 20 mg/kg de poids corporel de respectivement et clonidine à une dose fixe de 0,375 µg) permettant la profondeur optimale et stable de l’anesthésie (stade III, plan 2)17 . Injecter le volume du mélange anesthésique par voie intrapéritonéale et ensuite injecter le volume de la clonidine.
Remarque : Après 15 min, la souris doit être endormie et l’anesthésie peut durer pendant au moins 30 min. - Plier une feuille d’absorber le tissu pour faire un 3 cm large « oreiller » (Figure 2f) qui couvre la partie supérieure du coussin chauffant (Figure 2a) comme support pour la tête de souris.
- Couvrir le coussin chauffant avec une feuille d’absorber des tissus (« drap de lit » ; Figure 2 g). Posez la souris sur son dos sur le coussin chauffant. Ruban adhésif sur les membres et la queue (Figure 2).
- Insérer le cathéter intraveineux de référence (Figure 1g) dans l’espace sous-cutané d’un membre postérieur. Retirer l’aiguille et adapter le connecteur de tube de silicone (Figure 1e, 2C).
- Remplissez le cathéter et le connecteur avec la crème, mélanger et placer l’électrode négative dans le connecteur (Figure 1f).
- Fixer le cathéter et l’électrode avec du ruban comme nécessaire afin d’éviter tout déplacement. Après le placement de l’électrode de référence et de ponts, vérifiez la valeur de décalage de pont électrode mesure à nouveau en trempant l’extrémité du cathéter nasal dans le mélange de crème électrode à l’intérieur du connecteur du cathéter IV. Enregistrer la valeur de décalage finale stable (idéalement moins de (±) 2 mV).
- Fixer la souris oreilles avec du ruban de « doux » sur le pad de la chaleur dans un espace libre entre les deux morceaux d’absorber des tissus (« oreiller » (Figure 2,f) et « drap de lit » ; Figure 2g). Difficulté vibrisses (les poils raides qui poussent près des narines) sans toucher les yeux.
- Pour absorber le liquide de la cavité buccale, passer la langue sur le côté (Figure 3a) et insérez une mèche pointue de papier filtre (le « pipe » ; Figure 3 b) environ 1 cm dans la bouche. Pour absorber le liquide en cours d’exécution par la narine perfusée, placez un deuxième morceau de papier filtre (le « mouchoir » ; Figure 3 c) qui s’est tenue à la pointe du nez.
- Vérifier une valeur du contrôle positif du potentiel épithélial en plaçant l’extrémité du cathéter nasal en contact avec l’intérieur de la bouche.
Remarque : La lecture doit être stable et varie entre -10 mV et -20 mV. - Maintenant avec une pince fine et sous bon éclairage direct, introduire délicatement la sonde nasale dans une narine jusqu'à 4 - 6 mm du nez astuce.
Remarque : Le cathéter nasal de PD se trouve dans la milieu concha nasale à la position qui donne la ligne de base stable maximale PD valeur17,20. - 5 min après l’injection des médicaments anesthésiques, inclinez doucement le coussin chauffant de 30 ° avec la tête d’animal vers le bas. Contrôler la valeur maximale de PD basale.
- Quand il est stable sur une période d’environ 30 s, début perfusant la muqueuse nasale, à un taux constant de 10 µL / min, avec les 4 solutions tamponnées (A, A1, B1, B2) en succession. Perfuse la première solution (point 1.3.1.1) pendant 10 s et chaque solution suivante (point 1.4) pendant 5 min ou jusqu'à ce qu’une valeur stable a été atteint. Arrêter perfusant la forskoline (B2), lorsque la réponse de la forskoline transitoire commence à descendre.
- Sélectionnez un intervalle de 1 s pour l’enregistrement des données. Démarrer l’enregistrement de données au moment de commencer la perfusion. Afficher les données en fonction du temps sur l’écran de l’ordinateur.
- Saisie arrêt à la fin de la perfusion de solution B2. Enregistrer les données dans un fichier de feuille de calcul.
- Données correctes en soustrayant la valeur de décalage finale.
Figure 3 : Position de la souris sur le coussin chauffant avec le cathéter nasal et les papiers filtres en place. La figure illustre la langue mises sur le côté (a), le tube (b) et le mouchoir (c). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
3. après le test Assessment and Management
- Relâchez le bouton de la souris du coussin chauffant.
- Moucher la souris avec le « drap » (Figure 2g).
- Injecter par voie intrapéritonéale le mélange anesthésique antagoniste composé d’une dose fixe (4 µg) de naloxone, un antagoniste compétitif de la morphine et Atipamézole, un antidote spécifique médétomidine (2 mg/kg de poids corporel).
- Posez la souris sur le petit coussin chauffant dans la zone de récupération jusqu'à la guérison complète, qui est habituellement observée après 1 à 2 h.
Remarque : Dans le laboratoire de l’UCL, environ 10 % mortalité, principalement liée aux bronchoaspiration de solutions perfusés dans les fosses nasales pendant l’essai, on observe quel que soit le sexe ou le génotype.
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Representative Results
Afin d’illustrer les anomalies de transport ionique caractéristique dans les FC, nasale PD mesures ont été effectuées selon le protocole décrit ci-dessus chez une souris F508del-CF et à un contrôle de type sauvage du fond génétique de la colonie de Bruxelles de FVB/129 CFTRtm1Eur souris30. Ce modèle cliniquement pertinent, abritent les plus courantes et un des plus graves F508del-CFTR mutation23,24,25, est le meilleur actuellement disponibles CF souris modèle30,31, 32.
Représentant nasales tracés de PD, obtenus dans une 4 - mois vieille souris femelle homozygote pour la mutation F508del-CF et dans une même portée appariés selon l’âge et le sexe sauvage, sont indiquées dans la Figure 4. Pendant les deux premières phases de l’essai, l’état fonctionnel de l’ENaC a été étudiée en perfusant des solutions A et A1, l’amiloride contenant ce dernier. L’état fonctionnel du CFTR (et des transporteurs de chlorure alternative en l’absence de la forskoline) a été évalué pendant les deux dernières phases de l’épreuve, lorsque la contribution de l’ENaC sont restés bloquée par l’amiloride.
Chez la souris F508del-CF, une valeur de référence hyperpolarisé (un PDmax plus négatif comparé à la valeur de la souris sauvage) ainsi qu’une réponse accrue amiloride ont été observés ; les deux constatations reflètent la suractivité ENaC CFTR-associés. De manière plus cohérente, une repolarisation drastiquement réduite en réponse à la fois un gradient électrochimique favorable à l’efflux de chlorure et ajout de la forskoline, nommée ici réponse de chlorure comme total, a été observé. Même si l’ampleur de la réponse de la forskoline chez les souris de type sauvage est petite (-3 mV), dans les FC, la réponse est généralement affaiblie, compatible avec la perte de fonction CFTR.
Figure 4 -Représentant tracés de PD nasales. Sous-champs PD représentant nasales d’une souris normale homozygote (A) et une souris homozygote pour la mutation F508del-CFTR (B), ainsi que les valeurs obtenues pour les paramètres de PD nasales (C et D). PDmax: valeur stable de base maximale. Réponse de l’amiloride: différence entre les valeurs du Parkinson nasal à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec basale sel solution tamponnée contenant l’amiloride (solution A1). Réponse sans chlorure: différence entre les valeurs du Parkinson nasal à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec sans chlorure tamponné une solution salée avec l’amiloride (solution B1). Réponse de la forskoline: différence entre les valeurs du Parkinson nasal à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec sans chlorure tamponnée solution saline ainsi que la forskoline et amiloride (solution B2). Réponse de chlorure total: somme des deux derniers paramètres obtenus sous perfusion de chlorure de zéro. Les flèches indiquent les changements de solutions perfusées dans la narine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Antidotes des anesthésiques ont été appliqués à la fin des essais, ce qui réduit la durée de l’anesthésie, qui peut être jusqu'à 45 min après achèvement de l’essai. Comme le rétablissement des animaux a eu lieu sans séquelles, ils ont été testés à nouveau après un intervalle de sept jours, quand le même protocole a été appliqué. La même narine a été explorée pendant les deux tests. Exemples du second essai et différences appariées de chaque paramètre de PD nasale individuel entre les deux tests sont indiquées à la Figure 5. Comme indiqué précédemment35, les différences entre le test étaient proche de zéro, en particulier pour réponse de chlorure total, reflétant l’état fonctionnel des transport de chlorure dépendant du CFTR, défectueux dans les FC.
Figure 5 -Différentes valeurs des paramètres de PD nasales. Les valeurs ont été obtenues dans une deuxième épreuve (t2) dans une souris homozygote normale (A) et une souris homozygote de la mutation F508del-CFTR (B), ainsi que les différences appariées entre le deuxième et le premier test (t1) pour chaque paramètre correspondant. PDmax: valeur stable de base maximale. Réponse de l’amiloride: différence entre les valeurs du Parkinson nasal à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec la basale sel solution tamponnée contenant l’amiloride (solution A1). Réponse sans chlorure: différence entre les valeurs PD nasal à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec le chlorure libres mis en mémoire tampon une solution salée avec l’amiloride (solution B1). Réponse de la forskoline: différence des valeurs PD nasal à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec la sans chlorure tamponnée solution saline ainsi que la forskoline et amiloride (solution B2). Réponse de chlorure total: somme des deux derniers paramètres obtenus sous perfusion de chlorure de zéro. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Étiquette de solution | Description de la solution |
| A1 | Baso tampon salin (A) plus 10-4 M amiloride |
| B1 | Sans chlorure tampon salin (B) et 10-4 M amiloride |
| B2 | Sans chlorure tampon salin (B) et 10-4 M amiloride et 10-5 M la forskoline |
Tableau 4 : Liste des solutions fraîches pour le test de PD nasale chez les souris.
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Discussion
Le but de cet article est de décrire un protocole adéquat pour mesurer des PD nasale sous perfusion continue de solutions spontanément respiration souris pour un laps de temps requis pour contrôler l’intégrité des transporteurs ioniques, principalement CFTR et ENaC. Toutes les étapes du protocole ont été soigneusement optimisés afin d’assurer la récupération complète animale et de bonne qualité et de données reproductibles. En particuliers, critiques des étapes sont anesthésie évaluation et la gestion et position animale adéquate et soin pendant et après le test.
Des études antérieures ont montré que la scène plan 2 III d’exposition anesthésique, qui peut être obtenue en appliquant le mélange cocktail utilisé ici17, est associé à une respiration régulière et avec l’absence d’effet inotrope négatif et de clin, pupillaire et pédale réflexes de retrait. À ce niveau de profondeur de l’anesthésie, la sonde nasale peut être conservée sur place pour une perfusion continue de la cavité nasale et à utiliser comme un pont de l’électrode de mesure avec bonne tolérance. En outre, l’insertion du cathéter dans l’espace sous-cutané, agissant comme le pont de l’électrode de référence, n’a pas été suivie par une réaction douloureuse ou signe d’effet nocif. Chez les rongeurs, le rôle essentiel de l’information sensorielle de la région de nasofacial dans le contrôle du comportement visà-vis une situation extérieure, y compris une menace, a fait une profondeur adéquate de l’anesthésie particulièrement difficile lorsqu’elles opèrent dans la cavité nasale. Nébulisation au lieu de perfusion nasale continue a été appliquée pour tester de PD nasale dans certaines souris études33,34. Toutefois, cette méthode conduit à des résultats non fiables, en raison des déménagements répétés et reinsertions de la sonde nasale. En fait, grâce à une répartition non homogène des types de cellules de la muqueuse nasale de souris20, repositionnement de la pointe de la sonde au même endroit dans la narine est critique. Par ailleurs, les réponses aux changements des solutions, des solutions en particulier sans chlorure, disparaissent rapidement lorsque la perfusion est interrompue.
Broncho-aspiration des solutions conduisant à un arrêt respiratoire est une critique de la limitation de la procédure et est la principale cause de mortalité de l’essai. Plusieurs mesures essentielles visent à empêchant notamment une position de décubitus dorsal de l’animal, légèrement incliner la tête vers le bas et absorber l’excès de liquide des cavités orales et nasales17. Un niveau rapid et réversible de l’anesthésie avec une récupération complète des animaux est assuré en appliquant les antidotes des médicaments anesthésiques à la fin de l’essai. Le protocole présenté ici permet des mesures fiables de respiration souris spontanément et de recommencer l’essai chez le même animal. Elle influe sur le nombre de souris nécessaire pour obtenir la signification statistique35 et se conformant à la 3R (remplacer, affiner et réduire) règles pour animal utilisent des procédures expérimentales36. Chez l’homme comme la souris, la variabilité entre-test le plus bas a été trouvée pour réponse de chlorure total, suggérant qu’il comme paramètre PD nasal plus fiable pour détecter l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques CF. Chez les souris CF, l’erreur de mesure de la réponse de chlorure total s’est avéré inférieur à ±1.7 mV35. En d’autres termes, quand évaluant la bioactivité de la correction d’un CFTR de drogue chez les souris F508del-CF, une différence entre la réponse de chlorure total en l’absence et en présence de traitement supérieure à 2 mV indique 95 % de chances d’un effet d’amélioration liées à la drogue.
L’interprétation des données de calques représentant illustre la capacité de l’essai de PD nasale d’établir une distinction entre les FC et les souris de type sauvage18,19,20,21,35 et montre que le modèle de souris Erasmus F508del-CF30 imite la muqueuse nasale humaine en ce qui concerne les anomalies du transport ionique clinique typique. Toutefois, dans le modèle animal, une conductance de chlorure résiduel est détectable, résultant soit d’une fonction résiduelle de F508del-CFTR ou d’une contribution de canaux alternatifs de chlore non CFTR-dépendant. Traduire les résultats de la recherche de CF de précliniques en milieu clinique implique de traiter avec plusieurs différences majeures entre les deux réglages. Le phénotype de CF de la souris affiche un syndrome respiratoire atténué. L’absence de thérapies multiples ainsi que le fait que le modèle murin est logé dans des conditions privilégiées avec barrières hygiéniques contribuent également à la différence de37. Le protocole décrit ici montre une très faible variabilité35 et il a été adapté pour le cochon38,39 , et le furet modèles40. Dans une étude antérieure, le protocole expérimental a été modifié en incluant la perfusion de la muqueuse nasale des souris avec un inhibiteur de transporteurs alternatifs de chlorure, d’explorer la contribution possible du CFTR-non-dépendants activée par le calcium chlorure de chaînes18. L’essai a également servi à étudier le transport du sodium dans la β-ENaC sur-exprimant souris modèle41, conçu pour imiter CF-pulmonaire maladie42. À l’avenir, plus les applications de l’essai pourraient être considérée comme étudier d’autres transporteurs, tels que le ATP12A, un indépendant du CFTR H+-pompe protéine exprimée chez l’homme et chez le porc, mais absent dans la souris airways43. Au total, le protocole décrit ici permet des mesures fiables de l’état fonctionnel des transépithélial transporteurs de chlorure et de sodium en respiration spontanée des souris, réduction de la mortalité liées aux tests et essais multiples chez le même animal.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Prof. J. Lebacq pour l’édition critique du manuscrit. CFTRtm1Eur (souris homozygotes de F508del-CFTR (FVB/129) ont été élaborées par le MC Erasmus, Rotterdam, aux Pays-Bas, avec l’appui de l’Action de Coordination européenne Communauté économique européenne pour la recherche en mucoviscidose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
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