Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta nasal potentialskillnaden i möss. Testet kvantifierar funktionen av transmembrana ion transportörer såsom cystisk fibros transmembrane conductance regulator och kanalen epitelial natrium. Det är värdefullt att utvärdera effekten av nya behandlingar för cystisk fibros.
Abstract
Nasal potentiella skillnaden testet har använts i nästan tre decennier för att bistå vid diagnos av cystisk fibros (CF). Det har visat sig vara till hjälp i fall av försvagade, oligo - eller mono-symtomatisk former för CF oftast diagnostiseras senare i livet, och CF-relaterade störningar såsom medfödd bilateral avsaknad av sädesledaren, idiopatisk kronisk pankreatit, allergisk bronkopulmonell aspergillos och bronkiektasi. I både kliniska och prekliniska inställningar, har testet använts som en biomarkör att kvantifiera Svaren till riktade behandlingsstrategier för jfr anpassa testet till en mus är utmanande och kan medföra en associerad dödlighet. Detta dokument beskriver tillräcklig djup anestesi krävs för att upprätthålla en nasal katetern i situ för kontinuerlig perfusion. En lista över åtgärder för att undvika Bronko-aspiration av lösningar perfusion i näsan. Här beskrivs också djurvård i slutet av testet, inklusive administration av en kombination av motgift av bedövningsmedel droger, leder till snabbt vända anestesi med fullständig återhämtning av djuren. Representativa uppgifter som erhållits från en CF och en vildtyp mus visar att testet diskriminerar mellan CF och icke-CF. Sammantaget tillåter protokollet beskrivs här tillförlitliga mätningar av trans-epitelial klorid och natrium transportörer i spontant andning möss, liksom flera tester på samma djur samtidigt minska funktionell status test-relaterade mortalitet.
Introduction
I nästan tre decennier, har elektriska potentiella skillnaden (PD) mätningar använts att utvärdera transmembrana ion transportörer uttryckt på nässlemhinnan, som företrädare för den distala luftvägar1funktionella status. Som en utgångsämnet dynamisk prov2,3, nasal PD tillåter funktionella dissektion av cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) och epitelial natrium kanal (ENaC) aktivitet, lokaliserad både till apikala membranen i epitelceller och utövar kritiska roller i airway surface återfuktning. Stora kliniska tillämpningen av nasal PD testet är att bistå vid diagnos av CF, den vanligaste dödlig genetisk sjukdomen hos kaukasiska populationer med en genomsnittlig incidens av 1 av 2500 levande födda i Europeiska länder. Testet har länge visat sig användbart vid diagnos av försvagat, oligo - eller mono-symtomatisk former för CF oftast diagnostiseras senare i livet, och CF-relaterade störningar såsom medfödd bilateral avsaknad av sädesledaren, idiopatisk kronisk pankreatit, allergisk bronkopulmonell aspergillos och bronkiektasi4. Mer nyligen, clinometric utvärdering av den terapeutiska moduleringen av den grundläggande CFTR defekt5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 har utnyttjat den nasala PD i kliniska prövningar av nya CF terapier. I inställningen för prekliniska har test anpassats till mus17 till möjliggöra undersökning av bioaktiviteten av nya CF mål terapier18,19,20,21. Hos möss är tekniken delikat, baserat på arter-relaterade anatomiska skillnader i storlek i regionen nasal mellan gnagare och människa, och främst på den viktiga rollen som sensoriska input från regionen nasofacial hos gnagare. Det kräver välutbildade och kompetenta operatörer, dedikerad utrustning och förnödenheter.
CF är en multi systemisk sjukdom av exokrina körtlar, som kronisk respiratorisk sjukdom dominerar den kliniska bilden. Sjukdomen orsakas av mutationer i den gen som kodar de cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)-reglerade CFTR klorid kanal22. Hittills har mer än 2.000 CFTR-mutationer varit identifierade23. Den vanligaste mutationen24,25, Funna i nästan 90% av CF-alleler, motsvarar en borttagning av fenylalanin i position 508 i kedjan polypeptid av proteinet (F508del-CFTR). Det CFTR-proteinet är en renodlat ohmsk små konduktans klorid kanal. Det finns också betydande bevis att CFTR reglerar andra transportmekanismer, i synnerhet ENaC26,27. Defekt elektrolyt transport, inklusive minskad CFTR-beroende klorid konduktans och ökad ENaC-beroende natrium konduktans, är ett kännetecken för CF epitel. Den tidigare defekten återspeglas genom en sänkta eller avskaffade repolarisering svar på både en elektrokemisk gradient gynnar klorid efflux och tillägg av isoprenalin (en β-adrenerg receptoragonist som ökar intracellulära cAMP) eller forskolin (en hypofysadenylatecyclase cyclase agonist, inte godkänd för klinisk användning). Den sistnämnda defekten reflekteras av en basal hyperpolarisering av nässlemhinnan (en mer negativ PD) och en ökad respons till amilorid, ett urindrivande läkemedel som blockerar ENaC28.
CF musmodeller har ofta används i CF forskning och har varit ovärderliga i dissekera CF patologi. Minst femton modeller har nuförtiden, varit beskrivs29, varav tre är homozygota för den mest kliniskt relevanta F508del-mutationen30,31,32. En av dessa tre stammar30, utvecklat vid Erasmusuniversitetet i Rotterdam, har använts i nästan 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. De Cftrtm1Eur modell30 har visat sig vara mycket användbart att studera leverfunktiontest patofysiologin av CF sjukdom och att testa effekten av nya terapeutiska strategier18,19,20, 21. Många problem kan uppstå under eller tidigt efter (< 24 h) nasal PD testet hos möss. I detta dokument beskrivs tillräckligt djup anestesi krävs för att hålla en nasal katetern i situ för kontinuerlig perfusion och åtgärder för att undvika Bronko-aspiration av lösningar perfusion i näsan. Djurvård i slutet av testet beskrivs också, inklusive administration av en kombination av motgift av bedövningsmedel droger, leder till snabbt vända anestesi med fullständig återhämtning av djuren. Sammantaget tillåta dessa förfaranden pålitliga mätningar i spontant andning möss, minskade test-relaterad mortalitet och upprepa testet i samma djur. Representativa uppgifter som erhållits från nasal PD testet i en CF och en vildtyp mus visas och diskuteras.
Murina nasal PD testprotokollet rapporteras i tre sessioner: bedömning och hantering före, under och efter provet. I pre-test för bedömning och hantering beskrivs protokollet av beredning av dubbel lumen nasal katetern och lösningar som används för kontinuerlig nasal perfusion i detalj. Under bedömning och hantering av delar av testet, är experimentell installationen och hanteringen av musen minutiöst dissekeras. Slutligen, hantering av djur i slutet av testet beskrivs för att förbättra hela djur återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studier och förfaranden som godkändes av den etiska kommittén för djurförsök av UCL (2017/UCL/MD/015) och i samförstånd med Europeiska gemenskapens regler för användning av djur i forskning (CEE n ° 86/609). Utredarna är kvalificerade för de djurförsök som efter direktiv 2010/63/EU av Europaparlamentet och rådet av den 22 September 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål.
1. testa före bedömning och hantering
- Förbereda dubbel lumen nasal katetern.
Obs: En nasal kateter görs som en dubbel lumen kapillärrör, en lumen som används för kontinuerlig perfusionen av lösningar, och den andra en som en mäta kanal.- Värma upp den centrala delen av en bit, ca 20 cm lång, av polyeten rör (2,0 mm innerdiameter, 3,0 mm yttre diameter; Figur 1 en) i lågan av en gasbrännare tills den är mjuk nog för att dra (10-15 s).
- Dra de två ändarna isär för att få ett mycket tunt kapillärrör av lämplig längd (~ 15 cm) och ytterdiameter (~0.1 mm) för nasal sonden (figur 1b).
- Rengör och avfetta två sådana kapillärer med ren etanol, gå med dem med tejp (figur 1c) och limma ihop dem med cyanoakrylat lim.
- Skär bort överflödig längd av sonderna med ett rakblad eller en skalpell att erhålla en optimal längd av dubbel lumen katetern på ca 8 cm (figur 1d).
- Injicera vatten genom båda lumen att verifiera att de är genomsläppliga.
- Applicera en markering på en 5 mm avstånd från spets.
Obs: Sonden sätts upp till märket in i näsborren, så att alla mätningar görs på samma plats inuti näshålan. - Förvara dubbla lumen katetern i en torr låda.
Obs: Det kan vara begagnade 6 - 10 gånger om lämpligt rengöras omedelbart efter testet.
- Förbereda grädde mix.
- Blanda försiktigt elektrolyt grädde och mättad 3 M KCl lösning i förhållandet 1:1 (volym/volym), undvika bildandet av små luftbubblor.
Obs: Grädde mix används för att bygga de elektrod broarna för mätning och referens Ag/Granulatfyllda elektroder, som illustreras i figur 1.
- Blanda försiktigt elektrolyt grädde och mättad 3 M KCl lösning i förhållandet 1:1 (volym/volym), undvika bildandet av små luftbubblor.
Figur 1 : Sonder med elektroder och broar. Figuren illustrerar polyeten röret före a och efter uppvärmning och dra (b), den tejp som förbinder de två kapillär delarna (c) av de dubbla lumen kateter (d), silikon tub kontakterna (e) och de elektroder (f). För bildskärpa, har kontakterna inte fyllts med grädde mix. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning etikett | Lösning Beskrivning |
| A | Basala buffrad saltlösning |
| B | Klorid-fri buffrad saltlösning |
| C | 10-2 M amilorid stamlösning |
| D | 10-3 M forskolin stamlösning |
Tabell 1: Stamlösning för nasal PD test i möss.
| Salt | mM | Molekylvikt | HB |
| Natriumklorid (NaCl) | 135 | 58.44 | 7,889 |
| Kalciumkloriddihydrat (CaCl2.2H2O) | 2,25 | 147 | 0.331 |
| Magnesium klorid hexahydrat (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 203,3 | 0.244 |
| Dikaliumvätefosfat fosfat (K2HPO4) | 2.4 | 174,2 | 0.418 |
| Monokaliumfosfat fosfat (KH2PO4) | 0,4 | 136,1 | 0,054 |
Tabell 2: Sammansättningen av basala buffrad saltlösning (lager lösning A).
- Bered lösningar.
- Förbereda de fyra lagerföra lösningar som krävs för det experimentella protokollet (tabell 1).
- Förbereda den basala buffrad lösningen (stamlösning A; Tabell 2) och klorid-fri buffrad lösning (stamlösning B; Tabell 3) genom att blanda salterna i rent vatten vid rumstemperatur. Justera pH till 7,4 (utbud 7.0-7,6) med 1 N NaOH för att höja pH, 1 N HCl till lägre pH. Kontrollera osmolaritet lösningen (275 mOsm/L).
- Butik i märkt glasflaskor vid 4 ° C i upp till 3 månader eller frysta i plastflaskor för upp till 6 månader.
- Bered den 10-2 M amilorid (stamlösning C) genom att lägga till 26,6 mg amilorid hydroklorid 10 mL rent vatten. Värm blandningen i 5 till 10 minuter på 70 ° C. Som amilorid är känsliga för ljus, hålla lösning C i en mörk behållare. Märk behållaren och förvaras vid 4 ° C i upp till 3 månader.
- Bered den 10-3 M forskolin (stamlösning D) genom att lägga till 10 mg av forskolin 24.36 mL rent vatten. Etiketten 0,1 mL alikvoter av forskolin stamlösningen och förvaras vid-20 ° C i upp till 6 månader.
- Förbereda de fyra lagerföra lösningar som krävs för det experimentella protokollet (tabell 1).
- Förbereda färska lösningar A1, B1 och B2 (tabell 4).
- Förbereda ny lösning A1 (basal buffrad saltlösning plus 10-4 M amilorid) genom att erhålla 10 mL basala salt lösning (lager lösning A) och att tillsätta 0,1 mL 10-2 M amilorid lösning (stamlösning C). Märk behållaren och använda inom 24 timmar efter beredning.
- Förbereda ny lösning B1 (klorid buffrad lösning plus 10-4 M amilorid) genom att erhålla 10 mL natriumklorid-fri buffrad saltlösning (stamlösning B) och att tillsätta 0,1 mL 10-2 M amilorid lösning (stamlösning C). Märk behållaren och användas inom 24 timmar av förberedelser.
- Förbereda ny lösning B2 (klorid-fri buffrad saltlösning plus 10-4 M amilorid och 10-5 M forskolin) genom att erhålla 10 mL natriumklorid-fri buffrad saltlösning (stamlösning B) och att tillsätta 0,1 mL 10-2 M amilorid lösning (stamlösning C) och 0,1 mL 10-3 M forskolin lösning (stamlösning D). Märk behållaren och använda inom 2 timmar efter beredning.
| Salt | mM | Molekylvikt | HB |
| Natriumglukonat (natriumglutamat salt) | 135 | 218.1 | 29,444 |
| Kalciumglukonat (vattenfritt pulver) | 2.2 | 430,4 | 0.947 |
| Magnesiumsulfat heptahydrat (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 246,5 | 0.296 |
| Dikaliumvätefosfat fosfat (K2HPO4) | 2.4 | 174,2 | 0.418 |
| Monokaliumfosfat fosfat (KH2PO4) | 0,4 | 136,1 | 0,054 |
Tabell 3: Sammansättning av klorid-free buffrad lösning (stamlösning B).
Figur 2 : Ställning av musen under perfusion i nässlemhinnan. Figuren illustrerar värmedyna (a), de voltmeter (b), referenselektroden infogas i det subkutana utrymmet i ett bakben (c), den proximala (d) och distala e avsättningsmöjligheterna av peristaltiska pumpen, den kudde (f), och sängen blad (g). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. bedömning och hantering under provningen
- Förbereda den experimentella setup.
- För att förhindra hypotermi under och efter testet, använda två värmedynor upprätthålls vid fysiologiska temperaturer, en för den mäta setup (18,8 x 37,5 cm. Figur 2 en), och den andra (15,5 x 15,5 cm) för rutan där djuret kommer att placeras för återvinning i slutet av testet.
- Slå på datorn laddad med programvaran för datafångst ansluten till den data minne hög ingångsimpedans (> 1012Ω) och hög upplösning (0,1 mV) voltmeter (figur 2b).
- Anslut elektroderna till voltmetern. Anslut den positiva mätning elektroden till nasal katetern och negativa referenselektroden till katetern insatt i subkutan utrymme i ett bakben, som visas i figur 2c.
- Doppa spetsarna på elektroderna tillsammans i grädde mix. Kontrollera första elektrod förskjutningsvärdet. Avvisa elektroderna om värdet är större än (±) 2 mV (helst 0 mV).
- Slå på den peristaltiska pumpen och infoga pump röret på plats, som illustreras i figur 2.
- Ansluta pumpen röret proximala utlopp till injektionsflaskan med den valda lösningen för nasal perfusion (figur 2d). Ansluta pumpen röret distala utlopp till perfusion lumen av nasal katetern (figur 2e).
- Fyll en lumen av nasal katetern med elektrolyt grädde mix genom en 10 µL pipettspetsen. Anpassa katetern till en silikon tub kontakt (figur 1e), Fyll i kontakten med grädde mix och infoga den positiva elektroden i connector (figur 1f). Kontrollera mätning elektroden bridge förskjutningsvärdet. Avvisa broar om värdet är större än (±) 2 mV (helst 0 mV).
- Fyll andra lumen av nasal katetern med färska lösningen A1. Doppa toppen av nasal katetern i injektionsflaskan som innehåller lösning A. omvända riktningen av den peristaltiska pumpen att fylla en längd av nasal katetern motsvarande 10 s av perfusion.
Obs: Detta tillåter inspelning basala PD värden för 10 s innan du applicerar amilorid. Doppa toppen av nasal katetern i grädde mix släpper kopplingen av referenselektroden (figur 1).
- Börja hantera musen.
- Posten musen vikt att beräkna den exakta dosen bedövningsmedel injiceras av intraperitoneal (ip) väg17.
- 26G (0,45 x 10 mm) Barr, injicera premedicinering intraperitonealt att främja induktion av anestesi: en fast dos av 50 µL av 5 mg/mL midazolam. Vänta 5 min.
- Förbereda den anestetiska mix (fentanyl, Medetomidin, droperidol vid slutliga koncentrationer av 0,05, 0,40 och 20 mg/kg kroppsvikt respektive och klonidin vid fast dos 0,375 µg) möjliggör optimal och stabil djup anestesi (stadium III, plan 2)17 . Injicera volymen av bedövningsmedel mix intraperitonealt och sedan injicera volymen av klonidin.
Obs: Efter 15 min, musen ska somna och anestesi kan pågå i minst 30 min. - Vik ett ark av absorberande vävnad att göra en 3 cm bred 'kudde' (figur 2f) som kommer att täcka den övre delen av värme pad (figur 2en) som ett stöd för mus huvudet.
- Täcka Värmedyna med en plåt av absorberande vävnad ('lakan'; Figur 2 g). lägga musen på ryggen på en värmedyna. Tejpa ut armar och ben och svans (figur 2).
- Infoga referens intravenösa katetern (figur 1g) i subkutan utrymmet i ett bakben. Nålen och anpassa kopplingen silikon tub (figur 1e, 2 c).
- Fyll katetern och kontakten med grädde blanda och infoga den negativa elektroden i connector (figur 1f).
- Fixa katetern och elektroden med tejp som krävs för att förhindra någon förskjutning. Efter placering av referenselektrod och broar, verifiera mätning elektroden bridge förskjutningsvärdet igen genom att doppa spetsen av nasal katetern i elektroden grädde mix släpper kopplingen av IV katetern. Spela in stabil slutliga förskjutningsvärdet (helst mindre än (±) 2 mV).
- Fixa musen öron med ”mild” tejp på värmedyna i ett fritt utrymme mellan två bitar av absorberande vävnad ('kudde' (figur 2f) och 'lakan'; (Figur 2g)). Fixa vibrissae (de styva hårstrån som växer nära näsborrarna) utan att röra ögonen.
- För att absorbera vätska från munhålan, flytta den tungan i sidled (figur 3en) och infoga en spetsiga veke filtrerpapper ('röret'; Figur 3 ( b) ca 1 cm in i munnen. För att absorbera vätska slut perfunderade näsborren, placera en andra pjäs filtrerpapper ('näsduken'; Figur 3 c) hölls på spetsen av näsan.
- Kontrollera en positiv kontrollvärdet av epitelial potential genom att placera spetsen på nasal katetern i kontakt med insidan av munnen.
Obs: Behandlingen bör vara stabil och intervall mellan -10 mV och -20 mV. - Håller det med fina pincett och under bra direkt belysning, försiktigt introducera nasal katetern i ena näsborren upp till 4 - 6 mm från näsan spets.
Obs: Nasal PD katetern ligger i den mellersta nasal concha på den position som ger maximal stabil baslinje PD värde17,20. - 5 min efter injektion av bedövningsmedel droger, luta försiktigt värmedyna ca 30 ° med djura huvudet nedåt. Övervaka maximal basala PD värdet.
- När det är stabil över en period av ca 30 s, start startas nässlemhinnan, med en konstant hastighet av 10 µL / min, med 4 buffrade lösningar (A, A1, B1, B2) i följd. BEGJUTA den första lösningen (steg 1.3.1.1) för 10 s och varje följande lösning (steg 1.4) för 5 min eller tills ett stabilt värde har nåtts. Stoppa startas forskolin (B2) när övergående forskolin svaret börjar gå ner.
- Välj ett 1 s intervall för dataregistrering. Börja registrera data vid tidpunkten för start perfusion. Visa data som en funktion av tiden på datorskärmen.
- Stoppa datafångst i slutet av perfusion med lösning B2. Spara data som en kalkylbladsfil.
- Rätt data genom att subtrahera det slutliga offset-värdet.
Figur 3 : Position med musen på Värmedyna med nasal katetern och filtrerpapper på plats. Figuren illustrerar tungan i sidled (a), i röret (b) och de näsduk (c). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Testa efter bedömning och hantering
- Släpp musen från värmedyna.
- Torka mus näsan med bladet' säng' (figur 2g).
- Injiceras intraperitonealt bedövningsmedel antagonist mix består av en fast dos (4 µg) av naloxon, konkurrenskraftiga morfin antagonist och atipamezol, en Medetomidin specifik antidot (2 mg/kg kroppsvikt).
- Lägg musen på den mindre värmedyna i rutan återhämtning tills fullständig återhämtning, som vanligtvis observeras efter 1 till 2 h.
Obs: UCL laboratoriet, ca 10% dödlighet, främst relaterade till bronchoaspiration av lösningar perfusion i näshålan under testet följs oavsett kön eller genotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera den karakteristiska ion transport avvikelser i CF, utfördes nasal PD mätningar efter det protokoll som beskrivs ovan i en F508del-CF-mus och en vildtyp kontroll av Kandeekane/129 genetiska bakgrunden från Bryssel kolonin CFTRtm1Eur möss30. Denna kliniskt relevant modell, härbärgerat den vanligaste och en av de mest allvarliga F508del-CFTR mutation23,24,25, är bäst tillgängliga CF mus modell30,31, 32.
Representativa nasal PD tracings, erhålls i en 4 - månader gammal kvinnlig mus som är homozygota för F508del-CF-genen och i en och sex-åldersmatchade vildtyp littermate, visas i figur 4. Under de två första etapperna av testet studerade funktionella status för ENaC startas lösningar A och A1, den senare som innehåller amilorid. Funktionella status av CFTR (och alternativa klorid transportörer i avsaknad av forskolin) bedömdes under de två sista faserna i testet, när bidraget från ENaC återstod blockerade av amilorid.
I F508del-CF musen observerades en hyperpolarized utgångsvärde (en mer negativ PDmax jämfört med vildtyp mus värde) tillsammans med en ökad amilorid svar; båda resultaten återspeglar den CFTR-associerade ENaC överaktivitet. Mer konsekvent, en drastiskt minskad repolarisering svar på både en elektrokemisk gradient gynnsamt för klorid efflux och tillägg av forskolin, heter här som totala klorid svar, observerades. Även om omfattningen av forskolin svaret i vildtyp möss är små (-3 mV), i CF, svaret är oftast trubbiga, konsekvent med CFTR förlust-av-funktionen.
Figur 4 -Representativa nasal PD tracings. Representativa nasal PD tracings från en homozygot normal mus (A) och en mus som är homozygota för F508del-CFTR-genen (B), tillsammans med de enskilda värdena för parametrarna nasal PD (C och D). PDmax: maximal stabil utgångsvärde. Amilorid svar: skillnaden mellan värdena för nasal PD i slutet och början av perfusion i nässlemhinnan med basala buffrad saltlösning som innehåller amilorid (lösning A1). Klorid-fria svar: skillnaden mellan värdena för nasal PD i slutet och början av perfusion i nässlemhinnan med klorid-fri buffrade saltlösningen plus amilorid (lösning B1). Forskolin svar: skillnaden mellan värdena för nasal PD i slutet och början av perfusion i nässlemhinnan med klorid-fri buffrade saltlösningen plus forskolin och amilorid (lösning B2). Totala klorid svar: summan av de två sista parametrarna som erhålls under noll-klorid perfusion. Pilarna visar förändringar av lösningar perfusion i näsborren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Motgift av anestetika tillämpades i slutet av tester, därmed minska varaktigheten av den anestesi, som kan vara upp till 45 min utanför testet slutförts. Eftersom återvinning av djuren skedde utan efterverkningar, testades de igen efter ett intervall av sju dagar, när samma protokoll tillämpades. Den samma näsborren undersöktes under båda testerna. Exempel på det andra testet och Parade skillnader av varje enskild nasal PD parameter mellan de två proven visas i figur 5. Som tidigare rapporterats35var mellan-test skillnaderna nära noll, i synnerhet för totala klorid svar, återspeglar den funktionella statusen CFTR-beroende klorid transport, defekt i CF.
Figur 5 -Enskilda värden av nasal PD parametrar. Värden erhölls i ett andra test (t2) utförs i en homozygot normal mus (A) och en mus som är homozygota för F508del-CFTR mutationen (B), tillsammans med Parade skillnaderna mellan andra och första testet (t1) för varje motsvarande parameter. PDmax: maximal stabil utgångsvärde. Amilorid svar: skillnaden mellan värdena för nasal PD i slutet och början av perfusion i nässlemhinnan med den basala buffrad saltlösning som innehåller amilorid (lösning A1). Klorid-fria svar: skillnaden mellan värdena för nasal PD i slutet och början av perfusion i nässlemhinnan med den klorid-fria buffrade saltlösningen plus amilorid (lösning B1). Forskolin svar: skillnaden i värden av nasal PD i slutet och början av perfusion i nässlemhinnan med den klorid-fria buffrade saltlösningen plus forskolin och amilorid (lösning B2). Totala klorid svar: summan av de två sista parametrarna som erhålls under noll-klorid perfusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning etikett | Lösning Beskrivning |
| A1 | Basala buffrad saltlösning (A) plus 10-4 M amilorid |
| B1 | Klorid-fri buffrad saltlösning (B) plus 10-4 M amilorid |
| B2 | Klorid-fri buffrad saltlösning (B) plus 10-4 M amilorid plus 10-5 M forskolin |
Tabell 4: Förteckning över de färska lösningarna för nasal PD test i möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna uppsats är att beskriva ett adekvat protokoll för mätning av nasal PD under kontinuerlig perfusion av lösningar i spontant andning möss för en tidsperiod som krävs för att testa integriteten för ion transportörer, främst CFTR och ENaC. Alla steg i protokollet har noga optimerats för att säkerställa full djur återhämtning och god kvalitet och reproducerbara data. I synnerhet, kritiska steg är anestesi bedömning och hantering och adekvat djur position och hand under och efter provet.
Tidigare studier visade att planet 2 etapp III av bedövningsmedel exponering, vilket kan uppnås genom att tillämpa cocktail blandningen används här17, är associerad med regelbunden andning och avsaknad av negativ inotrop effekt och blink, pupilldeformitet och pedal uttag reflexer. På denna nivå av bedövningsmedel djup, kan nasal katetern hållas i situ för kontinuerlig perfusion i näshålan och för användning som en bro av mätning elektroden med bra tolerans. Införande av katetern i subkutan rymden, tjänstgör som bron av referenselektroden, följdes också, inte av smärtsam reaktion eller tecken på skadliga effekter. Hos gnagare, den viktiga rollen som sinnesintryck från den nasofacial regionen i kontroll av beteende gentemot en yttre situationen, inklusive ett hot, gör tillräcklig djup anestesi särskilt utmanande när du arbetar i näshålan. Nebulisering istället för kontinuerlig nasal perfusion har tillämpats för att utföra nasal PD test i vissa mus studier33,34. Denna metod leder dock till icke-tillförlitliga resultat, på grund av upprepade flyttningar och reinsertions av nasal sonden. Som en sakfråga, på grund av icke-homogen fördelning av celltyper i mus nässlemhinnan20är ompositionering spetsen av sonden på samma plats i näsborren kritisk. Dessutom försvinna svar på förändringar av lösningar, särskilt klorid-fria lösningar, snabbt när perfusion avbryts.
Bronko-aspiration av lösningar leder till andningsstillestånd är en kritisk begränsning av förfarandet och är den största orsaken till dödlighet av testet. Flera viktiga åtgärder syftar till att förhindra det, inklusive en dorsal decubitus position av djuret, lätt luta den med huvudet nedåt och absorbera överflödig vätska från orala och nasala hålrum17. En snabb och vändbar nivå av anestesi med fullständig återhämtning av djur säkerställs genom att tillämpa motgift anestetiska läkemedel i slutet av testet. Det protokoll som presenteras här gör pålitliga mätningar i spontant andas möss och upprepa testet i samma djur. Det påverkar antalet möss som krävs för att få statistisk signifikans35 och som uppfyller till 3R (ersätta, förfina och minska) regler för djur använder i experimentella rutiner36. I människor som möss, har lägsta mellan-test variabiliteten hittats för totala klorid svar, tyder på att det som den mest tillförlitliga nasal PD parametern att upptäcka effekten av nya CF terapeutiska strategier. I CF möss visade Mätfelet av totala klorid svar sig vara mindre än ±1.7 mV35. Med andra ord, när utvärdera bioaktiviteten av en CFTR-korrigera drug i F508del-CF möss, en skillnad mellan totalt klorid svar i frånvaro och närvaro av behandling större än 2 mV anger 95% chans att en narkotikarelaterade förbättrande effekt.
Tolkning av data av representativa tracings illustrerar nasal PD testet förmåga att diskriminera mellan CF och vildtyps-möss18,19,20,21,35 och visar att F508del-CF Erasmus mus modell30 härmar mänskliga nässlemhinnan med avseende på de typiska kliniska ion transport avvikelserna. Men i en djurmodell är en kvarstående klorid konduktans detekterbar, till följd av antingen en kvarstående F508del-CFTR-funktion eller ett bidrag av alternativa icke-CFTR-beroende kloridjonkanaler. Att översätta resultaten från CF forskning från prekliniska in kliniska inställningar innebär att hantera flera stora skillnader mellan de två inställningarna. Mus CF fenotypen visar ett försvagat luftvägsinfektion. Avsaknad av flera behandlingar tillsammans med det faktum att musmodell är inrymt i privilegierat villkorar med hygienisk hinder också bidra till de skillnader37. Protokollet beskrivs här visar en mycket låg variabilitet35 och det har anpassats till gris38,39 och vesslan modeller40. I en tidigare studie ändrades experimentell protokollet av inklusive perfusion i nässlemhinnan mus med en hämmare av alternativa klorid transportörer, att utforska det möjliga bidraget av icke-CFTR-beroende kalcium-aktiverat klorid kanaler18. Testet har också använts för att studera natrium transport i de β-ENaC overexpressing mus modell41, konstruerad för att efterlikna CF-lung sjukdom42. I framtiden ytterligare tillämpningar av testet kunde övervägas att studera andra transportörer, som ATP12A, en CFTR-oberoende H+-pump protein uttryckt i mänskliga och gris men frånvarande i mus airways43. Sammantaget kan protokollet beskrivs här pålitliga mätningar av transepithelial funktionella status klorid och natrium transportörer i möss, minskade test-relaterad mortalitet och flera tester på samma djur som andas spontant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Prof. J. Lebacq för kritiskt redigering manuskriptet. CFTRtm1Eur (homozygot F508del-CFTR (Kandeekane/129) möss har utvecklats av den Erasmus MC, Rotterdam, Nederländerna, med stöd av Europeiska ekonomiska gemenskapen Europeiska samordning åtgärder för forskning om cystisk fibros EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
References
- Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
- Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
- Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
- Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
- Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
- Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
- Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
- Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
- Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
- Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
- Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
- De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
- Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
- Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
- Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
- Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
- Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
- Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
- Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
- Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
- Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
- Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
- Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
- Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
- Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
- Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
- Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
- Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
- Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
- Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
- Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
