Summary
在这里, 我们提出了一个通过全血流式细胞仪表征单核细胞子集的协议。这包括概述如何门的子集和评估他们的表面标记的表达, 并提供了一个例子, 评估 M1 (炎症) 和 M2 标记 (抗炎) 的表达。
Abstract
单核细胞是各种炎症障碍的关键贡献者, 对这些体细胞的改变, 包括它们的子集比例和功能, 都可能具有病理意义。一种检测单核细胞改变的理想方法是全血流式细胞仪, 因为这种方法对样品的最小处理限制了界定细胞活化。然而, 许多不同的方法被采取的门单核细胞子集导致不一致的识别的子集之间的研究。在这里, 我们演示了一种使用全血流式细胞仪来识别和表征人单核细胞子集 (经典、中级和非经典) 的方法。我们概述如何准备血液样本的流式细胞术, 门的子集 (确保污染细胞已被删除), 并确定表面标记的单核细胞子集表达式-在本例 M1 和 M2 标记。此协议可扩展到其他需要标准门控方法来评估单核细胞子集比例和其他功能标记的单核细胞子集表达的研究。
Introduction
单核细胞是一种白细胞, 在促进和解决炎症方面起着重要作用。有三个主要子集的单核细胞识别, 古典 (~ 85%), 中间 (~ 5%), 和非经典 (~ 10%) 单核细胞, 其特点是其分化水平 (CD) 14 和 CD16 表达式1。单核细胞子集的比例可能与疾病的存在不同, 例如在各种炎症状态的中间体的比例增加2,3包括心血管疾病, 其中中间体的水平是与临床事件相关联4,5。此外, 在疾病情况下, 单核细胞也可以进行功能性的改变, 在表面标记表达式6、7的差异中可检测到许多变化。其中一个例子是单核细胞 M1-skewing, 与 M1 巨噬细胞相关的标记增加, 在心血管疾病、糖尿病、肥胖和代谢综合征中已经观察到7、8、9,10。
尽管流式细胞仪对单核细胞子集比例和功能的评估很受欢迎, 但在样本制备和研究之间的子集对照方面存在相当大的差异, 因此很难比较这些研究之间的结果。重要的是, 在单核细胞子集的标定方面没有共识, 但鉴于几种疾病的子集比例变化的临床意义, 标准化方法是必不可少的。在门控困难的一部分产生的事实, 单核细胞从古典通过中间到非经典子集11 , 因此, 单核细胞存在作为连续频谱而不是不同的种群12.有趣的是, Zawada et等显示了使用中间子集的矩形或梯形门控, 两者都导致了较高的中间子集, 预测心血管终点13。这突出表明, 至少对于计算比例而言, 关键问题是在不同的样本 (和研究) 之间应用一致的门控策略, 而不是试图明确区分子集。虽然在评估函数时, 确定性的门控可能更为重要, 但子集之间的标记表达式的变化是增量12、14, 因此, 在门控中的一致性可能是关键。因此, 需要在不同样本之间可重复摊派单核细胞子集的客观门控方法。本文所提出的方法的目的是通过对所采用的门控技术进行明确的解释和论证, 并评估表面标记表达的子集, 从而提供一种方法, 使研究人员能够在评估不同样品时对使用这种技术有信心。
Protocol
这项研究已获得 WSLHD 人类研究伦理委员会 (HREC) (批准 AU 红 HREC/15/WMEAD/289) 的批准。
1. 全血流式细胞仪的样品制备
注: 由于人体血液具有潜在传染性, 因此应在生物危害防护罩中进行样品设置。
- 收集血液样本从参与者到3毫升乙烯二胺利乐乙酸 (EDTA) 管。
- 使用血液分析仪或血细胞计数器测定白血球 (WBC) 计数。
- 稀释与磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (pH 值 ~ 7.4) 调整浓度为 ~ 5 x 106白细胞/毫升。
- 结合16x 体积50µL 血液、0.75 µL 抗 CD14-V450、0.5 µL 抗 CD16-APC 和0.625 µL 抗 HLA-DR-PerCP, 为管数 (例如, 14 管, 准备16x 主混音) 准备足够的主混合物。涡旋和移液器51.9 µL 混合到每个管 (表 1)。
注: 抗体应滴定, 以确定所用荧光抗体的最佳染色浓度。 - 添加表面标记 (M1 和 M2 或同种型控制, 藻红蛋白 (PE) 标记的) 抗体 (如每表 2) 和 PE 标记的 T 细胞 (CD3), B 细胞 (CD19), 嗜中性粒细胞 (CD66b) 和自然杀手 (NK) 单元格 (CD56) (表 3)。漩涡和孵育30分钟, 在黑暗中4摄氏度。
注: 淋巴细胞、中性粒细胞和 NK 单元的标记仅包含在门控方法的验证中。 - 添加250µL 联合红细胞裂解/白细胞固定液, 立即轻轻涡旋, 在4摄氏度的黑暗中孵育10分钟。
- 在室温下, 在 260 x g处添加250µL PBS 和离心细胞, 10 分钟。
- 除去上清液, 在300µL 1% 甲醛中重新悬浮细胞。
注意: 甲醛是有毒的。使用丁腈橡胶手套, 并在烟雾罩中使用。 - 在4摄氏度下存储, 直到进行分析。
注: 建议在样品制备48小时内进行流量分析。
2. 流式细胞术
- 检查流式细胞仪日志, 确保设备员工进行质量控制检查。
注意: 为了确保分析、仪器质量控制和使用控制珠保持一致的目标荧光强度, 建议一致性。 - 建立流式细胞术实验, 点击 "新实验" 新标本 "和" 新管 "添加管。单击图标并使用下拉菜单选择坐标轴参数, 选择双变量图。确保包含 CD16/CD14 图和显示探测器的图, 同时监视采集。
- 插入管, 然后点击 "获取"。检查仪器电压设置, 确保检测信号不处于关闭范围。
- 观察在 CD14/CD16 图的单核细胞门中下落的像元。将录制阈值设置为经典单核细胞门的5000事件, 然后单击 "记录"。
- 继续记录剩余管的数据。记录所有管的数据后, 将流数据导出为. fcs 文件以供分析。
注意: 为了确保准确性, 应记录单色补偿控制。补偿矩阵可在分析前计算并应用于数据, 以说明频谱溢出超过15、16。
3. 单核细胞门控
- 在分析软件中打开文件。双击管名称, 然后从下拉菜单中选择参数, 以可视化正向散射区域 fsc (a)/正向散射高度 fsc (H) 图解中的单元格。通过单击多边形门工具图标并将单元格括在 (图 1A) 中, 创建双峰排除门。
- 选择门控单元格 (通过双击门控区域), 在新显示框中调整下拉菜单参数以显示 FSC (a)/侧散射 SSC (a) 图中的单元格。单击矩形门图标, 慷慨选择基于正向和侧散射属性的单核细胞种群, 以排除大多数淋巴细胞、NK 细胞和粒粒 (图 1B)。
- 选择封闭单元格并在 CD14/CD16 图上重新显示, 使用下拉菜单选择参数。单击多边形门, 根据其特征 "┐" 形状选择单核细胞 (图 1C)。
- 通过使用下拉菜单选择参数, 选择封闭单元格并在 CD16/HLA-DR 图上显示单核细胞。单击多边形门以选择 HLA-DR 阳性细胞, 并排除任何剩余的 NK 细胞和中性粒细胞17 (图 1D)。
- 选择封闭单元格, 并使用下拉菜单选择参数, 在 CD14/HLA-DR 图上显示 HLA DR 阳性单元格。单击多边形门并绘制一个门以排除 hla-dr high/CD14 低细胞 (B 细胞表示 hla-dr, 但不是 CD14) (图 1E)。
注意: B 细胞污染可能发生, 因此应进行调查。如果图 1C中的非经典种群与其左侧的单元格不同, 则可能会产生污染。如果 B 细胞与非经典单核细胞不重叠, 可以跳过步骤3.5。 - 选择封闭单元格并使用下拉菜单在 CD16/CD14 图上显示它们。从图解选项中选择 "斑马图", 这将使单核细胞子集门被绘制来确定子集比例 (图 1F)。
注意: 如果在分析软件中无法使用斑马图, 则伪色 (平滑) 或等值线图解可能适合。 - 单击矩形门图标, 然后通过在 CD14 high/CD16 低、经典单核细胞种群周围绘制近似矩形门来选择经典单核细胞。在 "显示" 下选择 "显示中位数" 以显示经典单核细胞的中位荧光强度。调整浇口, 使种群的平均分布从左侧和右侧的中位数到左侧的所有单元格。
- 通过绘制包含经典门右侧单元格的矩形门来选择中间种群。调整栅极底部以排除非经典单元格, 方法是将栅极与完全位于经典单核细胞门内的同心圆底部对齐, 确保中间子集具有与 CD14 表达式相当的主要的古典种群符合当前的命名。
- 通过从中间子集的下边缘绘制一个矩形框来浇出非经典子集, 选择填充到底部的所有单元格 (图 1F)。
- 在 "显示" 下选择 "显示栅极频率" 以确定每个单核细胞子集的百分比。
4. 门控方法的验证
- 要确定潜在的污染细胞类型是否有效地被封闭, 首先要确定不同的细胞种群与 T 细胞 (CD3)、B 细胞 (CD19)、中性粒细胞 (CD66b) 和 NK 细胞 (CD56) 的抗体 (图 2)。
注意: 此处 T 细胞和中性粒细胞不靠近单核细胞的 "┐" 形状, 并在图 1C中被封闭。 - 确认在步骤 3.4 (图 1D) 中移除 NK 细胞, 并在步骤 3.5 (图 1E) 中删除 B 单元格, 如图 3所示。如果 NK 细胞或 B 细胞没有被封闭, 重新调整门。
5. 表型单核细胞标记表达
- 从每个单核细胞子集中选择单元格。更改下拉参数以创建每个单核细胞子集 (图 1F) 的直方图, 显示每个标记及其匹配的同种型 (图 4)。
- 计算每个标记 (中值或几何平均值) 的表达式的程度与相应的同种型控件相对应。
Representative Results
这里使用的单核细胞门控策略和流式细胞术分析 (图 1) 成功地封闭了单核细胞子集并揭示了它们的相对比例。此样本的比例计算为88.1% 经典、4.33% 中间体和7.49% 非经典。这些子集门没有被 B 细胞、T 细胞、中性粒细胞或 NK 细胞污染, 它们分别用标记 CD19、CD3、CD56 和 CD66b 进行了确认。通过评估其他种群的相对位置, 很明显, T 细胞和中性粒细胞在 CD16/CD14 图 (图 2A和2D) 的单核细胞 "┐" 形状之外很好地下降。然而, NK 细胞和 B 细胞种群与非经典单核细胞种群重叠 (图 2B和2C)。确定了门控策略 (图 1D和1E) 的步骤, 排除了 NK 细胞 (图 3A) 和 B 细胞 (图 3B)。虽然 B 细胞的数量包括非经典单核细胞的一小部分, 但数量微不足道。
对子集进行了门控后, 评估了不同表面标记、M1 (CD64、CD86 和 CD120b) 和 M2 (CD163、CD11b 和 CD93) 的表达程度。与相应的同种型控件相比, 标记显示为正表达式, 如直方图的移位 (图 4) 所示。标记的中位数大于同种型控件的中值。
将此门控策略应用于血液样本, 分离成四管, 分别染色和分析, 可在试管 (表 4) 之间产生比较结果。
图 1: 全人体血液中的代表性单核细胞门控策略.(a) fsc (a) vs. fsc (H) 图: 对具有相同面积和高度的细胞进行浇口, 从而去除团簇 (相对于 fsc (H)) 和碎屑 (非常低的 fsc) K = 1000。(B) FSC (a) vs. ssc (a) 图解: 根据其 SSC/FSC 性质, 广泛选择单核细胞。(C) CD16 vs. CD14 图: 根据其特征 "┐" 形状选择单核细胞的门控。(D) CD16 vs. hla-dr 图解: 门控选择 HLA-dr 阳性细胞和去除 NK 细胞。(E) CD14 vs. HLA-DR: 门控从单核细胞中排除 B 细胞 (HLA-high/CD14 博士低)。(F) 选定的单核细胞重新显示 CD16 vs. CD14 图, 以门核细胞子集。对于 f-颜色表示细胞密度与蓝色和绿色表示低密度, 红色和橙色表示高密度, 橙色表示中距离密度。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 通过识别可能污染的细胞来验证门控策略.潜在的污染细胞由标记物 (A) T 细胞 (CD3)、(b) b 细胞 (CD19)、(C) NK 细胞 (CD56) 和 (D) 中性粒细胞 (CD66b) 确定。左侧面板根据图 1A和1B的不同, 显示每个种群的识别, 颜色代表从高 (红色) 到低 (蓝色) 的细胞密度。右侧面板显示在最终单核细胞 CD16/CD14 图上叠加的每个细胞种群 (蓝色), 以揭示这些种群与单核细胞 (red) 的距离。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 确认浇道步骤去除污染细胞.热图显示从高 (红色) 到低 (蓝色) (A) CD56 和 (B) CD19 的表达式的程度。门控步骤成功地排除了高 CD56 (NK 细胞) 和高 CD19 (B 细胞) 的细胞。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: M1 (CD120b) 和 M2 (CD93) 标记的单核细胞表达.单核细胞 M1 和 M2 标记表达式的平滑直方图 (蓝色) 显示从同种型 (红色) 到 (A) 经典、(B) 中间体和 (C) 非经典的明显移位。请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 抗体 | 容积 (50 µL 血) | 容积 (16x) 800 µL 血 |
| CD14-V450 | 0.75 µL | 12µL |
| CD16-APC | 0.5 µL | 8µL |
| HLA-PerCP 博士 | 0.625 µL | 10µL |
表 1: 全血流和主混合的抗体。
| 管 | PE 抗体 | 代码 | 同种型匹配 | 库存浓度 | 工作容积 |
| 1 | IgG1 | BD (555749) | 那 | 1.0 µg/20 µL | 0.625 µL |
| 2 | CD163 | BD (556018) | BD IgG1 | 0.125 µg/20 µL | 5µL |
| 3 | CD64 | BD (558592) | BD IgG1 | 0.06 µg/20µL | 10µL |
| 4 | IgG1 | BD (555749) | 那 | 1.0 µg/20 µL | 1.25 µL |
| 5 | CD86 | BD (555658) | BD IgG1 | 1.0 µg/20 µL | 1.25 µL |
| 6 | CD11b | BD (561001) | BD IgG1 | 1.0 µg/20 µL | 1.25 µL |
| 7 | IgG2a | 研究 & 开发 (IC003P) | 那 | 25µg/毫升 | 5µL |
| 8 | CD120b (TNFRII) | 研究 & 开发 (FAB226P) | 研究 & 开发 IgG2a | 25µg/毫升 | 5µL |
| 9 | IgG1 | BL (400112) | 那 | 0.2 毫克/毫升 | 2.5 µL |
| 10 | CD93 | BL (336108) | BL IgG1 | 50µg/毫升 | 1.25 µL |
表 2: M1/M2-PE 荧光染料标记为全血流的单克隆抗体。
| 管 | 抗体 | 工作容积 |
| 11 | CD3 | 5µL |
| 12 | CD19 | 5µL |
| 13 | CD66b | 1.25 µL |
| 14 | CD56 | 5µL |
表 3: PE 荧光染料标记为淋巴细胞的单克隆抗体 (T 细胞, B 细胞), 中性粒细胞和 NK。
| 管 | % 古典 | % 中级 | % 非经典 |
| 1 | 84。3 | 5.11 | 10。1 |
| 2 | 84。2 | 5.05 | 10。5 |
| 3 | 84。3 | 5.03 | 10。7 |
| 4 | 81。6 | 5.03 | 12。1 |
表 4: 单核细胞子集比例从一个血液样本染色和单独分析。
Discussion
全血流式细胞术是研究单核细胞的理想方法, 因为在接近其生理微环境的条件下, 对其在感染和炎症条件下的作用进行检查。此外, 使用新鲜的 (即未处理的) 血液样本可最大限度地减少因储存或处理18、19等已知发生的那些因冷冻解冻单核细胞而出现的改变或细胞转换。20. 如果样品在室温处理19之前保持在室温下, 建议使用提示样品制备, 因为有些标记是上调的。滴定法测定了 M1 和 M2 标记物的最佳浓度, 并对任何新的抗体进行了限制非特异性结合的方法, 同时保证了转移的程度是由于抗原表达而不受抗体缺乏的限制。通过裂解液去除红细胞和白细胞的固定是本议定书的一个重要步骤, 因为红细胞的存在会干扰流式细胞术21,22。请注意, 虽然某些裂解溶液与无洗涤染色兼容, 但在使用洗涤步骤时, 我们的手部会明显显示出更清晰的种群。
在比较单核细胞标记的表达时, 正确设置流式分析仪也是至关重要的。我们建议研究人员保持控制珠的一致目标荧光强度, 并对仪器进行质量控制, 以在不同的时间运行不同的样品以提供一致的结果。此外, 同种型控制用于帮助解释非特异抗体结合产生的任何非特定背景信号。单核细胞具有高水平的 Fc 受体11 , 因此容易产生非特定的束缚。注意, 不同子集的非特定绑定级别不同, 因此在比较子集之间的标记表达式时, 使用同种型控件变得非常重要。
要考虑的另一个重要标准是采用的门控步骤。一些研究表明, 在 FSC (a)/SSC (a) 图中为消除大多数非单核细胞 CD16 阳性细胞23、24、25, 在单核细胞种群周围绘制一个紧密的门是至关重要的, 但这可能会导致一些单核细胞在 FSC/SSC 图26中可与单核干细胞重叠。相反, 要排除可能污染单核细胞的任何其他血细胞, 除了 CD14 和 CD16 之外, 包含第三个单核细胞标记是必不可少的26,27。因此, HLA-DR 经常被使用, 是理想的, 因为它不是由 NK 细胞或中性粒细胞17,28表示。虽然淋巴细胞 (B 细胞和 T 细胞) 可以表达 HLA-DR, 它们不同于单核细胞在 CD14 表达。虽然 HLA-DR 是一个理想的第三个标记, CD86 也被推荐5,27,29 , 但没有在这里使用, 因为它也是一个 M1 标记, 因此它的表达程度在单核细胞子集被评估。
对所使用的门控策略的验证至关重要。虽然 NK 细胞是已知的与非经典重叠, 如果他们不封闭28, 我们注意到 B 细胞也可以与非经典重叠 (图 2B);在其他研究中, 这种情况是否可能取决于荧光染料的选择、仪器配置、检测灵敏度, 甚至是正在检查的疾病状况。在这里, 重叠的 B 细胞显示了 hla-dr 的高表达, 并没有通过选择的 hla-dr 阳性细胞在图 1D中被封闭。相反, 要移除 b 细胞, 我们使用了一个额外的 CD14/HLA-dr, 其中 B 细胞分离出非经典由于其更高的 HLA-DR 和低 CD14 表达式。
还有许多不同的方式, 在其中的单核细胞本身的门被画在文学;这些包括象限 (子集由象限标记分隔) 和矩形或梯形框13 (每个子集绘制单独的框), 在放置一个子集结束和另一个开始时, 它们的位置也不同。这些差异可能反映了一个事实, 即单核细胞存在作为一个连续的单元格, 区分从古典到非经典, 而不是明显不同的种群。但是, 由于识别子集本身的技术的变化会导致计算的单核细胞子集比例的差异, 所以门控方法是合理客观的, 而不是主观的, 这就变得非常重要, 因为这将使方法更加健壮和重现性。一些研究使用同种型控制 CD16 来确定经典和中间子集30之间的边界。另一方面, 为确定中间体与非经典之间的分离, 提出了切断线可以是垂直或倾斜的, 并选择了调查人员, 其条件应是可重现的, 但矩形门建议促进研究13、30、31之间的比较。在这里, 通过绘制斑马图上的数据并应用客观的视觉规则获得了更高的客观性, 因为斑马图通过在传统的等高线图上混合颜色梯度到每个相等的概率 bin, 提供了额外的可视化提示。绘制了经典子集的右边框, 使种群平均分布在人口中位数中。中间体和非经典之间的划分也通过使中间体的基础与经典种群内同心圆的底部对齐而标准化 (即,中间种群清楚地表示高水平的 CD14, 根据标准命名1)。
虽然一些研究建议使用额外的标记物, 如 c-c 型趋化因子受体类型 2 (CCR2) 或 6-磺基 LacNAc (SLAN), 以获得单核细胞的成功计数, 并揭示其临床意义32,33, 在我们手中, 许多单核细胞功能标记的表达水平在个体之间有很大的差异14。这种变化可能会限制这些标记的用处, 以根据它们的表达式来定义子集。自动计算方法也用于可视化和聚类单核细胞子集, 包括视觉交互式随机邻域嵌入 (viSNE)、t-分布随机邻域嵌入 (tSNE) 或生成树级数密度规范化事件 (铁锹)34、35的分析, 它可以根据所使用的多个标记集提供单元的可视化表示。虽然这已被证明提高了单核细胞子集分类中的门控策略的准确性, 但它被认为是一个缺点是抗体 (和相应的荧光通道) 的数量需要。它的用处将取决于所问的问题;例如, 在枚举算例中, 可能不需要额外的复杂性。
单核细胞门控与我们的技术显示比例符合文献和三个子集的表面标记的表达可以很容易地确定。总的来说, 这里解释的技术和方法提供了一种标准化和直接的方法来枚举单核细胞子集的比例和评估表面标记表达, 这可以扩展到包括其他标记, 从而在各种其他条件下验证其功能角色。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
流式细胞术是在流式细胞仪核心设施中进行的, 该中心由韦斯特米德医学研究所、韦斯特米德研究中心、新南威尔士癌症研究所和国家卫生和医学研究理事会支持。本研究得到临床化学研究和教育基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
| BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 mL | Becton Dickinson | 7128959 | |
| Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
| 5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 mm x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
| V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
| APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
| Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
| PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
| PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
| PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
| PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
| PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
| PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
| PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
| PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
| PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
| PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
| PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
| PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
| OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
| Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
| Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
| Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |
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