Summary
نقدم هنا بروتوكولا لوصف مجموعات فرعية الوحيدات بقياس تدفق الدم كله. وهذا يتضمن الخطوط العريضة لكيفية بوابة المجموعات وتقييم التعبير عنها من علامات السطحية وإعطاء مثال لتقييم تعبير M1 (التهاب) وعلامات M2 (الالتهابات).
Abstract
وحيدات مساهم رئيسي في مختلف الاضطرابات التحريضية والتعديلات لهذه الخلايا، بما في ذلك بإبعاد فرعية ووظائفهم، يمكن أن يكون أهمية المرضية. طريقة مثالية لدراسة التعديلات إلى وحيدات بقياس تدفق الدم كله التعامل مع الحد الأدنى من عينات من هذا الأسلوب يحد تنشيط خلية أرتيفاكتوال. ومع ذلك، تتخذ العديد من مختلف النهج لبوابة المجموعات الوحيدات مما يؤدي إلى تحديد المجموعات غير متناسقة بين الدراسات. هنا نظهر أسلوب استخدام الدم كله التدفق الخلوي لتحديد وتوصيف المجموعات البشرية الوحيدات (الكلاسيكية، والمتوسطة، وغير الكلاسيكية). أننا مخطط كيفية تحضير عينات الدم للتدفق الخلوي وبوابة مجموعات فرعية (ضمان تم إزالة تلويث الخلايا) وتحديد التعبير فرعية الوحيدات من علامات سطح — في هذا المثال M1 و M2 علامات. ويمكن تمديد هذا البروتوكول إلى غيرها من الدراسات التي تتطلب أسلوباً النابضة قياسية لتقييم أبعاد فرعية الوحيدات والوحيدات فرعية التعبير عن علامات وظيفية أخرى.
Introduction
وحيدات هي نوع من خلايا الدم البيضاء التي تلعب دوراً رئيسيا في تعزيز وحل التهاب. وهناك ثلاث مجموعات فرعية رئيسية وحيدات معترف بها والكلاسيكية (~ 85%)، والمتوسطة (~ 5 ٪) وغير الكلاسيكية (~ 10%) وحيدات، التي تتميز بمستوى الكتلة التمايز (CD) 14 و التعبير CD161. يمكن أن تختلف نسب الوحيدات مجموعات فرعية مع وجود المرض، مثل نسبة متزايدة من المواد الوسيطة في الولايات الملتهبة مختلف2،3 بما في ذلك أمراض القلب والشرايين، حيث يكون مستوى المواد الوسيطة المرتبطة بأحداث السريرية4،5. وعلاوة على ذلك، في ظروف المرض، يمكن الخضوع وحيدات أيضا تغييرات وظيفية، مع تغييرات كثيرة يمكن كشفها بواسطة فرق في علامة سطح التعبير6،7. واحد هذه الأمثلة هو الوحيدات M1-انحراف، زيادة في العلامات المقترنة بالضامة M1، التي لوحظت في أمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري والسمنة والمتلازمة الأيضية7،،من89 , 10.
وعلى الرغم من الشعبية من التدفق الخلوي لتقييم نسبة فرعية الوحيدات والدالة، هناك تقلب كبير في إعداد العينة وفرعية النابضة بين الدراسات مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج بين هذه الدراسات. الأهم من ذلك، لا يوجد توافق في ترسيم الوحيدات مجموعات فرعية، ولكن نهج موحد أمر ضروري نظراً لأهمية السريرية للتغيرات في نسب فرعية في العديد من الأمراض. جزء من الصعوبة في النابضة ينبع من حقيقة أن وحيدات تفرق من الكلاسيكية من خلال الوسيطة إلى فرعية غير الكلاسيكية11 وعلى هذا النحو، وحيدات موجودة طيف مستمر بدلاً من السكان متميزة12 . من المثير للاهتمام، أظهر زاوادا et al. أن استخدام أما مستطيل أو شبه منحرف النابضة لمجموعة فرعية متوسطة، سواء أدت إلى مجموعة فرعية متوسطة أعلى توقع13نقطة نهاية القلب والأوعية الدموية. وهذا يبرز، على الأقل لحساب النسب، المسألة الرئيسية هو تطبيق استراتيجية النابضة متسقة بين العينات المختلفة (ودراسات)، بدلاً من محاولة نهائية تميز بين مجموعات فرعية. بينما النابضة نهائي قد يكون أكثر أهمية عند تقييم الدالة، هو التغيير في التعبير علامة بين المجموعات الفرعية الإضافية12،14، وبالتالي مرة أخرى، الاتساق في النابضة ربما الرئيسية. على هذا النحو، هناك حاجة موضوعية النابضة الأسلوب وينشيء تكاثر المجموعات الوحيدات بين العينات المختلفة. وغرض الطريقة المعروضة هنا بوابة فرعية الوحيدات مع تفسير واضح ومبررات تقنية النابضة المستخدمة وتقييم المجموعات للتعبير علامة السطحية، موفراً بذلك أسلوب الذي يسمح للباحثين أن يكون الثقة في استخدام هذا الأسلوب عند تقييم عينات مختلفة.
Protocol
هذه الدراسة قد أقرتها لجنة "أخلاقيات البحوث البشرية وسلهد" (حريك) (موافقة الاتحاد الأفريقي الأحمر حريك/15/وميد/289).
1-إعداد عينة لقياس تدفق الدم كله
ملاحظة: كما يحتمل أن تكون معدية الدم البشري، ينبغي إجراء إنشاء عينة في غطاء واقية.
- جمع عينات الدم من المشاركين إلى 3 مل الإثيلين diamine تترا أنابيب حمض الخليك (يدتا).
- تحديد عدد خلايا الدم البيضاء (WBC) باستخدام محلل الدم أو هيموسيتوميتير.
- مخفف مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (الرقم الهيدروجيني ~ 7.4) لضبط التركيز ~ 5 × 106 مليلتر مكافحة حرائق آبار النفط.
- إعداد مزيج الرئيسي كافية لعدد الأنابيب (مثلاً، لأنابيب 14، إعداد 16 x ميكس الرئيسي) عن طريق الجمع بين 16 × وحدات تخزين 50 ميليلتر الدم، ميليلتر 0.75 المضادة CD14-V450، 0.5 ميليلتر لمكافحة CD16-آسيا والمحيط الهادئ، وميليلتر 0.625 المضادة لهلا-الدكتور-بيركب. دوامة وماصة 51.9 ميليلتر من المزيج في كل أنبوبة (الجدول 1).
ملاحظة: يجب أن تيتراتيد الأجسام المضادة لتحديد تركيزات المصبوغة الأمثل لأجسام مضيئة المستخدمة. - إضافة علامة السطحية (مراقبة M1 و M2 أو ايستب، فيكوريثرين (PE) المسمى) الأجسام المضادة (على سبيل المثال وفقا الجدول 2) وبي المسمى علامات لخلايا تي (CD3)، والخلايا ب (CD19)، العَدلات (CD66b)، وخلايا القاتل الطبيعي (ناغورني كاراباخ) (CD56) (الجدول 3). دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة، 4 درجة مئوية في الظلام.
ملاحظة: يتم تضمين فقط للتحقق الأسلوب النابضة علامات للخلايا الليمفاوية، العَدلات، وخلايا ناغورني-كاراباخ. - إضافة 250 ميليلتر من الجمع بين خلايا الدم الحمراء تحلل/مكافحة حرائق آبار النفط تحديد الحل، دوامة بلطف على الفور، واحتضان لمدة 10 دقائق في الظلام في 4 درجات مئوية.
- إضافة 250 ميليلتر من خلايا برنامج تلفزيوني وزيادة ونقصان لأسفل في 260 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المادة طافية، وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميليلتر من 1% فورمالدهايد.
ملاحظة: فورمالدهايد السامة. استخدم قفازات النتريل واستخدم في غطاء الدخان. - تخزين في 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى يتم إجراء التحليل.
ملاحظة: يوصي بإجراء تحليل تدفق ينبغي القيام به خلال 48 ساعة إعداد عينة.
2-التدفق الخلوي
- تحقق تدفق cytometer سجل لضمان الموظفين مرفق قد أدوا الشيكات مراقبة الجودة.
ملاحظة: لضمان الاتساق بين التحليلات وأداة مراقبة الجودة والحفاظ على متسقة ينصح الهدف fluorescence كثافات استخدام الخرز التحكم. - لإعداد تجربة التدفق الخلوي، انقر على "التجربة الجديدة" نموذج جديد "ثم" أنابيب جديدة "لإضافة أنابيب. حدد المتغيرين المؤامرات بالنقر على الأيقونة واستخدم القوائم المنسدلة لتحديد معلمات المحور. كفالة إدراج CD16/CD14 مؤامرة ومؤامرة عرض جهاز كشف جنبا إلى جنب مع الوقت لرصد حيازة.
- إدراج أنبوب وانقر فوق "الحصول على". تحقق من إعدادات الجهد صك ضمان أن إشارات كاشف لا خارج النطاق.
- مراقبة الخلايا التي تقع في بوابة الوحيدات وارسم CD14/CD16. تعيين عتبة تسجيل الأحداث 5,000 لبوابة الوحيدات الكلاسيكية وانقر على "سجل".
- مواصلة لتسجيل البيانات لأنابيب المتبقية. بعد تم تسجيل البيانات لجميع الأنابيب، تصدير بيانات التدفق كملفات.fcs للتحليل.
ملاحظة: لضمان الدقة، ينبغي تسجيل عناصر تحكم تعويض لون واحد. ويمكن حساب مصفوفة تعويض وتطبيقه على البيانات قبل تحليلها لمراعاة انسكاب الطيفية على مدى15،16.
3-الوحيدات النابضة
- الملفات المفتوحة في برنامج التحليل. انقر نقراً مزدوجاً فوق اسم الأنبوب وحدد المعلمات من القوائم المنسدلة تصور الخلايا في منطقة مبعثر إلى الأمام "منتدى التعاون الأمني" (أ)/الأمام مبعثر الارتفاع FSC(H) الأرض. إنشاء بوابة إقصاء يبنوا بالنقر على أيقونة أداة المضلع البوابة وأرفق بها الخلايا كما هو الحال في (الشكل 1A).
- حدد الخلايا المبوب (بالنقر المزدوج على منطقة مسور) وفي العرض الجديد ضبط مربع القائمة المنسدلة قائمة معلمات لعرض الخلايا في "منتدى التعاون الأمني" (أ)/مؤامرة مبعثر الجانب SSC(A). انقر على أيقونة البوابة المستطيلة وسخاء حدد السكان الوحيدات استناداً إلى خصائص مبعثر الأمامية والجانبية لاستبعاد غالبية الخلايا الليمفاوية وخلايا ناغورني-كاراباخ والمحببة (الشكل 1B).
- حدد الخلايا مسور وإعادة عرضه على قطعة CD14/CD16، تحديد المعلمات باستخدام القوائم المنسدلة. انقر فوق بوابة مضلع لتحديد وحيدات استناداً إلى شكلها مميزة "┐" (الشكل 1).
- حدد الخلايا مسور وعرض وحيدات في مؤامرة CD16/هلا-الدكتور باستخدام القوائم المنسدلة لتحديد معلمات. انقر فوق بوابة مضلع حدد الخلايا إيجابية الدكتور هلا واستبعاد أي تبقى ناغورني كاراباخ الخلايا والعدلات17 (الشكل 1).
- حدد الخلايا مسور وعرض الدكتور هلا الخلايا إيجابية في مؤامرة CD14/هلا-الدكتور باستخدام القوائم المنسدلة لتحديد معلمات. انقر فوق بوابة المضلع ورسم بوابة لاستبعاد الدكتور هلا عالية/CD14 الخلايا منخفض (خلايا ب التعبير عن مستويات عالية من الدكتور هلا ولكن لا CD14) (الشكل 1E).
ملاحظة: قد يحدث تلوث الخلية ب ولذلك ينبغي التحقيق. إذا كان السكان غير الكلاسيكية في الشكل 1 غير متميزة من الخلايا إلى اليسار، ثم من التلوث المحتمل. يمكن تخطي الخطوة 3.5 إذا كانت الخلايا ب ليست متداخلة مع وحيدات غير الكلاسيكية. - حدد الخلايا مسور واستخدام القوائم المنسدلة لعرضها على قطعة CD16/CD14. حدد من الخيارات مؤامرة "مؤامرة الحمار الوحشي" الذي سيمكن الوحيدات فرعية البوابات التي يمكن استخلاصها لتحديد أبعاد فرعية (الشكل 1F).
ملاحظة: إذا ارسم حمار وحشي غير متوفر في تحليل البرمجيات، الألوان الزائفة (ناعمة) أو مؤامرة كفاف قد تكون مناسبة. - انقر على أيقونة البوابة المستطيلة وحدد وحيدات الكلاسيكية عن طريق رسم بوابة مستطيلة تقريبية حول السكان الوحيدات منخفضة، والكلاسيكية العالية/CD16 CD14. تحت "عرض" حدد "إظهار الوساطات" لعرض كثافة fluorescence الوسيط وحيدات الكلاسيكية. ضبط البوابة مثل السكان بالمساواة في توزيع من الوسيط على اليسار واليمين يشمل كافة الخلايا الموجودة إلى اليسار.
- حدد السكان المتوسطة عن طريق رسم بوابة مستطيلة التي تشمل الخلايا إلى يمين البوابة الكلاسيكية. ضبط الجزء السفلي من البوابة استبعاد الخلايا غير الكلاسيكية بمحاذاة البوابة في الجزء السفلي من دوائر متحدة المركز التي تقع تماما ضمن بوابة الوحيدات الكلاسيكية، مما يضمن أن مجموعة فرعية وسيطة تعبير CD14 قابلة لمقارنة الرئيسية السكان الكلاسيكية تمشيا مع التسمية الحالية.
- بوابة الفرعية غير الكلاسيكية عن طريق رسم مربع مستطيل من الحافة السفلية من المجموعة الفرعية المتوسطة، تحديد كافة الخلايا الموجودة في الجزء السفلي من السكان (الشكل 1F).
- تحت "عرض" حدد "إظهار الترددات بوابة" لتحديد النسبة المئوية لكل مجموعة فرعية الوحيدات.
4-التحقق من الأسلوب النابضة
- لتحديد ما إذا كانت أنواع الخلايا يحتمل أن تكون ملوثة فعلياً عن طريق بوابة الخروج، أولاً تحديد خلية مختلفة من السكان مع الأجسام المضادة ضد خلايا تي (CD3) وخلايا ب (CD19)، العَدلات (CD66b) والخلايا ناغورني كاراباخ (CD56) (الشكل 2).
ملاحظة: هنا تي الخلايا العَدلات لا تجلس قريبة من شكل وحيدات "┐" وهي بوابة الخروج في الشكل 1. - تأكد من أن تتم إزالة الخلايا ناغورني كاراباخ في الخطوة 3.4 (الشكل 1)، وتتم إزالة الخلايا ب في الخطوة 3، 5 (الشكل 1E) كما هو مبين في الشكل 3. إذا لم تكن ناغورني كاراباخ الخلايا أو الخلايا ب بوابات المغادرة، إعادة ضبط البوابات.
5-المظهرية الوحيدات علامة التعبير
- حدد الخلايا من كل مجموعة فرعية الوحيدات. تغيير معلمات القائمة المنسدلة لإنشاء رسم بياني لكل مجموعة فرعية الوحيدات (الشكل 1F) عرض كل علامة وبه ايستب مطابقة (الشكل 4).
- حساب درجة التعبير عن كل علامة (الوسيط أو هندسي) مقارنة بعنصر التحكم ايستب كل منهما.
Representative Results
استراتيجية النابضة الوحيدات والتدفق الخلوي التحليل المستخدمة هنا (الشكل 1) بنجاح بوابات فرعية الوحيدات وكشف النسب ذات الصلة. وحسبت النسب (بالنسبة لهذه العينة) كلاسيكالس 88.1 في المائة، ووسيطة 4.33%، وغير 7.49%-كلاسيكالس. هذه البوابات مجموعة فرعية كانت ملوثة لا ب الخلايا أو الخلايا T، العَدلات أو خلايا ناغورني كاراباخ، التي تأكدت بعلامات CD19, CD3, CD56، و CD66b، على التوالي. بتقييم الوضع النسبي للسكان الآخرين، فمن الواضح أن الخلايا T والعدلات تقع خارج نطاق الشكل الوحيدات "┐" في مؤامرة CD16/CD14 (الشكل 2A و 2D). ومع ذلك، كلا من ناغورني كاراباخ الخلايا والخلية بالسكان تتداخل مع السكان الوحيدات غير الكلاسيكية (الشكل 2 و 2 ج). تم تأكيد الخطوات الاستراتيجية النابضة (الشكل 1 و 1E) لاستبعاد ناغورني كاراباخ الخلايا (الشكل 3A) وب الخلايا (الشكل 3B). على الرغم من أن السكان خلية بادراج جزء صغير من وحيدات غير الكلاسيكية، والمبلغ لا يعتد بها.
بعد بوابات مجموعات فرعية، الدرجة التي أعربوا عن علامات السطح المختلفة، M1 (CD64 و CD86 و CD120b) و M2 (CD163 و CD11b و CD93) وقيمت. وأظهرت العلامات إيجابية التعبير ضوابطها ايستب المقابلة، بالمقارنة مع ما يراها التحول من الرسوم البيانية (الشكل 4). وكان متوسط علامات أكبر من عناصر التحكم ايستب.
تطبيق هذه الاستراتيجية النابضة بعينه دم، التي انقسمت إلى أربعة أنابيب، الملون وتحليلها بشكل منفصل، غلة النتائج قابلة للمقارنة بين أنابيب (الجدول 4).
رقم 1: الممثل الوحيدات النابضة استراتيجية في الدم البشري كله- (أ) FSC(A) مقابل FSC(H) الأرض: النابضة الخلايا التي تحتوي مساحة متساوية والارتفاع، وبالتالي إزالة كتل (FSC(A) أكبر بالنسبة FSC(H)) والحطام (FSC منخفضة جداً) K = 1000. (ب) FSC(A) مقابل SSC(A) الأرض: اختيار واسعة من وحيدات استناداً إلى خصائصها SSC/منتدى التعاون الأمني. (ج) CD16 مقابل CD14 الأرض: النابضة لتحديد وحيدات استناداً إلى شكلها مميزة "┐". (د) CD16 مقابل الدكتور هلا الأرض: النابضة لتحديد الخلايا إيجابية الدكتور هلا وإزالة الخلايا ناغورني-كاراباخ. (ﻫ) CD14 مقابل الدكتور هلا: النابضة باستبعاد الخلايا ب (الدكتور هلا عالية/CD14 منخفض) من وحيدات. (و) تحديد وحيدات redisplayed في CD16 مقابل CD14 مؤامرة لبوابة المجموعات الوحيدات. لواو لون يمثل كثافة الخلية باللون الأزرق والأخضر تشير إلى ذات الكثافة السكانية المنخفضة والأحمر والبرتقالي تشير إلى ارتفاع الكثافة واللون البرتقالي يشير إلى كثافة متوسطة المدى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التحقق من النابضة الاستراتيجية بتحديد احتمال تلويث الخلايا. يتم تمييز الخلايا يحتمل أن تكون ملوثة بعلامات الخلايا (A) T (CD3) وخلايا (ب) ب (CD19)، ناغورني كاراباخ (ج) خلايا (CD56)، (د) العَدلات (CD66b). إظهار لوحات الجانب الأيسر تحديد هوية كل السكان بعد النابضة وفقا الشكل 1A و 1B، مع لون يمثل كثافة الخلية من عالية (أحمر) إلى الأدنى (أزرق). الألواح الجانبية الحق في إظهار كل سكان الخلية (الأزرق) فرضه على الأرض CD16/CD14 الوحيدات النهائي لتكشف عن قرب من هؤلاء السكان إلى وحيدات (أحمر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تأكيد أن الخطوات النابضة بإزالة الخلايا تلويث. الحرارة خرائط تبين درجة التعبير من عالية (الأحمر) انخفاض (الأزرق) من CD56 (A) و (ب) CD19. خطوات النابضة بنجاح استبعاد الخلايا مع CD56 عالية (ناغورني كاراباخ الخلايا) و CD19 عالية (خلايا ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التعبير الوحيدات من M1 (CD120b) و M2 علامات (CD93)- ممهدة رسوم بيانية الوحيدات M1 و M2 علامة التعبير (الأزرق) يبين تحول واضح من ايستب (أحمر) كلاسيكالس (A) ووسيطه (ب) و (ج) غير-كلاسيكالس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| جسم مضاد | حجم (50 ميليلتر الدم) | وحدة التخزين (س 16) 800 ميليلتر الدم |
| CD14-V450 | ميليلتر 0.75 | 12 ميليلتر |
| CD16-آسيا والمحيط الهادئ | 0.5 ميليلتر | ميليلتر 8 |
| هلا-الدكتور-بيركب | 0.625 ميليلتر | 10 ميليلتر |
الجدول 1: الأجسام المضادة لتدفق الدم كله ومزيج الرئيسي.
| أنبوب | الأجسام المضادة PE | مدونة | مباراة ايستب | تركز الأسهم | حجم العمل |
| 1 | IgG1 | دينار بحريني (555749) | نا | 1.0 ميكروغرام/20 ميليلتر | 0.625 ميليلتر |
| 2 | CD163 | دينار بحريني (556018) | IgG1 دينار بحريني | 0.125 20 ميكروغرام/ميليلتر | 5 ميليلتر |
| 3 | CD64 | دينار بحريني (558592) | IgG1 دينار بحريني | 0.06 ميكروغرام/20µL | 10 ميليلتر |
| 4 | IgG1 | دينار بحريني (555749) | نا | 1.0 ميكروغرام/20 ميليلتر | ميليلتر 1.25 |
| 5 | CD86 | دينار بحريني (555658) | IgG1 دينار بحريني | 1.0 ميكروغرام/20 ميليلتر | ميليلتر 1.25 |
| 6 | CD11b | دينار بحريني (561001) | IgG1 دينار بحريني | 1.0 ميكروغرام/20 ميليلتر | ميليلتر 1.25 |
| 7 | IgG2a | البحث والتطوير (IC003P) | نا | 25 ميكروغرام/مل | 5 ميليلتر |
| 8 | CD120b (تنفري) | البحث والتطوير (FAB226P) | IgG2a د البحث والتطوير | 25 ميكروغرام/مل | 5 ميليلتر |
| 9 | IgG1 | از (400112) | نا | 0.2 مغ/مل | ميليلتر 2.5 |
| 10 | CD93 | از (336108) | BL IgG1 | 50 ميكروغرام/مل | ميليلتر 1.25 |
الجدول 2: M1/M2-PE Fluorochrome المسمى [مونوكلونل] لتدفق الدم كله.
| أنبوب | جسم مضاد | حجم العمل |
| 11 | CD3 | 5 ميليلتر |
| 12 | CD19 | 5 ميليلتر |
| 13 | CD66b | ميليلتر 1.25 |
| 14 | CD56 | 5 ميليلتر |
الجدول 3: المسمى PE Fluorochrome الأجسام المضادة للخلايا الليمفاوية (الخلايا T والخلايا ب)، العَدلات، والخلايا ناغورني-كاراباخ.
| أنبوب | % الكلاسيكية | % متوسط | % عدم الكلاسيكية |
| 1 | 84.3 | 5.11 | 10.1 |
| 2 | 84.2 | 5.05 | 10.5 |
| 3 | 84.3 | 5.03 | 10.7 |
| 4 | 81.6 | 5.03 | 12.1 |
الجدول 4: نسب الوحيدات مجموعة فرعية من عينة دم واحد ملون وتحليلها بشكل منفصل.
Discussion
قياس تدفق الدم كله نهج مثالي لدراسة وحيدات، ويتم فحص الخلايا في ظروف قريبة من المكروية الفسيولوجية على تقديم نظرة ثاقبة في أدوارها في الإصابة والظروف الملتهبة. وعلاوة على ذلك، استخدام الطازجة (أي، غير المجهزة) عينات الدم يقلل من تعديلات أو الخلية التحولات التي يمكن أن تحدث بسبب تخزين أو مناولة18،19، مثل تلك التي تعرف أن يحدث مع إذابة تجميد وحيدات 20-يوصي بإعداد عينة فورية كما بعض علامات أوبريجولاتيد إذا كان يتم الاحتفاظ بالعينات في درجة حرارة الغرفة قبل تجهيز19. وقد تحددت تركيزات الأمثل من علامات M1 و M2 بمعايرة، وينبغي أن يتم هذا لأي جسم جديد للحد من الربط غير محددة مع ضمان أن درجة التحول هو سبب التعبير مستضد وغير مقيدة بعدم وجود الأجسام المضادة. إزالة خلايا الدم الحمراء والتثبيت من خلايا الدم البيضاء مع تحلل الحل خطوة هامة في هذا البروتوكول كما أن وجود خلايا الدم الحمراء يمكن أن تتداخل مع التدفق الخلوي21،22. ملاحظة أن بينما بعض الحلول تحلل متوافقة مع تلطيخ لا يغسل، السكان أكثر وضوحاً جليا في أيدينا عندما يستخدم خطوة غسيل.
الإعداد الصحيح من سيتوميتير تدفق من الحيوي أيضا عند مقارنة التعبير عن علامات الوحيدات. نوصي بأن الباحثين الحفاظ على الهدف يتفق fluorescence كثافات من حبات مراقبة وتنفيذ مراقبة الجودة على الأداة التي ستستخدم لتوفير تشغيل نتائج متسقة عبر عينات مختلفة في أيام مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام عناصر تحكم ايستب للمساعدة في تفسير أي إشارة خلفية غير محدد يولدها جسم غير محددة ملزمة. تحتوي على مستويات عالية من مستقبلات Fc11 وحيدات وبالتالي عرضه للربط غير محددة. ملاحظة، يختلف مستوى الربط غير محددة بالنسبة لمجموعات فرعية مختلفة، وهكذا يصبح استخدام عنصر تحكم ايستب هامة عند مقارنة درجة التعبير علامة بين المجموعات الفرعية.
هو معيار هام آخر النظر في الخطوات النابضة التي استخدمت. تشير بعض الدراسات إلى أن من الأهمية بمكان رسم بوابة ضيقة حول الوحيدات السكان في FSC(A)/SSC(A) مؤامرة للتخلص من معظم غير مونوسيتيك CD16 الخلايا الإيجابية23،،من2425، ولكن هذا قد يؤدي إلى فقدان بعض وحيدات كما يمكن أن تتداخل الخلايا غير الوحيدات مع وحيدات في منتدى التعاون الأمني/SSC المؤامرات26. بدلاً من ذلك، هو إدراج علامة الوحيدات الثالثة بالإضافة إلى CD14 و CD16، لاستبعاد أي خلايا الدم الأخرى التي قد تلوث وحيدات، أساسي26،27. ولهذا السبب، كثيرا ما يستخدم الدكتور هلا ومثالية كما أنه لا يعبر عن ناغورني كاراباخ الخلايا أو العَدلات17،28. على الرغم من أن الخلايا الليمفاوية (ب الخلايا والخلايا T) قد أعرب الدكتور هلا، أنها تختلف عن وحيدات فيما يتعلق بالتعبير CD14. بينما الدكتور هلا علامة ثالثة مثالية، CD86 كما أوصت5،،من2729 ، لكن لم يتم استخدامه هنا كما أيضا علامة M1، وهكذا تم تقييم درجة التعبير على مجموعات فرعية الوحيدات.
التحقق من صحة استراتيجية النابضة المستخدمة ذات أهمية حاسمة. بينما الخلايا ناغورني كاراباخ معروفة للتداخل مع غير كلاسيكالس إذا كانوا لا عن طريق بوابة الخروج28، نلاحظ أن الخلايا ب يمكن أن تتداخل أيضا مع غير كلاسيكالس (الشكل 2)؛ ما إذا كان هذا هو الحال في دراسات أخرى قد تعتمد على اختيار فلوروتشرومي، أداة التكوين، حساسية للكشف عن، أو حتى حالة المرض يجري بحثها. هنا، ب تداخل الخلايا أظهرت التعبير عالية للدكتور هلا ولا كانت بوابات الخروج باختيار الدكتور هلا الخلايا إيجابية في الشكل 1. بدلاً من ذلك، لإزالة خلايا ب استخدمنا قطعة أرض إضافية من CD14/الدكتور هلا، حيث فصل من غير كلاسيكالس بسبب بهم الدكتور هلا أعلى الخلايا ب وانخفاض التعبير CD14.
وهناك أيضا العديد من الطرق المختلفة التي استخلصت بوابات وحيدات أنفسهم في الأدب؛ وتشمل هذه الأرباع (مجموعات فرعية مفصولة بعلامات رباعي)، و مربعات مستطيلة أو شبه منحرف13 (مع مربعات منفصلة لكل مجموعة فرعية) وعلاوة على ذلك تختلف في موضعها تحديد أين ينتهي فرعية واحدة ويبدأ آخر. وتعكس هذه الاختلافات المحتمل وجود وحيدات كسلسلة متصلة خلايا، والتفريق من الكلاسيكي إلى غير الكلاسيكية، بدلاً من السكان اختلافاً واضحا. ومع ذلك، نظراً للاختلافات في تقنيات لتحديد المجموعات الفرعية نفسها يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في نسب الوحيدات المحسوبة فرعية، يصبح من المهم أن الأسلوب النابضة هدف معقول، بدلاً من أن تكون ذاتية، وهذا سوف جعل الأسلوب أكثر قوة واستنساخه. بعض الدراسات استخدام عنصر تحكم ايستب ل CD16 لتحديد الحدود بين المجموعات الفرعية الكلاسيكية والمتوسطة30. من ناحية أخرى، لتحديد الفصل بين المواد الوسيطة وغير كلاسيكالس، فقد اقترح أن خط إنتاج قد تكون عمودية أو مائلة، مع اختيار ما يصل إلى المحققين، والشرط الذي ينبغي أن يكون قابل لإعادة الإنتاج، ولكن بوابة مستطيلة قد أوصى بتيسير إجراء المقارنات بين الدراسات13،،من3031. هنا، تم الحصول على زيادة موضوعية برسم البيانات على قطعة زيبرا وتطبيق قواعد موضوعية البصرية، لتوفر المؤامرات حمار وحشي جديلة تصور إضافية بمزج لون التدرج إلى كل الاحتمالات المتساوية بن على مؤامرة كفاف تقليدية. ووجه الحد الأيمن لمجموعة فرعية الكلاسيكية مثل أن السكان كانت موزعة بالتساوي حول متوسط السكان. كما جرى توحيد شعبة بين وسيطة وغير كلاسيكالس بوجود القاعدة للمواد الوسيطة محاذاة مع الجزء السفلي من دوائر متحدة المركز ضمن السكان الكلاسيكية (أي السكان متوسطة وضوح وتعرب عن مستويات عالية من CD14، وفقا للتسميات القياسية1).
وفي حين اقترحت بعض الدراسات باستخدام علامات إضافية، مثل نوع مستقبلات تشيموكيني ج-ج 2 (CCR2) أو 6-سالفو لاكناك (سلان) للحصول على تعداد ناجحة من وحيدات، وتكشف عن أهمية سريرية32،33 ، مستوى التعبير عن العديد من علامات وظيفية الوحيدات في أيدينا تفاوتاً بين الأفراد14. هذا الاختلاف قد تحد من فائدة هذه العلامات لتعريف مجموعات فرعية استناداً إلى التعبير عنها. استخدمت أيضا النهج الحسابية الآلي لتصور والكتلة الوحيدات مجموعات فرعية بما في ذلك البصرية التفاعلية العشوائية الجار التضمين (فيسني)، وتوزيع t العشوائية الجار التضمين (تسنى)، أو تطور شجرة الامتداد تحليل لإحداث تطبيع الكثافة (بستوني)34،35، التي يمكن أن توفر تمثيل مرئي للخلايا استناداً إلى مجموعة علامات متعددة تستخدم. في حين أن هذا قد ثبت لزيادة دقة الاستراتيجية النابضة في تصنيف فرعية الوحيدات، المسلم أن عيب هو عدد الأجسام المضادة (والمقابلة فلوروفوري القنوات) المطلوبة. فائدته سوف تعتمد على الأسئلة؛ تعقيد إضافي قد لا يكون له ما يبرره، على سبيل المثال، في دراسات التعداد.
وحيدات بوابات مع أن تقنية إظهار النسب وفقا للأدب ويمكن تحديد سهولة التعبير عن علامات السطحية من المجموعات الثلاث. عموما، هذه التقنية والمنهجية وأوضح هنا يوفر طريقة موحدة وواضحة لتعداد أبعاد فرعية الوحيدات وتقييم التعبير علامة السطحية، والتي يمكن أن توسع لتشمل علامات أخرى كذلك، ومن ثم التحقق من صحة أدوارها الوظيفية في مختلف الظروف الأخرى.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأجرى التدفق الخلوي في "تدفق المرفق الأساسية الخلوي" الذي يدعمه المعهد Westmead للصحة الوطنية ومعهد البحوث الطبية، Westmead بحوث المحور، سرطان نيو ساوث ويلز، ومجلس البحوث الطبية. هذه الدراسة أيده صندوق التعليم والبحوث الكيمياء السريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
| BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 mL | Becton Dickinson | 7128959 | |
| Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
| 5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 mm x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
| V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
| APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
| Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
| PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
| PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
| PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
| PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
| PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
| PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
| PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
| PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
| PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
| PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
| PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
| PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
| OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
| Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
| Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
| Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |
References
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
- Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483 (2016).
- Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
- Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
- Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).
- Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
- Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).
- Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
- Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
- Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).
- Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
- Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886 (2015).
- Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
- Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
- Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).
- Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
- Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
- Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
- Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
- Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
- Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).
- Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis". Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
- Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
- Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).
- Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).
