Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור אפיון מונוציט קבוצות משנה על-ידי cytometry זרימה של דם מלא. זה כולל חלוקה לרמות שער תת-קבוצות של להעריך את הבעות פניהם של סמני פני שטח נותן דוגמה ההערכה של התבטאות (דלקתיות) M1 ו- M2 סמנים (אנטי דלקתיות).
Abstract
ומונוציטים אנו רותמים הפרעות דלקתיות שונות ויש שינויים לתאים אלו, כולל ערכה הפרופורציות שלהם ואת פונקציות, משמעות פתולוגית. שיטה אידיאלית עבור בחינת שינויים ל ומונוציטים הוא cytometry זרימה של דם מלא כמו טיפול מינימלי של דגימות בשיטה זו מגבילה את הפעלת תא מלאכותית. עם זאת, גישות שונות רבות נלקחים לשער תת-קבוצות מונוציט המוביל זיהוי לא עקבי של ערכות המשנה בין מחקרים. כאן נדגים שיטה באמצעות cytometry זרימה של דם מלא כדי לזהות ולאפיין מונוציט האנושי קבוצות משנה (קלאסית, ביניים וקלאסי). אנחנו המתאר כיצד להכין את דגימות הדם עבור cytometry זרימה, שער של ערכות המשנה (להבטיח תאים מזהמים הוסרו) וכן לקבוע מונוציט ביטוי ערכה של סמני פני השטח – זו דוגמה M1 ו M2 סמנים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב מחקרים אחרים הדורשים המגביל שיטה סטנדרטית להערכת מונוציט משנה הפרופורציות ואת מונוציט ביטוי ערכה של סמנים אחרים פונקציונלי.
Introduction
ומונוציטים הן סוג של תאי דם לבנים, אשר ממלאים תפקיד מרכזי קידום של פתרון לדלקת. ישנן שלוש קבוצות משנה הראשי של monocytes שזוהה, קלאסית (~ 85%), בינוני (~ 5%) ומונוציטים (~ 10%)-קלאסי, אשר מאופיינים על ידי רמת אשכול של בידול (CD) 14 ו- ביטוי CD161. הפרופורציות של קבוצות משנה מונוציט יכולים להיות שונים עם הנוכחות של מחלה, כגון שיעור מוגבר ביניים שונים המצבים הדלקתיים2,3 כולל מחלות לב וכלי דם, איפה לרמת ביניים הקשורים אירועים קליניים4,5. יתר על כן, בתנאים המחלה, ומונוציטים יכול גם לעבור שינויים פונקציונליים, עם שינויים רבים ניתן לגילוי על ידי הבדל סמן משטח ביטוי6,7. דוגמה אחת כזו היא מונוציט M1-הטייה עלייה בסמני המשויך M1 מקרופאגים, אשר נצפתה למחלות לב וכלי דם, סוכרת, השמנת יתר, תסמונת מטבולית-7,-8,-9 , 10.
למרות הפופולריות של cytometry זרימה כדי להעריך מונוציט משנה פרופורציה ותפקוד, יש השתנות ניכר הכנת הדוגמא, ערכה gating בין מחקרים שקשה להשוות ממצאים בין מחקרים כאלה. חשוב לציין, יש הסכמה כללית להבחנה בין קבוצות משנה מונוציט, עדיין בגישה סטנדרטית היא חיונית נותן את המשמעות הקלינית של שינויים בפרופורציות ערכה מספר מחלות. חלק מהקושי gating נובע מהעובדה ומונוציטים להבדיל מהספרייה הקלסית דרך הביניים ערכה-קלאסי11 ו ככזה, ומונוציטים קיים ספקטרום רציף ולא אוכלוסיות נפרדות12 . מעניין, Zawada. et al. הראו כי שימוש גם מלבני או בצורת טרפז gating קבוצת ביניים המשנה, זיכו בקבוצת משנה ביניים גבוה אשר חזה על הקצה של הלב וכלי הדם13. זה מדגיש, לפחות לחישוב הפרופורציות, נושא המפתח הוא יישום אסטרטגיה המגביל עקבית בין שונים דגימות (לימודים), במקום ניסיון להפלות באופן מוחלט בין קבוצות משנה. בעוד gating סופית עשוי להיות חשוב יותר כאשר הערכת פונקציה, השינוי בביטוי סמן בין קבוצות משנה הוא מצטבר12,14, ובכך שוב, עקביות gating אולי מפתח. וככזה, נדרש אובייקטיבית gating שיטת reproducibly apportions תת-קבוצות מונוציט בין מדגמים שונים. מטרת השיטה המובאת כאן היא לשער קבוצות משנה מונוציט עם הסבר ברור ואת ההצדקה הטכניקה המגביל המועסקים ולהעריך את ערכות המשנה להבעה סמן משטח, ובכך מספק שיטה אשר מאפשר לחוקרים יש אמון השימוש בטכניקה זו כאשר הערכת מדגמים שונים.
Protocol
מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה של המחקר האדם WSLHD (HREC) (לאישור AU אדום HREC/15/WMEAD/289).
1. משאבות עבור Cytometry זרימה של דם מלא
הערה: כמו דם אנושי פוטנציאלי זיהומיות, קביעת המדגם צריכה להתבצע בשכונה חומרים מסוכנים.
- לאסוף דגימות הדם של המשתתפים לתוך 3 מ"ל אתילן diamine ב טטרה חומצה אצטית (EDTA) צינורות.
- לקבוע את ספירת תאי הדם הלבנים (WBC) באמצעות מנתח המטולוגיה או hemocytometer.
- שתדללו בתמיסת פוספט buffered (PBS) (pH ~ 7.4) כדי להתאים את הריכוז ~ 5 x 106 WBC/mL.
- להכין תערובת בסיס מספיק עבור מספר צינורות (למשל, עבור צינורות 14, להכין 16 x מיקס מאסטר) על-ידי שילוב 16 x אמצעי אחסון של 50 µL דם, 0.75 µL אנטי-CD14-V450, 0.5 µL אנטי-CD16-APC, 0.625 µL אנטי הלע-ד ר-PerCP. µL 51.9 מערבולת, פיפטה של שילוב לתוך כל שפופרת (טבלה 1).
הערה: צריך להיות טיטרציה נוגדנים לקביעת ריכוזים מכתימים אופטימלית עבור הנוגדנים פלורסנט בשימוש. - הוספת סמן משטח (M1 ו M2 או isotype פקד, phycoerythrin (PE) מתויג) נוגדנים (למשל לפי בטבלה 2) ו- PE מתויג סמנים עבור תאי T (CD3), תאים B (CD19), נויטרופילים (CD66b), ואת הרוצח הטבעיים (NK) תאים (CD56) (טבלה 3). מערבולת דגירה למשך 30 דקות, 4 ° C בחושך.
הערה: סמני לימפוציטים, נויטרופילים של תאי NK נכללים רק עבור האימות של השיטה חסימה. - להוסיף 250 µL של תאי הדם האדומים משולב פירוק/WBC פתרון תיקון, מערבולת בעדינות מיד, ולאחר תקופת דגירה של 10 דקות בחושך ב 4 º C.
- הוסף µL 250 תאים PBS ו ספין למטה ב x 260 גרם 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את תגובת שיקוע, מחדש להשעות בתאים µL 300 של 1% פורמלדהיד.
הערה: פורמלדהיד הוא רעיל. השתמש nitrile כפפות ולהשתמש fume הוד. - לאחסן ב 4 ° C מוגן מפני אור עד הניתוח מתבצע.
הערה: מומלץ ניתוח תזרים להיעשות בתוך 48 שעות של הכנת הדוגמא.
2. דנ
- בדוק זרימת יומן cytometer כדי להבטיח צוות המתקן שביצעת בדיקות בקרת איכות.
הערה: כדי להבטיח עקביות בין ניתוחים, בקרת איכות המכשיר, שמירה על עקביות עוצמות קרינה פלואורסצנטית היעד באמצעות שליטה חרוזים מומלץ. - כדי להגדיר את הניסוי cytometry זרימה, לחץ על "ניסוי חדש ואז"חדש הדגימה""צינור חדש"להוספת צינורות. בחר חלקות bivariate על-ידי לחיצה על הסמל, השתמש בתפריטים הנפתחים כדי לבחור את הפרמטרים ציר. ודא הכללה של מגרש CD16/CD14, מגרש הצגת גלאי לצד זמן כדי לפקח על הרכישה.
- הכנס צינור ולחץ "רכוש". בדוק את ההגדרות מתח כלי המבטיח כי גלאי אותות אינם את קנה המידה.
- להתבונן תאים נופלים בשער מונוציט של העלילה CD14/CD16. מוגדר סף הקלטת אירועים 5,000 לשער מונוציט קלאסית ולחץ על "שיא".
- המשך נתוני הרשומה עבור צינורות הנותרים. לאחר הנתונים עבור כל צינורות נרשמה, לייצא זרימת הנתונים כקבצים .fcs לניתוח.
הערה: כדי להבטיח דיוק, צבע אחד הפיצוי בקרות כדאי שיירשמו. מטריצה הפיצוי יכול להיות מחושב ומוחלים הנתונים לפני ניתוח להביא בחשבון ספקטרלי לשפוך מעל15,16.
3. מונוציט Gating
- קבצים פתוחים בתוכנת ניתוח. לחץ פעמיים על צינור ושם בחר פרמטרים מהתפריטים הנפתחים כדי להמחיש את התאים באזור פיזור קדימה FSC (א) / קדימה פיזור גובה FSC(H) עלילה. ליצור שער הדרה כפיל על-ידי לחיצה על סמל הכלי מצולע שער תוחמת את התאים כמו (איור 1 א').
- בחר את התאים מגודרת (על-ידי לחיצה כפולה על האזור מגודר) ואת התצוגה החדשה בתיבה התאם פרמטרים של תפריט הנפתח כדי להציג את התאים-FSC (A) / לצד פיזור SSC(A) עלילה. לחץ על סמל שער מלבני ובחר בנדיבות את האוכלוסייה מונוציט בהתבסס על מאפייני פיזור קדימה ואת הצד כדי לא לכלול את הרוב של לימפוציטים, תאי NK, גרנולוציטים (איור 1B).
- בחר את התאים מגודרת, להציג מחדש על מגרש CD14/CD16, בחירת הפרמטרים באמצעות התפריטים הנפתחים. לחץ על השער מצולע לבחירת ומונוציטים בהתבסס על צורתם מאפיין "┐" (איור 1C).
- בחר את התאים מגודרת ולהציג את ומונוציטים על מגרש CD16/הלע-ד ר באמצעות התפריטים רשימה נפתחת כדי לבחור פרמטרים. לחץ על השער מצולע כדי לבחור את התאים חיובי ד ר הלע לא לכלול כל NK תאים ו נויטרופילים הנותרים17 (איור 1D).
- בחר את התאים מגודרת ולהציג את התאים חיובי הלע-ד ר על מגרש CD14/הלע-ד ר באמצעות תפריטים הנפתחת כדי לבחור פרמטרים. לחץ על השער מצולע וצייר שער כדי לא לכלול הלע-ד ר גבוהה/CD14 התאים נמוך (תאי B אקספרס רמות גבוהות של ד ר הלע אבל לא CD14) (איור 1E).
הערה: תא B זיהום עלולה להתרחש, לכן צריך להיחקר. אם האוכלוסייה הלא-קלאסי איור 1C אינה נבדלת התאים משמאלו, זיהום סביר. ניתן לדלג שלב 3.5 אם בתאי B לא חופפות עם ומונוציטים הלא-קלאסי. - בחר את התאים מגודרת ולהשתמש הנפתחים כדי להציג אותם על מגרש CD16/CD14. מגרש אפשרויות בחר "זברה" מזימה אשר יאפשר מונוציט השערים משנה להיגרר לקביעת ערכה הפרופורציות (איור 1F).
הערה: אם עלילה זברה אינה זמינה על תוכנת ניתוח, צבע מדומה (' חלק ') או מגרש מתאר עשוי להיות מתאים. - לחץ על סמל שער מלבני ובחר את ומונוציטים הקלאסית על ידי ציור דרך שער מלבני משוער סביב האוכלוסייה גבוהה/CD16 נמוך, קלאסית מונוציט CD14. תחת "תצוגה", בחר 'הצג medians' כדי להציג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני עבור ומונוציטים קלאסית. התאם את השער כך האוכלוסייה יש של חלוקה שוויונית של החציון על שמאלה וימינה המקיף את כל התאים לשמאל.
- בחר את האוכלוסייה ביניים על-ידי ציור שער מלבני שמקיף את התאים שמימין לשער קלאסית. להתאים את החלק התחתון של השער כדי לא לכלול את התאים הלא-קלאסי על ידי יישור השער עם חלקו התחתון של מעגלים שנמצאים לחלוטין בתוך השער מונוציט הקלאסית, אשר מבטיח כי המשנה ביניים יש ביטוי CD14 להשוות היישוב קלאסית הראשית בקנה אחד עם המינוח הנוכחי.
- שער המשנה-קלאסי על ידי ציור תיבה מלבנית מהקצה התחתון של המשנה ביניים, בחירת כל התאים לחלק התחתון של האוכלוסייה (איור 1F).
- תחת "תצוגה", בחר 'הצג שער תדרים' כדי לקבוע את אחוז מונוציט משנה.
4. אימות של Gating שיטה
- כדי לקבוע אם סוגי תאים מזהמים פוטנציאלי ביעילות מגודרת-אאוט, תחילה לזהות אוכלוסיות תאים שונים עם נוגדנים נגד תאי T (CD3), תאים B (CD19), נויטרופילים (CD66b), תאי NK (CD56) (איור 2).
הערה: כאן T תאים, נויטרופילים אל תשב קרוב הצורה "┐" של monocytes, הן פיקוח בחוץ באיור 1C. - לאשר כי תאי NK מוסרים בשלב 3.4 (איור 1D), תאים B מוסרים בשלב 3.5 (איור 1E) בדומה למוצג באיור3. אם תאי NK או בתאי B אינם מגודרת-אאוט, להתאים מחדש את השערים.
5. פנוטיפי מונוציט סמן ביטוי
- בחר תאים מונוציט משנה. לשנות פרמטרים הנפתחת כדי ליצור היסטוגרמה עבור כל ערכה מונוציט (איור 1F) הצגת כל סמן, isotype שלו תואמות (איור 4).
- לחשב את מידת הביטוי של כל סמן (חציון או הגיאומטרי) לעומת הפקד isotype בהתאמה.
Representative Results
מונוציט המגביל אסטרטגיה וניתוח לזרום cytometry המשמש כאן (איור 1) בהצלחה מגודרת תת-קבוצות מונוציט וגילה כמויות יחסיות שלהם. הפרופורציות (עבור הדוגמה) חושבו 88.1% classicals, intermediates 4.33% ו 7.49% הלא-classicals. השערים משנה הללו היו לא מזוהם עם תאים B, תאי T, נויטרופילים או תאי NK, אשר אושר עם סמנים CD19, CD3, CD56 ו- CD66b, בהתאמה. על-ידי הערכת המיקום היחסי של אוכלוסיות אחרות, ברור כי תאי T ו נויטרופילים נופלים מחוץ לצורה מונוציט "┐" על מגרש CD16/CD14 (איור 2 א ו- 2D). עם זאת, תאי NK והן תא B אוכלוסיות חפפו האוכלוסייה הלא-קלאסי מונוציט (איור 2B ו- 2 C). השלבים של האסטרטגיה חסימה (איור 1D ו- 1E) אומתו כדי לא לכלול את תאי NK (איור 3 א) ותאי B (איור 3B). למרות האוכלוסייה תא B כללה רק חלק קטן מן ומונוציטים הלא-קלאסי, הסכום היה זניח.
יש פיקוח תת-קבוצות, מידת שאליו הם הביעו סמני פני שטח שונים, M1 (CD64, CD86 ו CD120b) ו- M2 (CD163, CD11b ו CD93) הוערך. הסמנים הראה ביטוי חיובי לעומת שולט isotype המקביל שלהם, כפי שנראה את השינוי של היסטוגרמות (איור 4). החציון של הסמנים היה גדול מזה של הפקדים isotype.
יישום של אסטרטגיה זו חסימה על דגימת דם, אשר היה לפצל 4 שפופרות, צבעונית, וניתח בנפרד, תוצאות דומות התשואות בין צינורות (טבלה 4).
איור 1: נציג מונוציט gating אסטרטגיה בדם האנושי כולו- (א) FSC(A) נ' FSC(H) עלילה: Gating את התאים שמכילים שווה באזור וגובה, ובכך להסיר גושים (FSC(A) גדול יחסית FSC(H)) ופסולת (FSC נמוך מאוד) K = 1000. (B) FSC(A) לעומת SSC(A) עלילה: מגוון רחב של מסעדות ומונוציטים בהתבסס על מאפייניהם האס/FSC. (ג) CD16 לעומת CD14 עלילה: Gating לבחירת ומונוציטים בהתבסס על צורתם מאפיין "┐". (ד) CD16 נ' ד ר הלע מגרש: חסימה כדי לבחור את התאים חיובי ד ר הלע ולהסיר תאי NK. (E) CD14 נ' ד ר הלע: חסימה כדי לא לכלול בתאי B (הלע-ד ר CD14 גבוה/נמוך) ומונוציטים. (F) נבחר מחדש על CD16 לעומת CD14 מגרש לשער תת-קבוצות מונוציט ומונוציטים. עבור A-F צבע מייצג תא צפיפות עם כחול וירוק בצפיפות נמוכה, אדום, כתום המציין צפיפות גבוהה, ורק כתום המציין צפיפות שבאנגליה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אימות של gating אסטרטגיה על ידי זיהוי של פוטנציאל לזיהום תאים. תאים מזהמים פוטנציאלי מזוהים באמצעות סמנים (א) T תאים (CD3), תאים (B) B (CD19), תאי NK (C) (CD56) ו נויטרופילים (D) (CD66b). לוחות צד שמאל הצג זיהוי של כל האוכלוסייה לאחר gating לפי איור 1A ו- 1B, עם צבע ייצוג תא צפיפות גבוהה (אדום) נמוך (כחול). לוחות צד ימין להראות כל אוכלוסיית תאים (כחול) יונחו על העלילה CD16/CD14 מונוציט הסופי כדי לחשוף את הקרבה של אוכלוסיות אלה כדי ומונוציטים (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אישור כי המגביל צעדים להסרת תאים מזהמים. חום מפות מציג את מידת ביטוי מ גבוה (אדום) נמוך (כחול) של CD56 (A) ו- (B) CD19. צעדים המגביל בהצלחה לא לכלול תאים עם CD56 גבוהה (תאי NK) ו- CD19 גבוהה (ב תאים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ביטוי מונוציט M1 (CD120b) ו- M2 סמנים (CD93). החליק היסטוגרמות מונוציט M1 ו M2 סמן ביטוי (כחול) מציג המעבר ברורה isotype (אדום) עבור classicals (א), intermediates (B) ו- (ג) אי-classicals. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| נוגדן | נפח (50 µL דם) | דם 800 µL נפח (16 x) |
| CD14 - V450 | 0.75 ΜL | 12 ΜL |
| CD16 - APC | 0.5 ΜL | 8 ΜL |
| הלע-ד ר-PerCP | 0.625 ΜL | 10 ΜL |
טבלה 1: נוגדנים עבור זרימת דם ומיקס מאסטר.
| שפופרת | PE נוגדנים | קוד | התאמה Isotype | ריכוז מניות | נפח העבודה |
| 1 | IgG1 | BD (555749) | נה | µL µg/20 1.0 | 0.625 ΜL |
| 2 | CD163 | BD (556018) | BD IgG1 | µL µg/20 0.125 | 5 ΜL |
| 3 | CD64 | BD (558592) | BD IgG1 | 0.06 µg/20µL | 10 ΜL |
| 4 | IgG1 | BD (555749) | נה | µL µg/20 1.0 | 1.25 ΜL |
| 5 | CD86 | BD (555658) | BD IgG1 | µL µg/20 1.0 | 1.25 ΜL |
| 6 | CD11b | BD (561001) | BD IgG1 | µL µg/20 1.0 | 1.25 ΜL |
| 7 | IgG2a | R & D (IC003P) | נה | µg 25/mL | 5 ΜL |
| 8 | CD120b (TNFRII) | R & D (FAB226P) | R & D IgG2a | µg 25/mL | 5 ΜL |
| 9 | IgG1 | BL (400112) | נה | 0.2 מ"ג/מ"ל | 2.5 ΜL |
| 10 | CD93 | BL (336108) | BL IgG1 | µg 50/mL | 1.25 ΜL |
טבלה 2: M1/M2-PE Fluorochrome תוויות נוגדנים חד-שבטיים זרימת דם.
| שפופרת | נוגדן | נפח העבודה |
| 11 | CD3 | 5 ΜL |
| 12 | CD19 | 5 ΜL |
| 13 | CD66b | 1.25 ΜL |
| 14 | CD56 | 5 ΜL |
טבלה 3: PE Fluorochrome תוויות נוגדנים חד-שבטיים לימפוציטים (תאי T, תאים B), נויטרופילים של תאי NK.
| שפופרת | % קלאסית | % בינוני | % Non-קלאסי |
| 1 | 84.3 | 5.11 | 10.1 |
| 2 | 84.2 | 5.05 | 10.5 |
| 3 | 84.3 | 5.03 | 10.7 |
| 4 | 81.6 | 5.03 | 12.1 |
טבלה 4: מונוציט הפרופורציות תת-קבוצה של דגימת דם אחת צבעונית וניתח בנפרד.
Discussion
Cytometry זרימה של דם מלא היא גישה אידיאלי ללמוד ומונוציטים כמו התאים נבדקים בתנאי קרוב microenvironment הפיזיולוגיים שלהם לספק תובנה על השתתפותם ב זיהום, במצבים דלקתיים. יתר על כן, השימוש טריים (קרי, לא מעובדת) דגימות דם ממזער את שינויים או העתקות התא יכול להתרחש עקב אחסון או טיפול18,19, כגון אלה עלולה להתרחש עם ומונוציטים הקרת ההקפאה 20. הכנת הדוגמא בקש מומלץ כמו כמה סימונים upregulated אם הדגימות מוחזקים בטמפרטורת החדר לפני עיבוד19. ריכוז אופטימלי של סמני M1 ו- M2 נקבעו על ידי טיטור, יש לבצע פעולה זו עבור כל נוגדן חדש להגבלת מחייב שאינם ספציפיים תוך הבטחת כי מידת shift עקב ביטוי אנטיגן, אינו מוגבל על ידי חוסר של נוגדן. ההסרה של כדוריות דם אדומות, קיבוע של כדוריות הדם הלבנות עם פירוק פתרון הוא שלב חשוב של פרוטוקול זה כמו הנוכחות של תאי דם אדומים יכולים להפריע לזרום cytometry21,22. שימו לב כי בעוד כמה פתרונות פירוק תואמים לא-השטיפה מכתים, ברור יותר אוכלוסיות ניכרות בידיים שלנו כאשר צעד שטיפת משמש.
התקנה נכונה של cytometer זרימת חיוני גם בהשוואת ביטוי מונוציט סמנים. אנו ממליצים כי החוקרים לשמור על עוצמות קרינה פלואורסצנטית היעד עקבית של שליטה חרוזים ולבצע בקרת איכות על הכלי שישמש כדי לספק תוצאות עקביות מדגמים שונים להפעיל בימים שונים. בנוסף לכך, isotype פקדים משמשים כדי לסייע לפרש כל אות שאינם ספציפיים הרקע שנוצר על-ידי איגוד נוגדן שאינם ספציפיים. ומונוציטים יש רמות גבוהות של Fc קולטנים11 , ולכן הם נוטים לא ספציפית מחייבת. ראוי לציין, הרמה של איגוד שאינם ספציפיים שונה עבור קבוצות משנה שונים, לכן השימוש של פקד isotype הופכת לחשובה בעת השוואת מידת סמן ביטוי בין קבוצות משנה.
קריטריון חשוב נוסף כדי להיחשב היא המדרגות המגביל המועסקים. מחקרים מראים כי זה חיוני כדי לצייר שער חזק סביב מונוציט באוכלוסיית FSC(A)/SSC(A) עלילה להיפטר רוב הלא-monocytic CD16 תאים חיוביים23,24,25, אבל זה עשוי להוביל לאובדן של חלק ומונוציטים כפי הלא מונוציט תאים יכולים לחפוף עם ומונוציטים-FSC/האס חלקות26. במקום זאת, כדי לא לכלול כל תאי דם אחרים עשויים לזהם את ומונוציטים, ההכללה של סמן מונוציט השלישי בנוסף CD14 ו CD16, הוא חיוני26,27. מסיבה זו, ד ר הלע משמש לעתים קרובות והוא אידיאלי לידי זה הוא לא NK תאים או נויטרופילים17,28. למרות לימפוציטים (תאי B ותאי T) עשוי לבטא ד ר הלע, הם שונים ומונוציטים בהקשר לביטוי CD14. בעוד הלע-ד ר הוא סמן האידיאלי שלישית, CD86 יש גם הומלצו27,5,29 אך לא שימש פה זה גם סמן M1, ובכך את מידת ההבעה על קבוצות משנה מונוציט הוערך.
אימות של האסטרטגיה המגביל המשמש היא בעלת חשיבות מכרעת. בעוד תאי NK ידועים כדי חפיפה עם הלא-classicals אם הם הן לא פיקוח28, אנו מבחינים כי בתאי B יכול לחפוף גם הלא-classicals (איור 2B); אם זה המקרה במחקרים אחרים תלויים הבחירה fluorochrome, תצורת המכשיר, גלאי רגישות או אפילו מצב המחלה נבחנת. . כאן, B חופפים תאים הראה ביטוי גבוהה של ד ר הלע ולא היו לא פיקוח בחוץ על-ידי בחירת התאים חיובי ד ר הלע ב איור 1D. במקום זאת, כדי להסיר תאים B השתמשנו של מגרש נוסף של CD14 / הלע-DR, להפריד הלא-classicals עקב שלהם הלע-ד ר גבוה יותר ואיפה נמוך CD14 ביטוי בתאי B.
יש גם הרבה דרכים שונות בהן השערים עבור ומונוציטים עצמם נמשכו בספרות; אלה כוללים הגזרות (תת-קבוצות מופרדים באמצעות סמנים רבעים), תיבות מלבניות או טרפז13 (עם קופסאות נפרדות נמשך משנה) אשר בנוסף נבדלים הצבתן בהתוויית מסתיים משנה אחד ומתחיל אחרת. סביר הבדלים אלה משקפים את העובדה כי ומונוציטים קיים רצף של תאים, המבדילים קלאסית מן הלא-קלאסית, ולא אוכלוסיות נפרדות בבירור. עם זאת, כי בווריאציות שיטות לזיהוי תת-קבוצות עצמם יכול להוביל הבדלים הפרופורציות משנה מונוציט מחושב, הוא הופך להיות חשוב כי השיטה המגביל הוא סביר אובייקטיבי, ולא סובייקטיבי, כמו זה להפוך את שיטת לשחזור ועמיד יותר. מספר מחקרים השתמש בפקד isotype עבור CD16 כדי לקבוע את הגבול בין קבוצות משנה קלאסית ובינוניים30. מצד שני, כדי להגדיר את ההפרדה בין intermediates, הלא-classicals, שהוא הוצע כי הקו ניתוק עשוי להיות אנכית או אלכסונית, עם הבחירה עד החוקרים, ההתניות להיות שזה צריך להיות לשחזור, אבל שער מלבני מומלץ כדי להקל על השוואות בין מחקרים13,30,31. כאן, ובאובייקטיביות מירבית מוגברת הושג על-ידי התוויית הנתונים על מגרש זברה והחלת הכללים ויזואלית אובייקטיבית, מכיוון חלקות זברה מספקים cue הדמיה נוספות על ידי ערבוב הצבע כדי לכל סל הסתברות שווה מעל מגרש מתאר מסורתיים. הגבול הימני של המשנה קלאסית נמשך כך האוכלוסייה היה מופץ באופן שווה סביב החציון האוכלוסייה. החלוקה בין intermediates הלא-classicals היו גם סטנדרטית על ידי בעל בסיס intermediates להתיישר עם תחתית המעגלים בתוך האוכלוסייה קלאסית (קרי, האוכלוסייה ביניים בבירור מבטא רמות גבוהות של CD14, לפי המינוח הרגיל1).
בעוד מספר מחקרים הציעו את השימוש סמנים נוספים, כגון C-C כימוקין קולטן מסוג 2 (CCR2) או 6-sulfo LacNAc (SLAN) להשגת ספירה מוצלחת של monocytes וכדי לחשוף את משמעות קלינית32,33 , בידיים שלנו רמת הביטוי של סמנים פונקציונליים רבים מונוציט משתנה מאוד בין אנשים14. וריאציה כזו עלולה להגביל את התועלת של סמנים אלה כדי להגדיר קבוצות משנה המבוסס על הביטוי שלהם. שיטות חישוביות לצורך אוטומטית גם שימשו כדי להמחיש אשכול מונוציט קבוצות משנה כולל ויזואלית אינטראקטיבית סטוכסטי השכן הטבעה (viSNE), t-מבוזרות סטוכסטי השכן הטבעה (tSNE) או התקדמות עץ מורחב ניתוח של אירועים מנורמל צפיפות (ספייד)34,35, אשר יכול לספק ייצוג חזותי של התאים המבוסס על הסט של מספר סמני בשימוש. בזמן זה הוכח כדי להגביר את הדיוק של האסטרטגיה חסימה בסיווג משנה מונוציט, הוא מוכר כי החיסרון הוא המספר של נוגדנים (ואת ערוצי fluorophore המקביל) נדרש. השימושיות שלה תהיה תלויה בשאלות שנשאלות; מורכבות נוספת עלולה לא להיות מוצדקת, לדוגמה, במחקרים ספירה.
ומונוציטים מגודרת עם הטכניקה שלנו להראות הפרופורציות בקנה אחד עם הספרות, הביטוי של סמני פני השטח על ידי שלוש קבוצות משנה ניתן לקבוע בקלות. בסך הכל, הטכניקה ואת מתודולוגיה המוסברת מספק שיטה סטנדרטית וישירה של ספירת מונוציט משנה הפרופורציות והערכה סמן משטח ביטוי, אשר ניתן להרחיב לכלול סמנים אחרים גם כן, ובכך אימות תפקידיהם פונקציונלי בתנאים שונים אחרים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
Cytometry זרימה בוצעה במתקן Flow Cytometry הליבה נתמך על ידי המכון Westmead עבור מכון המחקר הרפואי, Westmead מחקר ה-Hub, סרטן מדרום ווילס, ומתקני בריאות לאומי המועצה למחקר רפואי. מחקר זה נתמך על ידי קרן חינוך ומחקר קליני בכימיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
| BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 mL | Becton Dickinson | 7128959 | |
| Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
| 5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 mm x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
| V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
| APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
| Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
| PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
| PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
| PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
| PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
| PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
| PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
| PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
| PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
| PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
| PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
| PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
| PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
| OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
| Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
| Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
| Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |
References
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
- Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483 (2016).
- Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
- Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
- Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).
- Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
- Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).
- Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
- Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
- Szaloki, G., Goda, K.
- Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
- Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886 (2015).
- Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
- Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
- Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).
- Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
- Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
- Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
- Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
- Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
- Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).
- Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis". Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
- Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
- Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).
- Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).
