Summary
At nøje efterligne tilstanden af brænde skader kræver samspillet mellem klinisk observation og undersøgelser i dyremodeller. I denne undersøgelse, blev en svin model af svær brænde skade etableret for at vurdere en eksperimentel dressing i fysiologiske og patofysiologiske indstillinger.
Abstract
Sårheling er en dynamisk reparationsprocessen og er den mest komplekse biologiske proces i menneskers liv. Svar på brænde skade, forringer ændringer i biologiske veje inflammation svar, hvilket resulterer i Forsinket sårheling. Nedsat sårheling optræder hyppigt hos patienter med diabetes fører til ugunstige resultater såsom amputation. Derfor, dressinger med gavnlige virkning at fremme brænde sår reparation er nødvendige. Undersøgelser på burn sår behandling er dog begrænset på grund af mangel på ordentlig dyremodeller. Vores tidligere undersøgelse viste sårheling ydeevne i rotte og svin modeller ved hjælp af en minimalt invasiv kirurgisk teknik. Denne undersøgelse havde til formål at demonstrere et svin model af svær brænde skade, der eliminerer sår sammentrækning og mere kommer nærmest de menneskelige processer re epithelialization og dannelse af nyt væv. Denne protokol indeholder en detaljeret procedure for at skabe sammenhængende brænde sår og undersøge den sårheling ydeevne under behandlingen af en eksperimentel dressing i en svin model. Seks brænde sår blev lavet symmetrisk på dorsum, som var dækket med en klinisk dressing bestående af fire lag: et indre kontakt lag af eksperimentelle materialer, en indre mellemliggende lag af vandtæt film, en ydre mellemliggende lag gaze, og et ydre lag af hæfteplaster. Ved afslutningen af eksperimenter, blev sår lukning, sår område og Vancouver ar Scale score undersøgt. Prøver af huden resektion fra hvert dyr efter offer var histologisk rede og farves ved hjælp af hæmatoxylin og eosin pletter. Antibakterielle aktivitet af hver dressing i forbindelse med sårheling blev også undersøgt. Anvendelsen af den kliniske dressing til sår i svin model efterligner de biologiske processer i menneskelig sårheling med hensyn til epithelialization, cellulære spredning og angiogenese. Derfor, denne svin model giver en nem-at-lære, omkostningseffektiv og robust metode til at vurdere effekten af klinisk forbindinger i svær burn skade.
Introduction
En burn skade indleder den inflammatoriske proces og inducerer komplekse patologisk virkninger, som påvirker mange kropsfunktioner umiddelbart efter en ulykke, hvilket resulterede i negative indvirkning på patienternes livskvalitet. Nedsat sårheling forårsager betydelig sygelighed og dødelighed blandt patienter med diabetes mellitus1,2. De fleste patienter med brænde skader opleve smerter under brænde sår debridering, der er kendt som en ulidelig processen trods brugen af magtfulde opioidanalgetika3.
I modsætning til andre pattedyr del svin flere anatomiske og fysiologiske karakteristika med mennesker med hensyn til processen med epithelialization, cellulære spredning og angiogenese. Dette gør svin en potentielt bedre model for visse procedurer og undersøgelser, og de bruges ofte i efterfølgende undersøgelser, der vist lovende resultater i mus. Disse funktioner har ført til den stigende brug af svin som en større arter i prækliniske forsøg. For nylig, en hurtig stigning i biomedicinsk forskning med respekt til hjerte-kar-, urin, integumentary, og fordøjelsessystemet systemer er blevet observeret4,5,6. Denne undersøgelse sigter mod at påvise et svin model af svær brænde skade, der fjerner sår sammentrækning og giver en tættere indbyrdes tilnærmelse af de helbredende processer, menneskelige sår og dannelsen af nyt væv. Seks brænde sår blev lavet symmetrisk på dorsum, tre på hver side af rygsøjlen af svin. Næste, anexperimental dressing blev undersøgt i et svin model af svær brænde skade, der kan tilpasses til at replikere menneskelige sårheling (figur 1). Sår var dækket med en klinisk dressing, som er sammensat af fire lag: et indre kontakt lag af eksperimentelle materialer, en indre mellemliggende lag af vandtæt film, en ydre mellemliggende lag gaze og et ydre lag af hæfteplaster. En vandtæt film holder såret miljø fugtig mens forebyggelse af bakteriel infektion og at tillade gasser at gennemsyre dressing. Den ydre mellemliggende lag gaze blev anvendt på de vandtætte film og sikret af et ydre lag af hæfteplaster. Ved afslutningen af eksperimenter, blev sår lukning, sår område og Vancouver ar skala (VSS) score undersøgt. Prøver af huden resektion fra hvert dyr efter offer var histologisk rede og farves ved hjælp af hæmatoxylin og eosin (han) farvning. Antibakterielle aktivitet af hver dressing i forbindelse med sårheling blev også undersøgt i denne model. Vores tidligere undersøgelse har påvist sårheling ydeevne i rotte og svin model ved hjælp af en minimalt invasiv kirurgisk teknik7. Da der var seks brænde sår på dorsum inden for hvert svin, blev hver eksperimentelle dressing testet og evalueret i alle positioner for at minimere bias relateret til sår helingsprocessen i forskellige steder på svin dorsum. Derfor, svin model af svær brænde skade i denne undersøgelse giver en ny tilgang til vurdering af kliniske forbindinger og fremmer udviklingen af en ny behandling for burn skade. Denne undersøgelse giver afgørende værktøjer for at afdække Patofysiologi af brænde sårheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr emner er blevet godkendt af Animal Care Udvalget på National Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C). Denne undersøgelse blev gennemført i laboratorium animalsk Center på National Defense Medical Center. Svin, der vejer mellem 20 og 25 kg har været instrumenteret med succes ved hjælp af denne protokol.
1. tilpasning af dyr til menneskelige håndtering
- Efter ankomst i anlægget, hus dyr ensom, men lad dem interagere med hinanden.
- Give dyrene ad libitum adgang til mad og vand.
- Acclimate svin til menneskelige håndtering og transport fra Dyrefacilitet til den eksperimentelle laboratorium ved håndtering af dyr i det mindste en gang om dagen i en uge.
- Hurtig dyret i mindst 12 timer før operation for at undgå kvalme, opkastning og aspiration af maven væsker.
2. sedation
- Før skabelsen brænde sår adstadige dyr via en intravenøs injektion med Zoletil 50 (25 mg/kg).
3. intubation og Ventilation
- Placere dyret på en tabel og/eller trolley i brystbenet holdning.
- Åbne munden af dyret med en mundtlig sprederen.
- Utilstrækkelig lempelse af kæberne eller tilstedeværelse af synke reflekser, som hindrer intubation, maske svin med isofluran til at fremkalde sedation.
- Overvåge blodtryk, puls og kropstemperatur af fysiologiske signal skærm under operationen at forebygge potentielle komplikationer.
4. anæstesi
- Fremkalde og vedligeholde anæstesi; helst bedøver dyr via en intramuskulær injektion af Tiletamin og zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg).
- Intubate dyr med den endotrakealtube når muskelafslapning, karakteriseret ved tab af kæben tone og palpebral reflexed, blev observeret.
- Opretholde alle svin i en bedøvende stat ved en vaporizer indstilling af 0,5-2,5% (v/v) isofluran indtil slutningen af operationen.
- Undersøge dybde af anæstesi ved at teste smerte reflekser med et bagben tå knivspids før operationen. Når det er nødvendigt, tilføje yderligere anæstesi eller vente et par minutter. Kontrollere smerte reflekser regelmæssigt i hele operationen.
5. Sterilisation af operationsstedet
- Barbering og rense huden af dyret over et areal på cirka 25 cm bredde fra rygsøjlen hele vejen til armhule på begge sider.
- Skrub fugtes huden med povidon-jod krat (75 mg/mL) i ca 5 min.
- Fjerne povidon-jod sæbe fra huden ved hjælp af våde sterile gauzes.
- Sterilisere huden med povidon-jod lotion (100 mg/mL).
- Dække dyr med steril kirurgiske gardiner til at mindske bakteriel overførsel og efterfølgende kontaminering af operationsstedet.
6. brænde sår skabelse
- Bruge en kirurgisk mærkning pen til at markere midten af seks brænde sår symmetrisk på dorsum af grisen. Sikre, at afstanden mellem hver brænde sår er mindst større end radius af såret (figur 1A).
- Fyld en modificeret loddekolbe med 50 mL af glycerin og indsætte en elektronisk termometer ind i at overvåge temperaturen. Hot jern besidder et fladt område ca 9 cm2 (figur 1B).
- Varme op jern til 137-139 ° C med en varmeplade (figur 1 c).
- Oprette seks ensartet brænde sår ved at placere jern på det markerede område uden at anvende nogen styrke i 30 sekunder (figur 1 c).
- Vask brænde sår med 0,9% saltvand løsning (figur 1 d).
- Måle sår dimensioner og optage såret ved fotomikrografi (figur 1E).
7. forberedelse af forbindinger
- Dække hver såret med den indre kontakt lag af en fire-lags kliniske dressing gennem direkte kontakt. I dette lag, bruge CAPS-holdige dressing eller alternative materialer (figur 1F).
- Anvende en vandtæt film på kliniske dressing til at fungere som en barriere mod bakteriel penetration (figur 1F).
- Dække hver såret med en gaze (0,5 cm tykke) og lave med papir tape til at tjene som midt lag af dressing (figur 1 g).
- Sikre gaze med et ydre lag af hæfteplaster. Udvide dette lag til torso at undgå fortrængning af dressing (figur 1 H-1J).
8. efter brænde pleje og måling
- Injicere svin med buprenorphin (0,1 mg/kg, IM) til smertebehandling for hver 8-12 h, starter før helbredelse fra anæstesi, i en uge til at mindske potentielle smerter.
- Give pig gratis adgang til foder og vand.
- Ændre de kliniske forbindinger hver 2 dage for de første 10 dage og derefter to gange om ugen i 6-ugers undersøgelse.
- Ren og måle sår før ansøge kliniske forbindinger. Administrere anæstetika under dressing ændringer.
- Optage såret ved fotomikrografi for sammenligning af sår healing sats hver 2 dage for de første 10 dage og derefter to gange om ugen i 6-ugers undersøgelse.
- Beregne sår re epithelialization eller sammentrækning som procentdel af den oprindelige sår størrelse efter en tidligere beskrevne metode. Analyse af sår lukning blev gennemført i en dobbelt-blindet måde.
- Måle brænde ar ved hjælp af VSS, som består af fire variabler: vaskularisering, højde (tykkelse), smidighed og pigmentering på efter brænde dage 0, 7, 21 og 42. Hver variabel har fire til seks mulige score. Samlet score spænder fra 0 til 14, hvor en score på 0 afspejler normal hud.
9. bakteriers vækst eksperimenter af efter brænde væv
- Svaber sår til antibakterielle test på efter brænde dage 0, 7, 21 og 42.
- Placere svaber i 100 mL 0,9% steril saltvandsopløsning og forsigtigt vortex at opnå en homogen suspension.
- Seriefremstillede fortyndes (101– 10−5) homogenatet og plade 100 μL af hver fortynding i selektiv og nonselective medier, henholdsvis.
- Inkuber alle fortyndinger under aerobe betingelser ved 37 ° C i 24-72 timer.
- Plade tredobbelt delprøver af 10 μL fra alle fortyndinger på blod agar plade suppleret med 5% får blodet til at isolere aerob Gram-positive organismer.
- Inkuber prøven af spredning eller hælde prøven jævnt på overfladen af en agar plade natten over for fastsættelsen af antallet af kolonidannende enheder (CFUs).
- Læs pladerne efter natten inkubation. Invertere får blod agar plade og opdele i bunden af fadet i fire lige store kvadranter ved hjælp af en markør og små lineal.
- Placere plade på scenen af en dissektion mikroskop og kolonierne på hver plade. Pr. definition skal en koloni have et minimum af 300 CFU til optælles.
- Bakteriel kolonierne i hver af de tre gentagelser. Beregn den gennemsnitlige værdi af tre gentagelser. Bestemme CFU pr. plade ved at multiplicere den gennemsnitlige værdi af de endelige fortyndingsfaktoren.
10. aktiv dødshjælp og væv fiksation
- Intravenøst indsprøjtes en overdosis af natrium pentobarbital eutanasi løsning (80-120 mg/kg).
- Udføre blokoverførslen excision af brænde sår væv at medtage den underliggende muskulatur og omkringliggende unwounded væv.
- Fix væv med 10% neutrale bufferet formalin.
- Bland 10 mL af formaldehyd (37%) i 90 mL fosfatbufferet løsning (PBS) og butik i 4 ° C.
- Overføre væv til fiksativ og slyng container for at sikre, at alle væv er helt nedsænket i fiksativ. Mængden af fiksativ skal være 30 gange væv volumen.
- Fix væv natten over ved 4 ˚C.
- Dehydrere væv med ethanol og integrere i paraffinblokke. Udfør følgende trin på 4 ˚C på en shaker.
- Vaskes to gange med PBS i 30 minutter.
- Dehydrere væv med 70% ethanol for 8 timer, 80% ethanol natten, 95% ethanol i 8 timer, og derefter 100% ethanol natten over.
- Inkuber væv i 100% ethanol i yderligere 8 timer.
- Inkuber væv i tre ændringer af xylen hver i 30 minutter.
- Erstatte xylen med frisk smeltet (52 ° C) voks, og der inkuberes ved 52 ° C i en ovn i 1 time.
- Erstatte voks med frisk voks og inkuberes ved 52 ° C i en ovn i 3 timer, og derefter erstatte en gang mere og inkuberes ved 52 ° C natten over.
- Inkuber væv med to flere ændringer af voks hver for 1 time, og derefter integrere væv og opbevares ved 4 ° C.
- Skære og plette afsnittene paraffin-indlejret med han visualisere via et lysmikroskop med 100× forstørrelse.
- Oprette paraffin sektioner ved hjælp af en Rotationsmikrotom.
- Afvoksning sektioner med tre ændringer af xylen hver 3 minutter.
- Rehydrere væv med 100%, 95%, 80% og 70% ethanol hver for 3 minutter, og derefter nedsænke i destilleret vand.
- Pletten med hæmatoxylin i 10 minutter, og derefter skylles i rindende vand.
- Differentiere med 0,1% saltsyre ethanol i 5 minutter og skyl i postevand.
- Pletten med 0,5% eosin i 1 minut.
- Dehydrere væv med 70%, 80%, 95% og 100% ethanol hver for 2 minutter.
- Fjern farvning med xylen, og tørre i stinkskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brænde varighed på 30 sekunder af hot jern resulterede i sår, der var cirkulær med en veldefineret margen og ensartet bleg med en rand af erythema (fig. 1 d). Inden for hvert dyr var der seks brænde sår på dorsum. Arrangement af brænde sår blev afbildet i figur 1 K. Brænde sår var helt dækket med CAPS-holdige dressing og bruges til at vurdere dybde af scar dannelse på efter brænde dage 0, 7, 21 og 42 og fornyet epithelialization, som bestemt af brutto inspektion. Brænde sår var igen epithelialized baseret på grove inspektion efter brænde dag 42. Såret størrelse i disse dyr blev evalueret for at afgøre sårheling sats (figur 2A). Sår områder var 9, 10, 8 og 3 cm2 på efter brænde dage 0, 7, 21 og 42, henholdsvis. En betydelig reduktion i såret område blev observeret efter brænde dag 42 sammenlignet med dag 0. Den helbredende sats blev defineret som den største gennemsnitlige sår margen afstand fra byens sår divideret med tid til at fuldføre sår lukning. Sår behandlet med CAPS-holdige dressing viste en 73.43±6.33% sår lukning efter brænde dag 42 (figur 2B).
Figur 3 viser VSS scores ar vaskularisering, smidighed, pigmentering og højde på efter brænde dage 0, 7, 21 og 42. VSS score toppede 7.4±0.5 efter brænde dag 21 og faldt til 3.33±0.58 efter brænde dag 42.
Alle dyrene blev ofret på efter brænde dag 42. Prøver af huden resektion fra hvert dyr efter offer var histologisk forberedt og plettet med H & E. Histologic undersøgelse af prøverne bekræftede, at fuld-tykkelse burns blev opnået, og sårene syntes fuldt helbredt (figur 4). Nekrose som følge af forbrændinger kan observeres i epidermis, dermis og dermal komponenter af såret uden væsentlig grad indvirker på den underliggende muskel (figur 4). Dermis tykkelse under den eksperimenterende dressing var 5,4 mm (figur 4A). Derudover Afkastning af dermis og lymfatisk infiltration er observeret i den H & E farvning, som angivet ved den røde pil i figur 4B.
Den eksperimentelle dressing antibakterielle ejendom var bestemmes ved hjælp af en CFU assay på efter brænde dage 0, 7, 21 og 42. Resultatet viste en lille stigning i bakteriel celle numre observeret mellem efter brænde dage 0 og 21 efterfulgt af en betydelig stigning efter brænde dag 42 (figur 5). Dette resultat tyder på, at svin model af svær brænde skade i denne undersøgelse kunne bruges til at overvåge den kliniske ydeevne af eksperimentelle forbindinger, herunder antibakterielle ejendom.
Figur 1. Brænde sår oprettelsen og anvendelsen af en CAPS-holdige kliniske dressing. Efter hårfjerning og forberedelse af huden med jod og alkohol, (A) kirurgisk mærkning pen blev brugt til at skitsere seks cirkler på dorsum, enten side af midterlinjen. (B) den modificerede jern var fyldt med glycerin og et elektronisk termometer indsat i glycerin til viser temperaturen. (C) jern er opvarmet til 137-139 ° C med en varmeplade, og seks ensartet brænde sår var lavet på mærkerne på huden. Oprette brænde sår, placere den varme jern med ingen ekstern kraft på de svin tilbage hud (30 sekunder) til at oprette to fuld-tykkelse sår. (D) når alle sår blev oprettet, sår blev skyllet med 0,9% saltvand løsning. (E) skalaerne blev placeret ved sår til at tage billeder. (F) det første lag er dækket med en forbinding til test og det andet lag med en vandtæt film. (G) det tredje lag er dækket med gaze af om 0,5 cm tykkelse og fast med papir tape. (H-J) Sikre gaze med et ydre lag af hæfteplaster. Dette lag strækker sig til torso at undgå fortrængning af dressing. (K) skematisk diagram over den brænde sår distribution. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Ændring af sår størrelse i et svin model. (A) sats af sår lukning blev fastsat som en procentdel af det oprindelige sår på dag 0. Sår havde næsten helt indgået på efter brænde 42 dages, og (B) ændringer af området såret blev observeret mellem 0 til 42 dage efter brænde dyr model. Det viser den største nedgang efter brænde dag 42, udstiller 90 ± 4% sår område lukning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. De gennemsnitlige samlede score af Vancouver ar skala (VSS) ved hjælp af en dobbelt-blind eksperimentelle design på brænde efter dage i et svin model. Scar vurdering omfatter pigmentering, vaskularisering, smidighed og højden af arret. En lavere score angiver ar på den betingelse, der kommer nærmest normal hud (P = 0.0005). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Hæmatoxylin og eosin pletter på post brænde dag 42. (A, B) den sorte trekant indikerer det reparerede brænde væv. Morfologi af fuld-tykkelse såret var glat og løbende, og laget papillære lignede funktioner af hypertrofisk ardannelse. Bemærk tilstedeværelsen af neo-epidermis dække såret overfladen. (B) den røde pil angiver de dermale bindevæv-infiltreret inflammatoriske celler i brænde sår eschar over levedygtige dermis nedenfor. Oprindelige forstørrelse, × 10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. A bar diagram viser bakteriel optælling af sår på forskellige tidspunkter. Antibakterielle aktivitet af efter brænde sår dyremodel på 0, 7, 21 og 42 dage. Antibakterielle aktivitet blev evalueret af kolonidannende enheder (CFU) assay i tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende undersøgelse etableret et svin model af svær brænde skade og undersøgt den model, ved hjælp af en CAPS-holdige dressing. Vores resultater tyder på, at denne svin model kan bruges til at overvåge den kliniske ydeevne af eksperimentelle forbindinger, herunder antibakterielle ejendom. Sårheling sats, sår lukning og antibakterielle aktivitet blev også analyseret ved hjælp af VSS, H & E farvning og antibakterielle test. Brug af animalsk brænde modeller er blevet udviklet som et værdifuldt redskab til at gennemgå Patofysiologi af burn skade. Der er visse biologiske fordele ved at bruge rotter som eksperimenterende fag, herunder det høje antal af rotte-specifikke reagenser og de praktiske aspekter af at opnå transgene rotter til at opdage den molekylære signaling veje aktiv i aflåst proces. Men den store ulempe ved hjælp af rotter i en animalsk brænde model er dens fiasko fuldstændig indbyrdes tilnærmelse af den menneskelige sårheling proces. Re epithelialization er den vigtigste helende tilgang observeret i mennesker8, mens sårheling hos rotter stærkt afhænger af sår sammentrækning i en hurtig måde9. Derudover ikke sårbarheden af rotter til hypertrofisk eller kelloide ar dannelse bekræftet forskellighed af deres sår opsving proces fra mennesker. På den anden side har svin for nylig blevet genstand for forsker opmærksomhed, fordi deres hud arkitektur der ligner menneskelige hud. Derudover opstår sårheling proces hos svin og mennesker gennem fysiologisk lignende faser som betændelse, spredning, re epithelialization og remodellering. Generelt, forbrændinger i svin helbrede af 21 dage, med ny epithelialization mellem 7 og 14 dage efter såret påførelse10,11, som passer til tidslinjer observeret i mennesker. Svin viser også større sygelighed sammenligne til rotter på grund af deres kropsstørrelse, der gør mere modstandsdygtige over for sårinfektion. Mus er normalt den første model, der anvendes til at evaluere brænde sår betingelser under forskellige behandlinger. Desuden, i modsætning til andre pattedyr deler svin en række anatomiske og fysiologiske karakteristika med mennesker med hensyn til processen med epithelialization, cellulære spredning og angiogenese. Dette gør svin potentielt en bedre model, og de bruges ofte i efterfølgende undersøgelser, der vist lovende resultater i mus 12,13,14,15. Desuden distribution af dermal kollagen og elastisk indhold, kutane blodforsyning, sekvens af begivenheder i sårheling og re epithelialization har gjort svin en standard model af sårheling og rekonstruktive kirurgiske behandlinger15 ,16,17,18. Inden for hvert dyr, der var seks brænde sår beliggende på de øverste, midterste, og lavere tilbage af svin og fordelt symmetrisk på rygsøjlen. Brænde sår kan oprettes på lignende steder, men på forskellige svin. Derfor kan hver eksperimentelle dressing testet og evalueret forskellige steder at minimere bias relateret til sår helingsprocessen i forskellige steder på svin dorsum. Derudover denne svin model af svær brænde skade i denne undersøgelse også fordele fra at sikre, at hvert svin tjener som sin egen kontrol med et sår modtagende roman behandling og den anden som køretøjet kontrol, fører til en betydelig reduktion i den antallet af dyr.
Forvaltningen af brænde skader er en af de store komplikationer i sårheling. Den menneskelige helingsprocessen er sammensat af fire biologiske processer: hæmostase, betændelse, spredning og modning. Når den helbredende proces er forstyrret eller forsinket, fremmer det en fibroblastic spredning, som resulterer i en Hypertrofiske ar, som er synlig og tendens til at være hævet over den omgivende hud16. For at sikre reproducerbarheden og nøjagtig kvantificering, er tilstrækkelig vedhæftning ved hjælp af hæfteplaster påkrævet straks efter skade at minimere forsinkelsen i tid. Kutane irritation er en fælles reaktion fra hæfteplaster, der resulterer i et udslæt omkring den kliniske dressing. Således, anbefales forsigtighed i anvendelsen af foreliggende hæfteplaster at forhindre kløe. Efter aseptisk teknik og grundigt desinficering alt udstyr (f.eks., caliper) at undgå krydskontaminering mellem swines er afgørende.
Brænde sår healing er en indviklet proces. En række faktorer er blevet identificeret til at have en negativ indflydelse på sårheling proces som smerte, kløe og bakteriel forurening. Smerter har en negativ indvirkning på dyrets kost. Uden tilstrækkelig næringsstof optagelse er forsinket sårheling uundgåelig. Derfor, hvert svin blev sprøjtet med buprenorphin (0,1 mg/kg, IM) dagligt i 7 dage i træk til at mindske smerter. Fødeindtagelse blev overvåget en uge efter brænde sår skabelse. Når et fald i fødeindtagelse blev observeret på dag 7, buprenorphin (0,1 mg/kg, IM) administration fortsatte indtil dag 14. Bakteriel infektion, som er en potentiel risiko for sårheling, kan udløse betændelse og yderligere dæmpe helingsprocessen. Derfor var klinisk forbindinger dækket med vandtæt film at forhindre og minimere risikoen for kontaminering. Kløe er et ubehageligt del af sårheling proces. Svin kan ridse deres egen tilbage på jorden for at reducere kløe, hvilket kan være ugunstig for sårheling proces. En god dressing besidder egenskaber accelererende brænde sår healing med en acceptabel ar, forebyggelse af infektion og inflammation, lindre smerter og muliggør nem og hurtig mobilisering19,20. Dressingen kan fjernes, når det er påkrævet for yderligere aktuelle programmer og/eller målingen af sår område21,22. Selv om anvendelse af en fire-lags kliniske dressing til et svin er en mere kompliceret og tidskrævende proces end kliniske, svin model giver mulighed for tættere tilnærmelse til en menneskelig biologisk reaktion end musemodel. De mange potentielle fordele ved at bruge svin model gør det en bedre platform for præklinisk afprøvning end andre arter.
Den kliniske effekt med hensyn til sår lukning effektivitet og sår område reduktion blev overvåget ved hjælp af en CAPS-holdige dressing, der afslørede en 73.43±6.33% sår lukning efter brænde dag 42. Desuden blev VSS score, en valideret subjektive scale score, også brugt til at vurdere sår i svin i denne undersøgelse17. Det er vigtigt at overvåge Hypertrofiske ar dannelse under behandling med eksperimentelle forbindinger, især i kliniske forsøg18. Anvendelse af CAPS i behandlingen af brænde sår resulterede i en betydelig ændring i VSS scores efter brænde dag 42 sammenlignet med scores på dag 21. En lavere score angiver det skadede område forsøger at gendanne til en betingelse, at ligne normal hud farve pigmentering, vaskularisering, smidighed og højde. Endvidere, angivet resultaterne af H & E farvning en intakt stratum corneum lag i området CAPS-behandlet. Dette resultat tyder på, at svin model af en svær brænde skade kan bruges pålideligt til at vurdere såret område, sår lukning, VSS score og helbredende fremskridt.
Denne protokol repræsenterer de talrige detaljerede trin til demonstrerer brugen af en eksperimentel dressing på en svin model af svær brænde skade og kan anvendes til vurdering af alle typer af kliniske dressing. En modificeret loddekolbe fyldt med 50 mL af glycerin er i stand til at opretholde temperaturen inden 137-139° C under oprettelsesprocessen for sår. Denne metode har imidlertid begrænsninger såsom manglende evne til at absolut efterligner den virkelige brænde temperatur og smalle brænde lavet område på grund af loddekolbe anvendelsesområde. Men de vigtigste fordele ved metoden overvinde disse begrænsninger. Denne modificerede jern kan bruges til at oprette sammenhængende sår med præcision og lethed i forhold til de traditionelle metoder. Endvidere, denne model giver en fintmærkende måleinstrument af en termisk brænde skade under behandlingen af forskellige kliniske forbindinger fysiologiske og patofysiologiske reaktion. Fordelen ved den foreslåede model, udover de økonomiske fordele, er det let at blive håndteret af dem med relativt lille kirurgisk erfaring. Anvendelsen af den kliniske dressing til sår i modellen svin efterligner de biologiske processer i menneskelig sårheling. Derfor, svin model af svær brænde skade oprettet og testet med kliniske dressing i denne undersøgelse fremmer udviklingen af nye behandling for burn skade. Denne undersøgelse giver afgørende værktøjer for at afdække Patofysiologi af brænde sårheling. Til sidst, giver denne svin model en nem-at-lære, omkostningseffektiv og robust metode til at vurdere effekten af klinisk forbindinger i svær burn skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Tri-Service General Hospital; National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C107-042); Ministeriet for videnskab og teknologi, Taiwan (de fleste 106-2314-B-016-014); og National Defense Medical Center (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sedation: | |||
| Ketamine | Merial | 2528 ESP | 10 mL vial |
| Azaperone | China chemical & pharmaceutical | 47W406 | 100 mL vial |
| Atropine | Oriental chemical works | IN120802 | 1 mL vial |
| Anesthetic: | |||
| Tiletamine+Zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Isoflurane | Baxter | N002A225 | 100 mL vial |
| Surgery: | |||
| Hair clippers | Moser | - | - |
| Povidone iodine scrub solution | Ever star | HA161202 | 4 L barrel |
| Modified iron | - | - | - |
| 0.9% saline solution | CHI SHENG | KC130 | 500 mL vial |
| Gauze | China Surgical Dressings Center | MO15900080 | 10 x10 cm |
| CAPS | CoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan | - | - |
| Paper tape | 3M | NDC-8333-1530-01 | 2.5 cm x 9.1m |
| Waterproof film | 3M | NDC-8333-1600-40 | 10 cm x 10 m |
| Adhesive plaster | Young chemical | BH1426015 | 10 cm x 10 m |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (14 cm) | Shinetec instruments | ST-S114 | - |
| Halstead-Mosquito (12.5 cm) | Shinetec instruments | ST-H012 | - |
| Handle(# 4) | Shinetec instruments | ST-H004 | - |
| Surgical Blade(#21) | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml Plastic centrifuge tube | Falcon | 352070 | - |
| 10% neutral buffered formalin | Leica | 3800604EG | - |
| Bacterial Growth Experiments | |||
| Blood agar plate (BAP) (TSA with 5% sheep blood) | CMP | - | 90 mm Mono |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regeneration. 17, 1-18 (2009).
- Verhaegen, P. D., et al. Differences in collagen architecture between keloid, hypertrophic scar, normotrophic scar, and normal skin: an objective histopathological analysis. Wound Repair Regeneration. 17, 649-656 (2009).
- Experimental Surgery and Physiology: Induced Animal Models of Human Disease. Swindle, M. M., Adams, R. J. , Williams and Wilkins. Baltimore. (1988).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine as Models in Biomedical Research. , Iowa State University Press. Ames. (1992).
- Advances in Swine in Biomedical Research. Vols 1-2. Tumbleson, M. E., Schook, L. B. , Plenum Press. New York. (1996).
- Wang, C. H., et al. Enhanced wound-healing performance of a phyto-polysaccharide-enriched dressing - a preclinical small and large animal study. International Wound Journal. 14, 1359-1369 (2017).
- Rowan, M. P., Cancio, L. C., Elster, E. A., Burmeister, D. M., Rose, L. F., Natesan, S., Chan, R. K., Christy, R. J., Chung, K. K. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Journal of Critical Care. 19, 243 (2015).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 969618, 8 (2011).
- Gaines, C., Poranki, D., Du, W., Clark, R. A., Van Dyke, M. Development of a porcine deep partial thickness burn model. Burns. 39, 311-319 (2013).
- Gnyawali, S. C., Barki, K. G., Mathew-Steiner, S. S., Dixith, S., Vanzant, D., Kim, J., Dickerson, J. L., Datta, S., Powell, H., Roy, S., Bergdall, V., Sen, C. K. High-resolution harmonics ultrasound imaging for non-invasive characterization of wound healing in a pre-clinical swine model. PLoS One. 10 (3), e0122327 (2015).
- Eaglstein, W. H., Mertz, P. M. New methods for assessing epidermal wound healing: the effects of triamcinolone acetonide and polyethelene film occlusion. Journal of Investigative Dermatology. 71, 332-384 (1978).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Sciences. 25, 1-10 (1998).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging and Experimental Techniques. , 2nd ed, CRC Press. Boca Raton. (2007).
- Mertz, P. M., et al. IL-1 as a potent inducer of wound re-epithelization. Progress in Clinical and Biological Research. 365, 473-480 (1991).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translation Medicine. 6, 265-266 (2014).
- Aryza, M. J., Baryza, G. A. The Vancouver Scar Scale: an administration tool and its interrater reliability. The Journal of Burn & Rehabilitation. 16, 535-538 (1995).
- Bystrom, A., Claesson, R., Sundqvist, G. The antibacterial effect of camphorated paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of infected root canals. Endodontics & Dental Traumatology. 1, 170-175 (1985).
- Reig, A., Tejerina, C., Codina, J., Hidalgo, J., Mirabet, V. Application of a new cicatrization dressing in treating second-degree burns and donor sites. Annals of Burn and Fire Disasters. 4, 174 (1991).
- Hindy, A. Comparative study between sodium carboxymethyl-cellulose silver, moist exposed burn ointment, and saline-soaked dressing for treatment of facial burns. Annals of Burn and Fire Disasters. 22, 131-137 (2009).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 13505-13510 (2009).
