Summary
A pròxima imitar o modo de queimaduras requer a interação entre a observação clínica e estudos em modelos animais. Neste estudo, estabeleceu-se um modelo suíno de queimadura grave lesão para avaliar um curativo experimental em ajustes fisiológicos e fisiopatológicos.
Abstract
Cicatrização de feridas é um processo dinâmico de reparação e é o mais complexo processo biológico na vida humana. Em resposta a queimar a lesão, alterações nas vias biológicas prejudicam a resposta da inflamação, resultando em cicatrização retardada. Cicatrização de feridas prejudicada frequentemente ocorre em pacientes com diabetes, levando a resultados desfavoráveis como amputação. Daí, curativos, tendo efeito benéfico na promoção do reparo de ferida de queimadura são necessários. No entanto, estudos sobre tratamento de feridas de queimadura são limitados devido à falta de modelos animais apropriados. Nosso estudo anterior demonstrou desempenho de cicatrização de feridas em ratos e suínos modelos usando uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Este estudo teve como objetivo demonstrar um modelo suíno de queimadura grave lesão que elimina a contração da ferida e mais se aproxima dos processos humanos de re-epitelização e a formação de tecido novo. Este protocolo fornece um procedimento detalhado para a criação de feridas de queimadura consistente e examinar o desempenho de cicatrização de feridas, sob o tratamento de um curativo experimental em um modelo de suíno. Feridas de queimadura seis foram criadas simetricamente no dorso, que estavam cobertas com um molho clínico composto por quatro camadas: uma camada interna de contato de materiais experimentais, uma camada intermediária interna de película impermeável, uma camada intermediária de gaze, e uma camada externa de emplastro adesivo. Após a conclusão dos experimentos, fechamento de ferida, ferida área e pontuação da escala de cicatriz de Vancouver foram examinadas. As amostras de pele ressecada de cada pós-sacrifício animal histologicamente estavam preparadas e manchado usando hematoxilina e eosina coloração. Também foi examinada a atividade antibacteriana de cada molho no contexto da cicatrização de feridas. A aplicação do clínico curativo para feridas em modelo suíno imita os processos biológicos de humana ferida cura no que diz respeito os processos de epitelização, proliferação celular e angiogênese. Portanto, este modelo suíno fornece um método fácil de aprender, econômico e robusto para avaliar o efeito de clínicos curativos em lesões de queimadura grave.
Introduction
Um ferimento de queimadura inicia o processo inflamatório e induz efeitos patológicos complexos, que influenciam várias funções do corpo imediatamente após o acidente, resultando em um impacto negativo na qualidade de vida dos pacientes. Cicatrização de feridas prejudicada causa significativa morbidade e mortalidade entre os pacientes com diabetes mellitus1,2. A maioria dos pacientes com queimaduras sentir dor durante o desbridamento de ferida queimadura, que é conhecido como um processo torturante apesar do uso de analgésicos opioides poderosa3.
Em contraste com outros mamíferos, suína compartilhar várias características anatômicas e fisiológicas com seres humanos sobre o processo de epitelização, proliferação celular e angiogênese. Isto torna suína um modelo potencialmente melhor para determinados procedimentos e estudos, e eles são frequentemente usados em estudos subsequentes que demonstraram resultados promissores em camundongos. Estas características levaram à utilização crescente de suína como uma espécie de grande testes pré-clínicos. Recentemente, um aumento rápido na investigação biomédica, com respeito a cardiovascular, urinário, tegumentar e sistemas digestivos tem sido observado4,5,6. Este estudo visa demonstrar um modelo suíno de queimadura grave lesão que elimina a contração da ferida e fornece uma maior aproximação dos processos de cura de ferida humana e a formação de novos tecidos. Seis feridas de queimadura criaram-se simetricamente no dorso, três de cada lado da coluna vertebral dos suínos. Em seguida, curativos de emergência foi examinado em um modelo suíno de queimadura grave lesão, que pode ser adaptado para replicar a cicatrização de feridas humana (Figura 1). As feridas estavam cobertas com um curativo clínico, que é composto de quatro camadas: uma camada interna de contato de materiais experimentais, uma camada intermediária interna de película impermeável, uma camada intermediária de gaze e uma camada externa de emplastro adesivo. Uma película impermeável mantém o ambiente de ferida húmido enquanto evitando a infecção bacteriana e permitindo que os gases que permeiam o curativo. A camada exterior de intermediária de gaze foi aplicada nas películas impermeáveis e protegida por uma camada externa de emplastro adesivo. Após a conclusão dos experimentos, fechamento de ferida, ferida área e pontuação da escala de cicatriz de Vancouver (VSS) foram examinadas. As amostras de pele ressecada de cada pós-sacrifício animal histologicamente estavam preparadas e manchado usando hematoxilina e eosina (HE) de coloração. Atividade antibacteriana de cada molho no contexto da cicatrização de feridas foi também examinada neste modelo. Nosso estudo anterior demonstrou desempenho de cicatrização de feridas em ratos e suínos modelo usando uma técnica cirúrgica minimamente invasiva7. Já havia que seis queimam feridas no dorso dentro cada suína, cada curativo experimental foi testado e avaliado em todas as posições para minimizar o preconceito relacionado ao processo de cicatrização de ferimento em pontos diferentes no dorso suína. Portanto, o modelo suíno de queimadura grave prejuízo estabelecido neste estudo fornece uma nova abordagem para a avaliação de curativos clínicos e facilita o desenvolvimento de um novo tratamento para queimaduras. Este estudo fornece ferramentas cruciais para desvendar a fisiopatologia da cicatrização de feridas de queimadura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal no centro médico da defesa nacional, Taiwan (R.O.C). Este estudo foi realizado no centro de animais de laboratório no centro de medicina de defesa nacional. Suínos com peso entre 20 e 25 kg tem sido instrumentado com sucesso usando este protocolo.
1. adaptação dos animais a manipulação humana
- Após a chegada na instalação, casa dos animais solitariamente, mas deixá-los interagir uns com os outros.
- Fornece os animais ad libitum acesso à comida e água.
- ACCLIMATE suína à manipulação humana e transporte da instalação de animal para o laboratório experimental, manipulando o animal pelo menos uma vez por dia durante uma semana.
- Rapidamente o animal pelo menos 12 horas antes da cirurgia para evitar náuseas, vômitos e aspiração de fluidos do estômago.
2. sedação
- Antes da criação da ferida de queimadura, sede animais através de uma injecção intravenosa com Zoletil 50 (25 mg/kg).
3. intubação e ventilação
- Coloque o animal em uma tabela e/ou carrinho em posição esternal.
- Abra a boca do animal com um espalhador oral.
- Em caso de presença de reflexos de deglutição ou relaxamento insuficiente dos maxilares, que dificultar a intubação, máscara a suína com isoflurano para induzir sedação.
- Monitorar a temperatura corporal, frequência cardíaca e pressão arterial pelo monitor de sinais fisiológicos durante a cirurgia para prevenir complicações potenciais.
4. anestesia
- Induzir e manter a anestesia; de preferência anestesia o animal através de uma injeção intramuscular de tiletamina e eficiente (25 mg / kg + 25 mg / kg).
- Entubar o animal com o tubo endotraqueal, quando o relaxamento muscular, caracterizado pela perda do tônus da mandíbula e palpebral reflexed, foi observada.
- Manter todos os porcos um estado anestésico em uma configuração de vaporizador de 0,5 – 2,5% (v/v) de isoflurano até ao final da cirurgia.
- Examine a profundidade da anestesia por meio de testes de reflexos de dor com uma pitada de dedo do pé traseiro antes da cirurgia. Quando necessário, adicione anestesia adicional ou esperar por alguns minutos. Reflexos de dor regularmente durante a cirurgia.
5. esterilização do local cirúrgico
- Raspar e limpar a pele do animal por uma área de aproximadamente 25 cm de largura da coluna vertebral até a axila em ambos os lados.
- Esfregue a pele hidratada com esfoliante de iodo-povidona (75 mg/mL) por aproximadamente 5 min.
- Remova o sabão povidone-iodo da pele usando gazes estéreis molhados.
- Esterilize a pele com loção de iodo-povidona (100mg/mL).
- Cubra o animal com cortinas cirúrgicos estéril para reduzir transferência bacteriana e subsequente contaminação do local cirúrgico.
6. queimar a ferida criação
- Use uma caneta de marcação cirúrgica para marcar o centro dos seis feridas de queimadura simetricamente sobre o dorso do porco. Certifique-se de que a distância entre cada ferida de queimadura é pelo menos maior que o raio da ferida (figura 1A).
- Encha um ferro de soldar modificado com 50 mL de glicerina e insira um termómetro electrónico para monitorar a temperatura. O ferro possui uma área plana de aproximadamente 9 cm2 (figura 1B).
- Aquece o ferro para 137 – 139 ° C com uma chapa quente (Figura 1).
- Crie seis feridas de queimadura uniforme, colocando o ferro sobre a área marcada, sem aplicar qualquer força durante 30 segundos (Figura 1).
- Lave as feridas de queimadura com solução salina 0,9% (Figura 1).
- Medir as dimensões da ferida e a ferida que gravam por fotomicrografia (Figura 1E).
7. preparação de curativos
- Cobrir a ferida com a camada interna de contato de um curativo clínico de quatro camadas, através do contato direto. Para esta camada, use tampões contendo molho ou materiais alternativos (Figura 1F).
- Aplique uma película impermeável para o curativo clínico para servir como uma barreira contra a penetração bacteriana (Figura 1F).
- Cobrir a ferida com uma gaze (0,5 cm de espessura) e fixar com fita de papel para servir como a camada média do curativo (Figura 1).
- Prenda a gaze com uma camada externa de emplastro adesivo. Estender essa camada no torso para evitar o deslocamento do curativo (Figura 1 H-1J).
8. pós-queimadura cuidados e medição
- Injete o porco com buprenorfina (0,1 mg/kg, IM) para controle da dor para cada 8-12 h, começando antes da recuperação da anestesia, durante uma semana reduzir a dor potencial.
- Permita o acesso gratuito de porco alimentar e água.
- Trocar os curativos clínicos em 2 dias para os primeiros 10 dias e depois duas vezes por semana durante 6-semana de estudo.
- Limpar e medir as feridas antes de reaplicar clínicos curativos. Administre anestésicos durante as mudanças de curativo.
- Gravam a ferida por Fotomicrografia para comparação da taxa de cura de ferida a cada 2 dias durante os primeiros 10 dias e depois duas vezes por semana durante 6-semana de estudo.
- Calcule a re-epitelização ferida ou contração, como a porcentagem do tamanho da ferida original, de acordo com um método descrito anteriormente. A análise de fechamento de ferida foi conduzida de forma duplo-cego.
- Medir a cicatriz de queimadura usando o VSS, que consiste em quatro variáveis: vascularização, altura (espessura), maleabilidade e pigmentação na pós-queimaduras dias 0, 7, 21 e 42. Cada variável tem quatro a seis resultados possíveis. Total Pontuação varia de 0 a 14, no qual reflete um placar de 0 a pele normal.
9. experimentos de crescimento bacteriana dos tecidos pós-queimaduras
- Limpe a ferida para testes antibacteriano em pós-queimaduras dias 0, 7, 21 e 42.
- Coloca a zaragatoa em 100 mL de solução salina estéril 0,9% e suavemente vórtice para obter uma suspensão homogênea.
- Serialmente diluir (10− 1– 105) o homogeneizado e placa 100 μL de cada diluição em meios seletivos e não seletivos, respectivamente.
- Incube todas as diluições em condições aeróbias, a 37 ° C por 24-72 horas.
- Alíquotas triplicadas placa de 10 μL de todas as diluições em placa de ágar sangue suplementado com sangue de cordeiro de 5% para isolar os organismos aeróbios gram-positivos.
- Incubar a amostra por espalhar ou vazamento da amostra uniformemente na superfície de uma placa de ágar durante a noite para determinar o número de formadoras unidades (CFUs).
- Ler as placas após incubação durante a noite. Inverter a placa de ágar sangue ovino e dividir o fundo do prato em quatro quadrantes igual usando um marcador e régua pequena.
- Colocar a placa para o palco de um microscópio de dissecação e contar as colônias em cada placa. Por definição, uma colônia deve ter um mínimo de 300 UFC a ser enumerado.
- Conte as colônias bacterianas em cada um das três repetições. Calcule que o valor médio das três repetições. Determine o UFC / placa multiplicando o valor médio do fator de diluição final.
10. a eutanásia e a fixação de tecidos
- Injete por via intravenosa uma overdose de solução de eutanásia de pentobarbital de sódio (80 – 120 mg/kg).
- Execute em bloco excisão do tecido de ferida de queimadura para incluir a musculatura subjacente e intacta do tecido circundante.
- Fixe os tecidos com formol tamponado a 10% neutro.
- Misturar 10 mL de formol (37%) em 90 mL de solução tamponada fosfato (PBS) e loja em 4 ° C.
- Transferência de tecidos para fixador e agite o recipiente para garantir que todos os tecidos são completamente imerso no fixador. O volume de fixador deve ser 30 vezes o volume de tecido.
- Fixar os tecidos durante a noite a 4 ˚ c.
- Desidratar tecidos com etanol e incorporar em blocos de parafina. Execute as seguintes etapas no 4 ˚ c um agitador.
- Lave duas vezes com PBS durante 30 minutos.
- Desidrate tecidos com etanol a 70% para 8 horas, 80% de etanol durante a noite, etanol 95% por 8 horas e depois em 100% de etanol durante a noite.
- Incube os tecidos em 100% de etanol por mais 8 horas.
- Incube os tecidos em três mudanças de xileno cada durante 30 minutos.
- Substituir o xileno com cera derretida recentemente (52 ° C) e incubar a 52 ° C em um forno por 1 hora.
- Substituir a cera com cera fresca e incubar a 52 ° C em estufa por 3 horas e então substituir mais uma vez e incubar a 52 ° C durante a noite.
- Incubar os tecidos com mais duas alterações de cera cada por 1 hora e, em seguida, incorporar o tecido e armazenar a 4 ° C.
- Cortar e manchar as secções de parafina com ele e Visualizar através de um microscópio de luz com 100× ampliação.
- Crie seções de parafina usando um micrótomo rotativo.
- Dewax seções com três mudanças de xileno, a cada 3 minutos.
- Tecidos com 100%, 95%, 80% e 70% de etanol cada Re-hidratar por 3 minutos e em seguida mergulhe em água destilada.
- Manchar com hematoxilina por 10 minutos e depois enxaguar em água corrente.
- Diferenciar com álcool etílico de ácido clorídrico 0,1% por 5 minutos e enxaguar em água da torneira.
- Mancha com eosina 0,5% por 1 minuto.
- Desidrate tecidos com etanol 70%, 80%, 95% e 100% cada por 2 minutos.
- Limpar a mancha com xilol e secar na coifa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Queimadura de duração de 30 segundos por ferro quente resultou em feridas que foram circular com uma margem bem definida e uniformemente pálido com um aro de eritema (Figura 1). Dentro de cada animal, havia seis feridas de queimaduras no dorso. O arranjo de feridas de queimadura foi retratado na Figura 1 K. Feridas de queimadura eram completamente cobertas com molho contendo CAPS e usadas para avaliar a profundidade de formação de cicatriz na pós-queimaduras dias 0, 7, 21 e 42 e re-epitelização, conforme determinado pela inspeção de efectivação. Feridas de queimaduras foram re-epithelialized com base em bruta inspeção pós-queimadura dia 42. Tamanho da ferida nesses animais foi avaliado para determinar a taxa (Figura 2A) de cicatrização de feridas. Áreas de ferida foram 9, 10, 8 e 3 cm2 na pós-queimaduras dias 0, 7, 21 e 42, respectivamente. Uma redução significativa na área ferida foi observada no dia pós-queimadura 42 comparado com dia 0. A taxa de cura foi definida como a maior distância de margem média ferida do centro da ferida, dividido pelo tempo para concluir o fechamento da ferida. Feridas tratadocom com curativos contendo CAPS mostrado o fechamento da ferida de 73.43±6.33% no dia pós-queimadura 42 (Figura 2B).
A Figura 3 mostra os escores VSS com relação a cicatriz vascularização, elasticidade, pigmentação e altura na pós-queimaduras dias 0, 7, 21 e 42. A pontuação de VSS atingiu um pico de 7.4±0.5 pós-queimadura dia 21 e diminuiu para 3.33±0.58 no pós-queimadura dia 42.
Todos os animais foram sacrificados no pós-queimadura dia 42. Amostras de pele ressecada de cada pós-sacrifício animal histologicamente foram preparadas e coradas pelo H & E. histológicos análise das amostras confirmou que queimaduras de espessura total foram alcançadas, e as feridas apareceram totalmente curado (Figura 4). Necrose resultantes de queimaduras pode ser observado na epiderme, derme e componentes dérmicos da ferida sem significativamente afetar o músculo subjacente (Figura 4). A espessura da derme sob o curativo experimental foi de 5,4 mm (Figura 4A). Além disso, a descamação da derme e Infiltração linfocítica são observados a coloração H & E, conforme indicado pela seta vermelha na Figura 4B.
A propriedade antibacteriana do curativo experimental foi determinada utilizando um ensaio de UFC na pós-queimaduras dias 0, 7, 21 e 42. O resultado mostrou um ligeiro aumento no número de células bacterianas observado entre pós-queimaduras dias 0 e 21, seguido por um aumento significativo no dia pós-queimadura 42 (Figura 5). Este resultado sugere que o modelo suíno de queimadura grave prejuízo estabelecido neste estudo pode ser usado para monitorar o desempenho clínico de curativos experimentais, incluindo a propriedade anti-bacteriana.
Figura 1. Queimar a ferida criação e aplicação de um curativo clínico contendo CAPS. Após a remoção do cabelo e preparação da pele com iodo e álcool, caneta de marcação cirúrgica (A) foi usada para delinear seis círculos no dorso, ambos os lados da linha média. (B) o ferro modificado foi preenchido com glicerina e um termômetro eletrônico inserido em glicerina para mostrar a temperatura. (C) o ferro é aquecido a 137-139 ° C com uma chapa quente, e feridas de queimadura uniforme seis foram criadas sobre as marcas da pele. Para criar as feridas de queimadura, coloque o ferro quente com nenhuma força externa sobre costas pele do porco (30 segundos) para criar duas feridas de espessura total. (D) depois de todas as feridas foram criadas, as feridas foram lavadas com solução salina 0,9%. (E) as escalas foram colocadas ao lado as feridas para tirar fotos. (F) a primeira camada é coberta com um curativo de teste e a segunda camada com uma película impermeável. (G) a terceira camada é coberta com a gaze de sobre 0,5 cm de espessura e fixada com fita de papel. (H-J) Prenda a gaze com uma camada externa de emplastro adesivo. Esta camada estende-se até o tronco para evitar o deslocamento do vestir. (K) diagrama esquemático da distribuição ferida de queimadura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Alteração do tamanho da ferida em um modelo de suíno. (A) a taxa de fechamento da ferida foi determinada como uma porcentagem da ferida original no dia 0. Feridas quase completamente tinham contraído na pós-queimadura de 42 dias, e (B) as alterações da área ferida foram observadas entre 0 a 42 dias de um modelo animal pós-queimadura. Ele mostra a maior diminuição no pós-queimadura dia 42, exibir 90 ± 4% ferida fechamento de área. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A pontuação total média de Vancouver cicatriz escala (VSS), utilizando um delineamento experimental duplo-cego em dias pós-queimaduras em um modelo de suíno. Avaliação da cicatriz inclui vascularização, pigmentação, maleabilidade e altura da cicatriz. Uma menor pontuação indica a cicatriz sobre a condição de que se aproxima da pele normal (P = 0,0005). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Hematoxilina e eosina coloração sobre pós-queimam dia 42. (A, B) o triângulo preto invertido indica o tecido reparado queimadura. A morfologia da cheio-espessura ferida foi suave e contínua, e a camada papilar se assemelhava características de cicatriz hipertrófica. Observe a presença de neo-epiderme que cobre a superfície da ferida. (B) a seta vermelha indica as dérmicas células inflamatórias do tecido conjuntivo-infiltrou-se na escara de ferida de queimadura acima da viável derme abaixo. Original ampliação, × 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Um bar mostrando diagrama bacteriano contagem dos ferimentos em pontos diferentes do tempo. Atividade antibacteriana de pós queimadura ferida modelo animal em 0, 7, 21 e 42 dias. Atividade antibacteriana foi avaliada por ensaio de (CFU) de unidades formadoras de colônia em três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O presente estudo estabeleceu um modelo suíno de queimadura grave lesão e examinou o modelo usando um curativo contendo CAPS. Nossos resultados sugerem que este modelo suíno pode ser usado para monitorar o desempenho clínico de curativos experimentais, incluindo a propriedade anti-bacteriana. Ferida cura taxa, fechamento de ferida e atividade antibacteriana foram analisada usando o teste VSS, H & E manchando e antibacteriano. O uso de modelos animais queimadura foi desenvolvido como uma valiosa ferramenta para rever a fisiopatologia das queimaduras. São certos benefícios biológicos usando ratos como sujeitos experimentais, incluindo o elevado número de reagentes específicos do rato e os aspectos práticos da obtenção de ratos transgênicos, para descobrir as vias de sinalização moleculares ativas na recuperação processo. No entanto, a principal desvantagem do uso de ratos em um modelo animal de queimadura é sua incapacidade para aproximar completamente a ferida humana, processo de cura. Re-epitelização é a principal abordagem cura observada em humanos8, enquanto ferida cura em ratos fortemente depende da contração da ferida em uma maneira rápida de9. Além disso, a não-vulnerabilidade de ratos a hipertrófica ou queloide cicatriz formação confirmou a dissimilaridade de seu processo de recuperação de ferida do que a dos humanos. Por outro lado, suína recentemente tornaram-se objecto de atenção do pesquisador porque sua arquitetura de pele é semelhante da pele humana. Além disso, a processo em suínos e humanos de cicatrização de feridas ocorre através de fases fisiologicamente semelhantes, tais como inflamação, proliferação, re-epitelização e remodelação. Em geral, queimaduras em suínos curam por 21 dias, com re-epitelização ocorrem entre 7 e 14 dias pós-ferida inflição10,11, que se encaixam para os prazos observados em seres humanos. Suína também mostra maior morbidade comparar aos ratos devido ao seu tamanho de corpo que o torna mais resistente à infecção de ferida. Os ratos são geralmente o primeiro modelo usado para avaliar as condições de ferida de queimadura sob diferentes tratamentos. Além disso, em contraste com outros mamíferos, suína compartilham um número de características anatômicas e fisiológicas com seres humanos sobre o processo de epitelização, proliferação celular e angiogênese. Isto torna suína potencialmente um modelo melhor, e eles são frequentemente usados em estudos subsequentes que demonstraram resultados promissores em ratos 12,13,14,15. Além disso, a distribuição de colágeno dérmico e suprimento sanguíneo cutâneos, conteúdo elástico, a sequência de eventos na cicatrização de feridas e re-epitelização tornaram a suína um modelo padrão de cicatrização de feridas e tratamentos cirúrgicos reconstrutivos15 ,16,17,18. Dentro de cada animal, havia seis feridas de queimadura, localizadas na parte superior, médio, e menor de volta dos suínos e distribuídos simetricamente à espinha. Feridas de queimadura podem ser criadas nas localizações semelhantes, mas em diferentes suína. Portanto, cada curativo experimental pode ser testado e avaliado em diferentes locais para minimizar o preconceito relacionado ao processo de cicatrização de ferimento em pontos diferentes no dorso suína. Além disso, este modelo suíno de queimadura grave prejuízo estabelecido neste estudo também se beneficia garantindo que cada suína serve como seu próprio controle com um ferimento de receber tratamento de novela e o outro como o controle do veículo, levando a uma redução significativa da número de animais.
A gestão de feridas de queimadura é uma das principais complicações na cicatrização de feridas. O processo de cicatrização humano é composto de quatro processos biológicos: hemostasia, inflamação, proliferação e maturação. Uma vez que o processo de cicatrização é perturbado ou retardado, promove uma proliferação fibroblástica que resulta em uma cicatriz hipertrófica, que é visível e tende a ser levantada acima da pele circundante16. Para garantir a reprodutibilidade e quantificação exacta, aderência adequada usando Emplastro adesivo é necessária imediatamente após a lesão para minimizar o atraso no tempo. Irritação cutânea é uma reação comum do emplastro adesivo que resulta em uma erupção em torno o curativo clínico. Assim, cuidado é recomendado no uso do emplastro adesivo atualmente disponível para evitar coceira. Seguindo técnicas assépticas e desinfecção cuidadosamente todos os equipamentos (por exemplo, maxila) para evitar a contaminação cruzada entre suínos são imperativas.
Cura da ferida de queimadura é um processo intricado. Um certo número de fatores foram identificado para ter uma influência negativa sobre a processo, tais como dor, prurido e contaminação bacteriana de cicatrização de feridas. Dor tem um impacto negativo na dieta do animal. Sem absorção de nutrientes suficiente, cicatrização retardada é inevitável. Portanto, cada suína foi injetada com buprenorfina (0,1 mg/kg, IM) diariamente durante 7 dias consecutivos reduzir a dor. Ingestão de alimentos, foi monitorada uma semana após a queimadura ferida criação. Uma vez que foi observada uma diminuição na ingestão de alimentos no dia 7, a buprenorfina (0,1 mg/kg, IM) administração foi continuada até dia 14. Infecção bacteriana, que é um risco potencial para a cicatrização de feridas, pode desencadear a inflamação e diminuir ainda mais o processo de cicatrização. Portanto, curativos clínicos foram cobertos com filmes impermeáveis para prevenir e minimizar a contaminação potencial. Coceira é uma desconfortável parte a processo de cicatrização de feridas. Suína pode arranhar suas próprias costas no chão para reduzir a coceira, que pode ser desfavorável para o processo de cicatrização de feridas. Um bom curativo possui as propriedades de acelerar a queimar ferida cura com uma cicatriz aceitável, prevenção de infecção e inflamação, aliviando a dor e permitir a mobilização precoce e fácil19,20. O curativo pode ser removido quando necessário para novas aplicações tópicas e/ou medição do ferimento área21,22. Embora a aplicação de um curativo clínico de quatro camadas para um porco é um processo mais complicado e demorado do que o clínico, modelo suíno permite maior aproximação a uma resposta biológica humana do que o modelo do rato. As muitas vantagens potenciais do uso de modelo suíno seja uma melhor plataforma para testes pré-clínicos do que outras espécies.
A eficácia clínica em termos de redução de área ferida encerramento eficiência e ferida foi monitorada usando um curativo contendo CAPS que revelou o fechamento da ferida de 73.43±6.33% no pós-queimadura dia 42. Além disso, a pontuação de VSS, uma pontuação validada escala subjetiva, também foi usada para avaliar as feridas em suínos no presente estudo17. É importante controlar a formação de cicatriz hipertrófica durante o tratamento com curativos experimentais, especialmente em ensaios clínicos,18. Aplicação de tampas no tratamento de feridas de queimadura resultou em uma mudança significativa nos escores VSS no dia pós-queimadura 42 em comparação com as pontuações no dia 21. Uma menor pontuação indica que a área lesada tenta restaurar para uma condição que aproximam-se estreitamente altura, vascularização, maleabilidade e pigmentação de cor de pele normal. Além disso, os resultados de coloração H & E indicaram uma camada intacta estrato córneo na área tratada com CAPS. Este resultado sugere que o modelo suíno de uma queimadura grave lesão pode ser usado confiável para avaliar a área ferida, ferida encerramento, pontuação de VSS e progresso cura.
Este protocolo representa as numerosas etapas detalhadas para demonstrar o uso de um curativo experimental em um modelo suíno de queimadura grave lesão e pode ser aplicado para a avaliação de todos os tipos de curativo clínico. Um ferro de soldar modificado preenchido com 50 mL de glicerina é capaz de manter a temperatura dentro de 137 a 139° C durante o processo de criação da ferida. No entanto, este método tem limitações como incapacidade de imitar absolutamente a temperatura real da queimadura e a estreiteza da área de queimadura criada devido o escopo do ferro de soldar. No entanto, as principais vantagens do método superar essas limitações. Este ferro modificado pode ser usado para criar feridas consistentes com precisão e facilidade em comparação com os métodos tradicionais. Além disso, este modelo fornece uma medida sensível da resposta de um ferimento de queimadura térmica sob o tratamento de vários curativos clínicos fisiológica e fisiopatológico. A vantagem do modelo proposto, além das vantagens económicas, é que é fácil de ser manipulado por aqueles com experiência relativamente pouco cirúrgica. A aplicação do curativo clínico para as feridas no modelo suína imita os processos biológicos da cicatrização da ferida humana. Portanto, o modelo suíno de queimadura grave lesão estabelecida e testada com curativo clínico neste estudo facilita o desenvolvimento de novos tratamentos para queimaduras. Este estudo fornece ferramentas cruciais para desvendar a fisiopatologia da cicatrização de feridas de queimadura. Em conclusão, este modelo suíno fornece um método fácil de aprender, econômico e robusto para avaliar o efeito de clínicos curativos em lesões de queimadura grave.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por uma concessão do Tri-serviço Hospital Geral; Centro médico da defesa nacional, Taiwan (TSGH-C107-042); Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan (a maioria dos 106-2314-B-016-014); e o centro médico de defesa nacional (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sedation: | |||
| Ketamine | Merial | 2528 ESP | 10 mL vial |
| Azaperone | China chemical & pharmaceutical | 47W406 | 100 mL vial |
| Atropine | Oriental chemical works | IN120802 | 1 mL vial |
| Anesthetic: | |||
| Tiletamine+Zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Isoflurane | Baxter | N002A225 | 100 mL vial |
| Surgery: | |||
| Hair clippers | Moser | - | - |
| Povidone iodine scrub solution | Ever star | HA161202 | 4 L barrel |
| Modified iron | - | - | - |
| 0.9% saline solution | CHI SHENG | KC130 | 500 mL vial |
| Gauze | China Surgical Dressings Center | MO15900080 | 10 x10 cm |
| CAPS | CoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan | - | - |
| Paper tape | 3M | NDC-8333-1530-01 | 2.5 cm x 9.1m |
| Waterproof film | 3M | NDC-8333-1600-40 | 10 cm x 10 m |
| Adhesive plaster | Young chemical | BH1426015 | 10 cm x 10 m |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (14 cm) | Shinetec instruments | ST-S114 | - |
| Halstead-Mosquito (12.5 cm) | Shinetec instruments | ST-H012 | - |
| Handle(# 4) | Shinetec instruments | ST-H004 | - |
| Surgical Blade(#21) | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml Plastic centrifuge tube | Falcon | 352070 | - |
| 10% neutral buffered formalin | Leica | 3800604EG | - |
| Bacterial Growth Experiments | |||
| Blood agar plate (BAP) (TSA with 5% sheep blood) | CMP | - | 90 mm Mono |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regeneration. 17, 1-18 (2009).
- Verhaegen, P. D., et al. Differences in collagen architecture between keloid, hypertrophic scar, normotrophic scar, and normal skin: an objective histopathological analysis. Wound Repair Regeneration. 17, 649-656 (2009).
- Experimental Surgery and Physiology: Induced Animal Models of Human Disease. Swindle, M. M., Adams, R. J. , Williams and Wilkins. Baltimore. (1988).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine as Models in Biomedical Research. , Iowa State University Press. Ames. (1992).
- Advances in Swine in Biomedical Research. Vols 1-2. Tumbleson, M. E., Schook, L. B. , Plenum Press. New York. (1996).
- Wang, C. H., et al. Enhanced wound-healing performance of a phyto-polysaccharide-enriched dressing - a preclinical small and large animal study. International Wound Journal. 14, 1359-1369 (2017).
- Rowan, M. P., Cancio, L. C., Elster, E. A., Burmeister, D. M., Rose, L. F., Natesan, S., Chan, R. K., Christy, R. J., Chung, K. K. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Journal of Critical Care. 19, 243 (2015).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 969618, 8 (2011).
- Gaines, C., Poranki, D., Du, W., Clark, R. A., Van Dyke, M. Development of a porcine deep partial thickness burn model. Burns. 39, 311-319 (2013).
- Gnyawali, S. C., Barki, K. G., Mathew-Steiner, S. S., Dixith, S., Vanzant, D., Kim, J., Dickerson, J. L., Datta, S., Powell, H., Roy, S., Bergdall, V., Sen, C. K. High-resolution harmonics ultrasound imaging for non-invasive characterization of wound healing in a pre-clinical swine model. PLoS One. 10 (3), e0122327 (2015).
- Eaglstein, W. H., Mertz, P. M. New methods for assessing epidermal wound healing: the effects of triamcinolone acetonide and polyethelene film occlusion. Journal of Investigative Dermatology. 71, 332-384 (1978).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Sciences. 25, 1-10 (1998).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging and Experimental Techniques. , 2nd ed, CRC Press. Boca Raton. (2007).
- Mertz, P. M., et al. IL-1 as a potent inducer of wound re-epithelization. Progress in Clinical and Biological Research. 365, 473-480 (1991).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translation Medicine. 6, 265-266 (2014).
- Aryza, M. J., Baryza, G. A. The Vancouver Scar Scale: an administration tool and its interrater reliability. The Journal of Burn & Rehabilitation. 16, 535-538 (1995).
- Bystrom, A., Claesson, R., Sundqvist, G. The antibacterial effect of camphorated paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of infected root canals. Endodontics & Dental Traumatology. 1, 170-175 (1985).
- Reig, A., Tejerina, C., Codina, J., Hidalgo, J., Mirabet, V. Application of a new cicatrization dressing in treating second-degree burns and donor sites. Annals of Burn and Fire Disasters. 4, 174 (1991).
- Hindy, A. Comparative study between sodium carboxymethyl-cellulose silver, moist exposed burn ointment, and saline-soaked dressing for treatment of facial burns. Annals of Burn and Fire Disasters. 22, 131-137 (2009).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 13505-13510 (2009).
