Summary
Att noga härma funktionsläget av brännskador kräver samspelet mellan kliniska observationer och studier i djurmodeller. I denna studie inrättades en svin modell för allvarliga brännskador för att bedöma en experimentell dressing i fysiologiska och patofysiologiska inställningar.
Abstract
Sårläkning är en dynamisk reparationsprocessen och är den mest komplexa biologiska processen i människors liv. Svar på bränna skada, försämra förändringar i biologiska spridningsvägar inflammation svar, vilket resulterar i fördröjd sårläkning. Försämrad sårläkning uppstår ofta hos patienter med diabetes leder till ogynnsamma utfall såsom amputation. Därav, dressingar att ha gynnsam effekt att främja burn såret reparation behövs. Studier på burn sårbehandling är dock begränsad på grund av brist på ordentlig djurmodeller. Vår tidigare studie visat sårläkning prestanda i råtta och svin modeller med en minimalt invasiv kirurgisk teknik. Denna studie syftar till att demonstrera en svin modell av svåra brännskador som eliminerar såret kontraktion och mer approximerar nära de mänskliga processerna återepitelisation och ny vävnad bildas. Detta protokoll innehåller detaljerade anvisningar för att skapa konsekventa brännskador och undersöka sårläkning prestanda under behandling av en experimentell dressing i en svin-modell. Sex brännskador skapades symmetriskt på handryggen, som täcktes med en klinisk dressing består av fyra lager: ett inre kontakt lager av experimentella material, ett inre mellanliggande lager av vattentät film, ett yttre mellanliggande lager av gasväv, och ett yttre lager av plåster. Efter slutförandet av experiment undersöktes sårslutning, sårområdet och Vancouver ärr skala poäng. Proverna på huden resected från varje efter djuroffer utarbetades histologiskt och färgas med hematoxylin och eosin färgning. Antibakteriell aktivitet av varje dressing i samband med sårläkning undersöktes också. Tillämpning av kliniska dressing att såren i svin modell härmar de biologiska processerna av mänskliga sårläkning med avseende på processerna för epithelialization, cellulär proliferation och angiogenes. Därför ger denna svin modell en lätt att lära, kostnadseffektiv och robust metod för att bedöma effekten av kliniska förband i svåra brännskador.
Introduction
En brännskada initierar den inflammatoriska processen och inducerar komplexa patologiska effekter, som påverkar många kroppsfunktioner omedelbart efter en olycka, vilket resulterar i negativa inverkan på patienternas livskvalitet. Försämrad sårläkning orsakar betydande morbiditet och mortalitet bland patienter med diabetes mellitus1,2. De flesta patienter med brännskador upplever smärta under bränna såret debridering, som är känd som en olidlig process trots användningen av kraftfulla opioidanalgetika3.
Till skillnad från andra däggdjur dela svin flera anatomiska och fysiologiska egenskaper med människor när det gäller processen för epithelialization, cellulär proliferation och angiogenes. Detta gör svin en potentiellt bättre modell för vissa förfaranden och studier, och de används ofta i efterföljande studier som visade lovande resultat i möss. Dessa funktioner har lett till den ökande användningen av svin som en större art i prekliniska tester. Nyligen, en snabb ökning av biomedicinsk forskning med respekt till hjärt-, urin, sinnesorganen och tarmsystem har observerats4,5,6. Denna studie syftar till att demonstrera en svin modell av svåra brännskador som eliminerar såret kontraktion och ger en närmare uppskattning av de mänskliga såret läkningsprocesser och bildandet av ny vävnad. Sex brännskador skapades symmetriskt på handryggen, tre på vardera sidan av ryggraden av svin. Därefter undersöktes anexperimental dressing i en svin modell av svåra brännskador, som kan anpassas till replikera mänskliga sårläkning (figur 1). Såren var täckta med ett kliniska förband, som består av fyra lager: ett inre kontakt lager av experimentella material, ett inre mellanliggande lager av vattentät film, ett yttre mellanliggande lager av gasväv och ett yttre lager av plåster. En vattentät film håller såret miljön fuktig samtidigt som den förebygger bakteriella infektioner och låter gaser ska genomsyra dressing. Det yttre mellanliggande lagret av gasväv var appliceras på vattentät filmerna och säkrade genom ett yttre lager av plåster. Vid slutförandet av experiment undersöktes sårslutning, sårområdet och Vancouver ärr skala (VSS) poäng. Proverna på huden resected från varje efter djuroffer utarbetades histologiskt och färgas med hematoxylin och eosin (han) färgning. Antibakteriell aktivitet av varje dressing i samband med sårläkning undersöktes också i denna modell. Vår tidigare studie visat sårläkning prestanda i råtta och svin modellen på en minimalinvasiv kirurgisk teknik7. Eftersom det fanns sex brännskador på dorsum inom varje svin, var varje experimentella dressing testas och utvärderas i alla positioner för att minimera bias relaterade till såret läkningsprocessen i olika ställen på svin handryggen. Därför svin modell av svåra brännskador som fastställts i denna studie ger en ny metod för utvärdering av kliniska dressingar och underlättar utvecklingen av en ny behandling för brännskador. Denna studie ger avgörande verktyg för att avslöja patofysiologin av burn sårläkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden som omfattar animaliska ämnen har godkänts av Animal Care kommitté vid National Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C). Studien utfördes i laboratoriet Animal Center vid National Defense Medical Center. Svin som väger mellan 20 och 25 kg har varit framgångsrikt instrumenterad använder detta protokoll.
1. anpassning av djuren till människans hantering
- Efter ankomsten till anläggningen, hysa djuren solitarily men låt dem interagera med varandra.
- Ge djuren ad libitum tillgång till mat och vatten.
- Acklimatisera svin mänsklig hantering och transport från djuranläggningen till experimentella laboratoriet genom att hantera djur minst en gång om dagen i en vecka.
- Snabb djuret i minst 12 timmar före kirurgi för att förhindra illamående, kräkning och aspiration av magen vätskor.
2. sedering
- Före bränningen sår bildandet, lugna djur via en intravenös injektion med Zoletil 50 (25 mg/kg).
3. intubation och Ventilation
- Placera djuret på en tabell eller vagn i sternala position.
- Öppna munnen av djuret med en muntlig spridare.
- Vid otillräcklig avkoppling av jaws eller förekomsten av svälja reflexer, vilket hindrar intubation, mask svin med isofluran att framkalla sedering.
- Övervaka blodtryck, puls och kroppstemperatur av fysiologiska signalen monitor under operationen att förhindra potentiella komplikationer.
4. anestesi
- Inducera och bibehålla anestesi; företrädesvis söva djuret via en intramuskulär injektion av Tiletamin och zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg).
- Intubation djuret med endotrakealtub när muskelavslappning, kännetecknas av förlust av käken tonen och palpebrala bakåtböjda, observerades.
- Behålla alla svin i ett bedövningsmedel tillstånd vid en spridare inställning av 0,5 – 2,5% (v/v) isofluran fram till slutet av operationen.
- Undersöka djupet av anestesi genom att testa smärta reflexer med ett bakben tå nypa före operation. Vid behov, lägga till ytterligare anestesi eller vänta i några minuter. Kontrollera smärta reflexer regelbundet under hela operationen.
5. sterilisering av operationsområdet
- Raka och rengör huden på djuret över ett område på cirka 25 cm Bredd från ryggraden ända till axill på båda sidor.
- Skrubba den återfuktad hud med povidonjod scrub (75 mg/mL) under cirka 5 minuter.
- Ta bort povidonjod tvål från huden med hjälp av våta sterila Flor.
- Sterilisera huden med povidonjod lotion (100 mg/mL).
- Täcka djur med sterila kirurgiska draperier att minska bakteriell överföring och senare kontamination av operationsområdet.
6. Bränn såret skapandet
- Använda en kirurgisk märkning penna för att markera mitten av sex brännskador symmetriskt på dorsum av grisen. Se till att avståndet mellan varje brännskadan är åtminstone större än radien på såret (figur 1A).
- Fyll en modifierad lödkolv med 50 mL glycerin och infoga en elektronisk termometer i det att övervaka temperaturen. Den heta järnet äger ett platt område på cirka 9 cm2 (figur 1B).
- Hetta upp järnet till 137-139 ° C med en värmeplatta (figur 1 c).
- Skapa sex enhetliga brännskador genom att placera strykjärnet på det markerade området utan att tillämpa någon kraft i 30 sekunder (figur 1 c).
- Tvätta brännskador med 0,9% koksaltlösning (figur 1 d).
- Mät såret dimensioner och anteckna såret av fotomikrografi (figur 1E).
7. förberedelse av förband
- Täck varje såret med det inre kontakta skiktet av en fyra lager kliniska dressing genom direktkontakt. För detta lager, använda CAPS-innehållande dressing eller alternativa material (figur 1F).
- Applicera en vattentät film på kliniska dressing att fungera som en barriär mot bakteriell penetration (figur 1F).
- Täck varje såret med en kompress (0,5 cm tjock) och fixa med papperstejp att fungera som det mellersta lagret av förbandet (figur 1 g).
- Säkra gasväv med ett yttre lager av plåster. Utvidga detta lager i torso att undvika förskjutning av förbandet (figur 1 H-1J).
8. efter bränna vård och mätning
- Injicera svin buprenorfin (0,1 mg/kg, IM) för smärtlindring för varje 8-12 h, innan återvinning från anestesi, för en vecka börjat minska potentiella smärta.
- Ge grisen fri tillgång till foder och vatten.
- Ändra de kliniska dressingar varannan dag under de första 10 dagarna och sedan två gånger i veckan för den 6-veckors studie.
- Rengör och mät sår innan omtillämpa kliniska förband. Administrera bedövningsmedel under förbandsbyte.
- Spela in såret av fotomikrografi för jämförelse av såret helande kurs varannan dag under de första 10 dagarna och sedan två gånger i veckan för den 6-veckors studie.
- Beräkna den såret återepitelisation eller kontraktion som procentandelen av den ursprungliga sår storleken enligt en tidigare beskrivna metod. Analysen av sårslutning genomfördes en dubbel-blind sätt.
- Mäta bränna ärr med VSS, som består av fyra variabler: vaskularitet, höjd (tjocklek), följsamhet och pigmentering efter bränna dagar 0, 7, 21 och 42. Varje variabel har fyra till sex möjliga poäng. Totalen Poäng varierar från 0 till 14, whereby en poäng på 0 speglar normal hud.
9. bakterietillväxt experiment av efter bränna vävnader
- Svabba såret för antibakteriell testning efter bränna dagar 0, 7, 21 och 42.
- Placera provstickan i 100 mL 0.9% steril koksaltlösning och försiktigt vortex att uppnå en homogen suspension.
- Seriellt späd (10−1– 10−5) Homogenatet och platta 100 μL av varje utspädning i selektiva och icke-selektiva medier, respektive.
- Inkubera alla utspädningar under aeroba förhållanden vid 37 ° C i 24 – 72 timmar.
- Plattan tre exemplar alikvoter av 10 μL varje från alla spädningar på blodagar plattan kompletteras med 5% får blodet att isolera aeroba grampositiva organismer.
- Inkubera provet genom att sprida eller hälla provet jämnt på ytan av en agarplatta över natten för att fastställa antalet kolonibildande enheter (CFUs).
- Läs plattorna efter natten inkubation. Vänd på fåren blodagar plattan och dela botten av skålen i fyra lika kvadranter med hjälp av en markör och små härskare.
- Placera plattan på scenen av en dissektion Mikroskop och räkna kolonierna på varje tallrik. Definitionsmässigt måste en koloni ha minst 300 CFU att räknas.
- Räkna bakteriekolonier i varje av de tre replikat. Beräkna medelvärdet för tre replikerar. Bestämma CFU per platta genom att multiplicera det genomsnittliga värdet av slutliga utspädningsfaktorn.
10. dödshjälp och vävnad fixering
- Intravenöst injicera en överdos av natrium pentobarbital dödshjälp lösning (80 – 120 mg/kg).
- Utföra i klump excision av burn såret vävnad att inkludera den underliggande muskulaturn och omgivande oskadad vävnad.
- Fixa vävnader med 10% neutral buffrad formalin.
- Blanda 10 mL formaldehyd (37%) i 90 mL fosfatbuffrad lösning (PBS) och butik i 4 ° C.
- Överföra vävnader till fixativ och snurra behållaren för att säkerställa alla vävnader är helt nedsänkt i fixativ. Volymen av fixativ måste vara 30 gånger vävnad volymen.
- Fixa vävnader över natten vid 4 ˚C.
- Torka vävnader med etanol och bädda in i paraffinblock. Utför följande steg på 4 ° c på en shaker.
- Tvätta två gånger med PBS i 30 minuter.
- Torka vävnader med 70% etanol för 8 timmar, 80% etanol över natten, 95% etanol i 8 timmar, och sedan i 100% etanol över natten.
- Inkubera vävnader i 100% etanol i ytterligare 8 timmar.
- Inkubera vävnader i tre förändringar av xylen varje 30 minuter.
- Ersätt xylen med nymalen smält (52 ° C) vax och inkubera vid 52 ° C i en ugn i 1 timme.
- Ersätta vax med färska vax och inkubera vid 52 ° C i ugn i 3 timmar, och sedan ersätta gång och inkubera vid 52 ° C över natten.
- Inkubera vävnader med två fler ändringar av vax varje i 1 timme, och sedan bädda in vävnaden och förvaras vid 4 ° C.
- Klippa och färga avsnitten paraffin-inbäddat med han, och visualisera via ett ljusmikroskop med 100× förstoring.
- Skapa paraffin avsnitt med hjälp av en roterande mikrotom.
- Dewax avsnitt med tre ändringar av xylen varje i 3 minuter.
- Rehydrera vävnader med 100%, 95%, 80% och 70% etanol varje i 3 minuter, och sedan fördjupa i destillerat vatten.
- Fläcken med hematoxylin i 10 minuter, och skölj i rinnande vatten.
- Differentiera med 0,1% saltsyra etanol i 5 minuter, och skölj i rinnande vatten.
- Fläcken med 0,5% eosin i 1 minut.
- Torka vävnader med 70%, 80%, 95% och 100% etanol varje 2 minuter.
- Avmarkera färgningen med xylen och torka i dragskåp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burn varaktighet på 30 sekunder av varmt strykjärn resulterade i sår som var cirkulär med en väldefinierad marginal och enhetligt blek med en kant av erytem (figur 1 d). Inom varje djur fanns det sex brännskador på handryggen. Arrangemanget av brännskador var avbildad i figur 1 K. Brännskador var helt täckt med CAPS-innehållande dressing och används för att bedöma djupet av ärrbildning efter bränna dagar 0, 7, 21 och 42 och återepitelisation, som bestäms av brutto inspektion. Brännskador var åter epithelialized baserat på brutto inspektion efter bränna dag 42. Såret storlek i dessa djur var utvärderas för att fastställa de sårläkning takt (figur 2A). Sårområden var 9, 10, 8 och 3 cm2 efter bränna dagar 0, 7, 21 och 42, respektive. En betydande minskning i sårområdet observerades efter bränna dag 42 jämfört med dag 0. Den helande kursen definierades som det största genomsnittliga såret marginal avståndet från såret dividerat med tiden till fullständig sårslutning. Sår behandlas med CAPS-innehållande dressing visade en 73.43±6.33% sårslutning efter bränna dag 42 (figur 2B).
Figur 3 visar VSS poängen med avseende på ärret vaskularitet, följsamhet, pigmentering och höjd på efter bränna dagar 0, 7, 21 och 42. VSS Poäng nådde 7.4±0.5 efter bränna dag 21 och minskade till 3.33±0.58 efter bränna dag 42.
Alla djur offrades efter bränna dag 42. Prover av huden resected från varje efter djuroffer histologiskt preparerades och färgas av H & E. Histologic analys av proven bekräftade att fullhudsskador brännskador uppnåddes, och såren verkade helt läkt (figur 4). Nekros följd brännskador kunde observeras i epidermis, dermis och dermal komponenter av såret utan att signifikant påverka den underliggande muskeln (figur 4). Dermis tjockleken under experimentella förbandet var 5,4 mm (figur 4A). Dessutom den sårskorpa av dermis och lymfocytisk infiltration kan observeras i den H & E färgning, som indikeras av den röda pilen i figur 4B.
Experimentell förbandet antibakteriella egendom bestämdes med en CFU-analys efter bränna dagar 0, 7, 21 och 42. Resultatet visade en liten ökning i bakteriell cell nummer mellan efter bränna dag 0 och 21 följt av en betydande ökning efter bränna dag 42 (figur 5). Detta resultat tyder på att svin modell av svåra brännskador som fastställts i denna studie kunde användas för att övervaka kliniska prestanda för experimentell förband, inklusive antibakteriella egendom.
Figur 1. Bränna såret inrättandet och tillämpningen av en CAPS-innehållande kliniska dressing. Efter hårborttagning och förberedelse av huden med jod och alkohol, (A) kirurgiska märkning penna användes för att beskriva sex cirklar på handryggen, antingen sida av mittlinjen. (B) den modifierade järnet var fylld med glycerin och en elektronisk termometer infogas i glycerin att Visa temperaturen. (C) järnet värms till 137-139 ° C med en värmeplatta och sex enhetliga brännskador har skapats på märken i huden. För att skapa brännskador, placera det hett strykjärnet utan extern kraft på svins tillbaka huden (30 sekunder) för att skapa två fullhudsskador sår. (D) efter alla såren skapades, tvättades såren med 0,9% koksaltlösning. (E) skalorna placerades bredvid sår för att ta bilder. (F) det första skiktet är täckt med en test-dressing och det andra lagret med en vattentät film. (G) det tredje skiktet är täckt med gasväv av om 0,5 cm tjocklek och fast med tejp. (H-J) Säkra gasväv med ett yttre lager av plåster. Detta lager sträcker sig till bålen att undvika förskjutning av förbandet. (K) Schematisk bild av burn sår distribution. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Förändring av såret storlek i en svin-modell. (A) av sårslutning fastställdes som en procentandel av det ursprungliga såret på dag 0. Sår hade nästan helt avtalat på efter Bränn 42 dag och (B) av sårområdet observerades mellan 0 till 42 dagar efter en efter bränna djurmodell. Det visar den största minskningen efter bränna dag 42, uppvisar 90 ± 4% sår området stängning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. De genomsnittliga totala poängen av Vancouver ärr skala (VSS) med en dubbel-blind experimentell design på bränna efter dagar i en svin-modell. Ärr bedömning inkluderar pigmentering, vaskularitet, följsamhet och höjd av ärr. Lägre poäng indikerar ärret på villkor att nära approximerar normal hud (P = 0,0005). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Hematoxylin och eosin färgning på bränna efter dag 42. (A, B) den svarta inverterad triangeln indikerar den reparerade Bränn vävnaden. Morfologi av fullhudsskador såret var jämna och kontinuerliga och papillär lagret liknade funktioner av Hypertrofisk ärrbildning. Notera förekomsten av neo-överhuden som täcker sårytan. (B) den röda pilen anger de dermal connective silkespapper-infiltrerade inflammatoriska cellerna i bränna såret eschar ovan livskraftig dermis nedan. Ursprungliga förstoring, × 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. En bar diagram visar bakteriell räkna av sår vid olika tidpunkter. Antibakteriell aktivitet efter brännskada såret djurmodell på 0, 7, 21 och 42 dagar. Antibakteriell aktivitet utvärderades av kolonibildande enheter (CFU) analysen i tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föreliggande studie etablerat en svin modell av svåra brännskador och undersökte den modell som använder en CAPS-innehållande dressing. Våra resultat tyder på att denna svin modell kan användas för att övervaka kliniska prestanda för experimentell förband, inklusive antibakteriella egendom. Sårläkning takt, sårslutning och antibakteriell aktivitet analyserades också med hjälp av VSS, H & E färgning och antibakteriella test. Användningen av animaliskt burn modeller har utvecklats som ett värdefullt verktyg för att granska patofysiologin av brännskador. Det finns vissa biologiska fördelar med råttor som experimentella ämnen, inklusive antalet råtta-specifika reagens och de praktiska aspekterna av att erhålla transgena råttor, att upptäcka de molekylära signalvägar som är aktiv i återhämtningen processen. Den största nackdelen med råttor i en djur burn modell är dock dess underlåtenhet att helt ungefärliga mänskliga sårläkningsprocessen. Återepitelisation är den viktigaste helande metoden som observerats hos människor8, medan sårläkning hos råttor starkt beror på såret kontraktion i ett snabbt sätt9. Dessutom icke-sårbarheten hos råttor till hypertrofisk eller keloid ärrbildning bekräftade olikhet av deras sår återställningsprocessen från människor. Å andra har svin nyligen blivit föremål för forskare uppmärksamhet eftersom deras hud arkitektur är liknande till det av mänsklig hud. Dessutom uppstår sårläkningsprocessen i svin och människor genom fysiologiskt liknande faser såsom inflammation, spridning, återepitelisation och remodeling. I allmänhet läker brännskador hos svin av 21 dagar, med återepitelisation inträffar mellan 7 och 14 dagar efter sår åsamkandet10,11, som passar till tidslinjerna observerats hos människor. Svin visar också större sjuklighet jämför till råttorna på grund av deras kroppsstorlek som gör mer motståndskraftiga mot sårinfektion. Möss är oftast den första modellen som används för att utvärdera burn såret villkor olika behandlingar. Dessutom, till skillnad från andra däggdjur dela svin ett antal anatomiska och fysiologiska egenskaper med människor när det gäller processen för epithelialization, cellulär proliferation och angiogenes. Detta gör svin potentiellt en bättre modell, och de används ofta i efterföljande studier som visade lovande resultat i möss 12,13,14,15. Dessutom fördelningen av dermal kollagen och elastiska innehåll, kutan blodtillförsel, händelseförloppet i sårläkning och återepitelisation har gjort svin en standardmodell av sårläkning och rekonstruktiv kirurgiska behandlingar15 ,16,17,18. Inom varje djur, det fanns sex brännskador som ligger på övre, mellersta, och lägre tillbaka av svin och distribueras symmetriskt på ryggraden. Brännskador kan skapas på liknande platser men på olika svin. Därför, varje experimentella dressing kan testas och utvärderas på olika platser för att minimera bias relaterade till såret läkningsprocessen i olika ställen på svin handryggen. Dessutom denna svin modell av svåra brännskador som fastställts i denna studie också nytta av att säkerställa att varje svin serverar som sin egen kontroll med ett sår som får romanen behandling och den andra som fordonskontroll, leder till en betydande minskning av antal djur.
Förvaltningen av brännskador är en av de stora komplikationerna vid sårläkning. Den mänskliga läkande processen består av fyra biologiska processer: hemostas, inflammation, spridning och mognad. När läkningsprocessen är störd eller efterbliven, främjar det en fibroblastic spridning som resulterar i ett hypertrofiska ärr, som är synlig och tenderar att höjas ovanför den omgivande hud16. För att säkerställa reproducerbarhet och exakt kvantifiering, krävs tillräcklig vidhäftning med plåster omedelbart efter skadan att minimera förseningen i tid. Hudirritation är en vanlig reaktion från plåster som resulterar i ett utslag runt kliniska dressing. Således, försiktighet rekommenderas vid användning av för närvarande tillgängliga plåster att förhindra klåda. Efter aseptisk teknik och noggrant desinficering all utrustning (t.ex., bromsok) att undvika korskontaminering mellan svin är absolut nödvändigt.
Burn wound healing är en invecklad process. Ett antal faktorer har identifierats för att ha en negativ inverkan på sårläkningsprocessen som smärta, klåda och bakteriell kontamination. Smärta har en negativ inverkan på djurens kost. Utan tillräcklig näringsupptag är fördröjd sårläkning oundvikligt. Därför var varje svin injiceras med buprenorfin (0,1 mg/kg, IM) dagligen under 7 dagar att minska smärta. Födointag övervakades en vecka efter brännskadan sår skapandet. När en minskning i födointag observerades dag 7, buprenorfin (0,1 mg/kg, IM) administration fortsatte fram till dag 14. Bakteriell infektion, vilket är en potentiell risk för sårläkning, kan utlösa inflammation och ytterligare dämpa läkningsprocessen. Därför var kliniska förband täckta med vattentät filmer att förhindra och minimera risken för nedsmutsning. Klåda är en obehaglig del av sårläkningsprocessen. Svin kan repa sina egna tillbaka på marken för att minska klådan, vilket kan vara ogynnsamt för sårläkningsprocessen. En god dressing besitter egenskaperna för accelererande burn wound healing med en acceptabel ärr, förebygga infektion och inflammation, lindra smärta och tillåter lätt och tidig mobilisering19,20. Förbandet kan tas bort vid behov för ytterligare aktuella tillämpningar och/eller mätning av sår område21,22. Även tillämpa en fyra lager kliniska dressing till ett svin är en mer komplicerad och tidskrävande process än kliniska, tillåter svin modellen närmare tillnärmning till en mänsklig biologisk respons än musmodell. Många potentiella fördelarna med att använda svin modell gör en bättre plattform för prekliniska tester än andra arter.
Den kliniska effekten när det gäller såret stängning effektivitet och såret områdesförminskning övervakades med hjälp av ett CAPS-innehållande förband som avslöjade en 73.43±6.33% sårslutning efter bränna dag 42. Dessutom används VSS poäng, en validerad subjektiv skala poäng, också att bedöma sår hos svin i denna studie17. Det är viktigt att övervaka Hypertrofisk ärrbildning under behandling med experimentella dressingar, särskilt i kliniska prövningar18. Tillämpningen av tak vid behandling av brännskador resulterade i en betydande förändring i VSS noter efter bränna dag 42 jämfört med poängen på dag 21. Lägre poäng indikerar det skadade området försöker återställa till ett tillstånd som nära ungefärlig normal hud färg pigmentering, vaskularitet, följsamhet och höjd. Dessutom visade resultaten av H & E färgning ett intakt hornlagret lager i området CAPS-behandlade. Detta resultat tyder på att svin modell av en svår brännskada kan användas på ett tillförlitligt sätt att utvärdera de sårområdet, sårslutning, VSS Poäng och helande framsteg.
Detta protokoll representerar många detaljerade steg för att demonstrera användningen av en experimentell dressing på en svin modell av svåra brännskador och kan tillämpas på utvärderingen av alla typer av kliniska dressing. En modifierad lödkolv fylld med 50 mL glycerin är kan hålla temperaturen inom 137-139° C vid skapandeprocessen av såret. Denna metod har dock begränsningar såsom oförmåga att helt efterlikna verkliga brännskadatemperaturen och smala burn skapade området på grund av lödkolv tillämpningsområdet. Men övervinna de främsta fördelarna med metoden dessa begränsningar. Denna modifierade järn kan användas för att skapa konsekventa sår med precision och lätthet jämfört med de traditionella metoderna. Denna modell ger dessutom en känslig åtgärd i fysiologiska och patofysiologiska svaret av en termiska brännskador under behandling av olika kliniska förband. Fördelen med den föreslagna modellen, förutom de ekonomiska fördelarna, är att det är lätt att hanteras av dem med relativt lite kirurgisk erfarenhet. Tillämpning av kliniska dressing att såren i svin modellen härmar de biologiska processerna av mänskliga sårläkning. Därför underlättar svin modellen för allvarliga brännskador etablerade och testade med kliniska dressing i denna studie utvecklingen av ny behandling för brännskador. Denna studie ger avgörande verktyg för att avslöja patofysiologin av burn sårläkning. Avslutningsvis ger denna svin modell en lätt att lära, kostnadseffektiv och robust metod för att bedöma effekten av kliniska förband i svåra brännskador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ett bidrag från Tri-Service allmänna sjukhuset; National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C107-042); Ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (de flesta 106-2314-B-016-014); och National Defense Medical Center (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sedation: | |||
| Ketamine | Merial | 2528 ESP | 10 mL vial |
| Azaperone | China chemical & pharmaceutical | 47W406 | 100 mL vial |
| Atropine | Oriental chemical works | IN120802 | 1 mL vial |
| Anesthetic: | |||
| Tiletamine+Zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Isoflurane | Baxter | N002A225 | 100 mL vial |
| Surgery: | |||
| Hair clippers | Moser | - | - |
| Povidone iodine scrub solution | Ever star | HA161202 | 4 L barrel |
| Modified iron | - | - | - |
| 0.9% saline solution | CHI SHENG | KC130 | 500 mL vial |
| Gauze | China Surgical Dressings Center | MO15900080 | 10 x10 cm |
| CAPS | CoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan | - | - |
| Paper tape | 3M | NDC-8333-1530-01 | 2.5 cm x 9.1m |
| Waterproof film | 3M | NDC-8333-1600-40 | 10 cm x 10 m |
| Adhesive plaster | Young chemical | BH1426015 | 10 cm x 10 m |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (14 cm) | Shinetec instruments | ST-S114 | - |
| Halstead-Mosquito (12.5 cm) | Shinetec instruments | ST-H012 | - |
| Handle(# 4) | Shinetec instruments | ST-H004 | - |
| Surgical Blade(#21) | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml Plastic centrifuge tube | Falcon | 352070 | - |
| 10% neutral buffered formalin | Leica | 3800604EG | - |
| Bacterial Growth Experiments | |||
| Blood agar plate (BAP) (TSA with 5% sheep blood) | CMP | - | 90 mm Mono |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regeneration. 17, 1-18 (2009).
- Verhaegen, P. D., et al. Differences in collagen architecture between keloid, hypertrophic scar, normotrophic scar, and normal skin: an objective histopathological analysis. Wound Repair Regeneration. 17, 649-656 (2009).
- Experimental Surgery and Physiology: Induced Animal Models of Human Disease. Swindle, M. M., Adams, R. J. , Williams and Wilkins. Baltimore. (1988).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine as Models in Biomedical Research. , Iowa State University Press. Ames. (1992).
- Advances in Swine in Biomedical Research. Vols 1-2. Tumbleson, M. E., Schook, L. B. , Plenum Press. New York. (1996).
- Wang, C. H., et al. Enhanced wound-healing performance of a phyto-polysaccharide-enriched dressing - a preclinical small and large animal study. International Wound Journal. 14, 1359-1369 (2017).
- Rowan, M. P., Cancio, L. C., Elster, E. A., Burmeister, D. M., Rose, L. F., Natesan, S., Chan, R. K., Christy, R. J., Chung, K. K. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Journal of Critical Care. 19, 243 (2015).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 969618, 8 (2011).
- Gaines, C., Poranki, D., Du, W., Clark, R. A., Van Dyke, M. Development of a porcine deep partial thickness burn model. Burns. 39, 311-319 (2013).
- Gnyawali, S. C., Barki, K. G., Mathew-Steiner, S. S., Dixith, S., Vanzant, D., Kim, J., Dickerson, J. L., Datta, S., Powell, H., Roy, S., Bergdall, V., Sen, C. K. High-resolution harmonics ultrasound imaging for non-invasive characterization of wound healing in a pre-clinical swine model. PLoS One. 10 (3), e0122327 (2015).
- Eaglstein, W. H., Mertz, P. M. New methods for assessing epidermal wound healing: the effects of triamcinolone acetonide and polyethelene film occlusion. Journal of Investigative Dermatology. 71, 332-384 (1978).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Sciences. 25, 1-10 (1998).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging and Experimental Techniques. , 2nd ed, CRC Press. Boca Raton. (2007).
- Mertz, P. M., et al. IL-1 as a potent inducer of wound re-epithelization. Progress in Clinical and Biological Research. 365, 473-480 (1991).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translation Medicine. 6, 265-266 (2014).
- Aryza, M. J., Baryza, G. A. The Vancouver Scar Scale: an administration tool and its interrater reliability. The Journal of Burn & Rehabilitation. 16, 535-538 (1995).
- Bystrom, A., Claesson, R., Sundqvist, G. The antibacterial effect of camphorated paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of infected root canals. Endodontics & Dental Traumatology. 1, 170-175 (1985).
- Reig, A., Tejerina, C., Codina, J., Hidalgo, J., Mirabet, V. Application of a new cicatrization dressing in treating second-degree burns and donor sites. Annals of Burn and Fire Disasters. 4, 174 (1991).
- Hindy, A. Comparative study between sodium carboxymethyl-cellulose silver, moist exposed burn ointment, and saline-soaked dressing for treatment of facial burns. Annals of Burn and Fire Disasters. 22, 131-137 (2009).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 13505-13510 (2009).
