Summary
本文介绍了一种简便、有效的测量哺乳动物细胞中大块自噬性螯合活性的协议。该方法以定量测定乳酸脱氢酶 (ldh) 在 sedimentable 细胞分数与总细胞 LDH 水平的比例。
Abstract
大块自噬的特点是将大部分细胞质封存成双/多膜结构, 称为自噬体。这里介绍了一个用于监视此过程的简单协议。此外, 还提供了不同类型培养哺乳动物细胞在自噬诱导条件下的典型结果和实验验证。在大块自噬期间, 自噬体封存细胞质, 从而也可溶胞浆蛋白, 连同其他自噬性货物。乳酸脱氢酶是一种稳定、高度丰富的可溶性胞浆酵素, 无选择性地将其自噬体。因此, LDH 螯合的数量反映了散装自噬性封存的数量。为了有效、准确地测定细胞中 LDH 的封存, 我们采用了一种基于 electrodisruption 的分馏协议, 有效地将 sedimentable 与胞浆 ldh 分离, 其次是 sedimentable 酶活性的测定。分数与全细胞样本。自噬性螯合是通过从治疗细胞中减去未经处理细胞中 sedimentable LDH 的比例来确定的。LDH 螯合法的优点是它能定量测量内源性货物的自噬性封存, 而不是其他涉及螯合探针或半定量蛋白酶的异位表达的方法。自噬标记物或受体的保护分析。
Introduction
自噬 (希腊语为 "自我吃") 是一个进化保守的过程, 泡/溶酶体降解细胞内物质。在发现自噬相关的 ("ATG") 基因, 这是重要的是在酵母和人类的自噬, 并认识到自噬在人类健康和疾病中发挥重要作用 (承认2016诺贝尔医学或生理学奖, 以Ohsumi), 自噬已迅速成为细胞生物学1,2最强烈的研究过程之一。
Macroautophagy (以下简称 "自噬") 的特点是将胞内膜池 ("phagophores") 扩展和折叠成密封、双层或多膜结构 ("自噬体"), 有效地封存从细胞质的其余部分包裹材料。自噬体与溶酶体融合后, 内 autophagosomal 膜和螯合货物均被降解和回收。自噬体可以在随机 (非选择性自噬) 和选择性 (选择性自噬) 方式中封存细胞质材料。大块自噬很可能代表了非选择性和选择性自噬的混合。
在1960代和70代 (自噬研究的 "形态学时代"), 自噬性封存主要通过超微结构分析来评估。在1980代和开始的1990代 ("生物化学时代") 每 Seglen 和同事-谁研究了自噬在主要鼠肝细胞-开发了第一种方法定量测量自噬性封存活动3。使用这些化验, Seglen 定义和描绘了自噬性溶酶通路4,5的不同步骤, 发现和铸造 amphisome6 (endosome autophagosome 融合的产物), 是第一个描述蛋白质磷酸化在自噬规则7中的作用。然而, 在 ATGs 的发现以后在1990代 ("分子时代") 和第一个描述哺乳动物 ATG8 蛋白质, 微管伴生的蛋白质 1 a/1 b 光链子 3 (LC3) 在 2000年8, 使用 ATG 蛋白质作为标记为自噬性过程迅速获得普及, 并留下了更古老和更费力的生化方法。事实上, 在过去的18年中, LC3 的印迹和荧光显微分析已经成为目前为止最受欢迎的 (在许多情况下, 唯一的) 方法研究哺乳动物细胞的自噬。好处是这些方法的相对易用性可以进行。缺点是, 一个是研究车组件 (LC3) 而不是实际的自噬性货物。这是一个相当严重的劣势, 因为 LC3 的状态和/或通径与货物的封存和通量之间的关系是非常不清楚的。事实上, 我们已经表明, 尽管在细胞9中存在共轭 LC3, 但在没有 LC3 通量的情况下, 散装货物流量可以保持在高水平。此外, 我们证明了大体积自噬不受有效 LC3 损耗的影响, 因此很可能是 LC3-independent9。这一发现后来得到了10,11LC3 的研究证实, 这也表明, 依赖于 mitophagy (选择性自噬线粒体) 是独立的 LC310,11.
总而言之, 显然需要以货物为基础的化验来监测自噬性活动。最佳的这种化验应广泛适用, 定义明确, 易于执行。在过去的几年中, 我们对 LDH 螯合法的研究特别感兴趣, 这是在1980的12中由每 Seglen 开发的, 并以测量胞浆 ldh 为 sedimentable、自噬性液泡细胞的方法为基础。分数。乳酸脱氢酶是一种稳定的可溶性胞浆蛋白, 在 phagophores 包裹细胞质货物时易于相互隔离。因此, LDH 的封存是自噬性封存的一般措施。LDH 是完全退化的自噬性溶酶通路12。因此, 在酶抑制剂的存在,例如, bafilomycin A1 (生物滤池)13, 实验治疗效果直接反映了自噬性螯合活动的变化。在没有降解抑制剂的情况下, 可以测量 LDH 螯合和降解的改变的净效应。
乳酸脱氢酶螯合的测定是广泛适用的, 因为 ldh 是高度和无所不在表达的所有细胞类型, 和 LDH 水平可以准确地量化的酵素化验14,15。然而, 最初的协议12 -建立在原发鼠肝细胞-是相当耗时, 需要大量的启动材料以及一个定制的放电电容器。以循序渐进的方式, 我们已逐步将该检测转化为一种简便、通用的方法。首先, 原始的协议被适应了用于哺乳动物细胞线16。第二, 该方法实质上是缩小3,9。第三, 消除了协议中的几个步骤, 包括一个费力的密度缓冲步骤17。这同时使方法的进一步降尺度, 从最初的起点使用 10 cm 板材每样品16使用一个井从12井板材每样品 (即, 大约15倍较少开始材料)17。第四, 我们确定了一种商用电穿孔装置, 可取代自定义的放电电容器17。
在这里, 我们最新的乳酸脱氢酶封存试验的协议, 其中包括一些进一步简化的方法与以前发表的17相比, 提出。同时, 给出了一系列不同细胞类型的典型结果, 并给出了利用药理学和遗传击倒和剔除方法进行多行实验验证的方法。有关整个协议的总体流程方案, 请参见图 1。
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Protocol
1. 细胞播种和治疗
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培养黏附细胞在 75 cm2组织培养烧瓶在一个湿式孵化器与 5% CO2在37°c, 使用优选的培养基为有关的细胞类型。允许细胞生长, 直到它们到达接近汇合的细胞层。
注: 使用 RPMI 1640 培养基辅以10% 胎牛血清 (血清), 用于 LNCaP、HEK293、小鼠胚成纤维细胞 (MEFs)、BJ、MCF-7 和 RPE-1 细胞。- 用3毫升37摄氏度磷酸盐缓冲的生理盐水 (PBS) 冲洗细胞, pH 值为7.4。更换 PBS 与3毫升 0.25% (瓦特/v) 胰蛋白酶-ethylenediaminetetraacetate (EDTA), 并孵化瓶在一个湿润的孵化器与 5% CO2在37°c, 直到细胞分离 (2–5分钟)。
- 并用重悬7毫升培养基中含有10% 个血清的分离细胞。在离心管中混合10µL 细胞悬浮整除与10µL 0.4% 台盼蓝, 使用0.5–20µL 吸管尖。使用相同的吸管尖端立即填充计数室幻灯片, 并计算自动单元格计数器中的单元格。
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使用含有10% 种血清的培养基, 并在12井组织培养板 (表面积 ~ 3.8 厘米2) 的每个井中使用无菌, 准备一个适当稀释 (见下文) 的细胞悬浮液1.1。2技术。允许生长在一个湿润的孵化器与 5% CO2在37°c, 直到达到所需的细胞密度,例如, 60–90% 汇合在收获。
注: 适当稀释的细胞悬浮, 将给予所需的细胞融合在收获将不同的细胞类型, 细胞类型, 以及根据时间和类型的实验治疗。因此, 在每种情况下都必须进行经验评估。- 对于将在播种后2天处理和收获的实验, 种子 2.5 x 105 LNCaP, HEK293 或 MCF-7 细胞, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ, 或 1.5 x 10 5 RPE-1 细胞在12井板的每个井。
- 对于松散粘附的单元格, 请在所讨论的单元格类型上涂上所推荐的涂层类型。对于 LNCaP (和 HEK293) 细胞使用涂覆聚 d-赖氨酸 (PDL) 的板材。
- 为此, 增加500µL PDL 在2.5 µg/毫升在不育 H2O 对每个井, 并且在无菌环境中孵化板材在室温下 (20–25°c)。用吸力去除 PDL, 用1毫升不育的 H2O 简单地洗涤每个井。
注意: 一般情况下, 步骤1.2.1 是在没有任何实验治疗的情况下完成的。然而, 如果执行 rna 干扰, 它可能是方便的开始反向转染与播种9。
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在每一个条件下进行重复或三个井的实验治疗。
- 例如, 治疗细胞与50毫微米 mTOR 抑制剂 Torin1, 这通常是一个有效的诱导自噬性螯合, 或通过洗涤细胞与急性血清和氨基酸饥饿的1毫升氨基酸无酸厄尔的平衡盐溶液 (EBSS) 培养基, 然后在 5% CO2在37摄氏度的湿润孵化器中孵化1毫升 EBSS 的细胞。
- 留下一组未治疗的水井, 以确定 sedimentable LDH 的背景水平。
- 添加一个饱和量的后固位抑制剂 bafilomycin A1 (曝气生物滤池)3,13,16,18在缺乏或存在的实验治疗, 3–4 h 细胞前收获。孵化细胞在一个湿润的孵化器与 5% CO2在37摄氏度。
- 使用 100 nm 生物滤池 LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 和 RPE-1 细胞, 10 nm 生物滤池 MEFs。
- 对于只有 3–4 h (如步骤1.3.1 典型的例子) 的实验治疗, 同时添加曝气生物滤池处理。对于更长的实验治疗, 等到3-4 小时收获前, 并添加2µL 的500x 浓缩曝气生物滤料直接进入培养基。
- 在添加曝气生物滤池后立即搅拌板。在这一点上也可推荐添加 macroautophagic 螯合抑制剂作为控制,例如, 10 毫米的泛磷脂3激酶 (PI3K) 抑制剂 3-甲基腺嘌呤 (3MA)19, 或10µM 的选择性 PI3K 类 III。抑制剂 SAR-40520。
2. Electrodisruption 的细胞收获和制备
- 在治疗期结束时, 吸入培养基与吸力, 并添加200µL 细胞脱离解决方案 (预加热到37°c) 每井。孵育37摄氏度, 直到细胞分离 (通常约5分钟)。
注: 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA 可代替细胞脱离溶液, 后者含有 DNase, 有助于降低分离细胞的粘度。只要培养基完全吸气, 在加入胰蛋白酶-EDTA 或细胞脱离溶液之前, 不需要清洗细胞。 - 添加500µL 室温 (20-25 °c) PBS, pH 7.4, 含 2% (瓦特/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 每一个井, 并并用重悬与吸管, 直到没有细胞团簇是可见的。立即将细胞悬浮液转移到冰上的1.5 毫升离心管上。
注: 除非另有说明, 在冰上执行所有后续步骤。 - 通过离心 400 x g 5 分钟, 在4摄氏度沉积细胞。
- 彻底吸入上清液 (带吸力), 使细胞颗粒尽可能干燥。
- 添加400µL 10% (瓦特/v) 蔗糖 (在超纯 H2O) 到每管。
3. 血浆膜 Electrodisruption 分离 Sedimentable 和总细胞分数
- 并用重悬细胞颗粒与吸管获得近单细胞悬浮, 并将其转移到4毫米电穿孔试管。
注: 吹打10–15倍, 使用100–1,000 µL 吸管提示, 通常是足够的。 - 将试管在一个指数衰减波 electroporator, 并放电一个单一的电脉冲在 800 V, 25 µF, 400 Ω;这些设置产生一个8毫秒的脉冲。
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使用新的吸管尖端转移细胞 disruptate 到一个1.5 毫升离心管, 其中包含400µL 冰-冷磷酸盐缓冲蔗糖溶液 (100 毫米磷酸钠, 2 毫米 dithiothreitol (德勤), 2 毫米 EDTA, 和1.75% 蔗糖, pH 7.5), 并简单地混合吹打.
- 可选: 为了验证高效的等离子膜 electrodisruption17, 在0.4% 毫升离心管中混合10µL 的稀释细胞 disruptate 从步骤3.3 到10µL 1.5 台盼蓝。转移到计数室, 并验证台盼蓝阳性细胞的百分比为 > 99%。
- 在室温下 (20–25°c) 将样品留在计数室中30分钟, 并验证台盼蓝阳性细胞的百分比保持在 > 99%。
- 可选: 为了验证 electrodisruption 是否过于苛刻, 即它没有扰乱胞内细胞器, 执行上述步骤 1.1–3.3, 但使用更大的起始材料 (井从6井板与80% 汇合细胞层),并使用150µL 10% 蔗糖在步骤2.5 和150µL 磷酸盐缓冲蔗糖溶液没有在步骤3.3。
- 在一个50毫升离心机中, 使用吸管在1.2 毫升密度缓冲液 (µL) 密度梯度介质 (g, 8% Nycodenz, 2.2% 毫米磷酸钠, 1 蔗糖, 2 毫米 EDTA) 上, 仔细200层稀释细胞 disruptate 溶液的顶部。管。离心机在 2万 x g为45分钟在4°c 在离心以软模式作用 (为温和的加速度和减速), 并且小心地把管子放在冰上。
- 小心去除60µL 的200µL 顶部分数, 确保不拿起任何密度梯度介质溶液, 并转移到一个新鲜的离心管。
注: 这应包含细胞质的特殊纯度, 称为 "细胞 sap"21。 - 通过使用标准技术和4–20% 梯度凝胶16, 测试在上述步骤中获得的分数的纯度, 通过对细胞器所含蛋白质进行印迹分析。
- 执行例如免疫印迹法蛋白酶 B21、细胞色素 c 和蛋白质二硫化物异构酶, 以验证步骤3.2 中的电击不会分别干扰溶酶体、线粒体或内质网, 应用免疫印迹乳酸脱氢酶检查细胞液中胞浆蛋白的存在。
- 同时, 对来自总细胞 disruptate 溶液16的蛋白质提取物进行免疫印迹法, 以确认所使用的抗体能检测到正在评估的胞器包含的蛋白质。
- 可选: 为了验证高效的等离子膜 electrodisruption17, 在0.4% 毫升离心管中混合10µL 的稀释细胞 disruptate 从步骤3.3 到10µL 1.5 台盼蓝。转移到计数室, 并验证台盼蓝阳性细胞的百分比为 > 99%。
- 对每个示例重复步骤3.1–3.3。
- 从每个稀释细胞 disruptate 溶液中除去550µL (在步骤3.3 中获得) 到2毫升离心管, 含900µL 冰泥沙缓冲器 (50 毫米磷酸钠, 1 毫米, 毫米 EDTA, 1 个蔗糖, pH 5.9%) 补充 7.5 BSA 和0.5%Tween-20, 并简单地混合吹打。
- 离心机在 1.8万 x g 45 分钟在4°c 生产含有 "沉淀 LDH" 的小球。彻底吸入上清液 (带吸力), 使小球尽可能干燥。把样品放在-80 摄氏度的冰箱里。
- 转移150µL 从每个稀释的细胞 disruptate 解答 (获得在步 3.3) 到新的管子, 并且放置样品在-80 °c 冷冻机。使用这些示例可以确定单元格中的 "总 LDH" 级别。
注意: 在这一点上, 实验可以暂停, 只要需要。
4. ldh 酶活性的提取和测定
- 解冻 "沉淀 ldh" (从步骤 3.6) 和 "总 LDH" 样品 (从步骤 3.7) 冰。
- 添加300µL 的冰冷泥沙缓冲液, 含有1.5% 的海卫 X-405 到 "总 LDH" 样品 (产生最终的海卫一 X-405 浓度 1%)。在冷室 (4–8°c) 的滚筒上旋转样品30分钟。
- 添加750µL 的冰冷泥沙缓冲器与1% 海卫 X-405 的 "沉淀 LDH" 样本, 并并用重悬颗粒与吸管, 直到达到均匀的解决办法。
- 离心机从步骤4.2 和4.3 的样品 1.8万 x g 5 分钟在4°c 到沉积难溶细胞碎片。
- 混合4个部分冷65毫米咪唑 (ph 7.5)/0.75 毫米丙酮酸与冷65毫米咪唑 (ph 7.5)/1.8 毫米 NADH 的一部分, 以获得一个工作解决方案, 稳定至少三周在4摄氏度。
- 混合3–30µL 的上清液从步骤4.4 与200µL 的步骤4.5 工作解决方案。
- 通过测定 ldh 酶活性, 测定 ldh 的含量, 当烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (还原型) (NADH) 吸光度在37摄氏度时, 与已知 LDH 浓度的标准相比, 其吸收率降低 340 nm。在反应接近完成之前进行吸光度测量,即直到 340 nm 的吸光度不再随时间变化。
注: 这是测定 LDH 活性的经典生化方法。虽然目前的协议执行的反应在37摄氏度, 它也可以执行在室温 (20–25°c), 这是可取的, 如果做手动分光光度法。目前的协议使用机器人 multianalyzer 仪器, 在一个自动化的方式混合样品与工作解决方案在一个96井板, 并衡量吸收率在 340 nm 37 °c 每二十年代3分钟。此后, 该仪器软件计算的浓度的 LDH, 表示为单位 (U)/L, 通过比较的吸收量测量的斜率相比, 通过校准获得的标准曲线与标准的已知 LDH浓度。这一方法的线性检测范围是 30–1,500 U/L。作为替代, 有各种各样的商业可用的试剂盒来测量 LDH 存在。其中一些是基于将酶反应与比色或荧光产物的生成相耦合, 使其他方法比紫外分光光度法检测, 以及其他线性检测范围。
5. 乳酸脱氢酶螯合的计算
- 计算每个样品的沉淀 ldh 对总 ldh 的百分比, 并考虑稀释和取样:
沉淀 LDH (%) =
注: 在步骤3.1–3.3 大约50µL 丢失由于转移入和出电穿孔试管。因此, 计算从750µL (而不是800µL) 稀释细胞 disruptate 在步骤3.3。 - 减去未经处理的细胞 (步 1.3.2) 样品中获得的沉淀 ldh 的百分比, 从实验治疗细胞中获得的沉淀 ldh 的百分比, 除以曝气生物滤池的治疗时间, 以获得取样期间每小时隔离 LDH:
螯合 LDH (%/小时) =
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Representative Results
使用这里描述的协议, 大量自噬性螯合活动在许多不同的哺乳动物细胞系, 包括 LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, 小鼠胚胎成纤维细胞 (T47D), U2OS,HEK293、BJ 和 LNCaP 细胞进行了测量。在基本条件下 (在完全营养丰富的培养基中), 或者在急性饥饿的血清和氨基酸细胞 (一种真正的自噬诱导条件22) 下, 对螯合进行评估。结果表明, 在饥饿条件下的乳酸脱氢酶螯合活性在不同细胞系上有很大差异, 从 LAPC4、DU145、Huh7 和 PNT2 细胞 (未显示的数据) 到 LNCaP 细胞的 1.6%/小时的检测水平不等 (图2 A)。在饥饿的原代大鼠肝细胞中观察到的速率高于上述细胞系, 通常从 2.5–4%23。在基本条件下, 乳酸脱氢酶的螯合几乎无法检测到一半的细胞系测试, 并从约 0.2%/小时到 0.5%/小时的另一半 (数据没有显示)。在显示可检测到的基底自噬性吸收活性的细胞系中, 急性血清和氨基酸饥饿通常会导致 LDH 封存率的3–4倍增加 (如图 2所示的 LNCaP 实验)。在被测试的细胞线 (上面提到), 从未处理的细胞 (步 1.3.2) 样品获得的沉淀 LDH 的背景百分比通常在2–3% 附近。从不同细胞系进行的22项独立实验中, 沉淀 LDH 值 (% 沉淀 ldh) 与治疗复制的实验性变异系数 (cv) 为 5.8% 1.7% (average% CV), 范围从3.0–9.0%。这些数字一起表明了在哺乳动物细胞中进行 LDH 螯合检测时应期待的情况。
使用化学抑制剂以及基因击倒和敲除方法, 广泛地证实乳酸脱氢酶螯合物的测定能可靠地测量自噬性的吸收活性。Autophagosome 组需要活性 PI3K III. 类 (PIK3C3) 和 Unc-51, 如自噬活化激酶 (ULK)24, 以及细胞内钙2 +稳态16的平衡。如图 2所示, pan-PI3K 抑制剂3MA、选择性 PIK3C3 抑制剂 SAR-40520或 ER Ca2 +泵抑制剂 thapsigargin (TG) 完全废除了基底和饥饿诱导的 LDH 螯合物;25 LNCaP 细胞。在饥饿条件下的 LDH 螯合 (改用无氨基酸的厄尔的平衡盐溶液 (EBSS) 培养基) 也强烈地减少了 TG, 或由 ULK 抑制剂 MRT67307 HEK293 细胞 (图 2B)。此外, 饥饿导致的 LDH 螯合在 MEFs (图 2C)、BJ (图 2D)、MCF-7 (图 2E) 和 RPE-1 (图2F) 中一直受到3MA 的抑制。细胞。一般而言, 仅在 EBSS 培养基中培养细胞 (即在没有曝气生物滤过剂或其他固后抑制剂) 的情况下, 不会导致任何可测量的蓄积乳酸脱氢酶 (如图 2所示的 LNCaP 实验)。A). 这是可能的, 因为急性氨基酸饥饿导致加速自噬性溶酶酶的通量, 导致快速和持续退化的螯合酶。
接下来, 各种 ATG 基因敲除 (高) MEFs 被用来测试是否 LDH 螯合需要的自噬相关基因报告是必不可少的 autophagosome 形成。事实上, 饥饿导致的 LDH 螯合被废除在 ATG5 高 MEFs26 (图 3A), 确认我们以前的调查结果9。此外, 如图 3B和3C所示, 饥饿引起的 LDH 螯合在 ATG7 MEFs27和 ATG9A MEFs28也会减弱。
最后, 对乳酸脱氢酶的固位试验进行了试验, 研究了 ATG 基因转录的干扰性沉默是否能抑制饥饿诱导的螯合活性。事实上, 转染 ATG9A-targeting siRNA, 或联合靶向 ULK1 和 ULK2, 强烈减少在 LNCaP 细胞饥饿条件下的 LDH 螯合 (图 3D)。此外, 我们确认了我们以前的研究结果3,9 , 目标的焦点黏附分子激酶家庭互动蛋白 200 kDa (FIP200) 或联合靶向γ-丁酸 a (GABAA) 受体相关蛋白 (GABARAP) 家庭成员抑制饥饿引起的 LDH 螯合 (图 3D)。
图 1: LDH 封存协议的总体流程方案.该协议是基于一个12良好的组织培养板格式, 使用指定的体积每个样本 (从一个井)。该检测协议可以方便地分为两个单独的工作日, 如所示。但是, 在一天内完成整个过程也是可能的。缩写: ABB, 在爆炸缓冲之后 (参见步骤3.3 在协议为组分);RSB, 泥沙缓冲 (参见步骤3.5 在协议为配料)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 用自噬抑制化合物验证 LDH 螯合物的含量.(A) LNCaP 细胞要么未经治疗 (为背景减法: 见步骤 1.3.2) 在完全生长培养基 (厘米;RPMI 1640 + 10% 胎牛血清 (血清), 或者用甲基亚砜汽车 (0.1%) 或 100 nM 曝气生物滤池在 CM 或血清和氨基酸游离培养基 (EBSS) 治疗。另外, 如所示, 部分细胞以 3MA (10 毫米)、SAR-405 (10 µM) 或 Thapsigargin (300 nM) 治疗。经过3小时的治疗, 细胞被收获, LDH 的封存率被确定为详细的现行议定书。(B) HEK293 细胞用甲基亚砜汽车 (0.1%) 在厘米, 或与100纳米曝气生物滤池在 EBSS, 如所示。此外, 有些细胞接受了10µM MRT67307 (ULK 抑制剂) 或 300 nM Thapsigargin。在3小时的治疗后, 乳酸脱氢酶的截留率被确定。(C)如所示, MEF (C)、BJ (d)、MCF-7 (E)、或 RPE-1 (F) 细胞用 CM (0.1%) 厘米或与曝气生物滤池 (在 C 中, 100 nm 在 D F 中) 进行处理, EBSS 有或不超过10毫米3MA。在3小时的治疗后, 乳酸脱氢酶的截留率被确定。A、B、D、E 和 F 显示从一个实验 (n = 1) 到三个生物复制 (三个井) 的平均值值, 误差条表示标准偏差。C 显示三独立实验 (n = 3) 的平均值, 误差线表示平均值的标准误差。*p < 0.05, **p < 0.001, 重复样本单向方差分析。
图 3: 通过挖空 (C) 或击倒 (D) 方法验证 LDH 螯合试验.(丙)ATG5 野生型 (重量) 或挖空 (高) MEFs (A), ATG7 或高 MEFs (B), 或 ATG9A 重量或高 MEFs (C) 被处理的亚砜汽车 (0.01%) 在 CM, 或与 10 nM 生物滤池在 EBSS, 如所示。在3小时的治疗后, 乳酸脱氢酶的截留率被确定。平均值从四 (A; n = 4) 或三 (B 和 C; n = 3) 独立实验, 用误差条表示平均值的标准误差。*p < 0.05, 重复样品双向方差分析。生理盐水, 不重要。(D) LNCaP 细胞以 5 nm 的 nontargeting 控制 siRNA (siCtrl) 反向转染, 或以5纳米的 ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2, GABARAP, GABARAPL1, 或 GABARAPL2-targeting siRNA oligoes, 如所示。48小时后, 这些细胞要么用甲基亚砜汽车 (0.1%) 在 CM, 或与 100 nM 生物滤池在 EBSS, 如所示。在3小时的治疗后, 乳酸脱氢酶的截留率被确定。显示的是平均值从三生物复制 (三个井) 从一个实验 (n = 1), 以误差条代表标准偏差。
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Discussion
总之, 这里描述的协议是一种可靠和广泛适用的方法来监测哺乳动物细胞中的大块自噬性封存活动。与原来的方法12,16相比, 我们已经删除了一些不必要的步骤, 简化了几个剩余的步骤, 并引入了一个实质性的降尺度。因此, 该协议在成本和时间效率方面有了很大的改进, 与原始协议相比, 现在可以在不到一半的时间内处理相同数量的样本。对于24个样本, 步骤 2–3 (1 天) 需要大约½ h 的准备工作和 3 h 的有效工时, 而步骤 4 (天 2) 可以执行在 ~ 2 h (时间估计, 因为所有必要的缓冲区事先准备)。由于在1天的化验通常是在细胞治疗之前, 包括 3–4 h 孵化与曝气生物滤过或其他抑制剂的 autolysosomal LDH 降解, 这是方便分两天的化验。然而, 也有可能在一天内完成整个化验。在这种情况下, 在步骤3.6 和3.7 中, 可以节省对液氮中的样品进行快照冻结的时间。尽管没有使用当前的协议进行测试, 但可能会完全跳过冻融步骤, 因为在没有此步骤23的情况下, 在原发鼠肝细胞中进行了更精细的化验。
此处提供的协议可以相对轻松地执行。值得注意的是, 在吹打中准确是很重要的, 因为该检测包括几个取样和稀释步骤。此外, 上清的愿望应该彻底完成, 以便在步骤2.5 中的蔗糖细胞悬浮液中存在少量的离子, 因此尽可能少的胞浆 LDH 会污染步骤3.6 中的沉淀物质。这里所描述的化验方法对于广泛的起动材料是灵活的。例如, 在 LNCaP 细胞中, 我们成功地使用了一系列不同数量的细胞在收获, 跨越多达10倍的差异 (从 2.5 x 105细胞到 2.5 x 106细胞) 的检测。所需的最低起始材料是通过对乳酸脱氢酶活性检测方法的敏感性来确定的。通过向下扩展在步骤2.5、3.3、3.5、3.7、4.2 和4.3 中使用的卷, 该协议很可能会大幅度地向下扩展。
最关键的因素和技术挑战与分析是 electrodisruption 的步骤。在无离子、等渗溶液中, 细胞的强烈而短暂的电击导致了等离子膜的均匀和选择性的破坏, 同时留下细胞内结构和器 (包括自噬性泡) 完好无损的12, 29。当使用黏附细胞时, 它们必须在 2.1–3.1 (细胞分离、离心和泥沙) 步骤中耐受酶和机械治疗。对于步骤 3.1, 获得一个完美的单细胞悬浮是不重要的。例如, 这是很难实现与 LNCaP 细胞。然而, 成功的 electrodisruption 在接近100% 的细胞总是获得, 即使在细胞团簇包含数个物理附着细胞。在测试新的单元格类型时, 最好验证 electrodisruption 的效率 (参见步骤 3.3.1)17。在 electrodisruption 步骤17后, 接近100% 的细胞应该是永久的盼蓝阳性。如果不是这种情况, electroporator 设置必须最有可能被更改。使用20种不同哺乳动物细胞类型的检测, 我们从来没有改变 electroporator 设置。因此, 一旦找到了一个哺乳动物细胞线的正确设置, 它可能会为所有其他类型的哺乳动物细胞工作。为了验证 electrodisruption 条件是不是太苛刻,即只有等离子膜, 而不是细胞内器的细胞膜被打乱, 遵循步骤3.3.2。
大块自噬是由自噬体, 与其他货物共同封存大量的细胞质。这可能是通过纯粹的非选择性自噬细胞质的部分, 或以一种方式, 代表了选择性和非选择性自噬的组合。至今尚不清楚, 选择和非选择性自噬是否共存为两种不同的自噬模式, 还是自噬体作为一种规则同时在选择性和非选择性的方式中同时封存货物。然而, 重要的是, 最近的一项研究报告说, 选择性自噬的激活剂会导致散装胞浆货物封存的类似增加, 就像在特定货物30的封存一样。我们实验室的结果与此一致 (我们未发表的结果)。分析可溶性胞浆蛋白 (如LDH) 的封存, 因此有可能发现在许多情况下, 如果不是所有条件下, macroautophagic 封存活动的变化。然而, 虽然仍有待证实, 但这种可能性不能排除, 某些类型的条件唯一地诱发一种选择性专属自噬, 在货物被 phagophore 如此紧密包裹, 甚至细胞质被排除在被隔离在 autophagosome。为了探索这种情况是否存在, 像 LDH 螯合法这样的大块自噬试验应与选择性自噬测定平行运行。
LDH 螯合法的主要优点之一是测量内源货物的封存, 从而使其成为一种广泛适用的方法。此外, 该检测方法以高度定量的方式吸收了活性。ldh 螯合法是研究 autophagosome 形成机制和调控的重要工具, 因为开放 phagophores 不能封存 ldh。这是非常繁琐和困难的, 如果不是不可能的, 以评估是否 autophagosome 结构是密封的实体或没有电子显微镜。另一种用于分析自噬体是否闭合的方法是测试自噬标记 (如LC3) 或受体 (例如, sequestosome 1 (p62/SQSTM1) 或核点蛋白 52 (NDP52)) 对蛋白酶10的敏感性. ,31,32。这一分析的缺点是, 一是研究车组件的蛋白酶保护, 而不是自噬性的货物。此外, 由于该检测是基于西方印迹, 它只是半定量。
虽然分析内源性货物自噬的能力是一个优势, 但与 LDH 螯合法的固有局限性, 以及评估内源性货物封存的任何其他化验, 都必须包括一个降解抑制剂, 以便辨别对自噬性螯合的具体影响, 而不是螯合和降解的净效应。高效抑制剂的 LDH 降解包括质子泵抑制剂, 如曝气生物滤池或 concanamycin3,16,18和 lysosomotropic 剂, 如氯喹和氯化铵33。蛋白酶抑制剂 leupeptin 在原代大鼠肝细胞中的作用很好, 但在我们测试的哺乳动物细胞系中通常效率低下。我们经常使用曝气生物滤池13, 它的行动迅速, 是高效的良性和恶性细胞。然而, 重要的是要记住, 没有任何乳酸脱氢酶降解抑制剂是完全具体的, 和假定的作用, 抑制剂对自噬不能排除。为了尽量减少非特定影响的风险, 推荐使用仅在饱和水平的抑制剂浓度, 并在实验的最后几个小时 (3–4 h) 中加入抑制剂。每个细胞类型都应确定曝气生物滤池的饱和浓度。作为一个指南, 50–100 nM 是饱和的大多数养殖哺乳动物细胞线, 我们已经测试, 而某些细胞类型, 如 MEFs 只需要 10 nM 生物滤池, 一个完整的块在 LDH 降解。
LDH 螯合试验的一个明显局限性是, 它只能在活细胞上进行, 因此不包括用于分析固定细胞和组织中的自噬。另一方面, 目前尚无可测量固定细胞功能性自噬性活动的化验。虽然没有用目前的协议进行测试, 但应该完全有可能使用 LDH 螯合试验来评估实验生物体体内自噬性的吸收活性。其局限性是, 生物体必须容忍溶酶酶降解抑制剂的治疗, 而这种治疗与化验结果之间的时间段应相对较短, 以尽量减少潜在的非特异性影响。抑制剂。有趣的是, Kominami等的早期研究表明, 3–6治疗大鼠 leupeptin (腹腔注射 2 mg/100 g 体重) 适合观察 autophagically 游离 LDH 在肝脏中的有效积累自噬性泡34富集的亚细胞组分。
pH 敏感的荧光螯合探针 (如罗塞拉35或 Keima36 ) 的异位表达可用于可视化自噬性封存, 而不需要包括降解抑制剂。此外, 与 LDH 螯合法不同, 这种方法可用于可视化自噬性在单细胞中的吸收。此外, 探针与细胞靶序列的融合可以用来监测特定细胞器的封存。强大的微观平台也可能允许高通量筛选分析。缺点是, 异位探针的表达, 以及在溶酶系统中的探针积累, 可能影响自噬性途径。此外, 与 LDH 螯合检测不同, 一个依赖于能够有效地转染的细胞。最后, 虽然 LDH 螯合法提供了一个直接的定量输出的百分比螯合细胞质, 基于图像的方法一般不能提供这种类型的绝对定量产出。最好以互补的方式利用这两种方法。另一种很好的方法, 研究自噬性封存不需要退化抑制剂是引入核素糖到细胞中可逆电通透3,23,37, 38。糖是一种膜 impermeant 和代谢性的惰性糖, 抗溶酶酵素。因此, 它的自噬性螯合可随后分离胞浆从 sedimentable 细胞分数3,23,37,38。然而, 这种方法比 LDH 螯合法更耗时, 并且由于使用放射性而需要额外的安全预防措施。最后, 大量自噬性封存和通畅的自噬性货物流量的最终结果, 长期存活蛋白的降解, 可以准确地测量由一个成熟的蛋白质标签为基础的方法39,40 ,41,42,43。然而, 与 LDH 螯合法不同, 这种方法并没有为自噬性活动提供特定的读出, 因为长期存活的蛋白质也被其他机制降解而不是自噬, 最显著的是由蛋白酶体系统 (而 ldh螯合只发生于自噬的结果)。因此, 需要经常包括一些控制治疗,例如,自噬性溶酶体或蛋白酶体降解的化学抑制剂, 以及自噬3,16的遗传干扰。
LDH 固溶试验可与常用的 LC3 通量测定法进行比较, 通过荧光成像法测量 LC3-II 在酶 LC3 降解抑制剂不存在或存在的情况下, 采用西方印迹或 LC3 puncta 形成的方法进行测定 (生物滤池最频繁地使用), 或者荧光的转折被标记的 LC3 变形到酸性环境22。虽然这些 LC3-based 化验可以提供有用的信息, 但它们很难解释, 特别是因为 LC3 通量和货物流量的数量和类型之间的关系是未知的。正如导言中提到的, 大块自噬和依赖于 mitophagy 的不需要 LC3 家庭蛋白质9,10,11,44。此外, 在饥饿的大鼠肝细胞中, LDH 的螯合和降解在没有自噬性溶酶体 LC3 通量9的时间段不间断地进行。因此, 在这种情况下, 货物流量可以完全从 LC3 流量分离。为了更好地解释用 LC3 通量测定得出的结果, 需要对不同种类的 LC3 流量进行比较研究。
在目前的情况下, LDH 螯合法与西方印迹相比, 在所需的实际动手时间和成本方面。在测量大块自噬性方面, 它至少与糖的固溶试验或上面描述的长寿命蛋白质降解试验一样有效。对于大容量自噬性螯合活性的特定测量和闭合自噬体的形成, 它比 LC3 通量测定或 LC3 或自噬受体的蛋白酶保护试验更有效和更直接, 因为后者的化验测量车组件而不是实际的货物。尽管我们已经大大提高了 LDH 螯合检测的吞吐量, 但它远不是高通量的检测, 它不能与上面描述的基于图像的化验的效率相抗衡。然而, 以图像为基础的化验和 LDH 螯合法都有其优缺点, 因此这两种化验方法都有各自的价值。有可能通过今后的调整, 使 LDH 螯合检测半高通量。例如, 应该有可能执行 electrodisruption 的96井格式, 可以想象的是, 胞浆乳酸脱氢酶可由过滤而不是离心分离, 或离心步骤可以执行在96格式良好。此外, 还开发了用于测量 LDH 活性的化验, 这些方法比现行议定书中所使用的更为敏感, 并可在商业上获得。其他有趣的未来潜力的化验是它假定使用其他细胞类型比哺乳动物细胞, 例如在酵母或其他单细胞有机体, 甚至植物细胞, 以及它用于体内测量的自噬性实验生物体组织中的螯合活动。
最后, 我们认为, 乳酸脱氢酶在其改良和恢复的形式的检测将是未来自噬相关研究的一个重要工具。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了挪威研究委员会、奥斯陆大学、安德斯 Jahre 基金会、南森基金会的资助, 以及纪念亨利霍曼的遗产。我们感谢郎水岛博士 ATG5+/+ MEFs 和 ATG5-/MEFs, 为 ATG7+/+ MEFs 和 ATG7-/MEFs, 并 Shizuo 博士为 ATG9A+/+ MEFs 和 ATG9A-/MEFs。我们感谢弗兰克 Sætre 的技术援助, 以及每 Seglen 博士为建设性的方法讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µL) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µL) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1,000 µL) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
References
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