Summary
Aquí se describe un protocolo simple y bien validado para medir la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. El método se basa en cuantificar la proporción de lactato deshidrogenasa (LDH) en fracciones celulares de sedimentables en comparación con los niveles de LDH celulares total.
Abstract
A granel la autofagia se caracteriza por el secuestro de grandes porciones de citoplasma en estructuras de doble/múltiple-membrane denominado autophagosomes. Aquí se describe un protocolo simple para controlar este proceso. Además, se proporcionan resultados típicos y validación experimental del método bajo condiciones de inducción autofagia en varios tipos de células mamíferos cultivadas. Durante autofagia a granel, autophagosomes secuestrar citosol y así también soluble proteínas citosólicas, junto a otras cargas de autofagia. LDH es estable y muy abundante, soluble enzima citosólica que selectivamente no es secuestrado en autophagosomes. La cantidad de secuestro de LDH por lo tanto refleja la cantidad de secuestro autofagia a granel. Determinar eficientemente y exactamente secuestro de LDH en las células, empleamos un protocolo basado en electrodisruption fraccionamiento que separa efectivamente sedimentables de LDH citosólica, seguido por la medida de la actividad enzimática en sedimentables fracciones versus muestras celulares. Secuestro de autofagia se determina restando la proporción de sedimentables LDH en las células no tratadas de eso en células tratadas. La ventaja de la prueba de captura de LDH es que da una medida cuantitativa de la autofagia secuestro de carga endógena, en comparación con otros métodos que o bien implican expresión ectópica de sondas de captura o proteasa semi-cuantitativo Análisis de marcadores de autofagia o receptores de protección.
Introduction
Autofagia (griego para "la comer") es un proceso evolutivo conservado vacuolar/lysosomal degradación de material intracelular. Al descubrimiento de los genes relacionados con la autofagia ("ATG"), que son importantes para la autofagia en levaduras y humanos, y la realización que la autofagia juega un papel importante en la salud y enfermedad (reconocido por el Premio Nobel en medicina o fisiología a 2016 Yoshinori Oshumi), autofagia ha convertido rápidamente en uno de los procesos más intensamente estudiados en biología de la célula1,2.
Macroautophagy (en lo sucesivo, "autofagia") es caracterizado por la expansión y plegamiento de cisternas de membrana intracelular ("phagophores") en estructuras selladas, membrane doble o múltiple ("autophagosomes") que secuestran eficazmente la enwrapped material del resto del citoplasma. Sobre fusión de autophagosomes con lisosomas, la membrana autophagosomal interna y la carga secuestrada es degradado y reciclado. Autophagosomes puede secuestrar material citoplásmico en aleatorizada (no-selectivas autofagia) y modales de selectivo (selectivas autofagia). A granel autofagia probablemente representa una mezcla de la autofagia no selectivo y selectiva.
En los años 60 y 70 ("la era morfológico" de la investigación de autofagia), secuestro de autofagia se evaluó principalmente a través de análisis ultraestructurales. En la década de 1980 y principios de la década de 1990 ("la era bioquímica") por Seglen y compañeros de trabajo — que estudió autofagia en hepatocitos primarios de rata — desarrollaron los primeros métodos para medir cuantitativamente la autofagia secuestro actividad3. Mediante estos ensayos, Seglen define y caracteriza los diferentes pasos de la vía autofagia lisosomal4,5, descubierto acuñó el amphisome6 (el producto de la fusión del endosome-autophagosome) y fue el primero en describir el papel de la fosforilación de la proteína en autofagia Reglamento7. Sin embargo, tras el descubrimiento de los ATGs en 1990 ("la era molecular") y la primera caracterización de una proteína de ATG8 mamífera, proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-luz cadena 3 (LC3) en 20008, el uso de proteínas ATG como marcadores para la proceso de autofagia rápidamente ganó popularidad, y el más viejos y más laboriosos métodos bioquímicos se quedaron atrás. De hecho, durante los últimos 18 años, western blot y análisis de microscopía de fluorescencia de LC3 se han convertido en el más popular (y en muchos casos el único) medio de estudio de la autofagia en las células mamíferas. La ventaja es la facilidad relativa por la cual estos métodos pueden llevar a cabo. La desventaja es que uno está estudiando un componente del carro (LC3) en lugar de la carga real de autofagia. Esto es una desventaja bastante grave, porque la relación entre los Estados y el flujo de LC3 a través de la vía contra el secuestro y el flujo de carga es altamente confusa. De hecho, hemos demostrado que flujo de carga a granel puede ser mantenido en niveles elevados en condiciones donde no hay ningún flujo de LC3, a pesar de la presencia de conjugados LC3 en las celdas9. Por otra parte, hemos demostrado esa autofagia a granel se ve afectada por agotamiento de LC3 eficiente y es así probablemente LC3-independiente9. Este hallazgo más tarde ha sido confirmado por LC3 k.o. estudios10,11, que también indican que la mitofagia Parkin-dependiente (el selectiva autofagia de las mitocondrias) es independiente de LC310,11 .
En Resumen, existe una clara necesidad de ensayos de carga a controlar la actividad de autofagia. Forma óptima tales ensayos deben ser ampliamente aplicable, bien definidos y fáciles de realizar. En los últimos años hemos tomado un especial interés en el análisis del secuestro de LDH, que fue desarrollado por Seglen en la década de 198012y se basa en la transferencia de LDH citosólico a sedimentables, célula que contiene vacuolas autophagic de medición fracciones. LDH es una proteína citosólica estable y soluble que fácilmente Co es secuestrada cuando phagophores enwrap carga citoplásmico. Secuestro de LDH por lo tanto es una medida general de secuestro de autofagia. LDH se degrada exclusivamente por la vía autofagia lisosomal12. Así, en presencia de inhibidores de la degradación lisosomal, por ejemplo, bafilomycin A1 (Baf)13, directamente los efectos del tratamiento experimental reflejan alteraciones en la actividad de autofagia secuestro. En ausencia de inhibidores de la degradación, se puede medir el efecto neto de las alteraciones en el secuestro de la LDH y la degradación.
El ensayo de secuestro de LDH es ampliamente aplicable, puesto que la LDH se expresa altamente y ubicuo en todos los tipos de la célula y los niveles de LDH pueden cuantificarse con precisión por un ensayo enzimático14,15. Sin embargo, el original del protocolo12 , establecido en hepatocitos primarios de rata — era algo lento y requiere una gran cantidad de a partir de material así como un descarga eléctrica a la medida del condensador. De manera escalonada, poco a poco hemos transformado el ensayo en un método fácil y versátil. En primer lugar, el protocolo original fue adaptado para el uso en células de mamífero líneas16. En segundo lugar, el método era substancialmente reduce3,9. Tercero, se eliminaron varios pasos en el protocolo, incluyendo un cojín densidad laborioso paso17. Esto permitió al mismo tiempo una regionalización aún más el método, desde el punto de partida original del uso de una placa de 10 cm por ejemplo16 para usar un único pozo de una placa de 12 pozos por muestra (es decir, aproximadamente 15 dobleces menos a partir de material)17. En cuarto lugar, identificamos un aparato de electroporación comercial que podría sustituir el condensador descarga eléctrica por encargo del17.
Aquí se presenta nuestro protocolo más actualizada del ensayo LDH de secuestro, que incluye algunas otras simplificaciones del método con respecto a los previamente publicados17 . Además, se muestra un conjunto de resultados típicos obtenidos en un número de diferentes tipos de células, e importante, cuentan con varias líneas de validación experimental del método usando derribo farmacológico así como genético y enfoques de octavos de final. Para un esquema general de flujo del protocolo todo, vea la figura 1.
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Protocol
1. célula siembra y tratamiento
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Células adherentes en cultivo en frascos de cultivo de tejidos2 de 75 cm en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C, utilizando el medio de cultivo recomendado: para el tipo de célula en cuestión. Permitir a las células a crecer hasta llegar a una capa de la célula cerca del confluente.
Nota: Use Medio RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS) de LNCaP, HEK293, fibroblastos embrionarios del ratón (MEFs), BJ, MCF-7 y las células RPE-1.- Lavar las células con 3 mL 37 ° C con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Sustituya el PBS por 3 mL 0.25% tripsina-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) (w/v) e Incube el frasco en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C hasta que separe de las células (2-5 min).
- Resuspender las células separadas con 7 mL medio de cultivo que contiene 10% FBS. Mezclar una alícuota de 10 μl célula suspensión con 10 μl 0,4% azul de tripano en un tubo de microcentrífuga, utilizando una pipeta de 0.5-20 μl. Utilice la misma punta de pipeta para llenar inmediatamente una cuenta slide cámara y contar las células en un contador de células automatizado.
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Preparar una adecuada dilución (ver nota abajo) de la suspensión de células de paso 1.1.2 con cultura media que contiene 10% FBS y las semillas 1 mL de la suspensión celular diluido en cada pocillo de una placa (superficie ~3.8 cm2) de 12-bien cultivo de tejidos utilizando aséptica técnica. Permitir el crecimiento en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C hasta alcanzar la densidad deseada de la célula, por ejemplo, 60 – 90% de confluencia en la cosecha.
Nota: La dilución de la suspensión de células que dará la confluencia celular deseada en la cosecha varía de célula tipo tipo de la célula, así como según la duración y tipo de tratamientos experimentales. Por lo tanto, esto debe empíricamente evaluarse en cada caso.- Para los experimentos que deben ser tratados y había cosechado 2 días después de siembra, semilla de 2.5 x 105 LNCaP, HEK293, o MCF-7 células, MEFs de4 5 x 10, 4 x 105 BJ o 1,5 x 105 1 RPE células en cada pocillo de la placa de la pozo 12.
- Para las células que se adhieren libremente, cubrir las placas con el tipo de recubrimiento recomendado para el tipo de la célula en cuestión. Para las células LNCaP (y HEK293) Utilice placas recubiertas con poly-D-lisina (PDL).
- Para ello, agregar 500 μl de PDL en 2,5 μg/mL en estéril de H2O para cada pozo e incubar las placas en un ambiente estéril durante 30 min a temperatura ambiente (20 – 25 ° C). Retire de la PDL con la succión y lave cada bien brevemente con 1 mL estéril H2O.
Nota: Generalmente, se realiza paso 1.2.1 sin cualquier tratamiento experimental. Sin embargo, si realizar ARNi, puede ser conveniente comenzar una transfección inversa con la siembra9.
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Realice tratamientos experimentales en los pocillos duplicados o triplicados por condición.
- Por ejemplo, tratar las células con 50 nM de la Torin1 del inhibidor de mTOR, que generalmente es un eficiente inductor del secuestro de autofagia, o someter las células a la inanición aguda de suero y aminoácidos por lavar las células con 1 mL de Earle del aminoácido libre de equilibrado Medio de solución (EBSS) la sal y posteriormente incubar las células en 1 mL de EBSS en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C.
- Deja un conjunto de pozos sin tratar para definir niveles de sedimentables LDH de fondo.
- Agregue una cantidad de saturación de la bafilomycin del inhibidor de la captura posterior A1 (Baf)3,13,16,18 en la ausencia o presencia de los tratamientos experimentales, 3 – 4 h antes de la célula de la cosecha. Incubar las células en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C.
- Uso 100 nM Baf de LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 y las células de RPE-1 y 10 nM Baf para MEFs.
- Para tratamientos experimentales que tienen una duración de sólo 3-4 h (como ésos paso ejemplificada en 1.3.1 típicamente), agregue Baf simultáneamente con los tratamientos. Para más tratamientos experimentales, esperar 3-4 h antes de la cosecha y añadir 2 μl de 500 x concentrado Baf stock directamente en el medio.
- Mezclar por agitación de la placa inmediatamente después de la adición de Baf. En este punto también es recomendable añadir inhibidores de la captación de macroautophagic como controles, por ejemplo, 10 mM de la pan-Fosfoinositol 3-quinasa (PI3K) inhibidor de la 3-metil adenina (3MA)19o 10 μm de la selectivo PI3K clase III inhibidor de la SAR-40520.
2. cosecha y preparación para la Electrodisruption de la célula
- Al final del tratamiento, Aspire el medio con la succión y añadir solución de separación celular de μl 200 (precalentado a 37 ° C) a cada pocillo. Incubar a 37 ° C hasta que separe de las células (típicamente alrededor de 5 min).
Nota: Considerando que 0.25% tripsina-EDTA (w/v) pueden utilizarse en lugar de la solución de separación celular, este último contiene DNasa, que ayuda a reducir la viscosidad de las células separadas. Como el medio fondo se aspira, no es necesario lavar las células antes de la adición de solución de tripsina-EDTA o celda de separación. - Añadir 500 μl temperatura ambiente (20-25 ° C) PBS, pH 7,4, con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) a cada pocillo y resuspender con la pipeta hasta que no matas celulares visibles. Transferir inmediatamente la suspensión de células a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo.
Nota: A menos que se indique lo contrario, realice todos los pasos subsiguientes en el hielo. - Sedimentos las células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Cuidadosamente aspirar el sobrenadante (con succión) para salir de los gránulos de la célula tan secas como sea posible.
- Añadir 400 μl 10% (p/v) de sacarosa (en ultrapura H2O) a cada tubo.
3. membrana plasmática Electrodisruption y separación de fracciones celulares sedimentables y Total
- Resuspender el precipitado de células con una pipeta para obtener una suspensión unicelular cerca y transferir a una cubeta de electroporación de 4 mm.
Nota: Pipeteo altibajos ~ 10-15 veces, utilizando una pipeta de 100-1.000 μl, es generalmente suficiente. - Colocar la cubeta en un decaimiento exponencial onda electroporator y descarga un solo pulso eléctrico a 800 V, 25 μF y 400 Ω; Estos ajustes producen un pulso de 8 ms de duración.
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Utilice una nueva punta de pipeta para transferir la disruptate de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 400 μL de solución de helada sacarosa tamponada con fosfato (monofosfato de sodio 100 mM, 2 mM Ditiotreitol (DTT), 2 mM EDTA y 1.75% de sacarosa, pH 7,5) y mezclar brevemente pipeteo.
- Opcional: Para verificar la eficiente membrana plasmática electrodisruption17, mezclar 10 μl de la disruptate celular diluida en el paso 3.3 con 10 μl 0,4% azul de tripano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Traslado a una cámara de conteo y comprobar que el porcentaje de células positivas de azul de tripano es > 99%.
- Dejar la muestra en la cámara de conteo durante 30 min a temperatura ambiente (20 – 25 ° C) y verificar que se ha mantenido el porcentaje de células positivas de azul de tripano > 99%.
- Opcional: Para verificar que el electrodisruption no ha sido demasiado duro, es decir, no ha interrumpido los organelos intracelulares, realice pasos 1.1-3.3 como se describe anteriormente, pero utilice un material de partida más grande (un pozo de una placa de 6 pozos con una capa de células confluentes de ~ 80%), y 150 μl 10% de sacarosa paso 2.5 y 150 μL tampón fosfato solución sacarosa sin TDT paso 3.3.
- Utilice una pipeta cuidadosamente capa 200 μL de la solución de disruptate de celular diluida sobre un colchón de densidad 1,2 mL de medio de gradiente de densidad de 8% (w/v) con tampón fosfato (por ejemplo, 8% Nycodenz, fosfato de sodio 50 mM, 2.2% de sacarosa, 1 mM EDTA) en una centrífuga de 2 mL tubo. Centrifugue a 20.000 x g durante 45 minutos a 4 ° C en una microcentrífuga con función soft-mode (para suave aceleración y desaceleración) y con cuidado poner los tubos en hielo.
- Retire con cuidado 60 μL de la fracción superior de ~ 200 μL, asegurándose de que no cualquier solución medio gradiente de densidad y transferir a un tubo de microcentrífuga fresco.
Nota: Esto debe contener citosol de pureza excepcional, denominada "savia celular"21. - Prueba de la pureza de la fracción obtenida en el paso anterior, mediante la realización de análisis de western blot de organelo contiene proteínas, usando técnicas estándar y geles de gradiente de 4 – 20%16.
- Realizar por ejemplo immunoblotting para catepsina B21, citocromo c y isomerase del disulfuro de la proteína, para verificar que la descarga eléctrica en el paso 3.2 ha no interrumpido lisosomas, mitocondrias y retículo endoplásmico, respectivamente y el inmunoblot para LDH para verificar la presencia de una proteína citosólica en la savia celular.
- En paralelo, realizar immunoblotting en extractos de proteína procedente de la celda total disruptate solución16 para confirmar que los anticuerpos utilizados pueden detectar las proteínas contienen organelas que están siendo evaluadas.
- Opcional: Para verificar la eficiente membrana plasmática electrodisruption17, mezclar 10 μl de la disruptate celular diluida en el paso 3.3 con 10 μl 0,4% azul de tripano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Traslado a una cámara de conteo y comprobar que el porcentaje de células positivas de azul de tripano es > 99%.
- Repita los pasos 3.1-3.3 para cada muestra.
- Quitar 550 μl de cada solución de disruptate de células diluidas (obtenido en el paso 3.3) para tubos de microcentrífuga de 2 mL que contiene 900 μl resuspensión helada tampón (monofosfato de sodio 50 mM, 1 mM TDT, 1 mM EDTA y 5.9% de sacarosa, pH 7.5) suplementado con 0,5% BSA y 0,01% Tween-20 y mezclar brevemente por pipeteo.
- Centrifugar a 18.000 x g por 45 min a 4 ° C para producir pellets que contiene "LDH sedimentada". Cuidadosamente aspirar el sobrenadante (con succión) para dejar las pelotillas tan secas como sea posible. Coloque las muestras en un congelador de-80 ° C.
- Transferir 150 μL de cada solución de disruptate de células diluidas (obtenido en el paso 3.3) a nuevos tubos y coloque las muestras en un congelador de-80 ° C. Usar estas muestras para determinar los niveles de "total LDH" en las células.
Nota: En este punto el experimento puede pausarse para como deseado.
4. LDH extracción y medición de la actividad enzimática de LDH
- Deshielo "LDH sedimentada" (del paso 3.6) y muestras de "total LDH" (de paso 3.7) en hielo.
- Añadir 300 μL de buffer de resuspensión helada que contiene 1,5% Triton X-405 a la "LDH total" las muestras (obtención de una concentración final de X-405 Triton de 1%). Rotar las muestras en un rodillo en una cámara fría (4 – 8 ° C) durante 30 minutos.
- Añadir 750 μl de buffer de resuspensión helada con 1% Triton X-405 a la LDH"sedimentada" muestras y resuspender el pellet con una pipeta hasta que se alcance una solución homogénea.
- Centrifugue las muestras en el paso 4.2 y 4.3 en 18.000 x g durante 5 min a 4 ° C a los desechos celulares sedimento disuelta.
- Mezcle 4 partes de imidazol frío 65 mM (piruvato de mM de 7.5)/0.75 de pH con una parte de imidazol frío 65 mM (pH 7.5) / 1,8 mM NADH para obtener una solución de trabajo que es estable durante al menos tres semanas a 4 ° C.
- Mezcle 3 – 30 μl de los sobrenadantes de paso 4.4 con 200 μL de la solución de trabajo de paso 4.5.
- Determinar la cantidad de LDH por medición de la actividad enzimática de LDH como la disminución de nicotinamida-adenin-dinucleótido (forma reducida) absorbancia (NADH) a 340 nm a 37 ° C en comparación con un estándar con una concentración conocida de la LDH. Mida la absorbancia hasta que la reacción ha acercado al terminar, es decir, hasta que la absorbancia a 340 nm ya no cambia con el tiempo.
Nota: Este es el clásico método bioquímico para medir la actividad LDH. Aunque el protocolo actual realiza la reacción a 37 ° C, también se puede realizar a temperatura ambiente (20 – 25 ° C), que es recomendable si haciendo espectrofotometría manual. El protocolo actual utiliza un instrumento multianalyzer robótico, que en forma automática mezcla las muestras con solución de trabajo en una placa de 96 pocillos y mide la absorbancia a 340 nm a 37 ° C cada 20 s durante 3 minutos. Después de eso, el software del instrumento calcula la concentración de LDH, expresada como unidades (U) L, comparando la cuesta de las mediciones de absorbancia con el tiempo en comparación con una curva estándar obtenido a través de la calibración con un estándar de LDH conocida concentración. El rango lineal de detección por este método es de 30 – 1.500 U/L. Como alternativa, existen una gran variedad de kits disponibles en el mercado para medir la LDH. Algunos de ellos se basan en la reacción enzimática a la generación de productos colorimétricas o fluorescentes, permitiendo la detección por otros medios que la espectrofotometría UV y con otras gamas de lineales de detección de acoplamiento.
5. cálculo del secuestro de LDH
- Calcular el porcentaje de LDH sedimentado a LDH total para cada muestra, tomar las diluciones y toma en cuenta:
LDH sedimentado (%) =
Nota: Durante los pasos 3.1-3.3 aproximadamente 50 μl se pierde debido a traslado dentro y fuera de la cubeta de electroporación. Calcular por lo tanto, de tener un total de 750 μl (en lugar de 800 μL) de disruptate de células diluidas en el paso 3.3. - Restar el porcentaje de sedimentación LDH obtenida en las muestras de las células no tratadas (paso 1.3.2) del porcentaje de sedimentación LDH obtenida en muestras de células tratadas experimentalmente y se dividen por el tiempo de tratamiento con Baf para obtener el porcentaje de LDH secuestrado por hora en el período de muestreo:
Secuestrado LDH (% / h) =
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Representative Results
Usando el protocolo descrito aquí, la actividad de autofagia secuestro a granel en un número de líneas de diferentes células de mamífero, incluyendo LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, ratón (MEFs) los fibroblastos embrionarios, RPE-1, Se midió las células HEK293, BJ y LNCaP. Secuestro fue evaluado bajo condiciones basales (en medio completo, rico en nutrientes), o en células muy hambrientos de suero y aminoácidos (un bona fide inducción autofagia condición22). Los resultados indicaron que LDH secuestro actividad bajo condiciones de inanición varía extensamente a través de diferentes líneas celulares, que van desde niveles apenas detectables en LAPC4, DU145, Huh7 y PNT2 células ~1.6%/h en las células LNCaP (figura 2 (datos no mostrados) A). La tasa observada en los hepatocitos de rata hambrienta de primaria es mayor que en la líneas celulares mencionadas anteriormente y por lo general va de 2.5–4%/h23. Bajo condiciones basales, secuestro de LDH fue prácticamente imperceptible en medio de las líneas celulares probadas y osciló entre ~0.2%/h y ~0.5%/h en la otra mitad (datos no mostrados). En las líneas celulares que muestran actividad detectable secuestro autophagic basal, inanición aguda de suero y aminoácidos típicamente induce un aumento de 3 – 4 veces mayor en la tasa de secuestro de LDH (véase por ejemplo el experimento de LNCaP que se muestra en la figura 2A). En las líneas de celular probado (mencionadas anteriormente), el porcentaje de fondo de LDH sedimentación obtenido en las muestras de las células no tratadas (paso 1.3.2) es típicamente alrededor 2-3%. De 22 experimentos independientes realizados en varias líneas celulares, el la experimental coeficiente de variación (CV) entre los valores LDH sedimentados (% LDH sedimentado) de repeticiones del tratamiento fue 5.8% ± 1.7% (promedio % CV ± desviación estándar), que van desde 3.0 – 9.0%. Juntos, estos números dan una idea de qué esperar cuando realización del análisis de la captura de LDH en células de mamíferos.
Uso de inhibidores químicos como bien como genética caída y golpe de gracia se acerca, ampliamente verifica que el ensayo de secuestro del LDH mide confiablemente actividad de secuestro de autofagia. Autophagosome formación requiere activa PI3K clase III (PIK3C3) y Unc-51 como autofagia activación cinasa (ULK)24, así como equilibrio en intracelular Ca2 + homeostasis16. Como se muestra en la figura 2A, LDH tanto basal como inducida por inanición secuestro se suprime completamente por el pan-PI3K inhibidor 3MA, el selectivo PIK3C3 inhibidor SAR-40520, o el ER Ca2 + bomba inhibidor thapsigargin (TG) 25 en las células de LNCaP. Secuestro de LDH bajo condiciones de inanición (interruptor medio de solución sal balanceada (EBSS) de aminoácido libre Earle) también se reduce por TG, o por el MRT67307 de ULK-inhibidor en células HEK293 (figura 2B). Por otra parte, secuestro de LDH inducidos por el hambre constantemente es inhibida por 3MA en MEFs (figura 2C), BJ (figura 2D), MCF-7 (figura 2E) y RPE-1 (figura 2F) células. En general, incubación de las células en medio EBSS solamente (es decir, en ausencia de Baf u otros inhibidores de secuestro posterior) no conduce a la acumulación mensurable de LDH secuestrado (véase por ejemplo el experimento de LNCaP que se muestra en la figura 2 A). esto es probable debido a inanición aguda aminoácidos conduce al acelerado flujo de autofagia lisosomal, dando por resultado la degradación rápida y continua de la LDH secuestrada.
A continuación, diversos genes ATG MEFs nocaut (KO) se emplearon para probar si el secuestro de LDH requiere genes relacionados con la autofagia, divulgados para ser esencial para la formación de autophagosome. De hecho, secuestro de LDH inducidos por el hambre se suprime en MEFs KO ATG526 (figura 3A), confirma los anteriores resultados9. Por otra parte, como se muestra en la figura 3B y 3 C, secuestro de LDH inducidos por el hambre es blunted también en ATG7 KO MEFs27 y28de ATG9A KO MEFs.
Finalmente, el análisis del secuestro de LDH fue probado en relación a si RNAi-mediada silenciamiento de transcripciones del gene ATG claves inhiben la actividad de secuestro inducido por el hambre. De hecho, transfección con un siRNA dirigidas a ATG9A, o combinado contra ULK1 y ULK2, secuestro de LDH fuertemente reducido bajo condiciones de inanición de las células LNCaP (figura 3D). Por otra parte, nos confirma nuestros resultados anteriores3,9 orientación de la familia de la quinasa de adhesión focal interacción proteína de 200 kDa (FIP200) o combinado contra el tipo de ácido γ-aminobutírico () asociado a receptor de la proteína A (GABAA) Miembros de la familia GABARAP) inhibe el secuestro de LDH inducidos por el hambre (figura 3D).
Figura 1 : Flujo total esquema del Protocolo de captura de LDH. El protocolo se basa en un formato de placa 12-bien cultivo de tejidos, con los volúmenes indicados por muestra (de bien). El protocolo de ensayo puede dividirse convenientemente en dos días de trabajo separados, como se indica. Sin embargo, también es posible realizar todo el procedimiento en un solo día. Abreviaturas: ABB, después de búfer de explosión (ver paso 3.3 en el protocolo para los ingredientes); RSB, buffer de resuspensión (ver paso 3.5 en el protocolo para los ingredientes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Validación del ensayo de secuestro de LDH con compuestos inhibidores de la autofagia con. (A) LNCaP células tampoco quedaron sin trata (con el propósito de fondo: ver paso 1.3.2) en medio de cultivo completo (CM; RPMI 1640 + 10% suero bovino fetal (FBS)), o fueron tratados con vehículo DMSO (0.1%) o 100 nM Baf en CM o en medio libre de suero y aminoácidos (EBSS). Además, algunas de las células fueron tratadas con 3MA (10 mM), SAR-405 (10 μm), o Thapsigargin (300 nM), como se indica. Después de 3 horas de tratamiento, las células se cosecharon, y secuestro de LDH se determinaron las tasas como detalla en el protocolo actual. HEK293 (B) las células fueron tratadas con vehículo DMSO (0,1%) en CM, o con 100 nM Baf en EBSS, tal como se indica. Además, algunas de las células recibieron 10 μm MRT67307 (un inhibidor ULK) o 300 nM Thapsigargin. Las tasas de secuestro de LDH se determinan después de 3 h de tratamiento. (C-F) Las células MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) o EPR-1 (F) fueron tratadas con vehículo DMSO (0,1%) en CM, o con Baf (10 nM c, 100 nM en D-F) en EBSS con o sin 10 mM 3MA, tal como se indica. Las tasas de secuestro de LDH se determinan después de 3 h de tratamiento. A, B, D, E y F muestran valores promedios de tres réplicas biológicas (pozos por triplicado) de un experimento (n = 1), con barras de error que representa la desviación estándar. C muestra los valores promedio de tres experimentos independientes (n = 3), con barras de error que representa el error estándar de la media. p < 0.05, ***p < 0.001, repetidas muestras de ANOVA unidireccional.
Figura 3 : Validación del ensayo de secuestro de LDH por nocaut (A-C) o caída (D) enfoques. (A-C) ATG5 tipo salvaje (WT) o nocaut (KO) MEFs (A), ATG7 WT o KO MEFs (B), o ATG9A WT o KO MEFs (C) fueron tratados con vehículo DMSO (0,01%) en CM, o 10 nM Baf en EBSS, tal como se indica. Las tasas de secuestro de LDH se determinan después de 3 h de tratamiento. Valores de cuatro medios (A; n = 4) o tres (B y C; n = 3) experimentos independientes, con barras de error que representa el error estándar de la media. p < 0.05, repetidas muestras de ANOVA de dos vías. N.S. no significativo. (D) LNCaP células eran inversas transfected con 5 nM de un siRNA control nontargeting (siCtrl), o con 5 nM de ATG9A, FIP200, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1-o metas de GABARAPL2 siRNA oligoes, como se indica. Después de 48 h, las células fueron tratadas ya sea con vehículo DMSO (0,1%) en CM, o con 100 nM Baf en EBSS, tal como se indica. Las tasas de secuestro de LDH se determinan después de 3 h de tratamiento. Se muestran los valores promedios de tres réplicas biológicas (pozos por triplicado) de un experimento (n = 1), con barras de error que representa la desviación estándar.
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Discussion
En Resumen, el protocolo descrito aquí representa un método fiable y ampliamente aplicable para monitorear la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. Comparado con el original método12,16, hemos eliminado una serie de pasos innecesarios, simplificado a varios de los pasos restantes e introdujo una sustancial reducción de resolución. Como resultado, el protocolo es mejorado en relación a costo y tiempo-eficiencia, y ahora se puede manejar la misma cantidad de muestras en menos de la mitad del tiempo en comparación con el protocolo original. Para 24 muestras, pasos 2 – 3 (día 1) requiere aproximadamente ½ h de preparación más 3 h de trabajo eficiente, mientras que el paso 4 (día 2) se puede realizar en aproximadamente 2 h (tiempo estima que se prepararon de antemano para todos los buffers necesarios). Desde el ensayo día 1 generalmente es precedida por tratamientos con células, incluyendo un 3-4 h de incubación con Baf u otros inhibidores de la degradación de la LDH de autolysosomal, es conveniente dividir el análisis en dos días consecutivos. Sin embargo, también es posible realizar el ensayo entero en el mismo día. En ese caso, ahorraría tiempo a rápido-congele las muestras en nitrógeno líquido en paso 3.6 y 3.7. Aunque no probado con el protocolo actual, es probable que el paso de congelación y descongelación puede ser omitido en conjunto, desde las más elaboran versión del ensayo en hepatocitos primarios de rata se ha hecho sin este paso23.
El protocolo presentado aquí puede realizarse con relativa facilidad. De nota, es importante ser precisos en el pipeteo, ya que el análisis incluye varios pasos de muestreo y la dilución. Por otra parte, las aspiraciones sobrenadante deben hacerse cuidadosamente, para que cantidades mínimas de iones están presentes en la suspensión de células de sacarosa en el paso 2.5 y para que como poco LDH citosólica como sea posible está contaminando el material sedimentado en el paso 3.6. El ensayo como se describe aquí es flexible para una amplia gama de material de partida. Por ejemplo, en células LNCaP, nosotros hemos utilizado con éxito el ensayo con una gama de diferentes cantidades de células en la cosecha, que abarca hasta una diferencia de 10 veces (de 2.5 x 105 células a 2.5 x 106 células). El mínimo a partir de material necesario se define como sensible la detección es método de la actividad enzimática de LDH. El protocolo se puede escalar muy probablemente substancialmente más abajo, por el escalamiento por los volúmenes utilizados en pasos de 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 y 4.3.
El factor más crítico y el desafío técnico con el análisis es el paso de electrodisruption. Una descarga eléctrica fuerte, pero breve, de células en solución isotónica, libre de iones resulta en una interrupción uniforme y selectiva de la membrana plasmática, dejando la estructura intracelular y organelos (incluyendo las vacuolas autophagic) intacto12, 29. Cuando se utilizan células adherentes, es esencial que toleran los tratamientos enzimáticos y mecánicos en pasos 2.1-3.1 (desprendimiento celular, centrifugación y resuspensión). Paso 3.1, no es crítica para obtener una suspensión unicelular perfectamente. Por ejemplo, esto es muy difícil de lograr con las células de LNCaP. Sin embargo, electrodisruption éxito en casi 100% de las células se obtiene siempre, incluso dentro de grupos de célula que contiene varias docenas de células físicamente conectadas. Cuando se prueba un nuevo tipo de célula, es recomendable verificar la eficacia de la electrodisruption (ver paso 3.3.1)17. Cerca del 100% de las células debe ser permanentemente azul de tripán positivo después de la electrodisruption paso17. Si este no es el caso, más probable es que se puede modificar la configuración electroporator. No usando el análisis de 20 tipos diferentes de células de mamífero, nunca hemos tenido que cambiar la configuración de electroporator. Así, una vez que se han encontrado los ajustes necesarios para una línea de células de mamífero, es probable que trabajar para los demás tipos de células de mamíferos. Para verificar que las condiciones de electrodisruption no son muy duras, es decir,que sólo la membrana del plasma y no las membranas de los organelos intracelulares han sido perturbados, siga el paso 3.3.2.
A granel autofagia realiza autophagosomes que co secuestrar cantidades sustanciales de citosol junto con otras cargas. Esto puede ocurrir vía puramente selectivas autofagia de las porciones del citoplasma, o de una manera que representa una mezcla de la autofagia selectiva y no selectivo. Hasta la fecha no está claro si o hasta qué punto selectiva y no selectivas autofagia coexistir como dos modos diferentes de la autofagia, o si autophagosomes regla secuestrar simultáneamente carga de maneras selectivas y no selectivo. Lo importante, sin embargo, un estudio reciente informó que activadores de selectiva autofagia inducen un aumento similar en el secuestro de citosólica de carga a granel como en el secuestro de la carga específica30. Los resultados de nuestro laboratorio son de acuerdo con esto (los resultados no publicados). Analizar el secuestro de proteínas citosólicas soluble (por ejemplo, LDH), por lo tanto es probable que tiene el potencial para detectar alteraciones en la actividad de secuestro de macroautophagic debajo de muchos, si no todas las condiciones. Sin embargo, aunque todavía permanece ser probado, no puede excluirse la posibilidad de que ciertos tipos de condiciones únicamente inducen a un tipo de la autofagia selectiva exclusiva donde la carga es tan tapada por el phagophore ése cytosol incluso se excluye de ser secuestrado en el autophagosome. A prueba de si puede existir tal condición, se deben ejecutar ensayos de autofagia a granel como el ensayo de secuestro del LDH paralelamente con pruebas selectivas autofagia.
Una de las principales ventajas de la prueba de captura de LDH es que mide el secuestro de la carga endógena, por lo que es un método ampliamente aplicable. Por otra parte, el ensayo mide la actividad de secuestro de una manera altamente cuantitativa. El ensayo de captura de LDH es una herramienta importante para el estudio de los mecanismos y regulación de la formación de autophagosome, desde el abierto de phagophores no puede secuestrar LDH. Es muy engorroso y difícil, si no imposible, evaluar si autophagosome-como las estructuras son entidades selladas o no por microscopia electrónica. Otro método que se utiliza para analizar si están cerrados los autophagosomes es poner a prueba la sensibilidad de los marcadores de la autofagia (p. ej., LC3) o receptores (p. ej., sequestosome 1 (p62/SQSTM1) o proteína nuclear punto 52 (NDP52)) a proteasas10 ,31,32. La desventaja de este análisis es que uno está estudiando protección proteasa carro componentes en lugar de carga de autofagia. Por otra parte, puesto que el ensayo se basa en el western blot, es semicuantitativo.
Mientras que la capacidad de analizar la autofagia de carga endógena es una ventaja, una limitación inherente con el ensayo de captura de LDH y cualquier otros ensayos que evalúan el secuestro de la carga endógena, es que un inhibidor de la degradación debe incluirse a fin de discernir los efectos específicos sobre secuestro de autofagia y no efectos netos de secuestro y degradación. Eficaces inhibidores de la degradación de LDH son inhibidores de la bomba de protones como Baf o concanamycin una3,16,18y lysosomotropic agentes como la cloroquina y cloruro de amonio33. La proteasa inhibidor leupeptin funciona bien en hepatocitos de rata principal23, pero es generalmente ineficaz en las líneas de células de mamífero que hemos probado. Rutinariamente utilizamos Baf13, que actúa rápidamente y es altamente eficiente en células no malignas y malignas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que ninguno de los inhibidores de la degradación de LDH son totalmente específico y supuestos efectos de los inhibidores en autofagia no pueden ser excluidos. Para minimizar el riesgo de influencia no específicos, es recomendable utilizar concentraciones del inhibidor a saturar los niveles y con el inhibidor sólo para las últimas horas (3-4 h) del experimento. La concentración de saturación de Baf debe determinarse para cada tipo de célula. Como guía, 50 – 100 nM es saturador para la mayoría de las líneas de células de mamífero cultivadas que hemos probado, mientras que algunas células tipos como MEFs requieren solamente 10 nM Baf para un bloque completo de degradación de la LDH.
Una limitación obvia con el ensayo de captura de LDH es que puede sólo realizarse en células vivas, excluyendo así su uso para el análisis de la autofagia en los tejidos y fijadas células. Por otro lado, actualmente hay no ensayos establecieron que puede medir la actividad funcional de autofagia en las células fijas. Aunque no probado con el protocolo actual, debe ser posible utilizar el análisis del secuestro de LDH para evaluar en vivo secuestro autophagic actividad en organismos experimentales. La limitación sería que el organismo debe tolerar el tratamiento con un inhibidor de la degradación lisosomal de LDH, y que el período de tiempo entre tal tratamiento y rendimiento de la prueba debe ser relativamente corto, para reducir al mínimo efectos no específicos de el inhibidor. Curiosamente, un estudio reciente por Kominami et al., indicó que el tratamiento 3-6 h de ratas con leupeptin (inyección intraperitoneal de 2 mg/100 g de peso corporal) es apropiado observar la acumulación eficiente de LDH autophagically secuestrado en hígado fracciones subcelulares enriquecidos por las vacuolas autophagic34.
Expresión ectópica de secuestro fluorescente sensible al pH sondas como Rosella35 o36 de Keima puede utilizarse para visualizar secuestro autofagia sin la necesidad de la inclusión de los inhibidores de la degradación. Además, a diferencia del ensayo de secuestro del LDH, estos enfoques pueden utilizarse para visualizar la captura de autofagia en las células. Además, la fusión de la sonda a las secuencias dirigidas a organelas puede ser utilizada para monitorear el secuestro de organelos específicos. Potentes plataformas microscópicas también pueden permitir análisis de proyección de alto rendimiento. Las desventajas son que la expresión ectópica de la sonda, así como la acumulación de la sonda en el sistema lisosomal, puede influir en la vía de la autofagia. Además, a diferencia del ensayo de secuestro del LDH, uno es dependiente de las células que pueden ser transfectadas eficientemente. Por último, mientras que el ensayo de secuestro del LDH proporciona una salida directa cuantitativa del porcentaje secuestrado citosol, los métodos basados en la imagen generalmente no pueden proporcionar este tipo de salida cuantitativa absoluta. Sería recomendable hacer uso de ambos tipos de enfoques de forma complementaria. Otro método excelente para estudiar secuestro autofagia sin la necesidad de inhibidores de la degradación consiste en introducir rafinosa radiactiva en las células por electro-permeabilización reversible3,23,37, 38. Rafinosa es un azúcar membrana impermeant y metabólicamente inerte que es resistente a las enzimas lisosomales. Por lo tanto, su secuestro autofagia puede seguirse por la separación de citosólica de sedimentables celular fracciones3,23,37,38. Este enfoque es, sin embargo, más lento que el análisis del secuestro de LDH y requiere precauciones de seguridad adicionales debido al uso de la radiactividad. Finalmente, el resultado final de secuestro de autofagia a granel y carga autofagia flujo, la degradación de las proteínas de larga vida, puede ser medido con precisión por una bien establecida proteína método basado en el etiquetado39,40 ,41,42,43. Sin embargo, a diferencia del ensayo de secuestro del LDH, este método no proporciona datos específicos para la actividad de autofagia, puesto que las proteínas de larga vida son degradadas también por otros mecanismos de autofagia, en particular por el sistema proteasomal (mientras que LDH secuestro ocurre solamente como resultado de la autofagia). Por lo tanto, incluye un número de control de tratamientos deben ser rutinariamente, por ejemplo, químicos inhibidores de la autofagia lisosomal o degradación proteasomal e interferencia genética con autofagia3,16.
El ensayo de captura de LDH puede ser comparado con los ensayos de flujo utilizados LC3, que miden niveles LC3-II por western blot o LC3 puncta formación de imágenes por fluorescencia en ausencia o presencia de inhibidores de la degradación lisosomal LC3 (Baf es la más utiliza con frecuencia), o la transición fluorescencia etiquetada LC3 variantes a ambientes ácidos22. Aunque estos ensayos LC3-basado pueden proporcionar información útil, pueden ser difíciles de interpretar, en particular porque la relación entre el grado de flujo LC3 y la cantidad y el tipo de flujo de carga se desconoce. Como se mencionó en la introducción, a granel autofagia y Parkin-dependiente mitofagia no requieren LC3 proteínas familiares9,10,11,44. Por otra parte, en hepatocitos de rata hambrienta, secuestro de LDH y degradación procede ininterrumpidamente durante períodos de tiempo donde hay autofagia lisosomal no LC3 flujo9. Así, en este caso, flujo de carga puede ser separado completamente del flujo LC3. Se necesitan más investigaciones comparando LC3 flujo con diferentes tipos de flujo de carga para interpretar mejor los resultados obtenidos con ensayos de flujo LC3.
En su forma actual, el ensayo de captura de LDH es comparable a borrar occidental en términos de tiempo de práctica necesario y costos. En cuanto a la medición de autofagia a granel, es al menos tan eficiente como el ensayo de secuestro basada en la rafinosa o el ensayo de degradación de proteína larga vida descrito anteriormente. Medida específica de la actividad de autofagia secuestro a granel y la formación de autophagosomes cerrada, es mucho más eficiente y directa que LC3 flujo ensayos o ensayos de protección de proteasa receptores LC3 o autofagia, desde los ensayos de este último componentes del carro de medida en lugar de carga real. A pesar de que hemos mejorado sustancialmente el rendimiento de la prueba de captura de LDH, está lejos de ser un ensayo de alto rendimiento, y no puede competir con la eficiencia de las imagen-ensayos descritos anteriormente. Sin embargo, el análisis basado en imágenes y el análisis del secuestro de LDH tienen sus ventajas y desventajas, y por lo tanto ambos tipos de análisis tienen sus propios valores. Es probable que posible mediante ajustes futuros para hacer el LDH secuestro ensayo semi alto rendimiento. Por ejemplo, debería ser posible llevar a cabo electrodisruption en formato de 96 pozos, y es concebible que se podría separar LDH citosólica de LDH secuestrado por filtración en vez de centrifugación, o que el paso de centrifugación puede realizarse en un 96- bien el formato. Además, ensayos para medir la actividad LDH que son mucho más sensibles que en el actual protocolo se han desarrollado y están disponibles en el mercado. Otros potenciales futuros interesantes del ensayo están su posible uso en otros tipos celulares de células de mamíferos, por ejemplo en levaduras u otros organismos unicelulares, o incluso plantas de las células, así como su uso para la medición en vivo de autofagia actividades de secuestro en los tejidos de los organismos experimentales.
En conclusión, creemos que el análisis del secuestro de LDH en su forma mejorada y renovada será una herramienta importante en futuras investigaciones relacionadas con la autofagia.
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Disclosures
Los autores no tienen conflicto de interés.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Consejo de investigación de Noruega, la Universidad de Oslo, la Anders Jahre Foundation, la Fundación de Nansen y el legado en la memoria de Henrik Homan. Agradecemos a Dr. Noboru Mizushima para el ATG5 + / + MEFs y ATG5/MEFs, Dr. Masaaki Komatsu para la ATG7 + / + MEFs y ATG7/MEFs y Dr. Shizuo Akira para el ATG9A + / + MEFs y ATG9A/MEFs. Agradecemos Frank Sætre asistencia técnica, y el Dr. por Seglen O. constructivas discusiones metodológicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µL) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µL) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1,000 µL) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
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