Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مقايسة تنحية نازعة لاكتات — طريقة بسيطة وموثوق بها لتحديد النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57971
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

ويرد هنا بروتوكول بسيط وتم التحقق من صحتها جيدا لقياس النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات. الأسلوب يستند على قياس نسبة اللاكتات نازعة (رابطة حقوق الإنسان) في سيديمينتابل خلية الكسور مقارنة بإجمالي المستويات الخلوية في رابطة حقوق الإنسان.

Abstract

أوتوفاجي السائبة تتميز بعزل أجزاء كبيرة من السيتوبلازم إلى الهياكل المزدوجة-membrane متعددة تسمى أوتوفاجوسوميس. ويرد هنا بروتوكول بسيط لرصد هذه العملية. وعلاوة على ذلك، يتم توفير النتائج النموذجية والتجريبية التحقق من صحة الأسلوب تحت ظروف حمل أوتوفاجي في أنواع مختلفة من خلايا الثدييات المستزرعة. خلال أوتوفاجي السائبة، تنحية أوتوفاجوسوميس سيتوسول، وذلك أيضا للذوبان البروتينات سيتوسوليك، جنبا إلى جنب مع غيرها من البضائع أوتوفاجيك. رابطة حقوق الإنسان هي مستقرة وعالية الإنزيم سيتوسوليك وفيرة، والقابلة للذوبان هو المعزول غير انتقائية في أوتوفاجوسوميس. ولذلك يعكس مقدار تنحية رابطة حقوق الإنسان مبلغ السائبة تنحية أوتوفاجيك. لتحديد كفاءة ودقة تنحية رابطة حقوق الإنسان في الخلايا، نحن نوظف بروتوكولا تجزئة المستندة إلى اليكتروديسروبشن الذي يفصل فعالية سيديمينتابل من سيتوسوليك رابطة حقوق الإنسان، تليها قياس النشاط الأنزيمي في سيديمينتابل الكسور مقابل عينات كامل الخلية. عزل أوتوفاجيك يتحدد بطرح نسبة سيديمينتابل رابطة حقوق الإنسان في الخلايا غير المعالجة من تلك الخلايا في المعالجة. ميزة الفحص تنحية رابطة حقوق الإنسان أنه يعطي مقياس كمي لعزل أوتوفاجيك من البضائع المحلية، بدلاً من الأساليب الأخرى أما تنطوي على التعبير حمل خارج الرحم المسابير تنحية أو مبطلات شبه كمي حماية تحليلات لعلامات أوتوفاجي أو مستقبلات.

Introduction

أوتوفاجي (اليونانية "الأكل الذاتي") عملية تطورية مصانة لتدهور رغوي/تعويض المواد داخل الخلايا. عند اكتشاف الجينات المرتبطة أوتوفاجي ("ATG")، وهامة أوتوفاجي في الخميرة والبشر، والتحقيق أوتوفاجي أن يلعب دوراً هاما في صحة الإنسان والمرض (اعترف بفضل جائزة نوبل في الطب أو الفيزيولوجيا لعام 2016 يوشينوري اوشومي)، أوتوفاجي قد تصبح بسرعة واحدة من العمليات الأكثر كثافة درس في خلية علم الأحياء1،2.

ماكرووتوفاجي (يشار إليه فيما يلي "أوتوفاجي") تتسم بالتوسع وقابلة للطي للغشاء داخل الخلايا سيستيرناي ("فاجوفوريس") في هياكل مختومة، مزدوج أو متعدد membrane ("أوتوفاجوسوميس") الذي عزل فعال المواد enwrapped من باقي السيتوبلازم. عند انصهار أوتوفاجوسوميس مع lysosomes، الغشاء أوتوفاجوسومال الداخلي والبضائع المنحاة المتدهورة والمعاد تدويرها. أوتوفاجوسوميس يمكن عزل المواد هيولى في عشوائية (غير انتقائية أوتوفاجي) وآداب الانتقائي (أوتوفاجي الانتقائي). أوتوفاجي الأكبر على الأرجح يمثل مزيجاً أوتوفاجي انتقائية وغير انتقائي.

في عام 1960 و 70 ("المورفولوجية عصر" البحوث أوتوفاجي)، وعزل أوتوفاجيك قيمت أساسا من خلال التحليلات ultrastructural. في ثمانينيات القرن الماضي وبداية تسعينيات القرن العشرين ('' مرحلة البيوكيميائية '') "كل سيجلين" وزملاء العمل – الذي درس أوتوفاجي في خلايا الكبد في الفئران الأولية – تطوير أساليب الأولى لقياس كمي تنحية أوتوفاجيك النشاط3. استخدام هذه الاختبارات، سيجلين تعريف ووصف مختلف الخطوات من4،أوتوفاجيك الليزوزومية المسار5، اكتشفت ويسك أمفيسومي6 (منتج الانصهار دخلول-أوتوفاجوسومي) وكان الأول من وصف دور الفسفرة البروتين في أوتوفاجي لائحة7. ومع ذلك، بعد اكتشاف أتجس في لعام 1990 ("عصر الجزيئية")، ووصف أول بروتين ATG8 الثدييات، سلسلة البروتينات المرتبطة microtubule 1A/1B-الضوء 3 (LC3) في عام 20008، استخدام البروتينات ATG كعلامات عملية أوتوفاجيك سرعان ما اكتسب شعبية، وتركت الطرق البيوكيميائية الأكبر سنا وأكثر مشقة. وفي الواقع، على مدى 18 عاماً الماضية ولطخة غربية وتحاليل مجهرية fluorescence LC3 أصبحت حد بعيد الأكثر شعبية (وفي كثير من الحالات فقط) وسيلة لدراسة أوتوفاجي في خلايا الثدييات. الميزة هي السهولة النسبية التي يمكن تنفيذ هذه الأساليب. العيب أن واحداً دراسة مكون عربة (LC3) بدلاً من البضائع أوتوفاجيك الفعلية. وهذا عيب خطير بدلاً من ذلك، نظراً للعلاقة بين الدول و/أو التمويه LC3 من خلال المسار مقابل عزل وتدفق البضائع غير واضح جداً. وفي الواقع، أننا أظهرنا أنه يمكن الحفاظ على تدفق البضائع السائبة في مستويات عالية في ظروف حيث يوجد لا التمويه LC3، على الرغم من وجود LC3 مترافق في خلايا9. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن أوتوفاجي الأكبر لا تتأثر بكفاءة LC3 نضوب، وبالتالي يرجح أن هو مستقل LC39. وقد أكد هذا الاستنتاج في وقت لاحق LC3 الدراسات المغلوب10،11، التي تشير أيضا إلى أن تعتمد على باركين ميتوفاجي (أوتوفاجي انتقائية من الميتوكوندريا) بشكل مستقل LC310،11 .

وباختصار، هناك واضحة تحتاج لفحوصات على أساس الشحن لمراقبة نشاط أوتوفاجيك. على النحو الأمثل ينبغي أن تكون مثل هذه الاختبارات على نطاق واسع المنطبقة ومحددة تحديداً جيدا، وسهلة لتنفيذ. على مدى السنوات القليلة الماضية لقد أحطنا اهتماما خاصا بمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، التي وضعتها "كل سيجلين" في ثمانينيات القرن الماضي12، ويستند إلى قياس نقل رابطة حقوق الإنسان سيتوسوليك إلى سيديمينتابل، أوتوفاجيك الخلية التي تحتوي على المنقبضة الكسور. رابطة حقوق الإنسان هو بروتين سيتوسوليك مستقر وقابل للذوبان بسهولة المحتبس المشترك عند فاجوفوريس لف البضائع هيولى. ولذلك تنحية من رابطة حقوق الإنسان مقياس عام لعزل أوتوفاجيك. رابطة حقوق الإنسان المتدهورة حصرا ب المسار أوتوفاجيك الليزوزومية12. وبالتالي، وجود مثبطات تدهور الليزوزومية، مثلاً، بافيلوميسين A1 (Baf)13، آثار العلاج التجريبي مباشرة تعكس التغييرات في نشاط تنحية أوتوفاجيك. نظراً لغياب مثبطات التدهور، يمكن قياس الأثر الصافي للتعديلات في تنحية رابطة حقوق الإنسان والتدهور.

مقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان المطبقة على نطاق واسع، حيث يعبر رابطة حقوق الإنسان عاليا وأوبيكويتوسلي في جميع أنواع الخلايا، ويمكن قياس مستويات رابطة حقوق الإنسان بدقة تحليل الأنزيمي14،15. غير أن البروتوكول الأصلي12 – أنشئت في خلايا الكبد في الفئران الأولية – بدلاً من ذلك يستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب كمية عالية من ابتداء من المواد، فضلا عن تفريغ كهربائي مصنوعة خصيصا مكثف. على نحو تدريجي، ونحن قد تحولت تدريجيا المقايسة إلى طريقة سهلة ومرنة. أولاً، البروتوكول الأصلي تم تكييفها للاستخدام في خلايا الثدييات الأسطر16. وثانيا، كان الأسلوب كثيرا المصغرة3،9. ثالثا، تم القضاء على العديد من الخطوات في البروتوكول، بما في ذلك كثافة شاقة وسادة الخطوة17. مكن هذا في نفس الوقت تصغير أبعد من الأسلوب، من نقطة البداية الأصلية لاستخدام لوحة 10 سم كل عينة16 إلى استخدام بئر واحدة من صفيحة 12-جيدا كل عينة (أيحوالي 15-fold أقل بدءاً 17من المواد). ورابعاً، حددنا جهاز انهانسر تجارية التي يمكن أن تحل محل مكثف تفريغ كهربائي مصنوعة خصيصا17.

ويرد هنا لدينا البروتوكول الأكثر حداثة للمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، التي تشمل بعض التبسيطات مواصلة أسلوب مقارنة ب نشرها مسبقاً17 . وعلاوة على ذلك، يتم إظهار مجموعة من النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها في عدد من أنواع مختلفة من الخلايا، والأهم من ذلك، يتم توفير عدة أسطر من التصديقات التجريبية لأسلوب استخدام ضربة قاضية الدوائية فضلا عن الجينية والنهج خروج المغلوب. لمخطط تدفق الإجمالي البروتوكول كله، انظر الشكل 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-خلية البذر والعلاج

  1. ثقافة الخلايا ملتصقة في قوارير زراعة الأنسجة2 75 سم في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية، واستخدام الثقافة الوسيلة المفضلة لنوع الخلية في السؤال. السماح للخلايا لتنمو حتى تصل إلى طبقة خلايا بالقرب من روافد.
    ملاحظة: استخدام المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) لنكاب، HEK293، الماوس الليفية الجنينية (MEFs)، BJ، MCF-7، والخلايا RPE-1.
    1. تغسل الخلايا مع 3 مل 37 درجة مئوية مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، الرقم الهيدروجيني 7.4. استبدال برنامج تلفزيوني مع 3 مل 0.25% (w/v) التربسين-اتهيلينيديامينيتيتراسيتاتي (يدتا)، واحتضان قارورة في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا (2 – 5 دقيقة).
    2. ريسوسبيند الخلايا المنفصلة مع 7 مل الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS. مزيج قاسمة تعليق خلية 10 ميليلتر مع 10 ميليلتر 0.4% تريبان الأزرق في أنبوب ميكروسينتريفوجي، استخدام تلميح ماصة 0.5 – 20 ميليلتر. استخدام تلميح ماصة نفس فورا تعبئة شريحة دائرة عد الأصوات، وحساب الخلايا في عداد خلية الآلي.
  2. إعداد مناسبة تمييع (راجع الملاحظة أدناه) من تعليق خلية من استخدام الخطوة 1.1.2 الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS، والبذور 1 مل تعليق خلية المخفف في كل بئر زراعة الأنسجة 12-جيدا باستخدام لوحة (المساحة السطحية ~3.8 سم2) العقيم تقنية. تسمح بالنمو في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية حين تم بلوغ كثافة الخلايا المطلوب، مثلاً، 60 – 90% في التقاء في موسم الحصاد.
    ملاحظة: تتنوع تمييع المناسبة لتعليق الخلية التي سوف تعطي كونفلوينسي الخلايا المطلوب عند الحصاد من نوع الخلية إلى نوع من الخلايا، وكذلك وفقا للمدة ونوع من العلاجات التجريبية. وهكذا، وهذا يجب تجريبيا تقييم في كل حالة على حدة.
    1. لإجراء التجارب على أن يكون كل تعامل وتحصد بعد بذر البذور 2.5 × 105 LNCaP، HEK293، أو MCF-7 الخلايا، 5 × 104 ميفس، 4 × 105 BJ أو 1.5 × 10 أيام 25 RPE 1 الخلايا في كل من لوحة 12-جيدا جيدا.
    2. للخلايا التي تلتزم بشكل فضفاض، معطف اللوحات مع نوع طلاء الموصى بها لنوع الخلية في السؤال. لخلايا LNCaP (و HEK293) استخدام ألواح مغطاة بطبقة بولي-د-يسين (PDL).
    3. تحقيقا لهذه الغاية، إضافة 500 ميليلتر PDL في 2.5 ميكروغرام/مل في العقيمة ح2س لكل بئر، واحتضان اللوحات في بيئة معقمة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). إزالة PDL بالشفط، وتغسل كل جيدا بإيجاز مع 1 مل العقيمة H2o.
      ملاحظة: يتم خطوة 1.2.1 عموما، دون أي علاجات تجريبية. ومع ذلك، إذا كان أداء [رني]، قد يكون مناسب للبدء عكس تعداء مع بذر9.
  3. إجراء علاجات تجريبية في الآبار مكررة أو ثلاث كل حالة.
    1. على سبيل المثال، تعامل الخلايا مع 50 نيوتن متر Torin1 mTOR-المانع، عموما كفاءة محفز لتنحية أوتوفاجيك، أو رهنا بالخلايا المجاعة الحادة المصل-والأحماض الأمينية بغسل الخلايا مع 1 مل إيرل خال من الأحماض الأمينية التي موازنة الملح المتوسطة الحل (ابس)، وبعد ذلك تبني الخلايا الموجودة في 1 مل ابس في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
    2. اترك مجموعة واحدة من الآبار دون علاج من أجل تحديد مستويات أساسية من سيديمينتابل رابطة حقوق الإنسان.
    3. إضافة كمية تشبع من بافيلوميسين المانع بعد تنحية A1 (Baf)3،13،،من1618 في غياب أو وجود علاجات تجريبية، ح 3-4 قبل الخلية الحصاد. احتضان الخلايا في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
      1. استخدام 100 نانومتر Baf LNCaP, HEK293, BJ، MCF-7 وخلايا RPE-1، و 10 نانومتر Baf ميفس.
      2. لإضافة العلاجات التجريبية التي لها مدة إلا 3 – 4 ح (مثل تلك الخطوة المتمثلة في 1.3.1 وعادة ما يكون)، معامل التراكم الأحيائي في نفس الوقت مع العلاجات. لم يعد العلاج التجريبي، الانتظار حتى ح 3-4 قبل موسم الحصاد، وإضافة 2 ميليلتر من علامة x 500 تتركز الأسهم Baf مباشرة في المتوسط.
      3. مزيج من التحريض اللوحة مباشرة بعد إضافة معامل التراكم الأحيائي. وفي هذه المرحلة أيضا يوصي إضافة مثبطات تنحية ماكرووتوفاجيك كعناصر التحكم، مثلاً، 10 ملم من عموم--فوسفوينوسيتيدي 3-كيناز (PI3K) المانع 3-ميثيل الأدنين (3MA)19، أو 10 ميكرون من فئة PI3K انتقائية الثالث مثبط 405 ريال سعودي20.

2-الخلية الحصاد وإعداد اليكتروديسروبشن

  1. في نهاية فترة العلاج، نضح المتوسطة مع الشفط وإضافة حل مفرزة 200 خلية ميليلتر (مسخن مسبقاً إلى 37 درجة مئوية) لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا (عادة حوالي 5 دقائق).
    ملاحظة: بينما يمكن استخدام 0.25% (w/v) التربسين-يدتا بدلاً من الحل مفرزة الخلية، هذا الأخير يحتوي على الدناز، مما يساعد على تقليل لزوجة الخلايا المنفصلة. طالما ويستنشق دقة المتوسطة، فإنه ليس من الضروري غسل الخلايا قبل إضافة الحل مفرزة يدتا التربسين أو خلية.
  2. إضافة 500 ميليلتر درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) PBS، درجة الحموضة 7.4، الذي يحتوي على 2% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA) لكل بئر، وريسوسبيند الماصة حتى لا كتل الخلايا مرئية. نقل على الفور بتعليق خلية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب على الجليد.
    ملاحظة: ما لم يذكر خلاف ذلك، تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة على الجليد.
  3. الرواسب الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. دقة نضح المادة طافية (بالشفط) ترك الكريات الخلايا الجافة كما قدر الإمكان.
  5. إضافة 400 السكروز 10% (w/v) ميليلتر (في عالي النقاوة ح2س) لكل أنبوبة.

3-غشاء البلازما اليكتروديسروبشن والانفصال من الكسور سيديمينتابل ومجموع الخلايا

  1. ريسوسبيند بيليه الخلية مع ماصة للحصول على تعليق خلية واحدة تقريبا، وأنه نقل إلى ومبومو انهانسر 4 مم.
    ملاحظة: بيبيتينج صعودا ونزولاً ~ 10 – 15 مرة، استخدام تلميح ماصة ميليلتر 100 – 1,000، عادة ما تكون كافية.
  2. وضع في ومبومو في اليكتروبوراتور موجه تحلل أسي، والاضطلاع بنبضه كهربائية واحدة 800 الخامس و 25 µF و 400 Ω؛ تنتج هذه الإعدادات نبض لمدة ~ 8 مللي ثانية.
  3. استخدام تلميح ماصة جديدة لنقل ديسروبتاتي الخلية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل تحتوي على 400 من محلول السكروز المثلج مخزنة فوسفات ميليلتر (الأدينوزين الصوديوم 100 مم، 2 مم ديثيوثريتول (DTT)، يدتا 2 مم، والسكروز 1.75%، درجة الحموضة 7.5)، ومزيج بإيجاز قبل بيبيتينج.
    1. اختياري: للتحقق من كفاءة البلازما غشاء اليكتروديسروبشن17، خلط 10 ميليلتر من ديسروبتاتي الخلية المخففة من الخطوة 3، 3 مع 10 ميليلتر 0.4 في المائة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل تريبان الأزرق. نقل إلى غرفة الفرز والتحقق من أن النسبة المئوية للخلايا إيجابية تريبان الأزرق > 99%.
      1. تترك العينة في قاعة العد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية)، والتحقق من أن النسبة المئوية للخلايا إيجابية تريبان الأزرق ظل > 99%.
    2. اختياري: للتحقق من اليكتروديسروبشن لم تكن قاسية جداً، فإنها قد لم تنقطع العضيات داخل الخلية، نفذ الخطوات 3، 1، 1-3 كما هو موضح أعلاه، ولكن استخدام مادة انطلاق أكبر (بئر من صفيحة 6-جيدا مع طبقة خلية المتلاقية ~ 80 ٪)، واستخدم 150 ميليلتر 10% السكروز في الخطوة 2, 5 و 150 ميليلتر محلول السكروز مخزنة الفوسفات دون القيمة في الخطوة 3، 3.
      1. استخدام ماصة لعناية طبقة 200 ميليلتر من الحل ديسروبتاتي خلية المخفف على رأس وسادة كثافة 1.2 مل من الفوسفات مخزنة 8% (w/v) الكثافة المتوسطة التدرج (على سبيل المثال، 8% نيكودينز، فوسفات الصوديوم 50 مم، السكروز 2.2 في المائة، 1 مم يدتا) في أجهزة الطرد مركزي في 2 مل أنبوب. الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية في ميكروسينتريفوجي مع وظيفة وضع الناعمة (لتسريع لطيف والتباطؤ)، ووضع الأنابيب بعناية على الجليد.
      2. بعناية إزالة 60 ميليلتر من الكسر الأعلى ~ 200 ميليلتر، مع التأكد من عدم التقاط أي حل الكثافة المتوسطة التدرج، ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
        ملاحظة: يجب أن يتضمن سيتوسول النقاء استثنائية، يطلق عليه "ساب الخلية"21.
      3. اختبار نقاء الكسر التي تم الحصول عليها في الخطوة أعلاه، عن طريق إجراء تحليلات لطخة غربية للبروتينات الواردة عضية، باستخدام التقنيات القياسية و المواد الهلامية المتدرجة 4 – 20%16.
      4. القيام على سبيل المثال immunoblotting كاثيبسين ب21، السيتوكروم ج، والبروتين إيزوميراز الميثيل، للتحقق من أن صدمة كهربائية في الخطوة 3، 2 لا عطلت lysosomes أو الميتوكوندريا أو هيولى، على التوالي، وإيمونوبلوت رابطة حقوق الإنسان للتحقق من وجود بروتين سيتوسوليك في ساب الخلية.
      5. في موازاة ذلك، إجراء إيمونوبلوتينج على مستخلصات البروتين مصنوعة من حل ديسروبتاتي خلية الإجمالي16 لتأكيد أن الأجسام المضادة المستخدمة يمكن الكشف عن البروتينات عضية الواردة التي يجري تقييم.
  4. كرر الخطوات من 3، 3، 1-3 لكل عينة.
  5. إزالة 550 ميليلتر من كل حل ديسروبتاتي الخلية المخففة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 3) إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل الذي يحتوي على 900 ميليلتر استثارة المثلج المخزن المؤقت (الأدينوزين الصوديوم 50 مم، 1 مم DTT ويدتا 1 مم والسكروز 5.9 في المائة، درجة الحموضة 7.5) تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.5% و 0.01 ٪ توين-20، ومزيج بإيجاز عن طريق بيبيتينج.
  6. أجهزة الطرد المركزي في س 18,000 ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية لإنتاج الكريات المحتوية على "رسابة رابطة حقوق الإنسان". دقة نضح المادة طافية (بالشفط) ترك الكريات جافة قدر الإمكان. وضع العينات في ثلاجة-80 درجة مئوية.
  7. نقل 150 ميليلتر من كل حل ديسروبتاتي الخلية المخففة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 3) إلى أنابيب جديدة، ووضع العينات في ثلاجة-80 درجة مئوية. استخدام هذه العينات لتحديد مستويات "إجمالي رابطة حقوق الإنسان" في الخلايا.
    ملاحظة: عند هذه النقطة التجربة يمكن أن يكون مؤقتاً لطالما رغب.

4-رابطة حقوق الإنسان استخراج وقياس النشاط الأنزيمي رابطة حقوق الإنسان

  1. عينات "إجمالي رابطة حقوق الإنسان" (من الخطوة 3، 7) على الجليد وذوبان الجليد "رسابة رابطة حقوق الإنسان" (من الخطوة 3، 6).
  2. إضافة 300 ميليلتر لاستثارة المثلج المخزن المؤقت الذي يحتوي على 1.5% X-405 تريتون إلى "رابطة حقوق الإنسان الكلي" عينات (العائد نهائي تريتون X-405 تركيز 1%). قم بتدوير العينات على اسطوانة في غرفة باردة (4 – 8 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
  3. إضافة 750 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستثارة المثلج مع 1% X-405 تريتون إلى "رابطة حقوق الإنسان رسابة" عينات، وريسوسبيند الكريات مع ماصة حتى يتم التوصل إلى حل متجانسة.
  4. الطرد المركزي العينات المأخوذة من الخطوة 4، 2 و 4-3 في 18,000 س ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية للرواسب أونديسولفيد الحطام الخلوية.
  5. مزيج 4 أجزاء ايميدازول الباردة 65 مم (درجة الحموضة 7.5)/0.75 بيروفات ملم مع جزء واحد من ايميدازول الباردة 65 مم (درجة الحموضة 7.5)/1.8 مم NADH للحصول على حل عمل مستقرة لمدة ثلاثة أسابيع على الأقل في 4 درجات مئوية.
  6. خلط 3 – 30 ميليلتر من سوبيرناتانتس من الخطوة 4، 4 مع 200 ميليلتر من الحل العامل خطوة 4.5.
  7. تحديد مقدار رابطة حقوق الإنسان بقياس النشاط الأنزيمي رابطة حقوق الإنسان كانخفاض نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (نموذج مخفضة) امتصاص (NADH) في 340 نيوتن متر عند 37 درجة مئوية مقارنة بمستوى تركيز رابطة حقوق الإنسان معروفة. إجراء قياسات امتصاص حتى رد فعل قد اقترب من الإنجاز، أي حتى امتصاص في 340 نانومتر لن يتغير مع مرور الوقت.
    ملاحظة: هذا هو الأسلوب الكلاسيكي البيوكيميائية لقياس نشاط رابطة حقوق الإنسان. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يقوم برد فعل على 37 درجة مئوية، فإنه يمكن أيضا إجراء في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) والتي من المستحسن إذا كانت دليل أن تفعل. البروتوكول الحالي يستخدم أداة مولتياناليزير روبوتية، بطريقة إليه الذي يمزج بين العينات مع الحل العامل في صفيحة 96-جيدا، وتدابير امتصاص في 340 نيوتن متر عند 37 درجة مئوية كل 20 ثانية لمدة 3 دقائق. وبعد ذلك، يحسب البرنامج أداة تركيز رابطة حقوق الإنسان، كوحدات (U) وأعرب عن/L، بمقارنة منحدر القياسات امتصاص مع مرور الوقت بالمقارنة مع منحنى قياسي الحصول عليها عن طريق معايرة باستخدام معيار من رابطة حقوق الإنسان المعروفة التركيز. مجموعة الخطي للكشف بواسطة هذا النهج هو 30 – 1,500 U/l. وكبديل لذلك، توجد طائفة واسعة من مجموعات المتاحة تجارياً لقياس رابطة حقوق الإنسان. تستند بعض منها اقتران رد الفعل الأنزيمي لتوليد منتجات اللونية أو الفلورسنت، مما يتيح الكشف عن وسائل أخرى مما كانت الأشعة فوق البنفسجية، ومع النطاقات الأخرى الخطية للكشف عن.

5-حساب تنحية رابطة حقوق الإنسان

  1. حساب النسبة المئوية لرابطة حقوق الإنسان رسابة إلى مجموع رابطة حقوق الإنسان لكل عينة، أخذ تخفيف وأخذ العينات في الاعتبار:
    رابطة حقوق الإنسان رسابة (%) =Equation 1
    ملاحظة: خلال الخطوات 3.1 – 3.3 حوالي 50 ميليلتر من فقدت بسبب نقل داخل وخارج ومبومو انهانسر. ومن ثم، حساب من وجود ما مجموعة 750 ميليلتر (بدلاً من 800 ميليلتر) من ديسروبتاتي الخلية المخففة في الخطوة 3، 3.
  2. النسبة المئوية لرابطة حقوق الإنسان رسابة التي تم الحصول عليها في العينات المأخوذة من الخلايا غير المعالجة (الخطوة 1.3.2) من النسبة المئوية لرابطة حقوق الإنسان رسابة الحصول على عينات من الخلايا المعالجة تجريبيا، والفجوة في وقت المعاملة مع معامل التراكم الأحيائي للحصول على النسبة المئوية لطرح المحتبس رابطة حقوق الإنسان كل ساعة في فترة أخذ العينات:
    المحتبس رابطة حقوق الإنسان (%/h) =Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام البروتوكول الموصوفة هنا، نشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في عدد من خطوط خلايا الثدييات المختلفة، بما في ذلك LAPC4، DU145، Huh7، PNT2A، هيلا، VCaP، H3122، Hec1A، MCF-7، G361، T47D، U2OS، PC3 الماوس الليفية الجنينية (MEFs)، RPE-1، وتم قياس الخلايا BJ، HEK293 ولنكاب. عزل بتقييم ظروف القاعدية (في المتوسط كاملة، الغنية بالمغذيات)، أو في خلايا حادة المتعطشة للمصل والأحماض الأمينية ( حسن النية الذي يحفز أوتوفاجي شرط22). أشارت النتائج إلى أن نشاط تنحية رابطة حقوق الإنسان في ظل ظروف المجاعة تختلف على نطاق واسع عبر خطوط خلايا مختلفة، تتراوح بين مستويات لا يمكن اكتشافها بالكاد في LAPC4، DU145، Huh7، والخلايا PNT2 (البيانات لا تظهر) إلى ~1.6%/h في خلايا LNCaP (رقم 2 A). المعدل الملاحظ في خلايا الكبد في الفئران الابتدائي المتعطشة أعلى من خطوط الخلايا المشار إليها أعلاه، وعادة ما يتراوح من 2.5–4%/h23. تحت ظروف القاعدية، وتنحية رابطة حقوق الإنسان كان لا يمكن الكشف عنها تقريبا في نصف خطوط الخلايا اختبارها، وتراوحت من ~0.2%/h إلى ~0.5%/h في النصف الآخر (البيانات لا تظهر). في خطوط الخلية التي تظهر النشاط تنحية أوتوفاجيك القاعدية القابلة للاكتشاف، يستحث المجاعة الحادة المصل والأحماض الأمينية عادة إلى 3 – 4 إضعاف زيادة في معدل عزل رابطة حقوق الإنسان (انظر على سبيل المثال التجربة لنكاب هو مبين في الشكل 2أ). في خطوط الخلية اختبار (المذكور أعلاه)، نسبة الخلفية رسابة رابطة حقوق الإنسان التي تم الحصول عليها في عينات من الخلايا غير المعالجة (الخطوة 1.3.2) هو عادة حوالي 2 – 3%. من التجارب المستقلة 22 المنجز في مختلف خطوط الخلايا، تجريبية داخل معامل الاختلاف (CV) بين رسابة رابطة حقوق الإنسان قيم (% رسابة رابطة حقوق الإنسان) replicates العلاج كان ± 5.8% 1.7% (متوسط % السيرة الذاتية ± الانحراف المعياري)، تتراوح بين 3.0- 9، 0%. معا، هذه الأرقام تعطي مؤشرا لما يمكن توقعه عند إجراء المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان في خلايا الثدييات.

نهج استخدام مثبطات الكيميائية كضربة قاضية وخروج المغلوب جيدا كما الوراثية، يتحقق على نطاق واسع أن المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان تدابير موثوق بها النشاط تنحية أوتوفاجيك. يتطلب تكوين أوتوفاجوسومي PI3K نشطة في الفصل الثالث (PIK3C3) وقيادة الأمم المتحدة--51 مثل أوتوفاجي تفعيل كيناز (إلك)24، فضلا عن تحقيق التوازن في داخل الخلية Ca2 + التوازن16. كما هو مبين في الشكل 2أ، رابطة حقوق الإنسان القاعدية والمجاعة الناجمة عن عزل تماما إلغاء واسطة 3MA المانع عموم PI3K، مثبط PIK3C3 انتقائية 405 ريال سعودي20، أو ER Ca2 + مضخة مثبط ثابسيجارجين (تيراغرام) 25 في خلايا LNCaP. عزل رابطة حقوق الإنسان ظروف المجاعة (التبديل إلى متوسط حل متوازن الملح (ابس) خال من الأحماض الأمينية إيرل) ينخفض بشدة أيضا تيراغرام، أو MRT67307 إلك-المانع في الخلايا HEK293 (الشكل 2ب). وعلاوة على ذلك، عزل رابطة حقوق الإنسان الناجمة عن المجاعة تحول دون استمرار واسطة 3MA في ميفس (الشكل 2ج)، BJ (الشكل 2د)، MCF-7 (الشكل 2ه)، و RPE-1 (الشكل 2و) الخلايا. عموما، حضانة الخلايا في المتوسط ابس وحدها (أي، في غياب معامل التراكم الأحيائي أو مثبطات أخرى بعد تنحية) لا يؤدي إلى تراكم المنحاة رابطة حقوق الإنسان أي قابلة للقياس (انظر على سبيل المثال التجربة لنكاب هو مبين في الشكل 2 A). هذا المرجح لأن المجاعة الحادة من الأحماض الأمينية يؤدي إلى تسارع تدفق أوتوفاجيك الليزوزومية، أدى إلى تدهور سريع ومتواصل لرابطة حقوق الإنسان يلتقيه.

المقبل، ومختلف الجينات ATG MEFs خروج المغلوب (كو) استخدمت لاختبار ما إذا كانت تنحية رابطة حقوق الإنسان يتطلب الجينات المتعلقة أوتوفاجي ذكرت أنها أساسية لتشكيل أوتوفاجوسومي. في الواقع، هو إلغاء عزل رابطة حقوق الإنسان الناجمة عن المجاعة في ميفس كو ATG526 (الشكل 3أ)، تؤكد لنا النتائج السابقة9. وعلاوة على ذلك، كما هو مبين في الشكل 3ب وج 3، هو حدث احتباس رابطة حقوق الإنسان الناجمة عن المجاعة أيضا في ميفس كو ATG727 وميفس كو ATG9A28.

وأخيراً، تم اختبارها مقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان فيما يتعلق بما إذا كان [رني] بوساطة إسكات المحاضر الجينات ATG الرئيسية سوف تمنع تنحية المجاعة الناجمة عن النشاط. وفي الواقع، من تعداء مع استهداف ATG9A siRNA، أو تستهدف الجمع بين ULK1 و ULK2، تنحية رابطة حقوق الإنسان بشدة انخفاض تحت ظروف المجاعة في خلايا LNCaP (الشكل 3د). وعلاوة على ذلك، نحن أكدت لنا النتائج السابقة3،9 أن استهداف الأسرة كيناز التصاق تنسيق التفاعل البروتين من 200 كاتشين (FIP200) أو الجمع بين استهداف نوع حمض أمينوبوتيريك γ (المرتبطة بمستقبلات البروتين A (جابا) يمنع أفراد الأسرة جاباراب) رابطة حقوق الإنسان الناجمة عن المجاعة تنحية (الشكل 3د).

Figure 1
الشكل 1 : تدفق عموما نظام البروتوكول تنحية رابطة حقوق الإنسان- البروتوكول يستند على شكل لوحة زراعة الأنسجة 12-جيدا، استخدام وحدات التخزين المشار إليها كل عينة (من بئر واحدة). يمكن تقسيم البروتوكول المقايسة مريح إلى يومي عمل منفصلة، كما هو مبين. ومع ذلك، من الممكن أيضا لتنفيذ الإجراء بأكمله في يوم واحد. المختصرات: أي بي بي، بعد انفجار المخزن المؤقت (راجع الخطوة 3، 3 في البروتوكول للمكونات)؛ RSB، استثارة المخزن المؤقت (راجع الخطوة 3، 5 في البروتوكول للمكونات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : التحقق من صحة للمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان استخدام المركبات التي تحول دون أوتوفاجي- لنكاب (A) أما ترك الخلايا غير المعالجة (غرض الطرح الخلفية: راجع الخطوة 1-3-2) في النمو الكامل المتوسطة (سم؛ ربمي 1640 + 10% الجنيني البقري المصل (FBS))، أو كانوا يعاملون مع مركبة [دمس] (0.1%) أو 100 نانومتر Baf سم أو في مصل الدم والأحماض الأمينية الحرة المتوسطة (ابس). بالإضافة إلى ذلك، بعض الخلايا تعامل مع 3MA (10 ملم)، 405 ريال سعودي (10 ميكرومتر)، أو ثابسيجارجين (300 نانومتر)، وكما هو مبين. بعد 3 ساعات علاج، كانت تحصد الخلايا، وتنحية رابطة حقوق الإنسان وحددت معدلات كمفصل في البروتوكول الحالي. (ب) HEK293 الخلايا تعامل مع مركبة [دمس] (0.1%) في الطول، أو مع 100 نانومتر Baf في ابس، كما هو مبين. بالإضافة إلى ذلك، تلقي بعض الخلايا 10 ميكرون MRT67307 (مثبطات إلك) أو 300 نانومتر ثابسيجارجين. وحددت معدلات احتباس رابطة حقوق الإنسان بعد ح 3 من العلاج. (ج-F) خلايا MEF (C) BJ (د)، MCF-7 (ه) أو RPE-1 (و) تعامل مع مركبة [دمس] (0.1%) في سم أو معامل التراكم الأحيائي (10 نانومتر في ج 100 نانومتر في د إف) في ابس مع أو بدون 3MA 10 ملم، كما هو مبين. وحددت معدلات احتباس رابطة حقوق الإنسان بعد ح 3 من العلاج. أ، ب، د، هاء وواو إظهار القيم الوسطية من ثلاثة replicates البيولوجية (ثلاث آبار) من تجربة واحدة (n = 1)، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. ج يعرض القيم يعني من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3)، مع أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. ف < 0.05، * * *ف < 0.001، كرر عينات ANOVA أحادي الاتجاه.

Figure 3
الشكل 3 : التحقق من صحة للمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان بخروج المغلوب (أ-ج) أو ضربة قاضية (د) النهج. (أ-ج) ATG5 نوع البرية (WT) أو خروج المغلوب (كو) ميفس (A)، ATG7 WT أو ميفس كو (ب)، أو ATG9A WT أو ميفس كو (ج) تعامل مع [دمس] مركبة (0.01 ٪) في الطول، أو مع 10 نانومتر Baf في ابس، كما هو مبين. وحددت معدلات احتباس رابطة حقوق الإنسان بعد ح 3 من العلاج. يعني القيم من أربعة (A; n = 4) أو ثلاثة (B و C؛ n = 3) تجارب مستقلة، مع أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. ف < 0.05، كرر عينات ANOVA ثنائي الاتجاه. نوفاسكوتيا، ليس كبيرا. (د) LNCaP خلايا تم عكس transfected مع 5 نانومتر siRNA التحكم نونتارجيتينج (سيكترل)، أو مع 5 نانومتر كل من ATG9A-FIP200-، ULK1-، ULK2-، جاباراب-، GABARAPL1-أو GABARAPL2--استهداف siRNA أوليجوس، كما هو مبين. بعد 48 ساعة، أما معاملة الخلايا مع مركبة [دمس] (0.1%) في الطول، أو مع 100 نانومتر Baf في ابس، كما هو مبين. وحددت معدلات احتباس رابطة حقوق الإنسان بعد ح 3 من العلاج. يظهر هي القيم الوسطية من ثلاثة replicates البيولوجية (ثلاث آبار) من تجربة واحدة (n = 1)، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمثل البروتوكول الموصوفة هنا في ملخص، طريقة موثوقة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لمراقبة نشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات. مقارنة بالأسلوب الأصلي12،16، نحن إزالة عدد من الخطوات غير الضرورية، وتبسيط العديد من الخطوات المتبقية، وأدخلت تقليص حجم كبير. نتيجة لذلك البروتوكول هو تحسن كبير فيما يتعلق بكفاءة التكلفة والوقت، ويمكن الآن التعامل مع نفس المقدار من العينات في أقل من نصف الوقت بالمقارنة مع الأصلي للبروتوكول. لعينات 24، الخطوات 2 – 3 (اليوم الأول) يتطلب حوالي ½ ح إعداد زائد 3 ح لكفاءة العمل، بينما يمكن إجراء الخطوة 4 (اليوم 2) في ح ~ 2 (تقديرات الوقت نظراً إلى أن يتم إعداد كافة المخازن المؤقتة الضرورية مسبقاً). منذ الفحص في اليوم 1 عادة مسبوقاً بواسطة علاجات الخلية، بما في ذلك احتضان ح 3-4 مع معامل التراكم الأحيائي أو مثبطات أخرى أوتوليسوسومال رابطة حقوق الإنسان التدهور، من الملائم تقسيم المقايسة في يومين متتاليين. ومع ذلك، من الممكن أيضا لإجراء فحص كامل في يوم واحد. في هذه الحالة، فإنه سيوفر الوقت الأداة الإضافية-تجميد العينات في النتروجين السائل في خطوة 3.6 و 3.7. على الرغم من عدم اختباره مع البروتوكول الحالي، فمن المحتمل أنه قد يتم تخطي الخطوة تجميد أذاب تماما، منذ وضع الأكثر نسخة التحليل في خلايا الكبد في الفئران الأولية قد تم دون هذه الخطوة23.

يمكن تنفيذ البروتوكول المعروضة هنا بسهولة نسبية. من المذكرة، من المهم أن تكون دقيقة في بيبيتينج، حيث الفحص يشمل عدة خطوات أخذ العينات وتمييع. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يتم تطلعات طافية تماما، حيث أن كميات ضئيلة من أيونات موجودة في تعليق خلية السكروز في الخطوة 2، 5، وذلك كرابطة حقوق الإنسان سيتوسوليك صغيرة قدر الإمكان هو تلويث المواد رسابة في الخطوة 3، 6. مرونة بالنسبة لمجموعة واسعة من المواد بدءاً المقايسة كما هو موضح هنا. على سبيل المثال، في خلايا LNCaP، نحن استخدمت بنجاح في التحليل مع طائفة من كميات مختلفة من الخلايا في موسم الحصاد، التي تمتد حتى فارق الوقت (من 2.5 × 105 خلايا إلى 2.5 × 106 خلايا). يتم تعريف الحد الأدنى ابتداء من المواد اللازمة بمدى حساسية الكشف أسلوب النشاط الأنزيمي رابطة حقوق الإنسان. يمكن أن من المرجح جداً أن يكون تحجيم البروتوكول إلى حد كبير زيادة إلى أسفل، بتقليص الكميات المستخدمة في الخطوات 2.5 و 3.3، 3.5، 3.7، 4.2 و 4.3.

العامل الأهم والتحدي التقني مع الإنزيم هو الخطوة اليكتروديسروبشن. صدمة كهربائية قوية، ولكن قصيرة، من الخلايا في حل خالية من أيون، متساوي التوتر يؤدي إلى تعطيل موحدة وانتقائية من غشاء البلازما، بينما يترك الهيكل داخل الخلية والعضيات (بما في ذلك أوتوفاجيك vacuoles) سليمة12، 29. عند استخدام الخلايا ملتصقة، من الضروري أنها تسمح بالعلاجات الانزيمية والميكانيكية في خطوات 2.1-3.1 (مفرزة الخلية والطرد المركزي، واستثارة). للخطوة 3.1، أنها ليست حاسمة للحصول على تعليق خلية واحدة تماما. على سبيل المثال، وهذا من الصعب جداً تحقيق مع خلايا LNCaP. ومع ذلك، اليكتروديسروبشن الناجحة في القريب 100 ٪ من الخلايا دائماً الحصول على، حتى داخل كتل الخلايا التي تحتوي على عدة عشرات من خلايا جسدية المرفقة. عند اختبار نوع خلية جديدة، فإنه من المستحسن التحقق من كفاءة اليكتروديسروبشن (راجع الخطوة 3.3.1)17. ما يقرب من 100 ٪ الخلايا يجب أن تكون بشكل دائم تريبان الأزرق إيجابية بعد اليكتروديسروبشن الخطوة17. إذا كان هذا ليس هو الحال، يجب على الأرجح تغيير الإعدادات اليكتروبوراتور. استخدام الفحص في 20 نوعا من أنواع مختلفة من خلايا الثدييات، ونحن لم يكن لتغيير إعدادات اليكتروبوراتور. وهكذا، عندما تم العثور على الإعدادات الصحيحة لسطر واحد في خلية الثدييات، فمن المحتمل للعمل لجميع أنواع أخرى من خلايا الثدييات. للتحقق من أن الشروط اليكتروديسروبشن ليست قاسية جداً، أيأن الغشاء البلازمية فقط، ولا أغشية العضيات داخل الخلية قد تعطلت، اتبع الخطوة 3.3.2.

أوتوفاجي السائبة يؤديها أوتوفاجوسوميس التي شارك عزل كميات كبيرة من سيتوسول جنبا إلى جنب مع البضائع الأخرى. وقد يحدث ذلك عن طريق أوتوفاجي بحتة غير انتقائية لأجزاء من السيتوبلازم، أو بطريقة التي تمثل مزيجاً أوتوفاجي انتقائية وغير انتقائية. وحتى الآن فإنه من غير الواضح سواء أو إلى أي درجة أوتوفاجي انتقائية وغير انتقائية تتعايش كاثنين من وسائط مختلفة من أوتوفاجي، أو ما إذا كان أوتوفاجوسوميس كقاعدة في نفس الوقت عزل البضائع في الخلق كل انتقائية وغير انتقائية. الأهم من ذلك، ومع ذلك، أفادت دراسة مؤخرا أن المنشط أوتوفاجي انتقائية الحث على زيادة مماثلة في تنحية سيتوسوليك البضائع السائبة كما هو الحال في عزل البضائع المحددة30. النتائج من المختبرات الخاصة بنا يتم الاتفاق مع هذا (النتائج غير منشورة). تحليل عزل البروتينات سيتوسوليك القابلة للذوبان (مثل رابطة حقوق الإنسان) ولذلك يرجح أن لديه القدرة على الكشف عن التغييرات في نشاط تنحية ماكرووتوفاجيك تحت العديد، أن لم يكن جميع الشروط. إلا أنه، على الرغم من أنه لا يزال يتعين إثبات، لا يمكن استبعاد إمكانية أن أنواع معينة من شروط حمل فريد هو نوع من أوتوفاجي انتقائية حصري فيها البضائع أحكام حتى ملفوفة فاجوفوري أن سيتوسول حتى يتم استبعاد من يجري عزلها إلى أوتوفاجوسومي. للتحقيق لما إذا كان هذا الشرط قد تكون موجودة، يجب تشغيل فحوصات أوتوفاجي السائبة مثل المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان بالتوازي مع فحوصات أوتوفاجي انتقائية.

واحدة من المزايا الرئيسية للمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان أن تدابير عزل البضائع المحلية، مما يجعلها طريقة المطبق على نطاق واسع. وعلاوة على ذلك، تدابير المقايسة عزل النشاط بطريقة كمية عالية. والرزن تنحية رابطة حقوق الإنسان أداة هامة لدراسة الآليات والتنظيم لتشكيل أوتوفاجوسومي، منذ فتح فاجوفوريس لا يمكن عزل رابطة حقوق الإنسان. أنها مرهقة للغاية وصعبة، لم يكن من المستحيل، لتقييم ما إذا كانت الهياكل أوتوفاجوسومي مثل الكيانات مختومة أم لا من خلال الميكروسكوب الإلكتروني. أسلوب آخر الذي يتم استخدامه لتحليل ما إذا كان يتم إغلاق أوتوفاجوسوميس لاختبار حساسية علامات أوتوفاجي (مثل LC3) أو مستقبلات (مثلاً، سيكويستوسومي 1 (p62/SQSTM1) أو البروتين النووي نقطة 52 (NDP52)) إلى البروتياز10 ،،من3132. عيب هذا التحليل أن أحد يدرس حوزتي حماية مكونات سلة بدلاً من البضائع أوتوفاجيك. وعلاوة على ذلك، منذ يستند المقايسة النشاف الغربية، أنها فقط نصف الكمية.

بينما القدرة على تحليل أوتوفاجي الشحنات الذاتية ميزة، قيداً متأصلة بمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، وأي فحوصات أخرى تقييم عزل البضائع المحلية، أن مثبط تدهور يجب تضمين من أجل تبين آثار محددة على تنحية أوتوفاجيك بدلاً من الآثار الصافية لعزل والتدهور. وتشمل مثبطات فعالة من رابطة حقوق الإنسان تدهور مثبطات مضخة البروتون مثل وكلاء Baf أو كونكاناميسين3،،من1618، وليسوسوموتروبيك مثل الكلوروكين وكلوريد الأمونيوم33. ليوبيبتين مثبط البروتياز يعمل جيدا في خلايا الكبد في الفئران الابتدائية23، ولكن عموما بعدم الكفاءة في خطوط خلايا الثدييات التي اختبرناها. ونحن نستخدم بشكل روتيني Baf13، التي تعمل بسرعة وهي ذات كفاءة عالية في الخلايا نونماليجنانت والخبيثة على حد سواء. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن مثبطات تدهور رابطة حقوق الإنسان ليست محددة تماما، ولا يمكن استبعاد الآثار المفترضة للموانع على أوتوفاجي. للتقليل من خطر النفوذ غير محددة، فمن المفضل استخدام تركيزات مثبط فقط على تشبع المستويات، وأن يدرج في المانع فقط للساعات القليلة الماضية (3-4 ح) التجربة. وينبغي تحديد تركيز Baf تشبع لكل نوع من الخلايا. كدليل، 50 – 100 نانومتر هو تشبع بالنسبة لخطوط خلايا الثدييات التي اختبرناها، بينما أنواع بعض الخلايا مثل ميفس تتطلب فقط 10 نانومتر Baf لكتلة كاملة في رابطة حقوق الإنسان تدهور.

حد واضح مع المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان أن أنه يمكن إجراء فقط في الخلايا الحية، وبالتالي باستثناء استخدامه لتحليل أوتوفاجي في الأنسجة والخلايا الثابتة. من ناحية أخرى، لا يوجد حاليا لا فحوصات المنشأة التي يمكن قياس النشاط أوتوفاجيك الوظيفية في الخلايا الثابتة. على الرغم من عدم اختباره مع البروتوكول الحالي، سيكون من الممكن تماما استخدام مقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان لتقييم في فيفو تنحية أوتوفاجيك النشاط في الكائنات الحية التجريبية. وسيكون الحد أن الكائن الحي يجب أن تتسامح مع العلاج مع المانع الليزوزومية رابطة حقوق الإنسان تدهور، وأن تكون الفترة الزمنية بين مثل هذه المعاملة وأداء المقايسة قصيرة نسبيا، للتقليل من الآثار المحتملة غير محددة من المانع. من المثير للاهتمام، دراسة مبكرة قبل كومينامي et al.، وأشار إلى أن العلاج ح 3 – 6 من الفئران مع ليوبيبتين (حقن داخل من 2 ملغ/100 غرام وزن الجسم) مناسبة لمراقبة كفاءة تراكم رابطة حقوق الإنسان معزولاً أوتوفاجيكالي في الكبد الكسور سوبسيلولار أثرت على فاكوليس أوتوفاجيك34.

يسبر التعبير حمل خارج الرحم لتنحية الفلورسنت حساسة لدرجة الحموضة مثل روزيللا35 أو يمكن استخدام كيما36 لتصور تنحية أوتوفاجيك دون الحاجة إلى بما في ذلك تدهور مثبطات. وعلاوة على ذلك، خلافا للمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، يمكن استخدام هذا النهج لتصور تنحية أوتوفاجيك في الخلايا المفردة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الاستفادة من الانصهار للتحقيق معه لاستهداف عضية تسلسل لرصد عزل العضيات المحددة. قد تسمح منصات مجهرية قوية أيضا لتحليلات الفرز الفائق. العيوب أن التعبير مسبار حمل خارج الرحم، فضلا عن تراكم للتحقيق في نظام الليزوزومية، يمكن أن تؤثر في مسار أوتوفاجيك. وعلاوة على ذلك، خلافا للمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، واحد يعتمد على الخلايا التي يمكن أن تكون ترانسفيكتيد كفاءة. وأخيراً، حين المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان يوفر إخراج كمية مباشرة إلى الأمام من النسبة المئوية المحتبس سيتوسول، الأساليب المستندة إلى الصور عموما لا يمكن تقديم هذا النوع من المخرجات الكمية المطلقة. فإنه سيكون من المستحسن جعل استخدام كلا النوعين من النهج بطريقة متكاملة. أسلوب ممتاز آخر لدراسة تنحية أوتوفاجيك دون حاجة إلى مثبطات التدهور إدخال raffinose راديولابيليد في الخلايا التي عكسها الكهربائية-بيرميبيليزيشن3،،من2337، 38. رافينوسي من سكر غشاء إيمبيرمينت وايضي الخاملة التي مقاومة للإنزيمات الليزوزومية. ولذلك، يمكن أن يتبع تنحية أوتوفاجيك بالفصل بين سيتوسوليك من سيديمينتابل خلية الكسور3،23،،من3738. هذا النهج، مع ذلك، وقتاً أطول من مقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، ويتطلب احتياطات السلامة الإضافية بسبب استعمال النشاط الإشعاعي. أخيرا، النتيجة النهائية لتنحية أوتوفاجيك السائبة وتدفق البضائع أوتوفاجيك دون عائق، تدهور البروتينات المعمرة، يمكن أن تقاس بدقة بروتين راسخة أسلوب القائم على وضع العلامات39،40 ،41،،من4243. بيد عكس المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، هذا الأسلوب لا توفر قراءة محددة للنشاط أوتوفاجيك، إذ هي تتحلل البروتينات المعمرة أيضا آليات أخرى من أوتوفاجي، أبرزها النظام proteasomal (حين رابطة حقوق الإنسان عزل إلا يحدث نتيجة أوتوفاجي). ولذلك، أدرج عدد من مراقبة العلاج بحاجة إلى أن يكون بشكل روتيني، مثل المواد الكيميائية من مثبطات أوتوفاجيك الليزوزومية أو تدهور proteasomal، والتدخل الجيني في أوتوفاجي3،16.

يمكن مقارنة المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان مع فحوصات التمويه LC3 شائعة الاستخدام، التي تقيس مستويات الثاني LC3 النشاف الغربية أو تشكيل بونكتا LC3 بتصوير fluorescence في غياب أو وجود مثبطات لتعويض تدهور LC3 (Baf الأكثر وكثيراً ما تستخدم)، أو انتقال المتغيرات LC3 فلوريسسينتلي المعلمة إلى البيئات الحمضية22. على الرغم من أن هذه الاختبارات المستندة إلى LC3 قد يوفر معلومات مفيدة، يمكن أن يكون يصعب تفسيره، لا سيما لأن العلاقة بين درجة التمويه LC3 وكمية ونوع من تدفق البضائع غير معروف. وكما ذكر في المقدمة، أوتوفاجي السائبة وتعتمد على باركين ميتوفاجي لا تتطلب LC3 البروتينات الأسرة9،10،،من1144. وعلاوة على ذلك، في خلايا الكبد في الفئران جوعاً، تنحية رابطة حقوق الإنسان وتدهور العائدات دون انقطاع خلال الفترات الزمنية حيث يوجد لا أوتوفاجيك الليزوزومية LC3 الجريان9. وهكذا، وفي هذه الحالة، تدفق البضائع يمكن تماما فصل من التمويه LC3. يلزم إجراء مزيد من البحوث مقارنة التمويه LC3 مع أنواع مختلفة من تدفق البضائع أفضل تفسير النتائج التي تم الحصول عليها مع فحوصات التمويه LC3.

في شكله الحالي، يماثل المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان من النشاف الغربية من حيث الوقت العملي المطلوب والتكاليف. فيما يتعلق بقياس أوتوفاجي الأكبر، على الأقل بكفاءة التحليل القائم على raffinose تنحية أو المقايسة تدهور البروتين الطويلة الأمد المذكورة أعلاه. لقياس محددة النشاط تنحية أوتوفاجيك السائبة وتشكيل أوتوفاجوسوميس مغلقة، أكثر كفاءة ومستقيم إلى الأمام من فحوصات LC3 التمويه أو فحوصات حماية حوزتي مستقبلات LC3 أو أوتوفاجي، منذ فحوصات الأخير قياس مكونات سلة بدلاً من الشحن الفعلية. على الرغم من أننا قد تحسنت إلى حد كبير إنتاجية مقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان، أبعد ما يكون عن تحليل الفائق، وأنه لا يمكن أن تتنافس مع كفاءة تحليلات العناصر المستندة إلى الصور المبينة أعلاه. ومع ذلك، الاختبارات المستندة إلى الصور والمقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان لديها مزايا وعيوب، وهكذا كلا النوعين من فحوصات القيم الخاصة بها. فمن الممكن المحتمل عن طريق التعديلات المقبلة لجعل شبه رابطة حقوق الإنسان عزل مقايسة العالية الإنتاجية. على سبيل المثال، ينبغي أن يكون من الممكن إجراء اليكتروديسروبشن في شكل 96-جيدا، وليس من المستبعد أن سيتوسوليك رابطة حقوق الإنسان يمكن أن تنفصل عن رابطة حقوق الإنسان معزولاً عن طريق الترشيح بدلاً من الطرد المركزي، أو أن خطوة الطرد المركزي يمكن أن يؤديها في 96- تنسيق جيد. وعلاوة على ذلك، فحوصات لقياس نشاط رابطة حقوق الإنسان التي أكثر حساسية من تلك المستخدمة في البروتوكول الحالي قد وضعت، ومتاحة تجارياً. أخرى إمكانات المستقبل مثيرة للاهتمام التحليل يتم استخدامه المفترضة في سائر أنواع خلية من خلايا الثدييات، على سبيل المثال في الخميرة أو غيرها من الكائنات الحية أحادي الخلية، أو الخلايا النباتية حتى، فضلا عن استخدامه للقياسات في فيفو من أوتوفاجيك أنشطة تنحية في أنسجة الكائنات الحية التجريبية.

وفي الختام، نحن نعتقد أن المقايسة تنحية رابطة حقوق الإنسان في شكله أحياء وتحسين أداة هامة في البحوث المتصلة أوتوفاجي في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

كان هذا العمل دعم مالي من مجلس البحوث في النرويج وجامعة أوسلو، أندرس جهر مؤسسة، مؤسسة نانسن، والتركة في الذاكرة للأفغاني هنريك. ونشكر الدكتور نوبورو ميزُشيما ATG5 + + ميفس و ATG5--/--ميفس، الدكتور ماساكي كوماتسو ATG7 + + ميفس ATG7/ميفس، والدكتور شيزو أكيرا ATG9A + + ميفس و ATG9A/ميفس. ونشكر Sætre فرانك للمساعدة التقنية، والدكتور كل O. سيجلين للمناقشات البناءة بالمنهجية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Tags

علم الأحياء، 137 قضية، ورابطة حقوق الإنسان، نازعة لاكتات، تنحية، أوتوفاجي، الشحن أوتوفاجيك، فاجوفوري، أوتوفاجوسومي، بافيلوميسين، A1، LC3
مقايسة تنحية نازعة لاكتات — طريقة بسيطة وموثوق بها لتحديد النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N.… More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter