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Biology

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57971
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.

Abstract

Bulk Autophagie zeichnet sich durch die Sequestrierung große Teile der Zytoplasma in Doppel/multi-membrane Strukturen bezeichnet autophagosom. Hier ist ein einfaches Protokoll zur Überwachung dieses Prozesses beschrieben. Darüber hinaus sind typische Ergebnisse und experimentelle Validierung der Methode Autophagie-induzierenden Bedingungen in den verschiedenen Arten von kultivierten Säugerzellen vorgesehen. Während der Großteil Autophagie sequester autophagosom Zytosol, und damit auch lösliche cytosolischen Proteine, neben anderen selbstverdauende Ladung. LDH ist eine stabile und sehr reichlich, lösliche cytosolische Enzym, das nicht selektiv in autophagosom abgesondert wird. Die Höhe der LDH-Sequestrierung spiegelt daher die Menge an Masse selbstverdauende Sequestrierung. Um effizient und präzise LDH-Sequestrierung in Zellen bestimmen, setzen wir eine Electrodisruption-basierte Fraktionierung-Protokoll, die effektiv Sedimentable trennt sich von zytosolischen LDH, gefolgt durch eine Messung der Enzymaktivität in sedimentable Brüche im Vergleich zu ganzen Zellproben. Selbstverdauende-Sequestrierung wird durch Subtraktion des Anteils der Sedimentable LDH in den unbehandelten Zellen aus, dass im behandelten Zellen bestimmt. Der Vorteil des LDH-Sequestrierung Tests ist, dass es einem quantitativen Maß für die selbstverdauende Sequestrierung von endogenen Cargo, im Gegensatz zu anderen Methoden, dass entweder ektopische Expression von Sequestrierung Sonden oder semi-quantitativen Protease einbeziehen Schutz-Analysen der Autophagie Marker oder Rezeptoren.

Introduction

Autophagie (griechisch für "Self-Essen") ist ein evolutionärer konservierten Prozess für vacuolar/lysosomalen Abbau der intrazellulären Material. Nach der Entdeckung der Autophagie-bezogene ("ATG") Gene, die für Autophagie in Hefe und Menschen wichtig sind, und die Erkenntnis, dass Autophagie spielt eine bedeutende Rolle in Gesundheit und Krankheit (anerkannt durch die 2016 den Nobelpreis für Medizin oder Physiologie Yoshinori Ohsumi), Autophagie ist eines der am intensivsten untersuchten Prozesse in der Zelle Biologie1,2schnell geworden.

Macroautophagy (nachfolgend "Autophagie") ist geprägt durch den Ausbau und Faltung der intrazellulären Membran Cisternen ("Phagophores") in versiegelten, Doppel oder membrane Strukturen ("autophagosom"), die effektiv absondern der eingehüllt Material vom Rest des Zytoplasmas. Bei der Verschmelzung von autophagosom mit Lysosomen ist die innere Autophagosomal Membran und die abgesonderten Ladung abgebaut und recycelt. Autophagosom kann zytoplasmatischen Material in zufälligen (nicht-selektiven Autophagie) und selektive (selektiven Autophagie) Manieren sequester. Bulk Autophagie am wahrscheinlichsten ist eine Mischung von nicht-selektiven und selektiven Autophagie.

In den 1960er und 70er Jahre ("die morphologische Ära" der Autophagie Forschung) wurde selbstverdauende Sequestrierung hauptsächlich durch Ultrastrukturforschung Analysen beurteilt. In den 1980er Jahren und Anfang der 90er Jahre ("der biochemischen Ära") pro Seglen und Mitarbeitern – der Autophagie in primären Ratte Hepatocytes studiert – entwickelt die ersten Methoden zur Messung quantitativ selbstverdauende Sequestrierung Aktivität3. Mit diesen Tests, Seglen definiert und charakterisiert die verschiedenen Schritte der selbstverdauende lysosomalen Pathway4,5, entdeckt und prägte die Amphisome6 (das Produkt der Fusion Endosom-Autophagosome) und war der erste beschreiben Sie die Rolle der Protein-Phosphorylierung Autophagie Verordnung7. Jedoch nach der Entdeckung der Stuka in den 1990 ("Molekulare Zeitalter") und die erste Charakterisierung eines Säugetiers ATG8 Proteins, Mikrotubuli-assoziierten Protein 1A/1 b-Light chain 3 (LC3) im Jahr 20008, die Verwendung von ATG Proteine als Marker für die selbstverdauende Prozess schnell an Popularität gewann, und der älteren und mühsamen biochemischen Methoden wurden zurückgelassen. In der Tat über die letzten 18 Jahre, western-Blot und Fluoreszenz-Mikroskopie-Analysen der LC3 geworden die mit Abstand beliebteste (und in vielen Fällen die einzige) Mittel der Autophagie in Säugetierzellen zu studieren. Der Vorteil ist die relative Leichtigkeit, mit der diese Methoden durchgeführt werden können. Der Nachteil ist, dass man eine Warenkorb-Komponente (LC3) anstatt tatsächliche selbstverdauende Fracht studiert. Dies ist ein ziemlich gravierender Nachteil, da die Beziehung zwischen den Staaten und/oder Fluss der LC3 durch den Weg gegen die Sequestrierung und Flussmittel Ladung sehr unklar ist. In der Tat haben wir gezeigt, dass Bulk Cargo Flussmittel auf hohem Niveau unter Bedingungen aufrechterhalten werden kann wo es keine LC3 Flussmittel, trotz der Anwesenheit von konjugierten LC3 in den Zellen9. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass Bulk Autophagie ist unbeeinflusst von effizienten LC3 Erschöpfung und somit wahrscheinlich LC3-unabhängige9. Dieser Befund wurde später bestätigt durch LC3 Knock-out-Studien10,11, in dem auch angeben, dass Parkin-abhängige Mitophagy (der selektiven Autophagie der Mitochondrien) unabhängig von LC310,11 .

Zusammenfassend lässt sich sagen, es ist ein klares muss für Fracht-based Assays, selbstverdauende Aktivitäten zu überwachen. Solche Tests sollte optimal breit anwendbar, gut definierten und leicht durchzuführen. In den letzten Jahren haben wir ein besonderes Interesse an der LDH-Sequestrierung Assay getroffen, die war in den 1980er Jahren12von pro Seglen entwickelt und basiert auf der Messung der Übertragung der cytosolischen LDH, Sedimentable, selbstverdauende Vakuole-haltigen Zelle Brüche. LDH ist ein stabiles, lösliche cytosolischen Protein, das bereitwillig Co abgesondert ist, wenn Phagophores zytoplasmatischen Fracht Einhüllen. Sequestrierung von LDH ist daher ein allgemeines Maß für selbstverdauende Sequestrierung. LDH wird ausschließlich durch die selbstverdauende lysosomalen Pathway12abgebaut. Also, im Beisein von lysosomalen Abbau-Inhibitoren, z. B. Bafilomycin A1 (Baf)13, experimentelle behandlungseffekte direkt Änderungen in selbstverdauende Sequestrierung Aktivität widerspiegeln. In Ermangelung von Abbau-Inhibitoren kann der Netto-Effekt der Änderungen in LDH-Sequestrierung und Abbau gemessen werden.

Die LDH-Sequestrierung Assay ist breit anwendbar, da LDH hoch und ubiquitär sich in alle Zelltypen drückt und LDH Niveaus durch eine enzymatische Assays14,15genau quantifiziert werden können. Aber das Original Protokoll12 — primäre Ratte Hepatocytes gegründet – war ziemlich zeitaufwändig und erforderte ein hohes Maß an Material sowie eine maßgeschneiderte elektrische Entladung Kondensator. In gewissem Sinne schrittweise haben wir eine einfache und vielseitige Methode allmählich Assays umgewandelt. Erstens war das ursprüngliche Protokoll für den Einsatz in Säugetierzellen Linien16angepasst. Zweitens war die Methode wesentlich herunterskalierten3,9. Dritte, mehrere Schritte im Protokoll wurden eliminiert, einschließlich ein mühsamer Dichte Polster Schritt17. Dies ermöglichte gleichzeitig eine noch weiter verkleinern der Methode, aus der ursprünglichen Ausgangspunkt mit einem 10 cm Teller pro Probe16 mit einem einzigen Brunnen aus einer 12-Well-Platte pro Probe (d.h.ca. 15-fold weniger ab Material)17. Viertens haben wir eine kommerzielle Elektroporation-Apparat, der die maßgeschneiderte elektrische Entladung Kondensator17ersetzen könnte.

Hier ist unsere aktuelle Protokoll des LDH-Sequestrierung Assays, enthält einige weiteren Vereinfachungen des Verfahrens im Vergleich zu den bisher veröffentlichten17 vorgestellt. Darüber hinaus eine Reihe von typischen Ergebnisse in einer Reihe von verschiedenen Zelltypen wird angezeigt, und wichtig ist, mehrere Textzeilen experimentelle Validierung der Methode mit pharmakologischen sowie genetische Zuschlag und Ko-Ansätze zur Verfügung gestellt. Ein Fluss Gesamtschema das ganze Protokoll Siehe Bild 1.

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Protocol

(1) Zelle Aussaat und Behandlung

  1. Kultur adhärente Zellen in 75 cm2 Gewebe Kulturflaschen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C, mit dem bevorzugten Kulturmedium für den Zelltyp in Frage. Können Sie die Zellen wachsen, bis sie eine in der Nähe von Zusammenfluss Zellschicht erreichen.
    Hinweis: Verwenden Sie RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) für LNCaP, HEK293, Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs), BJ, MCF-7 und RPE-1-Zellen.
    1. Waschen Sie die Zellen mit 3 mL 37 ° C Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4. Ersetzen der PBS mit 3 mL 0,25 % (w/V) Trypsin-Ethylenediaminetetraacetate (EDTA), und den Kolben in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C inkubieren, bis die Zellen trennen (2 – 5 min).
    2. Aufschwemmen der freistehenden Zellen mit 7 mL Kulturmedium mit 10 % FBS. Mischen Sie eine 10 µL Zelle Aussetzung aliquoten mit 10 µL 0,4 % Trypan blau in einem Microcentrifuge Schlauch mit einer 0,5-20 µL PIPETTENSPITZE. Verwenden Sie die gleichen PIPETTENSPITZE sofort eine Zählung Kammer Folie füllen, und zählen Sie die Zellen in einem automatisierten Zelle Zähler.
  2. Bereiten Sie einen geeigneten Verdünnung (siehe Hinweis unten) die Zellsuspension hindern, Schritt 1.1.2 Kultur mittlere mit 10 % FBS und Samen 1 mL verdünnter Zellsuspension in jede Vertiefung eines 12-Well-Zellkultur-Platte (Fläche ~3.8 cm2) mit aseptischen Technik. Lassen Sie Wachstum in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C, bis die gewünschte Zelldichte erreicht wurde, z. B. 60 – 90 % Zusammenfluss bei der Ernte.
    Hinweis: Die entsprechende Verdünnung der Zellsuspension, die die gewünschte Zelle Konfluenz bei der Ernte wird vom Zelltyp Zelltyp, sowie nach der Dauer und Art der experimentelle Behandlungen variiert. So muss dies empirisch in jedem Einzelfall beurteilt werden.
    1. Für Experimente, die sollen beide behandelt und 2 Tage nach der Aussaat, Samen 2,5 x 105 LNCaP, HEK293, oder MCF-7 Zellen, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ oder 1,5 x 105 RPE-1-Zellen in jede Vertiefung des 12-Well-Platte geerntet.
    2. Für Zellen, die lose halten, Beschichten der Platten mit der Art der Beschichtung, die für den betreffenden Typ empfohlen. Verwenden Sie für LNCaP (und HEK293) Zellen Platten beschichtet mit Poly-D-Lysin (PDL).
    3. Zu diesem Zweck jedes gut 500 µL PDL bei 2,5 µg/mL in sterilen H2O hinzu, und inkubieren Sie die Platten in einer sterilen Umgebung für 30 min bei Raumtemperatur (20 – 25 ° C). Entfernen Sie die PDL mit Absaugung und waschen Sie auch kurz mit 1 mL sterile H2O.
      Hinweis: In der Regel erfolgt Schritt 1.2.1 ohne jede experimentellen Behandlungen. Jedoch kann wenn RNAi durchführen, es eine umgekehrte Transfektion mit der Aussaat9zu starten sein.
  3. Durchführen Sie experimentelle Behandlungen in doppelter oder dreifacher Brunnen pro Zustand.
    1. Zum Beispiel behandelt die Zellen mit 50 nM von der mTOR-Inhibitor Torin1, die in der Regel ist eine effiziente Induktor von selbstverdauende Sequestrierung oder vorbehaltlich der Zellen akute Serum und Aminosäure Hunger durch Waschen der Zellen mit 1 mL von Aminosäure-freie Earle ist ausgeglichen Salz-Lösung (EBSS) Medium, und anschließend die Zellen in 1 mL EBSS in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° c inkubieren
    2. Lassen Sie eine Reihe von Brunnen, die unbehandelt zur Hintergrund-Niveaus von LDH Sedimentable definieren.
    3. Fügen Sie eine Sättigung Menge von Post-Sequestrierung Inhibitor Bafilomycin A1 (Baf)3,13,16,18 in das Fehlen oder Vorhandensein der experimentelle Behandlungen, 3 – 4 h vor der Zelle Ernte. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° c
      1. Einsatz 100 nM Baf für LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 und RPE-1-Zellen, und 10 nM Baf für MEFs.
      2. Für experimentelle Behandlungen, die haben eine Laufzeit von nur 3 – 4 h (wie diese beispielhaft in Schritt 1.3.1 haben in der Regel), fügen Sie Baf gleichzeitig mit den Behandlungen. Warten Sie für mehr experimentelle Behandlungen, bis 3-4 h vor der Ernte, und fügen Sie 2 µL eines 500 x Baf Lager direkt in das Medium konzentriert.
      3. Durch Rühren die Platte sofort nach der Zugabe der Baf mischen. An dieser Stelle ist es auch empfehlenswert, Macroautophagic Sequestrierung Inhibitoren als Steuerelemente, z. B. 10 mM von der Pan-Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K) Hemmer 3-Methyl-Adenin (3MA)19oder 10 µM der selektiven PI3K Klasse III hinzufügen Inhibitor SAR-40520.

2. Handy-Ernte und Vorbereitung für Electrodisruption

  1. Am Ende des Behandlungszeitraums Aspirieren Sie das Medium mit Absaugung und jedes gut fügen Sie 200 µL Zelle Ablösung Lösung (vorgeheizt auf 37 ° C hinzu). Inkubieren Sie bei 37 ° C, bis die Zellen trennen (in der Regel ca. 5 min).
    Hinweis: 0,25 % (w/V) Trypsin-EDTA statt der Zelle Ablösung Lösung verwendet werden kann, enthält diese DNase, wodurch die Viskosität der freistehenden Zellen zu verringern. Solange das Medium gründlich abgesaugt wird, ist es nicht notwendig, die Zellen vor Zugabe von Trypsin-EDTA oder Zelle Ablösung Lösung zu waschen.
  2. Fügen Sie 500 µL Raumtemperatur (20-25 ° C) PBS, pH 7,4, mit 2 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) in jede Vertiefung und erneut mit der Pipette bis keine Zelle Klumpen sichtbar sind. Übertragen Sie sofort die Zellsuspension auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
    Hinweis: Sofern nicht anders angegeben, führen Sie alle weiteren Schritte auf dem Eis.
  3. Sediment der Zellen durch Zentrifugation bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C.
  4. Aspirieren Sie gründlich den überstand (mit Absaugung) um die Zelle Pellets so trocken wie möglich zu verlassen.
  5. Jedes Rohr 400 µL 10 % (w/V) Saccharose (in hochreinen H2O) hinzufügen.

(3) Plasmamembran Electrodisruption und Trennung von Sedimentable und Gesamt-Zelle Brüche

  1. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit einer Pipette, in der Nähe von einzelligen Aussetzung zu erhalten, und übertragen Sie es auf einem 4 mm-Elektroporation-Küvette.
    Hinweis: Pipettieren nach oben und unten ca. 10 – 15 Zeiten mit einer 100-1.000 µL PIPETTENSPITZE ist in der Regel ausreichend.
  2. Legen Sie die Küvette in einem exponentiellen Zerfall Welle Electroporator ab und lassen Sie einen einzigen elektrischen Impuls bei 800 V, 25 µF und 400 Ω; Diese Einstellungen erzeugen einen Puls von ca. 8 ms Dauer.
  3. Verwenden Sie eine neue PIPETTENSPITZE, um die Zelle Disruptate zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 400 µL eiskalte Phosphat-gepufferte Saccharoselösung (100 mM Natrium Monophosphate, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA und 1,75 % Saccharose, pH 7,5) übertragen, und kurz mischen Sie, indem pipettieren.
    1. Optional: Überprüfen Sie effiziente Plasmamembran Electrodisruption17, 10 µL verdünnter Zelle Disruptate aus Schritt 3.3 mit 10 µL mischen 0,4 % Trypan blau in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Auf einer Zählkammer übertragen und stellen Sie sicher, dass der Anteil der positiven Zellen Trypan blau > 99 %.
      1. Lassen Sie die Probe in der Zählkammer für 30 min bei Raumtemperatur (20 – 25 ° C), und stellen Sie sicher, dass der Anteil der positiven Zellen Trypan blau geblieben > 99 %.
    2. Optional: Um sicherzustellen, dass der Electrodisruption nicht zu hart, das heißt, hat es nicht gestört, intrazelluläre Organellen, führen Sie Schritte 1.1 – 3,3, wie oben beschrieben, aber verwenden Sie eine größere Ausgangsmaterial (ein gut von einer 6-Well-Platte mit einem konfluierende Zellschicht von ~ 80 %), und 150 µL 10 % Saccharose in Schritt 2.5 und 150 µL Saccharose-Phosphat-gepufferte Lösung ohne DVB-t im Schritt 3.3 verwenden.
      1. Verwenden Sie eine Pipette, sorgfältig Schicht 200 µL der Zelle verdünnte Disruptate Lösung auf einem 1,2 mL Dichte Kissen von Phosphat-gepufferte 8 % (w/V) Dichte Gradienten Medium (z.B., 8 % Nycodenz, 50 mM Natriumphosphat, 2,2 % Saccharose, 1 mM EDTA) in einer 2 mL-Zentrifuge Rohr. Zentrifugieren bei 20.000 X g 45 min bei 4 ° C in einem Microcentrifuge mit Soft-Modus-Funktion (für sanfte Beschleunigung und Verzögerung), und die Rohre sorgfältig auf Eis gelegt.
      2. Entfernen Sie vorsichtig die ~ 200 µL Top Bruchteil, und achten Sie nicht auf jede Dichte Gradienten mittlere Lösung abholen, und übertragen auf einen frischen Microcentrifuge Schlauch 60 µL.
        Hinweis: Dies sollte Zytosol von außergewöhnlicher Reinheit, genannt "Zellsaft"21enthalten.
      3. Testen Sie die Reinheit des Bruches in den oben genannten Schritt durch western-Blot Analysen der Organellen enthalten Proteine, mit Standardtechniken und 4 – 20 % Steigung Gele16zu erhalten.
      4. Führen Sie z. B. Immunoblotting für Cathepsin B21, Cytochrom c und Protein umgeformt Isomerase, um sicherzustellen, dass der Stromschlag im Schritt 3.2 nicht Lysosomen, Mitochondrien oder endoplasmatische Retikulum bzw. gestört hat und Immunoblot für LDH, Vorhandensein eines zytosolischen Proteins in den Zellsaft zu überprüfen.
      5. Parallel führen Sie Immunoblotting auf Protein-Extrakte hergestellt aus der gesamten Zelle Disruptate Lösung16 zu bestätigen, dass die Antikörper verwendet die Organelle enthaltenen Proteine erkennen können, die geprüft werden.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.3 für jede Probe.
  5. Entfernen Sie 550 µL aus jeder verdünnte Zelle Disruptate Lösung (erhältlich bei Schritt 3.3) auf 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 µL eiskalte Wiederfreisetzung Puffer (50 mM Natrium Monophosphate, 1 mM DVB-t, 1 mM EDTA und 5,9 % Saccharose, pH 7,5) ergänzt mit 0,5 % BSA und 0,01 % Tween-20 und Mix kurz durch pipettieren.
  6. Zentrifuge bei 18.000 X g 45 min bei 4 ° C zu produzieren pellets mit "sedimentierte LDH". Aspirieren Sie gründlich den überstand (mit Absaugung) um die Pellets so trocken wie möglich zu verlassen. Legen Sie die Proben in einem-80 ° C Gefrierschrank.
  7. 150 µL aus jeder verdünnte Zelle Disruptate Lösung (erhältlich bei Schritt 3.3), neue Röhren, und die Proben in einem-80 ° C Gefrierschrank. Verwenden Sie diese Beispiele, um die "totale LDH" Ebenen in den Zellen bestimmen.
    Hinweis: An dieser Stelle kann das Experiment für angehalten werden so lange wie gewünscht.

(4) LDH Extraktion und Messung der LDH enzymatische Aktivität

  1. Die "sedimentierte LDH" (aus Schritt 3,6) und "total LDH" Proben (aus Schritt 3,7) auf Eis Auftauen.
  2. Fügen Sie 300 µL der eiskalte Wiederfreisetzung Puffer mit 1,5 % Triton X-405 auf der "Gesamt-LDH" Proben (Gewinnung einer Endkonzentration von Triton X-405 von 1 %). Drehen Sie die Proben auf einer Walze in einem kalten Zimmer (4 – 8 ° C) für 30 min.
  3. Fügen Sie 750 µL eiskalte Wiederfreisetzung Puffer mit 1 % Triton X-405 auf die "sedimentierte LDH" Proben hinzu und aufzuwirbeln Sie die Pellets mit einer Pipette, bis eine homogene Lösung erreicht ist.
  4. Zentrifugieren Sie Proben aus Schritt 4.2 und 4.3 bei 18.000 X g für 5 min bei 4 ° C, Sediment ungelösten zelltrümmer.
  5. Mix 4 Teile des kalten 65 mM Imidazol (pH 7.5)/0.75 mM Pyruvat mit einem Teil der kalten 65 mM Imidazol (pH 7,5) / 1,8 mM NADH eine funktionierende Lösung zu erhalten, die für mindestens drei Wochen bei 4 ° c stabil ist
  6. Mischen Sie 3 – 30 µL der Überstände ab Schritt 4.4 mit 200 µL der Schritt 4.5 funktionierende Lösung.
  7. Bestimmen Sie die Höhe des LDH durch LDH enzymatische Aktivität als der Rückgang der Nicotinamid-adenin-Dinucleotide (reduzierte Form) messen (NADH) Absorption bei 340 nm bei 37 ° C im Vergleich zu einem Standard mit einer bekannten LDH-Konzentration. Extinktion Messungen durchführen, bis die Reaktion abgeschlossen, d. h. bis die Absorption bei 340 genähert hat nm nicht mehr mit der Zeit ändert.
    Hinweis: Dies ist die klassische biochemische Methode, LDH-Aktivität zu messen. Obwohl das aktuelle Protokoll die Reaktion bei 37 ° C durchführt, kann es auch bei Raumtemperatur (20 – 25 ° C), erfolgen die ist sinnvoll, wenn manuelle Spektrophotometrie zu tun. Das aktuelle Protokoll verwendet eine Roboter-multianalyzer Instrument, das in einer automatisierten Weise vermischt sich Proben mit Arbeitslösung in eine 96-Well-Platte, und misst die Absorption bei 340 nm bei 37 ° C alle 20 s 3 Minuten lang. Danach die Gerätesoftware berechnet die Konzentration von LDH, ausgedrückt als Einheiten (U) / L, durch den Vergleich der Neigung der Extinktion Messungen im Laufe der Zeit im Vergleich zu einer standard-Kurve zu erhalten, durch Kalibrierung mit einem Standard von bekannten LDH Konzentration. Des linearen Bereichs der Erkennung durch diesen Ansatz wird 30-1.500 U/L. Als Alternative gibt es eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Kits, LDH zu messen. Einige davon basieren auf Kupplung die enzymatische Reaktion auf die Generation der kolorimetrischen oder fluoreszierende Produkte, Erkennung durch andere Mittel als UV Spektralphotometrie und mit anderen linearen reicht der Erkennung aktivieren.

5. Berechnung der LDH-Sequestrierung

  1. Berechnung des Prozentsatzes des sedimentierten LDH, total LDH für jede Probe unter die Verdünnungen und Probenahme zu berücksichtigen:
    Sedimentierte LDH (%) =Equation 1
    Hinweis: Während der Schritte ist 3.1-3.3 rund 50 µL verloren durch den Transfer in und aus der Elektroporation-Küvette. So aus mit insgesamt 750 µL (statt 800 µL) des verdünnten Zelle Disruptate im Schritt 3.3 berechnen.
  2. Subtrahieren Sie den Prozentsatz der sedimentierte LDH erwarb die Proben aus unbehandelten Zellen (Schritt 1.3.2) aus dem Prozentsatz der sedimentierte LDH in Proben von experimentell behandelten Zellen und dividieren durch die Behandlungszeit mit Baf um den Prozentsatz der zu erhalten erhalten LDH pro Stunde in die Abfrageperiode abgesondert:
    Sequestriert LDH (% / h) =Equation 2

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Representative Results

Mit dem Protokoll beschrieben hier, Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in einer Reihe von verschiedenen Säugetieren Zelllinien, einschließlich LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, T47D, U2OS, PC3, MCF-7, G361, Maus embryonale Fibroblasten (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ und LNCaP Zellen gemessen wurde. Sequestrierung war unter basalen Bedingungen (im kompletten, nährstoffreichen Medium) bewertet, oder in Zellen verhungert akut für Serum und Aminosäuren (eine Bona Fide Autophagie-induzierende Zustand22). Die Ergebnisse zeigten, dass LDH-Sequestrierung Aktivität unter Hunger Bedingungen ausführlich verschiedenen Zelllinien unterschiedlich, angefangen bei kaum nachweisbaren Konzentrationen in LAPC4, DU145, Huh7 und PNT2 (Daten nicht gezeigt), ~1.6%/h in LNCaP Zellen (Abbildung 2 Zellen A). Die Rate beobachtet in ausgehungert primäre Ratte Hepatozyten ist höher als in der Zell-Linien, die oben genannten und in der Regel reicht von 2.5–4%/h23. LDH-Sequestrierung war unter basalen Bedingungen praktisch nicht nachweisbar im Halbjahr die Zelllinien getestet, und reichten von ~0.2%/h bis ~0.5%/h in der anderen Hälfte (Daten nicht gezeigt). In der Zell-Linien, die nachweisbar basale selbstverdauende Sequestrierung Aktivität zeigen, induziert akute Serum und Aminosäure-Hunger in der Regel eine 3 – 4 Falte Zunahme LDH-Sequestrierung Rate (siehe zum Beispiel die LNCaP-Experiment gezeigt in Abb. 2A). In der getesteten Zelllinien (oben erwähnt) ist der Hintergrund Prozentsatz der sedimentierte LDH in Proben aus unbehandelten Zellen (Schritt 1.3.2) erhalten in der Regel ca. 2 – 3 %. Aus 22 unabhängige Experimente in verschiedenen Zelllinien, die Intra experimentelle Variationskoeffizienten (CV) zwischen sedimentierten LDH-Werte (% sedimentierten LDH) der Behandlung Replikationen betrug 5,8 % ± 1,7 % (durchschnittlich % CV ± Standardabweichung), angefangen bei 3.0 – 9,0 %. Zusammen geben diese Zahlen eine Hinweis darauf, was Sie erwartet, wenn die LDH-Sequestrierung Assay in Säugetierzellen durchführen.

Verwendung von chemischen Inhibitoren als auch genetische Zuschlag und Knockout nähert, umfassend überprüft, ob die LDH-Sequestrierung Assay misst zuverlässig selbstverdauende Sequestrierung. Autophagosome Bildung erfordert aktive PI3K Klasse III (PIK3C3) und Unc-51 wie Autophagie Aktivierung Kinase (ULK)24, sowie im intrazellulären Ca2 + Homöostase16auszugleichen. Wie in Abbildung 2A, basale und Hunger-induzierte LDH, Sequestrierung von Pan-PI3K Inhibitor 3MA komplett abgeschafft wird, die selektive PIK3C3 Inhibitor SAR-40520, oder die ER Ca2 + Pumpe Hemmer Thapsigargin (TG) 25 in LNCaP Zellen. LDH-Sequestrierung verhungern Bedingungen (wechseln zu Aminosäure-freie Earle ausgewogen Salz Lösung (EBSS) Medium) wird auch stark durch TG oder durch die MRT67307 ULK-Inhibitor in HEK293 Zellen (Abbildung 2B) reduziert. Darüber hinaus ist Hunger-induzierte LDH Sequestrierung konsequent gehemmt durch 3MA in MEFs (Abbildung 2C), BJ (Abbildung 2D), MCF-7 (Abb. 2E) und RPE-1 (Abbildung 2F) Zellen. In der Regel führt Inkubation der Zellen im EBSS Medium allein (d. h. bei fehlender Baf oder andere Post-Sequestrierung Inhibitoren) nicht zu jede messbare Ansammlung von abgesonderten LDH (siehe das Beispiel in Abbildung 2 dargestellten LNCaP-experiment ( A). Dies ist wahrscheinlich, weil akute Aminosäure Hunger zu beschleunigten selbstverdauende lysosomale Flussmittel führt, wodurch schnelle und kontinuierliche Verschlechterung der abgesonderten LDH.

Neben verschiedenen ATG gen Knockout (KO) MEFs eingesetzt wurden, um testen, ob LDH-Sequestrierung Autophagie-Genen berichtet, dass essentiell für Autophagosome Bildung erfordert. In der Tat ist Hunger-induzierte LDH-Sequestrierung in ATG5 KO MEFs-26 (Abbildung 3A), bestätigt unsere bisherige Ergebnisse9abgeschafft. Darüber hinaus ist wie in Abbildung 3B und 3 Cdargestellt, Hunger-induzierte LDH Sequestrierung auch in ATG7 KO MEFs27 und ATG9A KO MEFs28abgestumpft.

Schließlich wurde die LDH-Sequestrierung Assay getestet, in Bezug auf ob RNAi-vermittelten verstummen der wichtigsten ATG gen Transkripte Sequestrierung Hunger-induzierte Aktivität hemmen würde. In der Tat Transfektion mit einer ATG9A gezielt SiRNA oder kombinierte Angriffe auf ULK1 und ULK2, stark reduzierte LDH-Sequestrierung unter Hunger Bedingungen in LNCaP Zellen (Abbildung 3D). Darüber hinaus wir bestätigt unsere bisherige Erkenntnisse3,9 , Ausrichtung der fokale Adhäsion Kinase Familie Interaktion Protein von 200 kDa (FIP200) oder kombiniert Ausrichtung der γ-Aminobuttersäure saure Typ A (GABAA) Rezeptor-assoziierten Protein) GABARAP) Familienmitglieder hemmt Hunger-induzierte LDH Sequestrierung (Abbildung 3D).

Figure 1
Abbildung 1 : Insgesamt fließen Schema des Protokolls LDH Sequestrierung. Das Protokoll basiert auf einem 12-Well-Zellkultur-Plattenformat, unter Verwendung der angegebenen Mengen pro Probe (aus einem Brunnen). Das Test-Protokoll kann bequem in zwei separaten Arbeitstage unterteilt werden, wie angegeben. Es ist jedoch auch möglich, das ganze Verfahren an einem Tag durchzuführen. Abkürzungen: ABB, nach Explosion Puffer (siehe Punkt 3.3 in das Protokoll für die Zutaten); RSB, Wiederfreisetzung Puffer (siehe Punkt 3.5 des Protokolls für die Zutaten). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Validierung des LDH-Sequestrierung Assays mit Autophagie-hemmende Verbindungen. (A) LNCaP Zellen entweder blieben unbehandelt (zum Zwecke der Hintergrundabzug: siehe Schritt 1.3.2) im vollständigen Wachstumsmedium (CM; RPMI 1640 + 10 % fetalen bovine Serum (FBS)), oder sie wurden behandelt mit DMSO Fahrzeug (0,1 %) oder 100 nM Baf in CM oder in Serum und Aminosäure-freien Medium (EBSS). Darüber hinaus wurden einige der Zellen mit 3MA behandelt (10 mM), SAR-405 (10 µM), oder Thapsigargin (300 nM), wie angegeben. Nach 3 h der Behandlung wurden die Zellen geerntet und LDH-Sequestrierung Preise wurden ermittelt, wie detailliert das aktuelle Protokoll. (B) HEK293 Zellen mit DMSO Fahrzeug (0,1 %) in CM oder mit 100 behandelt wurden nM Baf in EBSS, wie angegeben. Darüber hinaus erhielt einige der Zellen 10 µM MRT67307 (ein ULK-Hemmer) oder 300 nM Thapsigargin. LDH-Sequestrierung Raten waren nach 3 h der Behandlung bestimmt. (C-F) MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) oder RPE-1 (F) Zellen wurden behandelt mit DMSO Fahrzeug (0,1 %) in CM oder mit Baf (10 nM in C, 100 nM in D-F) in EBSS mit oder ohne 10 mM 3MA, wie angegeben. LDH-Sequestrierung Raten waren nach 3 h der Behandlung bestimmt. A, B, D, E und F zeigen Mittelwerte aus drei biologische Wiederholungen (dreifacher Brunnen) aus einem Experiment (n = 1), mit Fehlerbalken, Standardabweichung darstellt. C zeigt die Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten (n = 3), mit Fehlerbalken, Standardfehler des Mittelwerts darstellt. p < 0,05, ***p < 0,001, wiederholt Proben einfache ANOVA.

Figure 3
Abbildung 3 : Validierung des LDH-Sequestrierung Assays durch ko (A-C) oder (D) Zuschlag Ansätze. (A-C) ATG5 Wildtyp (WT) oder Knockout (KO) MEFs (A), ATG7 WT oder KO MEFs (B), oder ATG9A WT KO MEFs (C) wurden behandelt mit DMSO Fahrzeug (0,01 %) in CM oder mit 10 nM Baf in EBSS, wie angegeben. LDH-Sequestrierung Raten waren nach 3 h der Behandlung bestimmt. Mittelwerte aus vier (A; n = 4) oder drei (B und C; n = 3) unabhängigen Experimenten mit Fehlerbalken, Standardfehler des Mittelwerts darstellt. p < 0,05, wiederholt Proben zwei-Wege-ANOVA. N.s., nicht signifikant. (D) LNCaP Zellen umgekehrter transfiziert mit 5 waren nM eine nontargeting Kontrolle SiRNA (SiCtrl) oder mit 5 nM von SiRNA Oligoes ATG9A, FIP200, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- oder GABARAPL2-targeting, wie angegeben. Nach 48 h, die Zellen wurden entweder behandelt mit DMSO Fahrzeug (0,1 %) in CM oder mit 100 nM Baf in EBSS, wie angegeben. LDH-Sequestrierung Raten waren nach 3 h der Behandlung bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus drei biologische Wiederholungen (dreifacher Brunnen) aus einem Experiment (n = 1), mit Fehlerbalken, Standardabweichung darstellt.

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Discussion

Zusammenfassend lässt sich sagen ist das Protokoll hier beschrieben eine zuverlässigere und vielseitig einsetzbar-Methode, um lose selbstverdauende Sequestrierung in Säugetierzellen zu überwachen. Im Vergleich zu der ursprünglichen Methode12,16, haben wir etliche unnötige Schritte entfernt, einige der verbleibenden Schritte vereinfacht und eingeführt, eine erhebliche Herabsetzung. Infolgedessen das Protokoll in Bezug auf Kosten und Zeit-Effizienz erheblich verbessert und die gleiche Menge an Proben in weniger als der Hälfte der Zeit im Vergleich zu dem ursprünglichen Protokoll abgewickelt werden. Für 24 Proben erfordert Schritte 2 – 3 (Tag 1) ca. ½ h Vorbereitung plus 3 h für effizientes Arbeiten, während Schritt 4 (Tag 2) in ~ 2 h durchgeführt werden kann (Zeitschätzungen angesichts der Tatsache, dass alle notwendigen Puffer im Voraus zubereitet werden). Seit der Test am Tag 1 Zelle Behandlungen, einschließlich einer 3 – 4 h Inkubation mit Baf oder anderen Inhibitoren der Autolysosomal LDH Erniedrigung, in der Regel vorangestellt ist ist es bequem, die Probe in zwei aufeinander folgenden Tagen zu teilen. Es ist jedoch auch möglich, die gesamte Probe in ein und demselben Tag durchzuführen. In diesem Fall wäre es Zeit zu Snap-Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff in Schritt 3.6 und 3.7 sparen. Obwohl nicht mit dem aktuellen Protokoll getestet, ist es wahrscheinlich, dass der Frost-Tau-wechseln-Schritt insgesamt übersprungen werden kann, da mehr erarbeiten Version des Assays in primären Ratte Hepatocytes getan wurde, ohne diesen Schritt23.

Die hier vorgestellten Protokoll kann mit relativer Mühelosigkeit durchgeführt werden. Beachten ist ist es wichtig, genau in dem pipettieren, da der Test mehrere Probenahme und Verdünnung Schritte umfasst. Darüber hinaus sollte der Überstand Bestrebungen gründlich, erfolgen, so dass minimale Mengen an Ionen in der Saccharose Zellsuspension in Schritt 2.5 vorhanden sind und damit als wenig cytosolischen LDH möglichst das sedimentierte Material im Schritt 3.6 verunreinigt ist. Der Test wie hier beschrieben ist flexibel für eine Vielzahl des Ausgangsmaterials. In LNCaP Zellen, haben wir erfolgreich den Assay mit einer Reihe von unterschiedlichen Mengen von Zellen bei der Ernte, z. B. über bis zu 10-divisibel Unterschied (von 2,5 x 105 Zellen auf 2,5 x 106 Zellen). Das Ausgangsmaterial benötigt Minimum wird definiert, wie empfindlich die Erkennung Methode der LDH enzymatische Aktivität. Das Protokoll kann sehr wahrscheinlich skaliert wesentlich weiter unten, durch Verkleinerung der Bände Schritte 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 und 4.3 verwendet.

Der kritischste Faktor und technische Herausforderung mit dem Assay ist der Electrodisruption Schritt. Die starke, aber kurze, Stromschlag von Zellen in Ionen frei, isotonische Lösung führt zu einer einheitlichen und selektive Störung der Plasmamembran, wobei intrazelluläre Struktur und Organellen (einschließlich selbstverdauende Vakuolen) intakt12, 29. Bei der Verwendung von adhärenten Zellen ist es wichtig, dass sie die enzymatischen und mechanischen Behandlungen in Schritte 2.1-3.1 (Zelle Ablösung, Zentrifugation und Wiederfreisetzung) vertragen. Für Schritt 3.1 ist es nicht entscheidend für eine perfekt einzellige Suspension zu erhalten. Beispielsweise ist dies sehr schwer, mit LNCaP Zellen zu erreichen. Dennoch ist erfolgreiche Electrodisruption in der Nähe von 100 % der Zellen immer erhalten, sogar innerhalb der Zelle Klumpen, die mehrere Dutzend physisch angeschlossenen Zellen enthalten. Wenn Sie eine neue Zelle Art zu testen, es ist ratsam, die Effizienz der Electrodisruption prüfen (siehe Punkt 3.3.1)17. Nahezu 100 % der Zellen sollte Trypan blau dauerhaft positiv sein, nachdem die Electrodisruption Schritt17. Wenn dies nicht der Fall ist, müssen wahrscheinlich die Electroporator Einstellungen geändert werden. Mit dem Assay in 20 verschiedenen Säugetier-Zelle Arten, hatten wir nie die Electroporator-Einstellungen ändern. So, nachdem die richtigen Einstellungen für eine säugerzelle Zeile gefunden wurden, ist es wahrscheinlich, für alle anderen Arten von Säugetierzellen zu arbeiten. Um sicherzustellen, dass die Electrodisruption nicht zu hart sind, d. h., dass nur die Plasmamembran und nicht die Membranen der intrazellulären Organellen gestört wurde, folgen Sie Schritt 3.3.2.

Bulk Autophagie erfolgt durch autophagosom, die erhebliche Mengen an Zytosol zusammen mit anderen Ladung Co absondern. Dies kann passieren, über rein nicht-selektiven Autophagie Teile des Zytoplasmas, oder in einer Weise, die eine Mischung aus selektive und nicht-selektiven Autophagie darstellt. Bis heute ist nicht klar, ob oder inwieweit selektive und nicht-selektiven Autophagie koexistieren als zwei verschiedene Modi der Autophagie, oder ob autophagosom in der Regel gleichzeitig Fracht in selektive und nichtselektive Manieren absondern. Wichtig ist, berichtet jedoch eine kürzlich durchgeführte Studie, dass Aktivatoren der selektiven Autophagie eine ähnliche Steigerung Bulk cytosolischen Fracht Sequestrierung wie die Sequestrierung der spezifische Ladung30induzieren. Ergebnisse aus unserem eigenen Labor sind damit einverstanden (unsere unveröffentlichte Ergebnisse). Analyse der Sequestrierung von löslichen cytosolischen Proteine (z. B. LDH) daher wahrscheinlich hat das Potenzial, Veränderungen in Macroautophagic Sequestrierung Aktivität unter vielen, wenn nicht alle Bedingungen zu erkennen. Aber obwohl es noch bleibt um zu beweisen, die Möglichkeit nicht auszuschließen, dass bestimmte Arten von Bedingungen eindeutig induzieren eine Art selektive-exklusive Autophagie, wo die Ladung so eng durch die Phagophore, dass sogar Zytosol anliegt, ist ausgeschlossen in der Autophagosome abgesondert wird. Sonde für ob solchen Zustand existieren kann, bulk-Autophagie Assays wie LDH-Sequestrierung Assay mit selektiven Autophagie Assays parallel ausgeführt werden soll.

Einer der Hauptvorteile des LDH-Sequestrierung Tests ist, dass es die Sequestrierung von endogenen Ladung, so dass es eine allgemein anwendbare Methode misst. Darüber hinaus misst der Assay Sequestrierung Aktivität in einer höchst quantitative Art und Weise. Die LDH-Sequestrierung-Assay ist ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Mechanismen und Regulierung der Autophagosome Formation, da offene Phagophores kann nicht LDH absondern. Es ist sehr umständlich und schwierig, wenn nicht gar unmöglich, zu beurteilen, ob Autophagosome-artige Strukturen versiegelten Entitäten sind oder nicht durch Elektronenmikroskopie. Eine andere Methode, die verwendet wird, um zu analysieren, ob autophagosom geschlossen sind ist die Empfindlichkeit der Autophagie Marker (z. B. LC3) oder Rezeptoren zu testen (z. B. Sequestosome 1 (p62/SQSTM1) oder nuklearen Dot Protein 52 (NDP52)), Proteasen10 ,31,32. Der Nachteil dieses Tests ist, dass eine Protease Schutz der Warenkorb Komponenten anstatt selbstverdauende Fracht studiert. Darüber hinaus, da der Test basiert auf westliche Beflecken, ist es nur semi-quantitativen.

Autophagie der endogenen Ladung analysieren ein Vorteil ist, ist eine inhärente Begrenzung mit LDH-Sequestrierung Assay und andere Tests, die Sequestrierung von endogenen Fracht zu beurteilen, dass ein Abbau-Inhibitor zur einbezogen werden müssen spezifische Wirkungen auf selbstverdauende Sequestrierung anstatt Nettoeffekte der Sequestrierung und Erniedrigung zu erkennen. Effiziente Inhibitoren der LDH Abbau gehören Protonen-Pumpen-Inhibitoren wie Baf oder Concanamycin eine3,16,18und Lysosomotropic Mittel wie Chloroquin und Ammoniumchlorid33. Die Protease-Inhibitor Leupeptin funktioniert gut in primären Ratte Hepatocytes23, aber ist im allgemeinen ineffizient in den Säugetieren Zelllinien, die wir getestet haben. Wir verwenden routinemäßig Baf13, das wirkt schnell und ist sehr effizient in Vorsteherdrüse und bösartigen Zellen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass keines der LDH-Abbau-Inhibitoren ganz spezifisch sind und vermeintliche Auswirkungen der Inhibitoren auf Autophagie können nicht ausgeschlossen werden. Zur Minimierung des Risikos von unspezifischen Einfluss ist es empfehlenswert, Konzentration des Inhibitors verwenden, die sind nur auf Ebenen zu sättigen, und die Inhibitor nur für die letzten paar Stunden (3 – 4 h) des Experiments. Die Sättigung Konzentration der Baf sollte für jeden Zelltyp bestimmt werden. Als Leitfaden, 50 – 100 nM ist für die meisten kultivierten Säugetierzellen Linien wir getestet haben, Sättigung, während einige Zelltypen wie MEFs erfordern nur 10 nM Baf für einen vollen Block LDH Abbau.

Eine offensichtliche Einschränkung mit dem LDH-Assay-Bindung ist, dass es nur auf lebende Zellen, also ohne seine Verwendung für die Analyse der Autophagie in festen Zellen und Geweben erfolgen kann. Auf der anderen Seite gibt es derzeit keine Tests etabliert, die funktionelle selbstverdauende Aktivität in festen Zellen messen können. Obwohl nicht mit dem aktuellen Protokoll getestet, sollte es durchaus möglich, die LDH-Sequestrierung Assay in Vivo selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in experimentellen Organismen abzuschätzen. Die Einschränkung wäre, dass der Organismus Behandlung mit einem Inhibitor der lysosomalen Abbau der LDH hinnehmen muss und, dass der Zeitraum zwischen solchen Behandlung und Leistung des Tests sollte relativ kurz, um potentielle unspezifische Auswirkungen zu minimieren der Inhibitor. Interessant ist, eine frühe Studie von Kominami Et Al., darauf hingewiesen, dass 3 – 6 h Behandlung von Ratten mit Leupeptin (intraperitoneale Injektion von 2 mg/100 g Körpergewicht) effiziente Anhäufung von autophagically abgesonderten LDH in Leber festzustellen subzelluläre Brüche für selbstverdauende Vakuolen34bereichert.

Ektopische Expression von pH-Sensitive fluoreszierende Sequestrierung Sonden wie Rosella35 oder Otamegane36 eingesetzt werden, um selbstverdauende Sequestrierung ohne die Notwendigkeit der Einbeziehung Abbau Inhibitoren zu visualisieren. Darüber hinaus können im Gegensatz zu der LDH-Sequestrierung Assay, solche Ansätze selbstverdauende Sequestrierung in einzelne Zellen visualisieren verwendet werden. Fusion der Sonde Organell-targeting Sequenzen kann zusätzlich genutzt werden, um Sequestrierung von spezifischen Organellen zu überwachen. Leistungsstarke mikroskopische Plattformen kann auch für Hochdurchsatz-Screening-Analysen. Die Nachteile sind, dass ektopische Sonde Ausdruck sowie Akkumulation der Sonde in die lysosomalen System den selbstverdauende Weg beeinflussen kann. Darüber hinaus gehört im Gegensatz zu der LDH-Sequestrierung Assay abhängig von Zellen, die effizient transfiziert werden können. Schließlich während der LDH-Sequestrierung Assay eine geradlinige quantitative Leistung von Prozentsatz sequestriert Zytosol bietet, können nicht die Image-basierte Methoden in der Regel diese Art der absolute quantitative Ausgabe bieten. Es wäre ratsam, ergänzend beider Ansätze verwenden. Eine weitere ausgezeichnete Methode zur selbstverdauende Sequestrierung ohne Abbau Inhibitoren zu studieren ist, radioaktiven Raffinose in Zellen durch reversible Elektro-Permeabilisierung3,23,37einzuführen, 38. Raffinose ist ein Membran-impermeant und metabolisch inerten Zucker, die resistent gegen lysosomale Enzyme. Daher kann die selbstverdauende Sequestrierung durch Trennung der cytosolischen aus Sedimentable Zelle Brüche3,23,37,38verfolgt werden. Dieser Ansatz ist jedoch, mehr Zeit in Anspruch als die LDH-Sequestrierung Assay und erfordert zusätzliche Sicherheitsvorkehrungen durch den Gebrauch von Radioaktivität. Schließlich kann das Endergebnis der Masse selbstverdauende Sequestrierung und ungehinderte selbstverdauende Fracht Flussmittel, den Abbau von langlebigen Proteinen, durch eine gut etablierte Protein Etikettierung basierende Methode39,40 exakt vermessen werden ,41,42,43. Jedoch im Gegensatz zu der LDH-Sequestrierung Assay, diese Methode nicht vorsieht einen bestimmten Ausdruck selbstverdauende Aktivität, da langlebig Proteine auch durch andere Mechanismen als Autophagie, vor allem durch das proteasomalen System abgebaut werden (wobei LDH Sequestrierung tritt nur als Folge der Autophagie). Daher eine Anzahl von Behandlungen routinemäßig müssen enthalten, z. B. chemische Inhibitoren der selbstverdauende lysosomale oder proteasomalen Abbau und genetische Störungen mit Autophagie3,16.

LDH-Sequestrierung Assay die gängigen LC3 Flussmittel Assays vergleichbar mit die Messen LC3-II Ebenen durch westliche Beflecken bzw. LC3 Puncta Ausbildung durch Fluoreszenz-Bildgebung in das Fehlen oder Vorhandensein von Inhibitoren der lysosomalen LC3-Abbau (Baf ist den meisten häufig verwendet wird), oder der Übergang von eindringmittel tagged LC3-Varianten zu sauren Umgebungen22. Obwohl diese LC3 basierende Assays nützliche Informationen liefern können, können sie sein schwierig zu interpretieren, insbesondere weil die Beziehung zwischen den Grad der LC3 Flux und die Menge und Art der Fracht Flussmittel unbekannt ist. Wie in der Einleitung erwähnt, ist Masse Autophagie und Parkin-abhängige Mitophagy LC3 Familie Proteine9,10,11,44erforderlich. Darüber hinaus in ausgehungert Ratte Hepatocytes, LDH-Sequestrierung und Abbau verläuft ununterbrochen während der Zeiträume wo gibt es keine selbstverdauende lysosomale LC3 flux9. So kann in diesem Fall Fracht Flussmittel komplett von LC3 Fluss getrennt. Mehr Forschung LC3 Flussmittel mit verschiedenen Arten von Fracht Flussmittel zu vergleichen ist notwendig, um mit LC3 Flussmittel Assays erzielten Ergebnisse besser interpretieren.

In seiner jetzigen Form ist die LDH Sequestrierung Assay vergleichbar mit westlichen Beflecken in Bezug auf die erforderliche praktische Zeit und Kosten. Im Hinblick auf die Messung der Masse Autophagie, es ist mindestens so effizient wie die Raffinose-basierte Sequestrierung Assay oder langlebigen Protein Degradation Assay oben beschrieben. Für spezifische Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität und Bildung von geschlossenen autophagosom ist es wesentlich effizienter und geradlinig als LC3 Flussmittel Assays oder Protease-Schutz-Assays der LC3 oder Autophagie-Rezeptoren, da die letzteren assays Warenkorb-Komponenten anstatt tatsächliche Ladung zu messen. Obwohl wir den Durchsatz des LDH-Sequestrierung Assays erheblich verbessert haben, es ist weit von einer Hochdurchsatz-Assay, und es kann nicht konkurrieren mit der Effizienz der oben beschriebenen Bildern basierende Assays. Jedoch die Image-basierte Assays und LDH-Sequestrierung Assay haben ihre vor- und Nachteile, und somit beide Arten von Tests haben ihre eigenen Werte. Es ist wahrscheinlich möglich über künftige Anpassungen der LDH-Sequestrierung Assay halb hohem Durchsatz zu machen. Zum Beispiel, es sollte möglich sein, führen Sie Electrodisruption in einem 96-Well-Format, und es ist denkbar, dass cytosolischen LDH abgesonderten LDH durch Filtration statt Zentrifugieren getrennt werden konnte oder dass der Zentrifugationsschritt in eine 96 - durchgeführt werden kann Well-Format. Darüber hinaus Assays, LDH-Aktivität zu messen, die sehr viel empfindlicher als die in das aktuelle Protokoll verwendet sind entwickelt worden, und sind im Handel erhältlich. Andere interessante Zukunftspotenziale des Assays sind seine vermeintlichen Verwendung in andere Zelltypen als Säugetier-Zellen, z. B. in Hefe oder andere Einzeller oder auch Pflanzenzellen, neben der Anwendung für in Vivo Messungen von selbstverdauende Sequestrierung Aktivitäten in Geweben von experimentellen Organismen.

Zusammenfassend glauben wir, dass die LDH-Sequestrierung Assay in seiner verbesserten und wiederbelebte Form ein wichtiges Instrument in zukünftige Autophagie-bezogene Forschung werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Research Council of Norway, der Universität von Oslo, Anders Jahre Foundation, der Nansen-Stiftung und das Erbe in der Erinnerung an Henrik Homan finanziell unterstützt. Wir danken Dr. Noboru Mizushima für die ATG5 + / + MEFs und ATG5/MEFs, Dr. Masaaki Komatsu für die ATG7 + / + MEFs und ATG7/MEFs und Dr. Shizuo Akira für die ATG9A + / + MEFs und ATG9A/MEFs. Wir danken Frank Sætre für technische Hilfe und Dr. pro O. Seglen für konstruktive methodische Diskussionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

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References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

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Biologie Ausgabe 137 LDH Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Autophagie selbstverdauende Güter Phagophore Autophagosome Bafilomycin A1 LC3
Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen
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Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N.… More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

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