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Biology

स्तनपान डिहाइड्रोजनेज ज़ब्ती परख-एक सरल और विश्वसनीय विधि स्तनधारी कोशिकाओं में थोक Autophagic ज़ब्ती गतिविधि निर्धारित करने के लिए

doi: 10.3791/57971 Published: July 27, 2018
* These authors contributed equally

Summary

यहां स्तनधारी कोशिकाओं में थोक autophagic ज़ब्ती गतिविधि को मापने के लिए एक सरल और अच्छी तरह से मांय प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । विधि कुल सेलुलर LDH स्तर की तुलना में अवसादी कोशिका अंशों में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) के अनुपात को बढ़ाता है पर आधारित है ।

Abstract

थोक autophagy डबल में कोशिका द्रव्य के बड़े हिस्से की ज़ब्ती की विशेषता है/बहु झिल्ली संरचनाओं autophagosomes का कार्यकाल । यहां एक सरल प्रोटोकॉल इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए वर्णित है । इसके अलावा, विशिष्ट परिणाम और संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं के विभिंन प्रकार में autophagy उत्प्रेरण शर्तों के तहत विधि के प्रयोगात्मक सत्यापन प्रदान की जाती हैं । के दौरान थोक autophagy, autophagosomes एकांत cytosol, और इस तरह भी घुलनशील cytosolic प्रोटीन, अन्य autophagic कार्गो के साथ. LDH एक स्थिर और अत्यधिक प्रचुर मात्रा में घुलनशील cytosolic एंजाइम है कि गैर-चुनिंदा autophagosomes में तनहा है । LDH ज़ब्त की रकम इसलिए थोक autophagic ज़ब्त की मात्रा को दर्शाती है. कुशलता और सही कोशिकाओं में LDH ज़ब्ती का निर्धारण करने के लिए, हम प्रभावी ढंग से cytosolic LDH से तलछट अलग करता है कि एक electrodisruption आधारित अंश प्रोटोकॉल, अवसाद में एंजाइमी गतिविधि की माप के बाद काम पूरे सेल नमूने बनाम भिन्न । Autophagic ज़ब्ती इलाज कोशिकाओं में उस से अनुपचारित कोशिकाओं में अवसादपूर्ण LDH के अनुपात को घटाकर द्वारा निर्धारित किया जाता है. LDH ज़ब्ती परख का लाभ यह है कि यह अंतर्जात कार्गो के autophagic ज़ब्ती का एक मात्रात्मक उपाय देता है, के रूप में अंय तरीकों कि या तो ज़ब्ती जांच या अर्द्ध मात्रात्मक के अस्थानिक अभिव्यक्ति शामिल करने का विरोध autophagy मार्करों या रिसेप्टर्स के संरक्षण विश्लेषण.

Introduction

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Autophagy ("स्वयं के लिए यूनानी-खा") एक विकासवादी vacuolar/lysosomal intracellular सामग्री के क्षरण के लिए प्रक्रिया को संरक्षित है । autophagy की खोज पर संबंधित ("ATG") जीन है, जो खमीर और मनुष्यों में autophagy के लिए महत्वपूर्ण हैं, और बोध है कि autophagy मानव स्वास्थ्य और रोग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (२०१६ चिकित्सा या फिजियोलॉजी में नोबेल पुरस्कार से स्वीकार किया Yoshinori Ohsumi), autophagy जल्दी से एक सेल जीवविज्ञान1,2में सबसे अधिक तीव्रता से अध्ययन प्रक्रियाओं में से एक बन गया है ।

Macroautophagy (इसके बाद "autophagy" के रूप में संदर्भित) विस्तार और intracellular झिल्ली cisternae की तह की विशेषता है ("phagophores") में सील, डबल या बहु झिल्ली संरचनाओं ("autophagosomes") है कि प्रभावी ढंग से एकांत बाकी कोशिका द्रव्य से enwrapped सामग्री । lysosomes के साथ autophagosomes के संलयन पर, भीतरी autophagosomal झिल्ली और तनहा कार्गो नीचा और पुनर्नवीनीकरण है । Autophagosomes दोनों रैंडम (गैर चुनिंदा autophagy) और चयनात्मक (चयनात्मक autophagy) शिष्टाचार में cytoplasmic सामग्री एकांत कर सकते हैं । बल्क autophagy सबसे अधिक संभावना गैर-चयनात्मक और चुनिंदा autophagy के मिश्रण का प्रतिनिधित्व करता है ।

में 1960 है और 70 है ("autophagy अनुसंधान के रूपात्मक युग"), autophagic ज़ब्ती मुख्य रूप से ultrastructural विश्लेषण के माध्यम से मूल्यांकन किया गया । में 1980 है और 1990 की शुरुआत ("जैव रासायनिक युग") Seglen और सह के प्रति कार्यकर्ता-जो प्राथमिक चूहे हेपैटोसाइट्स में autophagy का अध्ययन-पहले तरीकों को मात्रात्मक autophagic ज़ब्ती गतिविधि3मापने के लिए विकसित की है । इन परख, Seglen परिभाषित और autophagic के विभिंन कदम-lysosomal मार्ग4,5विशेषता का उपयोग कर, की खोज की और amphisome6 गढ़ा (endosome-autophagosome संलयन के उत्पाद), और पहले था autophagy रेगुलेशनमें प्रोटीन फास्फारिलीकरण की भूमिका का वर्णन कीजिये. हालांकि, 1990 में ATGs की खोज के बाद ("आणविक युग") और एक स्तनधारी ATG8 प्रोटीन के पहले लक्षण वर्णन, microtubule-जुड़े प्रोटीन 1a/1b-लाइट चेन 3 (LC3) में २०००8, के लिए मार्करों के रूप में ATG प्रोटीन का उपयोग autophagic प्रक्रिया जल्दी लोकप्रियता प्राप्त की है, और पुराने और अधिक श्रमसाध्य जैव रासायनिक तरीकों को पीछे छोड़ दिया गया । वास्तव में, पिछले 18 वर्षों में, पश्चिमी दाग और LC3 के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से अब तक के सबसे लोकप्रिय बन गए है (और कई मामलों में ही) स्तनधारी कोशिकाओं में autophagy अध्ययन का मतलब है । लाभ रिश्तेदार आसानी है जिसके द्वारा इन तरीकों से बाहर किया जा सकता है । नुकसान यह है कि एक एक गाड़ी घटक (LC3) के बजाय वास्तविक autophagic कार्गो अध्ययन कर रहा है । यह एक जगह गंभीर नुकसान है, क्योंकि राज्यों और/या माल की ज़ब्ती और प्रवाह बनाम मार्ग के माध्यम से LC3 के प्रवाह के बीच संबंध बेहद अस्पष्ट है । वास्तव में, हमें पता चला है कि थोक माल फ्लक्स शर्तों के तहत उच्च स्तर पर बनाए रखा जा सकता है जहां कोई LC3 प्रवाह है,9कोशिकाओं में संयुग्मित LC3 की उपस्थिति के बावजूद । इसके अलावा, हम प्रदर्शन किया है कि थोक autophagy कुशल LC3 कमी से अप्रभावित है, और इस तरह की संभावना LC3-निर्दलीय9है । इस खोज ने बाद में LC3 नॉक आउट स्टडीज10,11द्वारा पुष्टि की गई है, जो यह भी संकेत देती है कि Parkin-निर्भर mitophagy (mitochondria के चुनिंदा autophagy) LC310,11 से स्वतंत्र है .

सारांश में, वहां कार्गो आधारित परख के लिए एक स्पष्ट की जरूरत है autophagic गतिविधि पर नजर रखने के लिए । इष्टतम ऐसी परख मोटे तौर पर लागू किया जाना चाहिए, अच्छी तरह से परिभाषित है, और प्रदर्शन करने के लिए आसान है । पिछले कुछ वर्षों से हम LDH ज़ब्ती परख है, जो 1980 के12में Seglen प्रति द्वारा विकसित किया गया था में एक विशेष रुचि ले लिया है, और cytosolic LDH के हस्तांतरण के लिए अवसादन, autophagic vacuole-युक्त सेल को मापने पर आधारित है भिन्न. LDH एक स्थिर, घुलनशील cytosolic प्रोटीन है कि आसानी से सह तनहा है जब phagophores enwrap cytoplasmic कार्गो । LDH की ज़ब्ती इसलिए autophagic ज़ब्ती के एक सामांय उपाय है । LDH विशेष रूप से autophagic-lysosomal मार्ग12से नीचा है । इस प्रकार, lysosomal क्षरण अवरोधकों की उपस्थिति में, जैसे, bafilomycin A1 (बाफ)13, प्रयोगात्मक उपचार प्रभाव सीधे autophagic ज़ब्ती गतिविधि में परिवर्तन को प्रतिबिंबित । क्षरण अवरोधकों के अभाव में, LDH ज़ब्ती और क्षरण में परिवर्तन के शुद्ध प्रभाव मापा जा सकता है.

LDH ज़ब्ती परख मोटे तौर पर लागू है, के बाद से LDH उच्च और बैरे सभी प्रकार के सेल में व्यक्त की है, और LDH स्तर सही एक quantified परख14,15द्वारा एंजाइमी जा सकता है । हालांकि, मूल प्रोटोकॉल12 -प्राथमिक चूहे हेपैटोसाइट्स में स्थापित-बल्कि समय लेने वाली थी और सामग्री के रूप में अच्छी तरह से एक कस्टम बनाया बिजली निर्वहन संधारित्र की एक उच्च राशि की आवश्यकता है । एक कदम बुद्धिमान तरीके से, हम धीरे से एक आसान और बहुमुखी विधि में परख बदल दिया है । सबसे पहले, मूल प्रोटोकॉल स्तनधारी कक्ष लाइनों16में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था । दूसरा, विधि काफी downscaled3,9था । तीसरा, प्रोटोकॉल में कई कदम एक श्रमसाध्य घनत्व तकिया कदम17सहित, समाप्त किया गया । यह एक साथ विधि के एक भी आगे downscaling सक्षम, नमूना प्रति एक 12 अच्छी तरह से थाली से एक अच्छी तरह से उपयोग करने के लिए16 नमूना प्रति 10 सेमी प्लेट का उपयोग कर के मूल प्रारंभिक बिंदु से (यानी, लगभग 15 गुना कम शुरू सामग्री)17. चौथा, हम एक वाणिज्यिक electroporation तंत्र की पहचान की है कि कस्टम बनाया बिजली निर्वहन संधारित्र17की जगह सकता है ।

यहां हमारे सबसे ऊपर है LDH ज़ब्ती परख, जो विधि के कुछ और सरलीकरण के रूप में पहले प्रकाशित की तुलना में शामिल है की तारीख प्रोटोकॉल प्रस्तुत की है । इसके अलावा, विशिष्ट विभिन्न प्रकार के सेल के एक नंबर में प्राप्त परिणामों का एक सेट दिखाया गया है, और महत्वपूर्ण बात, औषधीय के रूप में अच्छी तरह के रूप में आनुवंशिक पछाड़ना और नॉकआउट दृष्टिकोण का उपयोग विधि के प्रयोगात्मक वैधता के कई लाइनें प्रदान की जाती हैं । पूरे प्रोटोकॉल की एक समग्र प्रवाह योजना के लिए, चित्र 1देखें ।

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Protocol

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1. सेल सीडिंग और उपचार

  1. संस्कृति अनुयाई कोशिकाओं में ७५ सेमी2 ऊतक संस्कृति humidified मशीन में 5% CO के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस पर, प्रश्न में सेल प्रकार के लिए पसंदीदा संस्कृति माध्यम का उपयोग कर । जब तक वे एक निकट-धाराप्रवाह सेल परत तक पहुंचने के लिए कोशिकाओं को विकसित करने की अनुमति दें ।
    नोट: LNCaP, HEK293, माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs), बीजे, MCF-7, और RPE-1 कोशिकाओं के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक RPMI १६४० मध्यम का उपयोग करें ।
    1. 3 मिलीलीटर ३७ ° c फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब), पीएच ७.४ के साथ कोशिकाओं को धो लें । 3 मिलीलीटर ०.२५% (डब्ल्यू/वी) Trypsin-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) के साथ पंजाबियों की जगह है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ एक humidified मशीन में कुप्पी गर्मी जब तक कोशिकाओं अलग (2-5 मिनट) ।
    2. 10% FBS युक्त 7 एमएल संस्कृति माध्यम के साथ अलग कोशिकाओं resuspend । एक microcentrifuge ट्यूब में 10 µ l ०.४% Trypan ब्लू के साथ एक 10 µ l सेल सस्पेंशन aliquot मिलाएं, एक 0.5 – 20 µ l पिपेट टिप का प्रयोग करें । एक ही पिपेट टिप का उपयोग तुरंत एक गिनती चैंबर स्लाइड को भरने के लिए, और एक स्वचालित सेल काउंटर में कोशिकाओं की गिनती ।
  2. एक उपयुक्त कमजोर पड़ने तैयार (नीचे नोट देखें) 1.1.2 कदम से सेल निलंबन की संस्कृति 10% FBS युक्त माध्यम का उपयोग कर, और बीज 1 एक 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुआं में पतला सेल निलंबन के मिलीलीटर (सतह क्षेत्र ~ ३.८ cm2) अपूतित का उपयोग तकनीक. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ एक humidified मशीन में वृद्धि की अनुमति दें जब तक वांछित सेल घनत्व तक पहुंच गया है, जैसे, 60-फसल में 90% संगम ।
    नोट: सेल निलंबन की उचित कमजोर पड़ने कि फसल में वांछित कोशिका प्रवाह सेल प्रकार के लिए सेल प्रकार से भिंन हो जाएगा, साथ ही साथ अवधि और प्रयोगात्मक उपचार के प्रकार के अनुसार होगा । इस प्रकार, यह प्रत्येक मामले में मूल्यांकन empirically होना चाहिए ।
    1. प्रयोगों के लिए है कि दोनों का इलाज किया और बोने के बाद 2 दिन काटा जा करने के लिए कर रहे हैं, बीज २.५ x 105 LNCaP, HEK293, या MCF-7 कोशिकाओं, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 बीजे, या १.५ x 105 RPE-1 कोशिकाओं 12 के प्रत्येक कुआं में अच्छी तरह से थाली ।
    2. कोशिकाओं है कि शिथिलता का पालन करने के लिए, कोट कोटिंग के प्रकार के साथ प्लेटों प्रश्न में सेल प्रकार के लिए सिफारिश की । LNCaP (और HEK293) कोशिकाओं के लिए पाली-डी-lysine (PDL) के साथ लेपित प्लेटों का उपयोग करें ।
    3. कि अंत करने के लिए, जोड़ें ५०० µ l PDL पर २.५ µ g/एमएल में बाँझ एच2ओ एक अच्छी तरह से, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक बाँझ वातावरण में प्लेटें मशीन (20-25 डिग्री सेल्सियस). सक्शन के साथ PDL निकालें, और 1 मिलीलीटर बाँझ एच2ओ के साथ एक अच्छी तरह से संक्षेप में धो लें ।
      नोट: आम तौर पर, चरण 1.2.1 किसी भी प्रयोगात्मक उपचार के बिना किया जाता है । हालांकि, यदि RNAi प्रदर्शन कर रहा है, यह एक रिवर्स अभिकर्मक9सीडिंग के साथ प्रारंभ करने के लिए सुविधाजनक हो सकता है ।
  3. प्रति शर्त डुप्लिकेट या तपसिल कुओं में प्रयोगात्मक उपचार करते हैं ।
    1. उदाहरण के लिए, mTOR के ५० एनएम के साथ कोशिकाओं का इलाज-अवरोध करनेवाला Torin1, जो आम तौर पर autophagic ज़ब्ती की एक कुशल उत्प्रेरण, या तीव्र सीरम के लिए कोशिकाओं के अधीन है-एमिनो एसिड की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने से एमिनो एसिड भुखमरी-मुक्त अर्ल है संतुलित नमक समाधान (EBSS) मध्यम, और बाद में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ एक humidified मशीन में EBSS के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं की मशीन ।
    2. अवसादी LDH की पृष्ठभूमि के स्तर को परिभाषित करने के क्रम में अनुपचारित कुओं का एक सेट छोड़ दें ।
    3. के बाद-ज़ब्ती अवरोध करनेवाला bafilomycin A1 (बाफ) के एक संतृप्ति राशि जोड़ें3,13,16,18 के अभाव या प्रयोगात्मक उपचार की उपस्थिति में, 3 – 4 ज सेल से पहले फसल. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ एक humidified मशीन में कोशिकाओं की मशीन ।
      1. LNCaP, HEK293, बीजे, MCF-7 और RPE-1 कोशिकाओं, और MEFs के लिए 10 एनएम बाफ के लिए १०० एनएम बाफ का प्रयोग करें ।
      2. प्रयोगात्मक उपचार है कि केवल 3 की एक अवधि है के लिए-4 ज (कदम 1.3.1 में उन उदाहरण की तरह आम तौर पर है), उपचार के साथ एक साथ बाफ जोड़ें । अब प्रयोगात्मक उपचार के लिए, फसल से पहले 3-4 घंटे तक इंतजार है, और एक 500x केंद्रित बाफ शेयर के 2 µ एल सीधे माध्यम में जोड़ें ।
      3. इस थाली को बाफ के जोड़ के तुरंत बाद उत्तेजित करके मिलाएं । इस बिंदु पर यह भी नियंत्रण के रूप में macroautophagic ज़ब्ती अवरोधकों को जोड़ने के लिए सिफारिश की है, जैसे, पैन के 10 मिमी-phosphoinositide 3-कळेनासे (PI3K) अवरोध करनेवाला 3-मिथाइल adenine (3MA)19, या चयनात्मक µ कक्षा III के 10 PI3K एम अवरोधक SAR-४०५20.

2. सेल हार्वेस्ट और Electrodisruption के लिए तैयारी

  1. उपचार की अवधि के अंत में, सक्शन के साथ मध्यम महाप्राण और २०० µ एल सेल टुकड़ी समाधान (पूर्व-गरम करने के लिए ३७ ° c) प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन जब तक कोशिकाओं अलग (आम तौर पर 5 मिनट के आसपास) ।
    नोट: जबकि ०.२५% (डब्ल्यू/वी) Trypsin-EDTA सेल टुकड़ी समाधान के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है, बाद DNase शामिल हैं, जो अलग कोशिकाओं की चिपचिपाहट को कम करने में मदद करता है । जब तक मध्यम अच्छी तरह से aspirated है, यह आवश्यक नहीं है Trypsin-EDTA या कोशिका टुकड़ी समाधान के अलावा कोशिकाओं को धोने के लिए ।
  2. जोड़ें ५०० µ एल कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पंजाब, पीएच ७.४, 2% युक्त (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) प्रत्येक अच्छी तरह से, और पिपेट के साथ resuspend जब तक कोई सेल के झुरमुट दिखाई दे रहे हैं । तुरंत बर्फ पर १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    नोट: जब तक अंयथा कहा, बर्फ पर सभी बाद के चरणों का प्रदर्शन ।
  3. तलछट से कोशिकाओं को ४०० x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ।
  4. supernatant (सक्शन के साथ) को अच्छी तरह से महाप्राण के रूप में संभव के रूप में सूखी सेल छर्रों छोड़ने के लिए ।
  5. Add ४०० µ l 10% (w/v) सुक्रोज (ultrapure एच2ओ में) प्रत्येक ट्यूब के लिए ।

3. प्लाज्मा झिल्ली Electrodisruption और अवसादी-और कुल-सेल भागों की जुदाई

  1. एक के पास एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक पिपेट के साथ सेल गोली resuspend, और यह एक 4 मिमी electroporation cuvette करने के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: Pipetting अप और नीचे ~ 10-15 बार, एक 100-1000 µ एल पिपेट टिप का उपयोग कर, आमतौर पर पर्याप्त है ।
  2. एक घातीय क्षय लहर electroporator में cuvette प्लेस, और ८०० V, 25 µF, और ४०० Ω में एक भी बिजली की नाड़ी का निर्वहन; ये सेटिंग्स ~ 8 ms अवधि की एक नाड़ी का उत्पादन ।
  3. एक नए पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब युक्त ४०० µ एल बर्फ कोल्ड फॉस्फेट बफर सुक्रोज समाधान (१०० मिमी सोडियम मोनोफोस्फेट, 2 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 2 मिमी EDTA, और १.७५% सुक्रोज, पीएच ७.५), और संक्षेप में मिश्रण द्वारा सेल disruptate pipetting ।
    1. वैकल्पिक: कुशल प्लाज्मा झिल्ली electrodisruption17सत्यापित करने के लिए, 10 µ एल ०.४% Trypan नीले रंग में एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के साथ ३.३ कदम से पतला सेल disruptate के १० µ एल मिश्रण । एक गिनती कक्ष में स्थानांतरण और सत्यापित करें कि Trypan नीले सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत है > 99% ।
      1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गिनती कक्ष में नमूना छोड़ दो (20-25 डिग्री सेल्सियस), और सत्यापित करें कि Trypan नीले सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत रह गया है > 99% ।
    2. वैकल्पिक: सत्यापित करें कि electrodisruption भी कठोर नहीं किया गया है, कि है, यह intracellular organelles बाधित नहीं हुआ है, चरण 1.1 – 3.3 ऊपर वर्णित के रूप में निष्पादित करें, लेकिन एक बड़ा प्रारंभ सामग्री का उपयोग करें (एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के साथ एक ~ ८०% धाराप्रवाह सेल परत), और १५० µ l 10% सुक्रोज चरण २.५ और १५० µ l फॉस्फेट-बफ़र्ड सुक्रोज समाधान में डीटीटी के बिना चरण ३.३ का उपयोग करें ।
      1. एक पिपेट का उपयोग करने के लिए ध्यान से परत २०० µ एल पतला सेल disruptate समाधान के एक १.२ मिलीलीटर फॉस्फेट के घनत्व तकिया-बफ़र्ड 8% (डब्ल्यू के शीर्ष पर) घनत्व ढाल मध्यम (जैसे, 8% Nycodenz, ५० मिमी सोडियम फॉस्फेट, २.२% सुक्रोज, 1 मिमी EDTA) में एक 2 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब. ४५ मिनट के लिए नरम मोड समारोह (कोमल त्वरण और मंदी के लिए), और ध्यान से बर्फ पर ट्यूबों डाल के साथ एक microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर २०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
      2. ध्यान से हटा ~ २०० µ एल शीर्ष अंश के ६० µ एल, यकीन है कि किसी भी घनत्व ढाल माध्यम समाधान लेने के लिए नहीं बना है, और एक ताजा microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण ।
        नोट: यह असाधारण शुद्धता के cytosol शामिल होना चाहिए, "सेल एसएपी"21शब्द ।
      3. organelle-निहित प्रोटीन के पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रदर्शन करके, ऊपर कदम में प्राप्त अंश की शुद्धता का परीक्षण, मानक तकनीक और 4 – 20% ढाल जैल16का उपयोग कर ।
      4. cathepsin B21, cytochrome c, और प्रोटीन disulphide isomerase के लिए उदाहरण immunoblotting के लिए प्रदर्शन, सत्यापित करें कि ३.२ चरण में बिजली के झटके बाधित नहीं किया है lysosomes, mitochondria, या endoplasmic जालिका, क्रमशः, और immunoblot के लिए LDH सेल एसएपी में एक cytosolic प्रोटीन की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए ।
      5. समानांतर में, प्रोटीन अर्क पर प्रदर्शन immunoblotting कुल सेल disruptate समाधान16 से बनाया पुष्टि करने के लिए कि एंटीबॉडी का उपयोग किया जा रहा है कि organelle-निहित प्रोटीन का पता लगा सकते हैं ।
  4. दोहराएं प्रत्येक नमूने के लिए 3.1-3.3 कदम ।
  5. प्रत्येक पतला सेल disruptate समाधान से निकालें ५५० µ l (३.३ कदम पर प्राप्त) ९०० µ l बर्फ ठंड resuspension बफर (५० मिमी सोडियम मोनोफोस्फेट, युक्त 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए 1 मिमी डीटीटी, 1 मिमी EDTA, और ५.९% सुक्रोज, पीएच ७.५) ०.५% BSA और ०.०१% के साथ पूरक -20 के बीच, और pipetting द्वारा संक्षेप में मिश्रण ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए १८,००० x g पर केंद्रापसारक "तलछटी LDH" युक्त छर्रों का उत्पादन करने के लिए । supernatant (सक्शन के साथ) को अच्छी तरह से महाप्राण के रूप में संभव के रूप में सूखी छर्रों छोड़ने के लिए । एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूनों प्लेस ।
  7. स्थानांतरण १५० µ l प्रत्येक पतला सेल disruptate समाधान से (३.३ कदम पर प्राप्त) नई ट्यूबों के लिए, और एक में नमूनों जगह-८० ° c फ्रीजर. कक्षों में "कुल LDH" स्तरों का निर्धारण करने के लिए इन नमूनों का उपयोग करें ।
    नोट: इस बिंदु पर प्रयोग के रूप में लंबे समय के लिए रोका जा सकता है के रूप में वांछित ।

4. LDH निष्कर्षण और LDH एंजाइमी गतिविधि की माप

  1. गल "तलछटी LDH" (कदम ३.६ से) और बर्फ पर "कुल LDH" नमूने (३.७ कदम से) ।
  2. जोड़ें ३०० µ आइस-शीत resuspension बफर के १.५% ट्राइटन एक्स-४०५ के लिए "कुल LDH" नमूने (उपज एक अंतिम ट्राइटन x-४०५ एकाग्रता की 1%) । 30 मिनट के लिए एक ठंडे कमरे (4-8 डिग्री सेल्सियस) में एक रोलर पर नमूने घुमाएँ ।
  3. बर्फ के ७५० µ एल जोड़ें-ठंडा पुनर्निलंबन बफर 1% ट्राइटन X-४०५ के साथ "तलछटी LDH" नमूनों के लिए, और एक समरूप समाधान तक पहुंच जाता है जब तक एक पिपेट के साथ छर्रों resuspension ।
  4. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तलछट undissolved सेलुलर मलबे के लिए कदम ४.२ और ४.३ से १८,००० x जी में नमूने केंद्रापसारक ।
  5. ठंडे ६५ mm imidazole के एक भाग के साथ ठंडा ६५ mm imidazole (ph 7.5)/0.75 mm पाइरूवेट के 4 पार्ट्स को मिक्स करें, जो एक काम समाधान प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से कम तीन हफ्तों के लिए स्थिर है ।
  6. मिश्रण 3 – 30 µ l के supernatants चरण ४.४ से २०० µ l के साथ चरण ४.५ कार्य समाधान.
  7. nicotinamide adenine dinucleotide में गिरावट के रूप में LDH एंजाइमी गतिविधि को मापने के द्वारा LDH की मात्रा का निर्धारण (कम फार्म) (नध) ३४० एनएम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक ज्ञात LDH एकाग्रता के साथ एक मानक की तुलना में अवशोषित । जब तक प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए संपर्क किया है, यानी ३४० एनएम पर अवशोषक अब समय के साथ बदलता है जब तक अवशोषक माप प्रदर्शन ।
    नोट: यह शास्त्रीय जैव रासायनिक विधि LDH गतिविधि को मापने के लिए है । हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया करता है, यह भी कमरे के तापमान पर किया जा सकता है (20-25 डिग्री सेल्सियस), जो उचित है अगर मैनुअल spectrophotometry कर रही है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक रोबोट multianalyzer साधन है, जो एक स्वचालित फैशन में एक ९६-अच्छी तरह से थाली में काम समाधान के साथ नमूनों घोला जा सकता है का उपयोग करता है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ३४० एनएम में अवशोषित उपायों 3 मिनट के लिए हर 20 एस । इसके बाद, साधन सॉफ्टवेयर LDH की एकाग्रता की गणना करता है, इकाइयों के रूप में व्यक्त (यू)/L, ज्ञात LDH के मानक के साथ अंशांकन के माध्यम से प्राप्त एक मानक वक्र की तुलना में समय पर अवशोषक माप की ढलान की तुलना करके एकाग्रता. इस प्रकिया के द्वारा पता लगाने की रैखिक सीमा 30 – 1500 U/ एक विकल्प के रूप में, LDH को मापने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट की एक विस्तृत विविधता मौजूद है । उनमें से कुछ वर्णमिति या फ्लोरोसेंट उत्पादों की पीढ़ी के लिए एंजाइमी प्रतिक्रिया युग्मन पर आधारित हैं, यूवी spectrophotometry से अंय तरीकों से पता लगाने को सक्षम करने, और अंय का पता लगाने के रैखिक पर्वतमाला के साथ ।

5. LDH ज़ब्ती की गणना

  1. प्रत्येक नमूने के लिए कुल LDH के लिए तलछटी LDH के प्रतिशत की गणना, कमजोर पड़ने और खाते में नमूने लेने:
    तलछटी LDH (%) =Equation 1
    नोट: कदम के दौरान 3.1 – 3.3 लगभग ५० µ एल में और electroporation cuvette से बाहर स्थानांतरण के कारण खो दिया है. इस प्रकार, ७५० µ एल की कुल होने से गणना (८०० µ एल के बजाय) पतला सेल disruptate के चरण ३.३ में ।
  2. प्रयोग किए गए कोशिकाओं से नमूनों में प्राप्त तलछटी LDH के प्रतिशत से अनुपचारित कोशिकाओं (चरण 1.3.2) से नमूनों में प्राप्त अवसादी LDH का प्रतिशत घटाना, और का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए बाफ के साथ उपचार के समय से विभाजित सैंपलिंग की अवधि में प्रति घंटे तनहा LDH:
    तनहा LDH (%/h) =Equation 2

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Representative Results

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प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, बल्क autophagic अलग स्तनधारी सेल लाइनों के एक नंबर में गतिविधि, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, हेला, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs), RPE-1, सहित HEK293, मुखमैथुन, और LNCaP कोशिकाओं मापा गया था । ज़ब्ती बेसल शर्तों के तहत मूल्यांकन किया गया था (पूरी तरह से, पोषक तत्वों से भरपूर मध्यम), या कोशिकाओं में तीव्रता से सीरम और एमिनो एसिड के लिए भूखे (एक बोना autophagy-उत्प्रेरण हालत22). परिणाम संकेत दिया कि भुखमरी की स्थिति के तहत LDH ज़ब्ती गतिविधि बड़े पैमाने पर विभिंन कोशिका लाइनों भर में बदलता है, LAPC4, DU145, Huh7 और PNT2 कोशिकाओं में बमुश्किल पता लगाने के स्तर से लेकर (डेटा नहीं दिखाया गया है)/h कोशिकाओं में ~ 1.6% LNCaP (चित्रा 2 ). दर में मनाया प्राथमिक चूहे हेपैटोसाइट्स भूखे ऊपर उल्लेख किया है सेल लाइनों की तुलना में अधिक है, और आम तौर पर 2.5-4%/h23से पर्वतमाला । बेसल शर्तों के तहत, LDH ज़ब्ती परीक्षण सेल लाइनों के आधे में वस्तुतः undetect था, और ~ 0.2%/h से लेकर ~ 0.5%/h अंय छमाही में (नहीं दिखाया गया डेटा) । सेल लाइनों कि शो में पता लगाने के बेसल autophagic ज़ब्ती गतिविधि, तीव्र सीरम और एमिनो एसिड भुखमरी आम तौर पर LDH ज़ब्ती दर में एक 3-4 गुना वृद्धि लाती है (उदाहरण के लिए देखें LNCaP प्रयोग चित्रा 2में दिखाया) । परीक्षण सेल लाइनों में (ऊपर उल्लेख किया), अनुपचारित कोशिकाओं से नमूनों में प्राप्त तलछटी LDH की पृष्ठभूमि प्रतिशत (चरण 1.3.2) आमतौर पर लगभग 2 – 3% है । विभिन्न सेल लाइनों में किए गए 22 स्वतंत्र प्रयोगों से, अवसादपूर्ण LDH मूल्यों (सीवी) के बीच अंतर के प्रायोगिक गुणांक (% तलछटीय LDH) उपचार की प्रतिकृतियां ५.८% ± १.७% (औसत% सीवी ± मानक विचलन) थी, ३.० से लेकर – ९.०% । एक साथ, इन नंबरों क्या उंमीद करने के लिए जब स्तनधारी कोशिकाओं में LDH ज़ब्ती परख प्रदर्शन का एक संकेत दे ।

रासायनिक अवरोधकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आनुवंशिक पछाड़ना और नॉकआउट दृष्टिकोण का उपयोग करें, बड़े पैमाने पर पुष्टि है कि LDH ज़ब्ती परख मज़बूती से autophagic ज़ब्ती गतिविधि उपाय । Autophagosome गठन सक्रिय PI3K वर्ग III (PIK3C3) और Unc-५१ की तरह autophagy सक्रिय कळेनासे (ULK)24, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से intracellular Ca2 + homeostasis16में संतुलन की आवश्यकता है । जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, दोनों बेसल और भुखमरी प्रेरित LDH ज़ब्ती पूरी तरह से पैन द्वारा समाप्त हो गया है PI3K अवरोध करनेवाला 3MA, चयनात्मक PIK3C3 अवरोधक SAR-४०५20, या एर Ca2 + पंप अवरोध करनेवाला thapsigargin (टीजी) LNCaP कोशिकाओं में 25 . भुखमरी की स्थिति में LDH ज़ब्ती (एमिनो एसिड मुक्त अर्ल है संतुलित नमक समाधान (EBSS) मध्यम करने के लिए स्विच) भी जोरदार टीजी द्वारा कम है, या ULK द्वारा HEK293 कोशिकाओं में अवरोध करनेवाला MRT67307 (चित्रा 2बी) । इसके अलावा, भुखमरी प्रेरित LDH ज़ब्ती लगातार MEFs में 3MA द्वारा बाधित है (चित्रा 2सी), बीजे (चित्रा 2डी), MCF-7 (चित्रा 2), और RPE-1 (चित्रा 2एफ) कक्षों. आम तौर पर, EBSS अकेले में कोशिकाओं की गर्मी (यानी, बाफ या अंय पद ज़ब्ती अवरोधकों के अभाव में) तनहा LDH के किसी भी औसत दर्जे का संचय करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है (उदाहरण के लिए LNCaP 2 चित्रा में दिखाया प्रयोग देखें ). यह संभावना है क्योंकि तीव्र एमिनो एसिड भुखमरी तेजी से autophagic-lysosomal प्रवाह की ओर जाता है, तेजी से और तनहा LDH के निरंतर गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप ।

अगले, विभिंन ATG जीन नॉकआउट (KO) MEFs परीक्षण के लिए कि क्या LDH ज़ब्ती autophagy की आवश्यकता संबंधित जीन autophagosome गठन के लिए आवश्यक होने की सूचना कार्यरत थे । दरअसल, भुखमरी प्रेरित LDH ज़ब्ती ATG5 KO MEFs26 (चित्रा 3), हमारे पिछले निष्कर्ष9की पुष्टि में समाप्त हो गया है । इसके अलावा, के रूप में चित्रा 3बी और 2 सी में दिखाया गया है, भुखमरी प्रेरित LDH ज़ब्ती भी ATG7 ko MEFs 27 और ATG9A ko28MEFs में कुंद है ।

अंत में, LDH ज़ब्ती परख के संबंध में परीक्षण किया गया कि क्या RNAi-मध्यस्थता कुंजी ATG जीन टेप के मुंह बंद करने भुखमरी प्रेरित ज़ब्ती गतिविधि को बाधित करेगा । दरअसल, एक ATG9A के साथ अभिकर्मक लक्ष्यीकरण सिरना, या ULK1 और ULK2 के संयुक्त लक्ष्यीकरण, दृढ़ता से LDH कोशिकाओं में भुखमरी की स्थिति के तहत LNCaP ज़ब्ती कम (चित्रा 3डी) । इसके अलावा, हम अपने पिछले निष्कर्षों की पुष्टि की3,9 कि फोकल आसंजन कळेनासे परिवार के लक्ष्यीकरण २०० केडीए (FIP200) या γ-aminobutyric एसिड प्रकार एक (GABAA) रिसेप्टर से जुड़े प्रोटीन के संयुक्त लक्ष्यीकरण का आदान प्रदान ( GABARAP) परिवार के सदस्यों भुखमरी प्रेरित LDH ज़ब्ती (आंकड़ा 3डी) रोकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : LDH ज़ब्ती प्रोटोकॉल का समग्र प्रवाह योजना. प्रोटोकॉल एक 12-well टिशू कल्चर प्लेट प्रारूप पर आधारित है, नमूना प्रति संकेत खंड (एक अच्छी तरह से) का उपयोग कर । परख प्रोटोकॉल आसानी से दो अलग कार्य दिवसों में विभाजित किया जा सकता है, के रूप में संकेत दिया । हालांकि, यह भी एक दिन में पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए संभव है । संक्षिप्त: एबीबी, विस्फोट बफर के बाद (३.३ सामग्री के लिए प्रोटोकॉल में कदम देखें); RSB, resuspension (घटक के लिए प्रोटोकॉल में चरण ३.५ देखें) बफ़र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : LDH ज़ब्ती परख के सत्यापन autophagy-बाधा यौगिकों का उपयोग कर । (एक) LNCaP कोशिकाओं या तो अनुपचारित छोड़ दिया गया (पृष्ठभूमि घटाव के प्रयोजन के लिए: चरण 1.3.2 देखें) में पूर्ण विकास मध्यम (सेमी; RPMI १६४० + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)), या वे सेमी में या सीरम और एमिनो एसिड मुक्त माध्यम (EBSS) में DMSO वाहन (०.१%) या १०० एनएम बाफ के साथ इलाज किया गया । इसके अतिरिक्त, कुछ कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया 3MA (10 मिमी), SAR-४०५ (10 µ m), या Thapsigargin (३०० एनएम), के रूप में संकेत दिया. उपचार के 3 ज के बाद, कोशिकाओं को काटा गया, और LDH ज़ब्त दरों वर्तमान प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में निर्धारित किया गया । () HEK293 कोशिकाओं DMSO वाहन (सेमी में ०.१%), या EBSS में १०० एनएम बाफ के साथ के साथ इलाज किया गया, के रूप में संकेत दिया । इसके अतिरिक्त, कुछ कोशिकाओं के 10 µ एम MRT67307 (एक ULK अवरोध करनेवाला) या ३०० एनएम Thapsigargin प्राप्त किया । LDH ज़ब्त किए गए दरों के उपचार के 3 ज के बाद निर्धारित किया गया । (सी-एफ) MEF (C), बीजे (डी), MCF-7 (ई), या RPE-1 (च) कोशिकाओं में DMSO वाहन के साथ इलाज किया गया (०.१%) सेमी, या बाफ के साथ (में 10 एनएम सी, १०० एनएम में डी-एफ) के साथ या बिना EBSS में 10 मिमी 3MA, के रूप में संकेत दिया । LDH ज़ब्त किए गए दरों के उपचार के 3 ज के बाद निर्धारित किया गया । ए, बी, डी, ई, और एफ शो तीन जैविक प्रतिकृति (तपसिल वेल्स) से एक प्रयोग (n = 1), मानक विचलन का प्रतिनिधित्व त्रुटि सलाखों के साथ मूल्यों से मतलब है । C तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब मूल्यों से पता चलता है (n = 3), त्रुटि सलाखों के साथ मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व. *p < 0.05, * * *p < 0.001, दोहराए गए नमूने एक-तरफा ANOVA ।

Figure 3
चित्रा 3 : नॉकआउट द्वारा LDH ज़ब्ती परख के सत्यापन (एक-सी) या पछाड़ना (डी) दृष्टिकोण । (A-C) ATG5 जंगली प्रकार (WT) या पीटा (ko) MEFs (), ATG7 WT या ko MEFs (बी), या ATG9A WT या ko MEFs () सेमी में DMSO वाहन (०.०१%), या के साथ EBSS में 10 एनएम बाफ के साथ इलाज किया गया, के रूप में संकेत दिया । LDH ज़ब्त किए गए दरों के उपचार के 3 ज के बाद निर्धारित किया गया । चार से मतलब मान (A; n = 4) या तीन (B और C; n = 3) स्वतंत्र प्रयोग, त्रुटि पट्टियों के साथ, माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । *p < 0.05, दोहराए गए नमूने दो-तरफा ANOVA । एन एस, महत्वपूर्ण नहीं है । () LNCaP कोशिकाओं को एक गैर निशाना नियंत्रण सिरना (siCtrl) के 5 एनएम के साथ रिवर्स transfected थे, या 5 एनएम के साथ ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1-, या GABARAPL2-लक्ष्यीकरण सिरना oligoes, के रूप में संकेत दिया । ४८ ज के बाद, कोशिकाओं या तो DMSO वाहन के साथ इलाज किया गया (०.१%) सेमी में, या १०० एनएम बाफ के साथ EBSS में, के रूप में संकेत दिया । LDH ज़ब्त किए गए दरों के उपचार के 3 ज के बाद निर्धारित किया गया । दिखाया एक प्रयोग से तीन जैविक प्रतिकृति (तपसिल वेल्स) से मतलब मान रहे है (n = 1), त्रुटि सलाखों के साथ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व ।

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Discussion

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सारांश में, प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक विश्वसनीय और व्यापक रूप से लागू करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में थोक autophagic ज़ब्ती गतिविधि की निगरानी विधि का प्रतिनिधित्व करता है । मूल विधि12,16की तुलना में, हम अनावश्यक कदम की एक संख्या को हटा दिया है, शेष चरणों के कई सरलीकृत, और एक पर्याप्त downscaling शुरू की । नतीजतन, प्रोटोकॉल लागत और समय दक्षता के संबंध में काफी सुधार हुआ है, और नमूने की एक ही राशि के मूल प्रोटोकॉल की तुलना में अब आधे से भी कम समय में संभाला जा सकता है । 24 नमूनों के लिए, चरण 2 – 3 (दिन 1) की आवश्यकता लगभग ½ h की तैयारी से अधिक कुशल काम के 3 ज, जबकि चरण 4 (दिन 2) में किया जा सकता है ~ 2 घंटे (समय अनुमान है कि सभी आवश्यक बफ़र्स पहले से तैयार कर रहे हैं) दिया. 1 दिन पर परख के बाद से आम तौर पर सेल उपचार से पहले है, एक 3-बाफ या autolysosomal LDH क्षरण के अंय अवरोधकों के साथ 4 ज मशीन सहित, यह दो लगातार दिनों में परख विभाजित सुविधाजनक है । हालांकि, यह भी एक और एक ही दिन में पूरी परख प्रदर्शन संभव है । उस स्थिति में, यह चरण ३.६ और ३.७ में लिक्विड नाइट्रोजन में नमूने स्नैप-फ़्रीज़ करने के लिए समय की बचत होगी । हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण नहीं, यह संभावना है कि रुक-गल कदम पूरी तरह से छोड़ दिया जा सकता है, प्राथमिक चूहे हेपैटोसाइट्स में परख के अधिक विस्तृत संस्करण के बाद से इस कदम के बिना किया गया है23

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल रिश्तेदार आसानी के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । नोट की, यह pipetting में सटीक होना महत्वपूर्ण है, के बाद से परख कई नमूना और कमजोर पड़ने कदम भी शामिल है । इसके अलावा, supernatant आकांक्षाओं अच्छी तरह से किया जाना चाहिए, ताकि आयनों की ंयूनतम मात्रा २.५ कदम में सुक्रोज सेल निलंबन में मौजूद हैं, और इतना है कि के रूप में छोटे cytosolic LDH के रूप में संभव है ३.६ कदम में तलछट सामग्री दूषित है । परख के रूप में यहां वर्णित शुरू सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लचीला है । उदाहरण के लिए, LNCaP कोशिकाओं में, हम सफलतापूर्वक फसल में कोशिकाओं के विभिंन मात्रा की एक सीमा के साथ परख इस्तेमाल किया है, एक 10-गुना अंतर करने के लिए फैले (से २.५ x 105 कोशिकाओं को २.५ x 106 कोशिकाओं) । न्यूनतम प्रारंभिक सामग्री की जरूरत LDH एंजाइमी गतिविधि का पता लगाने की विधि कैसे संवेदनशील द्वारा परिभाषित किया गया है. प्रोटोकॉल बहुत संभव है स्केल किया जा सकता काफी आगे नीचे, चरणों २.५, ३.३, ३.५, ३.७, ४.२, और ४.३ पर उपयोग किया गया वॉल्यूम नीचे स्केलिंग द्वारा ।

सबसे महत्वपूर्ण कारक है और परख के साथ तकनीकी चुनौती electrodisruption कदम है । मजबूत है, लेकिन संक्षिप्त, आयन में कोशिकाओं के बिजली के झटके से मुक्त, isotonic समाधान एक वर्दी में और चयनात्मक विघटन प्लाज्मा झिल्ली का परिणाम है, जबकि intracellular संरचना और organelles छोड़ने (autophagic रिक्तिकाएं सहित) बरकरार12, 29. जब अनुयाई कोशिकाओं का उपयोग कर, यह आवश्यक है कि वे एंजाइमी और चरणों 2.1 – 3.1 (सेल टुकड़ी, केंद्रापसारक, और resuspension) में यांत्रिक उपचार बर्दाश्त । ३.१ चरण के लिए, यह एक पूरी तरह से एकल-कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है । उदाहरण के लिए, यह बहुत LNCaP कोशिकाओं के साथ प्राप्त करने के लिए कठिन है । फिर भी, कोशिकाओं के पास १००% में सफल electrodisruption हमेशा शारीरिक रूप से जुड़े कोशिकाओं के कई दर्जनों युक्त सेल के झुरमुट के भीतर, प्राप्त किया जाता है । जब एक नया सेल प्रकार का परीक्षण, यह सलाह दी जाती है electrodisruption की क्षमता को सत्यापित करने के लिए (3.3.1 चरण देखें)17. electrodisruption चरण17के बाद कोशिकाओं के १००% के पास स्थाई रूप से Trypan नीले सकारात्मक होना चाहिए । यदि यह मामला नहीं है, electroporator सेटिंग्स होना चाहिए सबसे अधिक संभावना बदल दिया है । 20 विभिन्न स्तनधारी सेल प्रकार में परख का उपयोग करना, हम electroporator सेटिंग्स को बदलने के लिए कभी नहीं किया है । इस प्रकार, एक बार सही सेटिंग्स एक स्तनधारी सेल लाइन के लिए पाया गया है, यह स्तनधारी कोशिकाओं के अंय सभी प्रकार के लिए काम करने की संभावना है । यह सत्यापित करने के लिए कि electrodisruption स्थितियाँ भी कठोर नहीं हैं, अर्थात,कि केवल प्लाज्मा झिल्ली, और नहीं intracellular organelles की झिल्ली बाधित किया गया है, कदम 3.3.2 का पालन करें.

थोक autophagy autophagosomes द्वारा किया जाता है कि सह अन्य कार्गो के साथ साथ cytosol की पर्याप्त मात्रा एकांत. यह विशुद्ध रूप से गैर कोशिका द्रव्य के भागों के चयनात्मक autophagy के माध्यम से हो सकता है, या एक तरह से है कि चयनात्मक और गैर चयनात्मक autophagy का मिश्रण का प्रतिनिधित्व करता है । तारीख करने के लिए यह स्पष्ट नहीं है कि क्या या जो डिग्री चयनात्मक और गैर चयनात्मक autophagy सह दो autophagy के विभिंन तरीकों के रूप में मौजूद है, या कि एक नियम के रूप में autophagosomes दोनों चयनात्मक और गैर चयनात्मक शिष्टाचार में एक साथ एकांत कार्गो । महत्वपूर्ण बात है, तथापि, एक ताजा अध्ययन की रिपोर्ट है कि चयनात्मक autophagy के उत्प्रेरक थोक cytosolic कार्गो ज़ब्ती में विशिष्ट कार्गो30के ज़ब्ती के रूप में एक समान वृद्धि प्रेरित । हमारी प्रयोगशाला से परिणाम इस (हमारे अप्रकाशित परिणाम) के साथ समझौते में हैं । घुलनशील cytosolic प्रोटीन की ज़ब्ती का विश्लेषण (जैसे, LDH) इसलिए संभावना है कि कई के तहत macroautophagic ज़ब्ती गतिविधि में परिवर्तन का पता लगाने की क्षमता है, नहीं तो सभी शर्तों । हालांकि, हालांकि यह अभी भी सिद्ध किया जा करने के लिए बनी हुई है, संभावना बाहर रखा जा सकता है कि शर्तों के कुछ प्रकार के विशिष्ट चयनात्मक-अनंय autophagy के एक प्रकार के प्रेरित जहां माल इतना कसकर phagophore कि cytosol से बाहर रखा गया है से लिपटे है autophagosome में तनहा होने के नाते । के लिए जांच के लिए कि क्या ऐसी हालत मौजूद हो सकता है, थोक LDH ज़ब्ती परख की तरह autophagy परख चयनात्मक autophagy परख के साथ समानांतर में चलाया जाना चाहिए ।

LDH ज़ब्ती परख के मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह अंतर्जात कार्गो की ज़ब्ती उपाय है, इस प्रकार यह एक मोटे तौर पर लागू विधि बना रही है । इसके अलावा, परख एक उच्च मात्रात्मक ढंग से गतिविधि ज़ब्ती उपाय । LDH ज़ब्ती परख तंत्र और autophagosome गठन के विनियमन के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, के बाद से खुला phagophores LDH एकांत नहीं कर सकते । यह बहुत बोझिल और मुश्किल है, अगर असंभव नहीं है, का आकलन करने के लिए कि autophagosome की तरह संरचनाओं या नहीं इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सील कर रहे हैं । एक और तरीका है कि autophagosomes बंद कर रहे है विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है autophagy मार्करों की संवेदनशीलता का परीक्षण (जैसे, LC3) या रिसेप्टर्स (जैसे, sequestosome 1 (p62/SQSTM1) या परमाणु डॉट प्रोटीन ५२ (NDP52)) के लिए 10 को छेड़ने ,31,३२. इस परख का नुकसान यह है कि एक गाड़ी के घटकों के बजाय autophagic कार्गो के संरक्षण को छेड़ने का अध्ययन कर रहा है । इसके अलावा, के बाद से परख पश्चिमी सोख्ता पर आधारित है, यह केवल अर्द्ध मात्रात्मक है ।

जबकि अंतर्जात कार्गो के autophagy विश्लेषण करने की क्षमता एक फायदा, LDH ज़ब्ती परख के साथ एक अंतर्निहित सीमा है, और किसी भी अंय परख कि अंतर्जात कार्गो के ज़ब्ती का आकलन है, कि एक क्षरण अवरोधक आदेश में शामिल किया जाना चाहिए autophagic ज़ब्ती पर बजाय ज़ब्ती और गिरावट का शुद्ध प्रभाव पर विशेष प्रभाव समझदार । LDH ह्रास के कुशल अवरोधकों में शामिल है प्रोटॉन की तरह पंप अवरोधकों या concanamycin एक3,16,18, और lysosomotropic एजेंटों जैसे क्लोरोक्वीन और अमोनियम क्लोराइड३३। छेड़ने अवरोधक leupeptin प्राथमिक चूहे हेपैटोसाइट्स23में अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन आम तौर पर स्तनधारी सेल लाइनों हम परीक्षण किया है में अक्षम है । हम नियमित रूप से13बाफ का उपयोग करते हैं, जो तेजी से काम करता है और अत्यंत घातक और घातक कोशिकाओं में कुशल है । हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि LDH ह्रास अवरोधकों में से कोई भी पूरी तरह से विशिष्ट हैं, और autophagy पर अवरोधकों के ख्यात प्रभाव को बाहर नहीं किया जा सकता । गैर विशिष्ट प्रभाव के जोखिम को कम करने के लिए, यह केवल स्तर संतृप्ति पर हैं कि अवरोधक की सांद्रता का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, और प्रयोग के केवल पिछले कुछ घंटों (3-4 एच) के लिए अवरोधक शामिल करने के लिए. बाफ के संतृप्त एकाग्रता प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । एक गाइड के रूप में, 50-100 एनएम प्रसंस्कृत स्तनधारी सेल लाइनों हम परीक्षण किया है की सबसे के लिए संतृप्त है, जबकि कुछ कोशिका प्रकार MEFs के रूप में LDH क्षरण में एक पूर्ण ब्लॉक के लिए केवल 10 एनएम बाफ की आवश्यकता होती है ।

LDH ज़ब्ती परख के साथ एक स्पष्ट सीमा है कि यह केवल जीवित कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है, इस प्रकार निश्चित कोशिकाओं और ऊतकों में autophagy के विश्लेषण के लिए इसके उपयोग को छोड़कर । दूसरी ओर, वर्तमान में कोई परख कि तय कोशिकाओं में कार्यात्मक autophagic गतिविधि उपाय कर सकते है स्थापित कर रहे हैं । हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण नहीं, यह पूरी तरह से प्रयोगात्मक जीवों में vivo autophagic ज़ब्ती गतिविधि में मूल्यांकन करने के लिए LDH ज़ब्ती परख का उपयोग करने के लिए संभव होना चाहिए. सीमा होगी कि जीव lysosomal LDH गिरावट का एक अवरोधक के साथ इलाज बर्दाश्त करना चाहिए, और है कि इस तरह के उपचार और परख के प्रदर्शन के बीच समय अवधि अपेक्षाकृत कम होना चाहिए, के संभावित गैर विशिष्ट प्रभाव को कम करने के लिए अवरोध करनेवाला । दिलचस्प है, Kominami एट अलद्वारा एक प्रारंभिक अध्ययन, संकेत दिया कि 3-6 leupeptin के साथ चूहों के एच उपचार (2 मिलीग्राम के intraperitoneal इंजेक्शन/जिगर में autophagically तनहा LDH के कुशल संचय का निरीक्षण करने के लिए उपयुक्त है उपसेलुलर अंशों autophagic रिक्तिकाएं३४के लिए समृद्ध ।

अस्थानिक ऐसे Rosella३५ या Keima३६ के रूप में पीएच के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट ज़ब्ती जांच की अभिव्यक्ति के लिए क्षरण अवरोधकों सहित की आवश्यकता के बिना autophagic ज़ब्ती कल्पना इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, LDH ज़ब्ती परख के विपरीत, इस तरह के दृष्टिकोण एकल कोशिकाओं में autophagic ज़ब्ती कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, organelle को जांच के फ्यूजन-लक्ष्यीकरण दृश्यों के लिए विशिष्ट organelles की ज़ब्ती की निगरानी का उपयोग किया जा सकता है । शक्तिशाली सूक्ष्म प्लेटफार्मों भी उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है । नुकसान कर रहे है कि अस्थानिक जांच अभिव्यक्ति, साथ ही साथ lysosomal प्रणाली में जांच के संचय, autophagic मार्ग को प्रभावित कर सकते हैं । इसके अलावा, LDH ज़ब्ती परख के विपरीत, एक कोशिकाओं है कि कुशलता से transfected जा सकता है पर निर्भर है । अंत में, जबकि LDH ज़ब्ती परख प्रतिशत तनहा cytosol के सीधे आगे मात्रात्मक उत्पादन प्रदान करता है, छवि आधारित तरीकों आम तौर पर निरपेक्ष मात्रात्मक उत्पादन के इस प्रकार प्रदान नहीं कर सकते । यह एक पूरक तरीके से दृष्टिकोण के दोनों प्रकार के उपयोग करने के लिए उचित होगा । एक और उत्कृष्ट विधि क्षरण अवरोधकों के लिए एक की जरूरत के बिना autophagic ज़ब्ती अध्ययन करने के लिए प्रतिवर्ती इलेक्ट्रो द्वारा कोशिकाओं में radiolabeled raffinose परिचय है-permeabilization3,23,३७, ३८. Raffinose एक झिल्ली है impermeant और चयापचय निष्क्रिय चीनी कि lysosomal एंजाइमों के लिए प्रतिरोधी है । इसलिए, इसके autophagic ज़ब्ती cytosolic के पृथक्करण से अवसादपूर्ण कोशिका भिन्न3,23,३७,३८के बाद किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण है, तथापि, LDH ज़ब्ती परख से अधिक समय लेने वाली, और रेडियोधर्मिता के उपयोग के कारण अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता है. अंत में, थोक autophagic ज़ब्ती और अबाधित autophagic कार्गो फ्लक्स के अंत परिणाम, लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन का क्षरण, सही ढंग से मापा जा सकता है एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटीन लेबलिंग-आधारित विधि३९,४० ,४१,४२,४३. हालांकि, LDH ज़ब्ती परख के विपरीत, इस विधि प्रदान नहीं करता है एक विशिष्ट पढ़ने के लिए बाहर autophagic गतिविधि के लिए, लंबे समय के बाद से प्रोटीन रहता है भी autophagy से अंय तंत्र द्वारा नीचा, सबसे विशेष रूप से proteasomal प्रणाली द्वारा (जबकि LDH ज़ब्ती केवल autophagy का एक परिणाम के रूप में होता है). इसलिए, नियंत्रण उपचार के एक नंबर के लिए नियमित रूप से शामिल किया जाना चाहिए, जैसे, autophagic के रासायनिक अवरोधकों-lysosomal या proteasomal गिरावट, और autophagy3,16के साथ आनुवंशिक हस्तक्षेप ।

LDH ज़ब्ती परख आम तौर पर इस्तेमाल किया LC3 फ्लक्स परख, जो पश्चिमी सोख्ता या LC3 puncta के अभाव में प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा LC3-द्वितीय स्तर को मापने के साथ तुलना की जा सकती lysosomal क्षरण के अवरोधकों की उपस्थिति (बाफ सबसे अक्सर इस्तेमाल किया), या फ्लोरोसेंट अम्लीय वातावरण के लिए LC3 वेरिएंट टैग का संक्रमण22. हालांकि इन LC3 आधारित परख उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं, वे की व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो सकता है, विशेष रूप से, क्योंकि LC3 फ्लक्स की डिग्री और मात्रा और कार्गो प्रवाह के प्रकार के बीच संबंध अज्ञात है । परिचय के रूप में उल्लेख किया है, थोक autophagy और Parkin-निर्भर mitophagy LC3 परिवार प्रोटीन9,10,11,४४की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, भूखे चूहे हेपैटोसाइट्स में, LDH ज़ब्ती और गिरावट समय अवधि के दौरान निर्बाध आय जहां कोई autophagic-lysosomal LC3 फ्लक्स9है । इस प्रकार, इस मामले में, कार्गो फ्लक्स पूरी तरह से LC3 फ्लक्स से अलग किया जा सकता है । अधिक कार्गो फ्लक्स के विभिंन प्रकार के साथ LC3 प्रवाह की तुलना अनुसंधान के लिए बेहतर LC3 फ्लक्स परख के साथ प्राप्त परिणामों की व्याख्या की जरूरत है ।

अपने वर्तमान रूप में, LDH ज़ब्ती परख आवश्यक हाथों के संदर्भ में पश्चिमी सोख्ता के लिए तुलनीय है-समय और लागत पर । थोक autophagy को मापने के संदर्भ में, यह है raffinose-आधारित ज़ब्ती परख या लंबे समय तक प्रोटीन क्षरण परख के ऊपर वर्णित के रूप में कम से कम कुशल के रूप में । थोक autophagic ज़ब्ती गतिविधि और बंद autophagosomes के गठन के विशिष्ट माप के लिए, यह बहुत अधिक कुशल और सीधे LC3 फ्लक्स परख या LC3 या autophagy रिसेप्टर्स के संरक्षण परख की तुलना में आगे है, बाद के बाद से परख मापने गाड़ी घटकों के बजाय वास्तविक कार्गो । हालांकि हम काफी LDH ज़ब्ती परख के प्रवाह में सुधार हुआ है, यह एक उच्च प्रवाह परख से दूर है, और यह छवि की क्षमता के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं कर सकते है आधारित परख ऊपर वर्णित है । हालांकि, दोनों की छवि परख और LDH ज़ब्ती परख आधारित अपने फायदे और नुकसान है, और इस प्रकार दोनों परख के प्रकार के अपने मूल्यों है । यह संभव है कि भविष्य के समायोजन के माध्यम से LDH ज़ब्ती परख अर्द्ध उच्च प्रवाह बनाने की संभावना है । उदाहरण के लिए, यह एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में electrodisruption प्रदर्शन संभव होना चाहिए, और यह है कि cytosolic LDH के बजाय केंद्रापसारक द्वारा तनहा LDH से अलग किया जा सकता है, या कि केंद्रापसारक कदम एक ९६ में प्रदर्शन किया जा सकता है कल्पना है- अच्छी तरह से प्रारूप । इसके अलावा, परख LDH गतिविधि है कि अधिक से अधिक संवेदनशील है कि मौजूदा प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है विकसित किया गया है मापने के लिए, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । अंय दिलचस्प परख के भविष्य की क्षमता स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में अंय प्रकार के सेल में अपने ख्यात उपयोग कर रहे हैं, उदाहरण के लिए खमीर या अंय कोशिकीय जीवों में, या यहां तक कि संयंत्र कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इसके उपयोग के लिए vivo माप में autophagic प्रयोगात्मक जीवों के ऊतकों में ज़ब्ती गतिविधियों.

अंत में, हम मानते है कि इसके सुधार और पुनर्जीवित रूप में LDH ज़ब्ती परख भविष्य autophagy में एक महत्वपूर्ण उपकरण से संबंधित अनुसंधान होगा ।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

यह काम आर्थिक रूप से नॉर्वे की अनुसंधान परिषद, ओस्लो विश्वविद्यालय, ऐंडर्स Jahre फाउंडेशन, Nansen फाउंडेशन, और Henrik Homan की स्मृति में विरासत द्वारा समर्थित किया गया । हम ATG5 +/+ MEFs और ATG5-/MEFs के लिए डॉ॰ Noboru Mizushima का धन्यवाद करते हैं, डॉ॰ Masaaki कोमात्सु के लिए ATG7 +/+ MEFs और ATG7-/MEFs, और डॉ॰ Shizuo अकीरा के लिए ATG9A +/+ MEFs और ATG9A-/MEFs । हम तकनीकी सहायता के लिए फ्रैंक Sætre का धन्यवाद करते हैं और रचनात्मक methodological चर्चाओं के लिए प्रति ओ. Seglen डॉ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

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References

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स्तनपान डिहाइड्रोजनेज ज़ब्ती परख-एक सरल और विश्वसनीय विधि स्तनधारी कोशिकाओं में थोक Autophagic ज़ब्ती गतिविधि निर्धारित करने के लिए
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Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

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