Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metaboliske mærkning med 4-thiouracil og kvantificering af nyligt syntetiserede mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57982
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

Protokollen beskrevet her er baseret på en genome-wide kvantificering af nyligt syntetiserede mRNA renset fra gærceller mærket med 4-thiouracil. Denne metode gør det muligt for at måle mRNA syntese sammenkædet fra mRNA i tænderne og således giver en nøjagtig måling af RNA polymerase II transskription.

Abstract

Globale defekter i RNA polymerase II transskription kan blive overset af transkriptom undersøgelser analysere steady-state RNA. Faktisk, den globale fald i mRNA syntese har vist sig at blive opvejet af et samtidigt fald i mRNA nedbrydning at genoprette normale steady state niveauer. Genome-wide kvantificering af mRNA syntese, uafhængigt af mRNA i tænderne, er derfor den bedste direkte afspejling af RNA polymerase II transcriptional aktivitet. Her diskuterer vi en metode ved hjælp af ikke-forstyrrende metaboliske mærkning af spirende RNA'er i Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifikt, cellerne er kulturperler i 6 min. med en uracil analog, 4-thiouracil, og at mærket nyligt transskriberede RNA'er er renset og kvantificeret Bestem syntese satser for alle individuelle mRNA. Desuden ved hjælp af mærket Schizosaccharomyces pombe celler som intern standard giver mulighed for sammenligning af mRNA syntese i forskellige S. cerevisiae stammer. Ved hjælp af denne protokol og montering data med en dynamisk kinetiske model, kan de tilsvarende mRNA henfald satser bestemmes.

Introduction

Celler reagerer på endogene og eksogene stikord, gennem den dynamiske ændring af deres gen expression program. I de seneste år tillader en enorm udvikling af genome-wide metoder en præcis og omfattende beskrivelse af transkriptom ændringer i forskellige betingelser. I de fleste transkriptom undersøgelser, microarray hybridisering eller høj overførselshastighed sekventering bruges til at kvantificere RNA niveauer fra en total steady-state RNA brøkdel. Transkriptionel ændringer under en bestemt undertrykkelse af netbårne kan vise en bred vifte af mulige udfald, med enten bestemt gen expression ændringer eller et stort spektrum af gener er enten op- eller downregulated. Genekspression er resultatet af en finjusteret ligevægt — eller steady-state — mellem RNA syntese af RNA polymeraser og andre processer, der påvirker RNA niveauer. RNA-polymerase II transskription, herunder dens tre særskilte faser (indledning, strækforlængelse og opsigelse), er stærkt og uløseligt forbundet med mRNA behandling, cytoplasmatisk eksport, oversættelse og nedbrydning.

Flere nyere undersøgelser viste, at mRNAs syntese og tænderne er koblet mekanismer og viste at transcriptional effekter ved mutation eller under stimuli kan blive overset, når kvantificere samlede steady-state RNA. Første afhænger påvisning af transcriptional ændringer gennem analyser af steady state niveauer af mRNA altid mRNAs half-life. Når den undertrykkelse af netbårne er indført, vil steady state niveauer af mRNAs med lange halveringstider langt mindre påvirket end mRNAs med korte halveringstider. Derfor, sporbarhed af ændringer i RNA syntese er kraftigt forudindtaget til fordel for kortvarig udskrifter, mens analyse af teknologiinvesteringer mRNA arter kan mislykkes at afsløre dynamiske ændringer i transskription sats. Andet, flere rapporter har vist, at både i gær og pattedyr, globale ændringer i transskription kan blive overset når analyserer steady state niveauer af mRNA. Dette er sandsynligvis på grund af de mekanismer, der knytter mRNA syntese og nedbrydning som følge i mRNA buffering. Dette bedt om udviklingen af nye protokoller at kvantificere mRNA syntese sammenkædet fra nedbrydning, gennem en analyse af nyligt transskriberede mRNA. I de seneste år, er blevet præsenteret flere alternativer, herunder globale køre sekventering (GRO-seq)1og indfødte brudforlængelse udskrift sekventering (NET-seq)2,3. Her, fremlægger vi en protokol i første omgang udviklet i pattedyrceller4,5,6 og derefter tilpasset gær7,8,9,10, 11, som er baseret på RNA mærkning med en thiolated nucleoside eller base analog, 4-thiouridine (4sU) eller 4-thiouracil (4tU), henholdsvis.

Denne metode specielt renser nyligt transskriberede RNA fra cellerne i hvilke RNA er puls-mærket med 4sU med næsten ingen indblanding i celle homøostase. Derfor, når cellerne er udsat for 4sU, molekylet er hurtigt uptaken, fosforyleret til 4sU-trifosfat, og indarbejdet i RNA'er er transskriberet. Når puls-mærket, det er muligt at udtrække samlede cellulære RNA (svarende til steady state niveauer af RNA), og efterfølgende 4sU-mærket RNA brøkdel er thiol-specielt ændret, fører til dannelsen af en disulfid obligation mellem biotin og de nyligt transskriberet RNA4,5. 4sU kan dog kun være uptaken af de celler, der udtrykker en nucleoside transportøren, som den menneskelige equilibrative nucleoside transporter (hENT1), forhindrer dets umiddelbare anvendelse i spirende eller fission gær. Mens man kunne udtrykke hENT1 i enten S. pombe eller S. cerevisiae, kan en lettere tilgang opnås ved hjælp af den ændrede base 4tU, da gærceller kan 4tU, uden savn i udtryk for en nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. I virkeligheden, metabolismen af 4tU kræver aktiviteten af enzymet uracil phosphoribosyltransferase (UPRT). I mange organismer, herunder gær men ikke pattedyr, er UPRT afgørende for en pyrimidin bjærgning pathway, genbrug uracil til uridine monophosphate.

En vigtig skævhed i transkriptom undersøgelser kan indføres ved normalisering mellem forskellige prøver analyseres samtidig. Faktisk, mange afvigende faktorer kan påvirke den sammenlignende analyse af transkriptom mutant og vildtype stammer: effektiviteten af cellen lysis, forskelle i udvinding og genanvendelse af RNA, og afvigelser i scanner kalibrering for microarray analyser , blandt andre. Som beskrevet ovenfor, kan sådanne variationer især vildledende, når der forventes globale virkninger på RNA polymerase II transskription. En elegant betyder præcist at sammenligne mRNA syntese satser mellem forskellige prøver blev udviklet ved hjælp af fjernt beslægtede fission gær Schizosaccharomyces pombe som en intern standard. For at et fast antal mærket S. pombe celler føjes til S. cerevisiae prøver, enten wild-type eller muterede celler, før cellen lysis og RNA udvinding10. Efterfølgende, er både steady-state og nyligt syntetiserede RNA'er fra S. pombe og S. cerevisiae kvantificeret enten af RT-qPCR eller via brugen af microarray chips eller høj overførselshastighed sekventering10. Ved at kombinere disse data med kinetic modellering, kan absolut satser af mRNA syntese og nedbrydning i spirende gær måles.

Inden for rammerne af dette manuskript, vil vi vise, hvordan analysen af nyligt transskriberede RNA lov til at afsløre en global rolle for coactivator komplekser SAGA og TFIID i RNA polymerase II transskription i spirende gær14,15, 16. Vigtigere, tidligere undersøgelser kvantificeret steady-state mRNA niveauer i S. cerevisiae og foreslog, at SAGA spiller en fremherskende funktion på et begrænset sæt af gær gener, som er stærkt berørt af mutationer i SAGAEN, men relativt resistente over for TFIID mutationer17,18,19. Overraskende, blev SAGA enzymaktiviteter vist til at handle på det hele transskriberede genom, tyder på en bredere rolle for denne Co aktivator i RNA polymerase II transskription. Nedsat RNA polymerase II ansættelse på mest udtrykte gener blev observeret ved inaktivering af SAGA eller TFIID, hvilket tyder på, at disse coactivators arbejde sammen på de fleste gener. Dermed, kvantificering af nyligt transskriberede mRNA afslørede, at SAGA og TFIID er nødvendige for transskription af næsten alle gener af RNA polymerase II14,15,16. Gennemførelsen af kompenserende mekanismer fremstår som en måde for cellerne til at håndtere en global nedgang i mRNA-syntese, der er adskilt af en samtidig global nedgang i mRNA nedbrydning. SAGA tilføjer til listen over faktorer at have en global indvirkning på RNA polymerase II transskription, såsom RNA Pol II underenheder10, mægler coactivator komplekse20, generelt transskription faktor TFIIH21,22 , og indirekte elementer af mRNA nedbrydning maskiner9,10,23. Sådanne kompensatoriske begivenheder var universelt observeret i SAGA mutanter, tegner sig for de beskedne og begrænsede ændringer i steady-state mRNA niveauer på trods af en global og alvorlige nedgang i mRNA syntese14. Lignende analyser er også udført i en BRE1 sletning stamme, hvilket resulterede i et fuldstændigt tab af Histon H2B ubiquitination. Interessant, der kunne påvises en meget mildere, men konsekvent globale virkning på RNA polymerase II transskription i mangel af Bre1, der angiver, at metaboliske mærkning af nyligt transskriberede RNA i gær kan detektere og kvantificere en lang række ændringer i mRNA syntese satser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle dyrkning og Rapamycin udtømning af en SAGA Subunit

  1. For hver S. cerevisiae stamme og kopiere podes herunder wild-type eller kontrol stammer, en enkelt koloni fra en frisk plade på 5 mL af YPD-medium (2% pepton, 1% gærekstrakt og 2% glukose).
  2. Vokse S. cerevisiae celler natten over ved 30 ° C med konstant agitation (150 rpm).
  3. Måle den optisk tæthed på 600 nm (OD600) og fortyndes kultur til en OD600 af ca. 0,1 i 100 mL YPD medium og lad det vokse indtil OD600 er omkring 0,8.
  4. Parallelt, podes en enkelt koloni af S. pombe celler fra en frisk plade på 50 mL af ja medium (0,5% gærekstrakt; 250 mg/L adenin, histidin, uracil, leucin og lysin; 3% glukose) og dyrke celler natten over ved 32 ° C med konstant agitation (150 rpm).
  5. Måle OD600 af S. pombe overnight kultur og fortyndes kultur til en OD600 af ca. 0,1 i 500 mL ja medium og lad det vokse indtil OD600 er ca 0,8.
  6. For hver S. cerevisiae anker-lager stamme og kopiere podes herunder wild-type eller kontrol stammer, en enkelt koloni fra en frisk plade på 5 mL af YPD-medium (2% pepton, 1% gærekstrakt og 2% glukose).
  7. Vokse celler natten over ved 30 ° C med konstant agitation (150 rpm).
  8. Den næste morgen, måle OD600, fortyndes kultur til en OD600 af ca. 0,1 i 100 mL YPD medium og lad det vokse indtil OD600≈ 0,8.
  9. Tilsæt 100 µL af rapamycin til kulturen fra en stamopløsning af 1 mg/mL (endelige rapamycin koncentration på 1 µg/mL) og lad cellerne inkuberes ved 30 ° C med konstant agitation for den nødvendige tid til protein af interesse at være betinget forarmet fra kernen ( normalt, er 30 min tilstrækkelig). For kontrolelementet, bruge et lignende gær kultur, men i stedet for at tilføje rapamycin, tilføje de tilsvarende volumen af dimethylsulfoxid (DMSO).

2. 4tU mærkning med S. pombe som en Spike-i (optælling)

  1. Forberede en frisk løsning af 2 M 4-thiouracil. Når der tilberedes, opbevare det ved stuetemperatur og væk fra lys.
    1. Præcist 64.1 mg af 4-thiouracil for hver S. cerevisiae kultur, og opløse den i 250 µL af dimethylformamid (DMF) eller 250 µL af DMSO.
    2. For S. pombe kultur anvendes som spike-in, 320.5 mg af 4-thiouracil og opløse den i 1,250 µL af DMSO.
  2. Tilføje 4-thiouracil løsning til S. cerevisiae og S. pombe kulturer til en endelig koncentration på 5 mM og Inkuber dem i 6 min. med konstant agitation ved 30 ° C og 32 ° C, henholdsvis.
  3. Efter 6 min, fjerne en lille alikvot af hver kultur til celle optælling. Tælle celler ved hjælp af en automatisk celle counter eller en Neubauer kammer.
  4. Indsamle cellerne gennem centrifugering (2.500 x g) i 5 min. ved 4 ° C.
  5. Supernatanten, vaske cellerne med iskold 1 x PBS, og der centrifugeres igen (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).
  6. Beregn det samlede antal celler i hver af S. cerevisiae og S. pombe prøverne.
  7. Resuspend celler i 5 mL iskold 1 x PBS og bland S. cerevisiae med S. pombe celler med forholdet 3:1.
  8. Centrifugeres celler (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), fjerne PBS, flash-fryser cellerne i flydende N2og gemme prøve ved-80 ° C indtil videre anvendelse.

3. RNA udvinding og DNase behandling

  1. Optø cellerne i isbad i ca 20-30 min.
  2. Fortsætte med RNA udvinding ved hjælp af en gær-RNA udvinding kit (Tabel af materialer) med et par tilpasninger.
  3. Per hver prøve, hæld 750 µL af iskold Zirconia perler i et 1,5 mL skruelåg rør leveres med kittet. Husk på, at per hver tube, RNA fra op til 109 celler kan effektivt udvindes. Derfor Forbered antallet rør nødvendigt for hver enkelt prøve. For eksempel, en S. cerevisiae kultur af 100 mL (OD600≈ 0,8) kan gøre 3 x 109 celler, fører op til 2,7 x 10 i alt omkring 2 x 10,9 9 4 x 109 celler i alt (efter spike-i med en tredjedel af S. pombe celler). I dette tilfælde, ville op til 3-4 reaktion rør pr. hver prøve/tilstand/mutant/kopiere være påkrævet.
  4. Per hver 1 x 109 celler, tilføje 480 µL af lysisbuffer leveres med kittet, 48 µL af 10% SDS og 480 µL af phenol: chloroform: isoamyl alkohol (25:24:1, v/v/v).
  5. Bland celler ved hjælp af en vortex-mixer og overføre dem til de rør, der indeholder de iskolde Zirconia perler.
  6. Rumme rør på en vortex mixer adapter, drej vortex ved maksimal hastighed og slå i 10 min til at lyse gærceller (i et værelse ved 4 ° C). Alternativt kan du udføre lysering af celler i en automatisk perle-tæppebanker.
  7. Centrifugeres rør på 16.000 x g i 5 min ved stuetemperatur og omhyggeligt indsamle den øverste fase (RNA-holdige fase) til en frisk 15 mL falcon tube. Volumen inddrives pr hver tube er typisk omkring 500 – 600 µL.
  8. Til 15 mL rør indeholdende delvist oprenset RNA, tilføje binding buffer forsynet med kit og bland grundigt. Per hver 100 µL af RNA løsning, tilføje 350 µL af binding buffer (dvs., når den vandige fase løsning volumen er 600 µL, 2,1 mL af den bindende buffer bør være tilføjet).
  9. Den tidligere blanding, tilføje 100% ethanol og blandes grundigt. Per hver 100 µL af RNA løsning, tilføje 235 µL af 100% ethanol (dvs., når den vandige fase løsning volumen er 600 µL, tilføje 1.41 mL ethanol).
  10. Anvende op til 700 µL af blandingen fra trin 3,9 til en filterpatron samlet i en collection tube, begge forsynet med kit.
  11. Der centrifugeres i 1 min på 16.000 x g. Hvis centrifugering varighed ikke var nok for den samlede mængde til at passere gennem filteret, skal du gentage centrifugeringen for 30 s.
  12. Kassér gennemstrømnings- og genbruge den samme collection tube. Tilføje en anden 700 µL af RNA-bindende buffer-ethanol opløsning til filter og centrifugeres igen på 16.000 x g i 1 min.
  13. Kassér gennemstrømnings- og Gentag trin 3.11 og 3.12 indtil RNA løsning er færdig.
  14. Vask filteret 2 x med 700 µL af vask løsning 1. Indsamle vask løsning via centrifugering ved 16.000 x g i 1 min og altid holde collection tube.
  15. Vask filteret 2 x med 500 µL af vask løsning 2. Indsamle vask løsning via centrifugering ved 16.000 x g i 1 min og altid holde collection tube.
  16. Der centrifugeres rør igen på 16.000 x g i 1 min helt tørre filteret.
  17. Overføre filter cartridge til sidste indsamling rør (RNA-passende tube) og elueres RNA med 50 µL af DEPC-behandlet, RNase-fri H2O (forvarmet til 100 ° C).
  18. Der centrifugeres i 1 min på 16.000 x g.
  19. Elueres RNA igen (at det samme rør) med 50 µL forvarmet DEPC-behandlet, RNase-fri H2O. Sørg for at alle volumen har passeret gennem filteret; ellers, centrifugeres i længere perioder.
  20. Hvis flere rør til én enkelt prøve anvendes, samle dem alle i et rør.
  21. Kvantificere og tjekke renheden af prøven ved hjælp af det relevante udstyr.
    Bemærk: Mens 4tU indgår kun inden for nyligt syntetiserede RNA, der er en chance for mindre kontaminering med DNA. Derfor, det er altid tilrådeligt at behandle stikprøver med DNase jeg. For at bruge reagenser leveres med RNA-udvinding kit (Table of Materials) efter fabrikantens anvisninger.

4. thiol-specifikke Biotinylation af nyligt syntetiserede RNA

  1. Justere koncentrationen af RNA fremstillet med punkt 3 i protokollen til 2 mg/mL. Alikvot 200 µg af total RNA, varme den i 10 min. ved 60 ° C, og straks chill det på køl i 2 min.
  2. RNA alikvot, tilføje de reagenser, der er nævnt nedenfor i følgende rækkefølge: 600 µL af DEPC-behandlet, RNase-fri H2O, 100 µL af biotinylation buffer (100 mM Tris-HCl [pH 7,5] og 10 mM EDTA, i DEPC-behandlet, RNase-fri H2O), og 200 µL af Biotin-HPDP fra et lager af 1 mg/mL biotin-HPDP i DMSO eller DMF.
    1. I nogle situationer, biotin-HPDP løsning har tendens til at udfælde, sandsynligvis på grund af dets lave Opløselighed i vand. I denne situation, øge omfanget af DMSO/DMF op til 40% af den reaktion (trichloromethan RNA tilføje 400 µL af DEPC-behandlet H2O, 100 µL af biotinylation buffer og 400 µL af biotin-HPDP fra en 0,5 mg/mL bestand).
  3. Inkuber prøve ved stuetemperatur og beskyttet mod lys for 3 h, med blid agitation.
  4. Efter inkubation, tilføje en omtrent lige saa stort volumen af chloroform til rør og bland kraftigt.
  5. Spin prøve på 13.000 x g i 5 min. ved 4 ° C. Dette trin giver mulighed for fjernelse af overskydende biotin, der gjorde ikke biotinylate af RNA. Alternativt kan du udføre dette trin, ved hjælp af fase-lock rør (tunge). For at dreje ned fase-lock rør for 1 min på 13.000 x g, tilføje RNA blandingen og et tilsvarende beløb af chloroform, blande dem kraftigt, og der centrifugeres dem på 13.000 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  6. Omhyggeligt overføre den øverste fase i nyt 2 mL rør.
  7. Tilføje en tiendedel af mængden af 5 M NaCl og bland prøven.
  8. Tilføje et lige saa stort volumen af isopropanol, proeven blandes grundigt, og spinde det på 13.000 x g i mindst 30 min. ved 4 ° C.
  9. Forsigtigt fjerne supernatanten og tilsættes 1 mL iskold 75% ethanol.
  10. Spin på 13.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
  11. Omhyggeligt fjernes supernatanten, hurtig-spin røret, og fjerne de resterende ethanol løsning. Sørg for, at RNA pelleten ikke tør.
  12. Suspendere RNA i 100 µL af DEPC-behandlet, RNase-fri H2O.

5. rensning af nyligt syntetiserede fraktion fra samlede og umærkede RNA ved hjælp af Streptavidin-belagt magnetiske perler

  1. Varme biotinylated RNA i 10 min. ved 65 ° C og derefter chill prøver på is i 5 min.
  2. Tilføje 100 µL af streptavidin-belagt magnetiske perler til biotinylated RNA (på en endelige mængden af 200 µL). Specifikt, anbefales det at bruge perler angivet i Tabel af materialer, siden, efter samtaler med andre laboratorier, disse syntes for at være mere konsekvent og pålidelig.
  3. Inkuber prøve med let rysten i 90 min ved stuetemperatur.
  4. Anbring kolonnerne forsynet med kit (Table of Materials) i den magnetiske stå.
  5. Tilføje 900 µL af stuetemperatur vask buffer (100 mM Tris-HCl [pH 7,5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, og 0,1% Tween 20, i DEPC-behandlet, RNase-fri H2O) til kolonner (pre-opstille og reagensglasset).
  6. Anvende perler/RNA blanding (200 µL) til kolonnerne.
  7. Indsamle gennemstrømnings i 1,5 mL rør og anvende det igen til den samme magnetiske kolonne. Hvis det er nødvendigt, holde denne gennemstrømnings som det repræsenterer de umærkede RNA brøkdel.
  8. Vaske kolonner 5 x med stigende mængder af vask buffer (600, 700, 800, 900 og 1.000 µL).
  9. Elueres af nyligt syntetiserede RNA med 200 µL af 0,1 M DTT.
  10. Udføre en anden eluering, 3 min senere, med et lige saa stort volumen af 0,1 M DTT.
  11. Efter eluerer RNA, tilføje 0,1 mængder af 3 M NaOAc (pH 5,2), 3 bind for iskold 100% ethanol, og 2 µL af 20 mg/mL glykogen (RNA-grade) og lad RNA bundfald overnatning på-20 ° C.
  12. Genskab RNA ved centrifugering (13.000 x g i 10 min. ved 4 ° C) og resuspend det i 15 µL af DEPC-behandlet, RNase-fri H20. Andelen af mærket til total RNA forventes at være omkring 2-4% (normalt mere mod den nedre ende), gengivelse ca 2,0 µg af nyligt syntetiserede RNA. Denne mængde er nok til at gøre flere qPCR eksperimenter, samt for microarray-sekventering analyser.

6. RT-qPCR validering af de forskellige fraktioner

  1. Syntetisere cDNA fra 2 µg af total RNA eller 10 µL af mærket RNA ved hjælp af tilfældige hexamers og reverse transkriptase valg, ifølge producentens anvisninger (Tabel af materialer).
  2. Forstærke cDNA ved real-time qPCR ved hjælp af en standardprotokol (Tabel af materialer).
    Bemærk: Alle prøver skal køres i tre eksemplarer fra mindst to biologiske replikater. Rette alle rå værdi for udtryk for S. pombe tubulin.

7. Microarray hybridisering

  1. Krydse RNA prøver på foretrukne microarray chips ifølge producentens anvisninger (for denne specifikke protokol, se Tabel af materialer). Kort, forberede biotinylated cRNA mål fra 150 ng af RNA ved hjælp af Premier RNA forstærkning Kit (Table of Materials), ifølge producentens anvisninger. Krydse 4 mg af fragmenterede cRNAs for 16 h ved 45 ° C og 60 rpm microarray chips.
  2. Vask, pletten, og scanne chips ved hjælp af de angivne station og scanner (Tabel af materialer). Uddrag de rå data (CEL intensitet filer) fra scannede billeder ved hjælp af kommandokonsollen (AGCC, version 4.1.2).
  3. Yderligere behandle CEL filer med udtryk konsollen softwareversion 1.4.1 til beregning af sonden sat signal intensiteter, ved hjælp af statistik-baserede algoritmer MAS 5.0 med standardindstillingerne og global skalering som normalisering metode.
    Bemærk: Trimmet gennemsnit target intensiteten af hver chip var vilkårligt angivet til 100. Udføre alle eksperimenter ved hjælp af mindst to uafhængige biologiske replikater. Normalisere rådata til S. pombe signal og beregne fold ændringer i samlede og nyligt syntetiserede RNA niveauer.

8. dataanalyse ved hjælp af en eksisterende R Pipeline

  1. Beregne syntese og henfald priser ved hjælp af en rørledning og R/Bioconductor pakke offentligt tilgængelige, som tidligere beskrevet8,10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når du udfører metaboliske mærkning af nyligt transskriberede RNA, flere aspekter skal kontrolleres: tid og effektivitet mærkning, spike-i andelen, udvinding protokol og biotinylation effektivitet (herunder signal-støj-forhold), blandt andre. Disse betingelser har været omfattende og metodisk vist af andre7,10,11. Her fokuserer vi hovedsageligt på fortolkning og umiddelbar analyser, der kan udføres, når prøverne er blevet behandlet, enten af RT-qPCR, microarray eller sekvensering. Analyser af forskellige mutantstammen demonstrere magt af metoden til at registrere ikke blot en dramatisk globale fald i mRNA syntese, som i tilfælde af SAGA mutant S. cerevisiae stammer, men også en meget mild reduktion af RNA polymerase II aktivitet på undertrykkelse af Histon H2B monoubiquitination.

Vores analyser af SAGA enzymaktiviteter foreslog en bred rekruttering til kromatin15, som ikke blev afsløret af analysen af steady-state mRNA niveauer i SAGA mutantstammen. Som RNA polymerase II rekruttering blev nedsat efter SAGA inaktivering, besluttede vi at analysere om mRNA syntese satser berøres globalt. Derfor, wild-type eller mutant S. cerevisiae stammer blev udsat for 4tU for en 6 min periode, at mærke nyligt transskriberede RNA'er. Efter blanding med spike-i mærket celler (S. pombe) i en del af 3:1, total RNA blev udvundet, og nyligt syntetiserede RNA var biotinylated og renset efter protokol præsenteres her, som i chronogram vist i figur 1. Mærket RNA'er blev renset fra i alt 200 µg af RNA, at sikre, at mængden af renset produkt ville være tilstrækkelig for enhver downstream ansøgning. Som et indledende og systematisk skridt før enhver genome-wide analyse, blev nyligt syntetiserede RNA oprensning valideret af RT-qPCR. Gener var udvalgt efter forskellige parametre, herunder et niveau af udtryk, regulerende veje og en afhængighed af forskellige RNA polymeraser.

For at bekræfte, at denne protokol specifikt renser mærket RNA, kvantificeres vi niveauer af udskrifter i brøkdele renset fra wild-type celler, der var kulturperler med eller uden 4tU. Ubetydelig baggrundsværdier for de analyserede RNA'er blev opdaget fra celler, der ikke var udsat for 4tU (figur 2A). Nyligt transskriberede RNA oprensning var yderligere valideret af den observerede berigelse af den der indeholder intron Akt1 pre-mRNA (data ikke vist). Efter validering af kvaliteten af prøverne, vi har testet om mRNA syntese ville blive berørt ved sletning af SPT20, som er kendt for at forstyrre den SAGA komplekse forsamling. Som rapporteret af andre, afslørede mRNA kvantificering udføres på samlede (steady state) RNA fra spt20Δ stamme for det meste uændret eller mildt reducerede niveauer for de testede gener (figur 2B). Lignende resultater blev opnået for stammer slettet for BRE1 (figur 2B). Derimod analyse af nyligt transskriberede RNA fra spt20Δ stamme afslørede et dramatisk fald i mRNA syntese af tre-til femdoblet for alle testet gener (figur 2C). Tabet af Bre1 førte til en mere diskret, men stadig synligt fald i nyligt syntetiserede mRNA niveau for de studerede gener (figur 2C). I god aftale med en rolle af SAGA og Bre1 i RNA polymerase II transskription, tab af enten Spt20 eller Bre1 ikke påvirkede udtrykket af gener, RDN25 eller snR6 , transskriberet af RNA polymerase jeg og RNA polymerase III, henholdsvis ( Figur 2C).

Dog vises stammer slettet for strukturelle underenheder af SAGAEN kompleks, som SPT7 eller SPT20, svær langsom vækst fænotyper, der eventuelt tegner sig for de observerede transcriptional ændringer. For at udelukke uønsket sekundære virkninger, vi betinget forarmet Spt7 fra kernen, ved hjælp af anker-lager S. cerevisiae stammer14,24. Efter 60 min af rapamycin behandling, før pulsen-mærkning med 4tU (Se figur 1 for en skematisk fremstilling), nyligt transskriberede mRNA niveauer blev reduceret til en lignende omfang som observeret i sletning stamme (figur 2D og 2E ). Denne analyse, således bekræftet vores tidligere resultater og valideret protokol for denne inducerbar udtynding system. I en tid-kursus analyse, hvor celler blev udsat for rapamycin for en tid der spænder fra 0 til 240 min., blev reducerede udtryk dokumenteret umiddelbart efter 15 min af eksponering for stoffet. Mere interessant, steady-state mRNA niveau tendens til i første omgang mindske men vendte tilbage til normale niveauer efter 60 min, en angivelse af at en kompenserende mekanisme finder sted i mellemtiden (figur 2E).

Helt, mærkning og kvantificering af nyligt syntetiserede RNA tilladt afslører nye lovgivningsmæssige roller for SAGA-komplekset. Den beskrevne protokol kan også afsløre moderat effekter på RNA polymerase II aktivitet og blev med succes anvendt til betinget udtynding gærstammer.

En af de efterfølgende applikationer for den renset nyligt syntetiserede RNA er en genome-wide kvantificering af udskrifter ved hjælp af microarray hybridisering eller sekventering (4tU-seq). Mens høj overførselshastighed sekventering er mere kvantitative, følsomme og informative, kan microarray hybridisering være meget nyttigt at fastslå, om de globale mRNA niveau er ændret. I denne sammenhæng, hvor normalisering er afgørende, tilføjet vi en spike-i organismen til stikprøven, og som vi har til formål at analysere. Specifikt, blandet vi S. cerevisiae celler til S. pombe celler i forholdet 3:1, begge er tidligere udsat for 4tU. Når renset, mærket RNA'er udsættes for høj overførselshastighed sekventering, enhver standard biblioteket forberedelse protokollen kan bruges, oftest efter ribosomale RNA nedbrydning. Normalisering mellem 4tU-seq data fra forskellige prøver er udført ved at tilføje enten mærket RNA fra en forskellige arter (dvs. blanding S. cerevisiae og S. pombe celler som ovenfor)22 eller in vitro- transskriberet, thiolated spike-i RNA12,25,26,27. Kommercielt tilgængelige microarray chips indeholder sonder til den hele transkriptom af både spirende og fission gær, at kvantificeringen af mRNA fra begge organismer i én enkelt eksperiment. Microarray hybridizations blev udført med total og nyligt syntetiserede RNA valideret af RT-qPCR som anført ovenfor (wild-type, spt20Δ og bre1Δ). Derudover indgår vi en stamme, der ikke understøtter monoubiquitination af Histon H2B, gennem punkt mutation af ubiquitinable rester (K123R). Fordi den præcise samme andel af S. pombe celler blev brugt i forskellige prøver og replikater, det er muligt at skalere lineært igen arrays' intensiteter således at den samlede og mærket S. pombe sonder har samme median intensitet. Denne normalisering, eller rescaling, kan udføres ved hjælp af en Bioconductor pakke udviklet af laboratoriet af Patrick Cramer og bruges parallelt i alle analyserede prøver, samlede og mærket brøker og wild-type og mutanter stammer8. Kort, input af denne rørledning er en Excel-fil, der indeholder sonderne og deres intensitet (MAS5 eller RMA) for alle de prøver og brøker. Efter undtagen sonder, der er uden for rækkevidde af påvisning, er signal intensitet reskaleres, under hensyntagen til intensitetsværdierne af S. pombe sonder. Endelig, kan du knytte sonderne til spirende og fission gær genomer, slutter med en matrix, der indeholder udtrykket værdierne normaliseres til spike-i. Disse værdier kan være yderligere forarbejdes (se næste afsnit) eller anvendes som er. I følgende eksempel er vi fast besluttet på folden ændring af hver udskrift mellem mutanten og vildtype stamme.

Analyser blev udført for begge steady-state eller nyligt syntetiserede niveauer af RNA og plottes i deres statistiske signifikans (p-værdi) (figur 3). I samarbejde med andre undersøgelser, når total RNA niveauer blev analyseret, kun et par gener havde deres udtryk ændres, enten op- eller downregulated (figur 3A-3 C). Men analysen af nyligt transskriberede RNA førte til påfaldende forskellige konklusioner. De nyligt transskriberede mRNA niveauer af mere end 4.000 gener blev væsentligt reduceret med mindst dobbelt på sletning af SPT20, hvilket tyder på en global positiv effekt af SAGA på RNA polymerase II transskription i spirende gær (figur 3D ). Derudover i bre1Δ og K123R mutanter, resultaterne var mere diskret: de fleste gener syntes at have deres udtryk, reduceret, men omfanget af downregulation og antallet af væsentligt berørt gener (≈ 300-500) var faktisk mere Limited (figur 3E og 3F).

Som tidligere nævnt, steady-state eller samlede niveauer af mRNA er dikteret af den stramme ligevægt mellem syntese og nedbrydning (figur 4A). Når RNA-polymerase II transskription er globalt nedsat, to scenarier kan være afbilledet: (i) enten den samlede mRNA niveau falde globalt, som en reaktion på reduceret syntese, men konstant forfald, eller (ii) mRNA nedbrydning er faldet i samme omfang, resulterende i uændret for det meste steady-state mRNA niveau. Det andet scenarie er blevet rapporteret for flere forhold, herunder i forbindelse med SAGA eller TFIID forstyrrelser9,10,14,16,22. En procedure kaldet sammenlignende dynamisk transkriptom analyse (cDTA) baseret på 4tU mærkning og dynamisk kinetic modellering tillader os at bestemme mRNA syntese og udlede henfald satser for hver udskrift8,10. Igen, tog vi fordel af data indsamlet for de tidligere nævnte stammer (wild-type, spt20Δ, bre1Δ og K123R). Som forventet, ved sletning af SPT20, bemærkede vi et samtidigt fald i mRNA syntese og nedbrydning priser sammenlignet med vildtype stamme. I denne mutant stamme, erstatningen var næsten optimal, med gennemsnitligt fald i syntesen af 3.8-fold og gennemsnitligt fald i henfald af 4.1-fold (fig. 4B), bekræfter hvorfor kun begrænset transcriptional ændringer kunne være fundet på samlede mRNA niveau (fig. 3A). I de to andre mutantstammen (bre1Δ og K123R), ledsagende ændringer i mRNA syntese og forfald blev også observeret, men ændringerne var i meget mindre målestok og mere spredt (figur 4 c og 4 D).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk fremstilling af den metaboliske mærkning af RNA ved hjælp af 4tU. Frisklavede 4tU er tilføjet til substratet og celler er mærket for 6 min. mærket S. cerevisiae og S. pombe celler er blandet i forholdet 3:1 og total RNA er udvundet. Bagefter, nyligt syntetiserede RNA er biotinylated og kan renses ved hjælp af streptavidin-belagt magnetiske perler. Endelig, i alt (steady state) RNA og mærket nyligt syntetiserede RNA kan bruges i en lang række downstream applikationer, herunder RT-qPCR og microarray hybridisering eller sekvensering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Analyse skildrer transcriptional ændringer i både steady-state og nyligt transskriberet RNA bestemmes af RT-qPCR. (A) RNA niveau af fem forskellige gener var kvantificeres fra mærket RNA brøken renset fra wild-type celler, der var enten udsatte eller ikke at 4tU. De næste to paneler viser (B) samlede og (C) syntetiserede nyligt RNA kvantificering af RT-qPCR for wild-type (WT), spt20Δ og bre1Δ gærceller. Spt7 anker-lager stammer, ubehandlet eller behandlet med rapamycin for 60 min, blev mærket med 4tU, og (D) total eller (E) nyligt transskriberet RNA var kvantificeres ved RT-qPCR. (F) dette panel viser tidsforløb analyse af ændringer i steady-state og nyligt syntetiserede mRNA ved Spt7 nukleare udtynding. For alle prøver, var mRNA niveau for fem RNA polymerase II gener kvantificeres ved RT-qPCR. RNA-polymerase jeg og RNA polymerase III gener (RDN25 og snR6, henholdsvis) blev brugt som kontrol. Udtrykket værdier (mener ± SD af tre uafhængige eksperimenter) var normaliseret til den spidse i S. pombe signal og indstillet til 1 i kontrolprøve. Paneler D-F er blevet ændret fra Baptista et al. 14. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Genome-wide analyser af mRNA niveauer ved hjælp af samlede eller mærket RNA fraktioner. Disse paneler viser vulkan observationsområder viser fold ændringer i (A-C) steady-state mRNA niveau eller (D-F) nyligt syntetiserede mRNA niveau i forhold til deres betydning (p-værdi). Fold ændringer (FC) blev beregnet som forholdet mellem udtryk værdien af hvert gen log2 efter normalisering S. pombe signalet i (A og D) spt20Δ, (B og E) bre1Δ, eller () C og F) K123R stamme versus udtryk værdien af samme gen i wild-type S. cerevisiae. Ialt 5,385 gener blev analyseret, og tærskler for dobbelt ændre (blå prik: mere end en dobbelt formindske; gule prikker: mere end en dobbelt stigning) og 0,05 p-værdier blev anset. Paneler A og D er blevet ændret fra Baptista et al. 14. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Parallelle ændringer i mRNA syntese og mRNA henfald resultater i mRNA buffering. (A) dette panel viser en skematisk gengivelse af resultatet af RNA syntese undertrykkelse af netbårne på steady-state RNA niveauer. (B-D) Disse paneler viser beregningen af mRNA syntese og henfald priser fra analyser af total og nyligt syntetiserede RNA. Syntese og nedbrydning priser blev fastsat for hver S. cerevisiae udskrift i (B) spt20Δ, (C) bre1Δ og (D) K123R. Ændringer (beregnet som log2 af forholdet mellem mutant og wild-type) i syntese satser var plottes ændringer i forfald priser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens genome-wide værktøjer til at analysere ændringer i transskription bliver stadig bedre, kan den eneste analyse af transkriptom gennem kvantificering af steady state niveauer af RNA ikke præcist afspejler ændringer i RNA polymerase II aktivitet. Faktisk, mRNA niveauer er reguleret af RNA syntese, men også af deres modning og nedbrydning. For at måle mRNA syntese sammenkædet fra mRNA nedbrydning, er adskilte protokoller blevet udviklet i de seneste år til analyse af spirende transskription i både gær og pattedyr.

En af de mest udbredte protokoller til kvantificering af spirende transskription er GRO-seq1. Mens GRO-seq's største fordel er dens evne til at afsløre transcriptionally engagerede og aktive polymerase i høj opløsning og lav baggrund, det har to forskellige punkter, der sænker sin tiltrækningskraft: (i) det er teknisk udfordrende og kræver det isolering af kerner og (ii) kerner manipulationer indføre nogle perturbationer til system28. Et andet alternativ er NET-FF., som bygger på sekventering af 3'-ender af udskrifter fremstillet ved immunoprecipitation af den ekstremt stabil ternære komplekse dannet mellem spirende RNA, template DNA og RNA polymerase II. Denne tilgang giver mulighed for karakterisering af spirende RNA'er på basepar beslutning og kan udforske mRNA forarbejdning begivenheder gennem immunoprecipitation af modificerede RNA polymerase II (Serin-5 fosforylering, for eksempel)2,3 , 29. ikke desto mindre, det præsenterer nogle forhindringer, som vi fremhæve tre. Først, mens antistoffer rettet mod RNA polymerase II er normalt meget specifikke, det afhænger af antistof effektivitet. Andet RNA kan være udsat for nedbrydning i perioder, inkubering, hvilket fører os tilbage til det forrige punkt (mindre effektive antistoffer kan kræve længere inkubation times, forlader RNA mere modtagelige for nedbrydning)29. Tredje, og især i pattedyr, den MNase fordøjelse og størrelse udvælgelse kan udelukke entydig tegnsekvens justering29,30.

Her præsenterede vi en detaljeret protokol for den metaboliske mærkning af nyligt syntetiserede RNA ved hjælp af 4tU i S. cerevisiae , der har forskellige fordele i forhold til andre tilgængelige tilgange. Fordi transskription er meget følsomme over for forstyrrelser, bør celler bevares i de mest fysiologiske tilstande. For eksempel, indebærer GRO-seq arrestationen af transcriptionally engageret RNA polymerase II gennem udsættelse af celler/kerner for sarkosyl. Dog er sarkosyl behandling blevet beskrevet som hæmmende af flere cellulære processer11. I dette tilfælde metaboliske mærkning med 4tU eller 4sU i den beskrevne koncentration er ikke-forstyrrende og påvirker ikke synligt celle homøostase, især i korte perioder af eksponering. I modsætning til andre metoder bruger transskription hæmning for at måle mRNA halveringstider, bestemmer cDTA eller 4tU-FF. og montering med dynamisk modellering nedbrydningshastigheder af hver enkelt mRNA i uforstyrrede celler. Dermed kan én enkelt metode samtidig tage fat på både syntesen og henfald satser af den hele transkriptom på en bestemt celletype. Da cDTA eller 4tU-seq tager fordel af meget pålidelige normalisering metoder, nemlig gennem brugen af spike-i kan forskellige DataSet analyseres sammen og en direkte sammenligning. Endelig, metabolisk mærkning og kvantificering af nyligt syntetiserede RNA er en teknik, der let kan implementeres i alle molekylærbiologiske laboratorium, som det ikke kræver nogen specifikke udstyr. Dette forklarer sandsynligvis den temmelig store udbredelse af denne teknik, som har tendens til at blive brugt mere og mere systematisk at udforske RNA produktion og nedbrydning i gær og højere eukaryoter.

RNA kan mærkes i levende celler ved hjælp af andre nucleoside analoger, nemlig 5-bromouridine (BrU)31,32 eller 5-ethynyluridine (EU)33,34. Isolering af BrU pulse-mærket RNA er afhængig af anti-BrdU antistof rensning, som kan have forskellige effektivitetsgevinster mellem eksperimenter. EU-mærket RNA kan kovalent konjugeret med biotin ved hjælp af klik kemi fører til en ikke-reversibel konjugation i modsætning til thiol ændring, som kan vendes med reduktionsmiddel. BrU og EU mærkning har været brugt i pattedyrceller at fastslå genome-wide RNA henfald priser31,32 eller at vurdere spirende RNA syntese34,35. Men BrU eller EU mærkning er ikke blevet beskrevet i S. cerevisiae. Faktisk, optagelse af nucleoside analoger kræver udtryk af nucleoside transporter, og således disse metoder vises mindre fleksibel i spirende gær end mærkning med 4tU.

Varigheden af 4tU mærkning kan tilpasses og varierer afhængigt af spørgsmålet. Ved vurderingen af mRNA syntese i S. cerevisiae, en kort mærkning puls på 6 min. sikrer, at er de nyligt transskriberede mRNA niveauer minimalt berørt af RNA nedbrydning. I betragtning af at den mellemliggende tid før den modificerede nukleotid kan indarbejdes i den spirende RNA er mindre end 1 min, garanterer denne 6-min mærkning varighed, at et rimeligt beløb af nyligt syntetiserede RNA kan blive renset. Sådan protokol, som defineret af Miller et al. 11, har været brugt i forskellige S. cerevisiae mutanter at afsløre globale ændringer i mRNA syntese og RNA henfald9,10,22,26,27, 36. en længere mærkning varighed (3 h) blev brugt i en metabolisk pulse-chase mærkning med 4tU for at bestemme henfald satser for alle mRNAs i S. cerevisiae12. Endelig, ekstremt korte (fra 1,5 min) 4tU mærkning er blevet brugt til at undersøge RNA forarbejdning kinetik i spirende og fission gær13,25,37.

Denne metode har imidlertid visse begrænsninger, som de relativt lavt udbytte af mærket RNA tilbagebetalt i slutningen af den hele protokol. Mens i gær, der er ingen begrænsning i udgangsmaterialet, og dette kan være et problem, når du analyserer metazoan celler, specielt hvis denne protokol er at være udnyttet in vivo. En af de begrænsende trin i protokollen er biotinylation af mærket RNA pool, hvis effektivitet er langt fra komplet og blev anslået til at ændre en ud af tre 4sU rester i mærket RNA5. Det for nylig viste, at brugen af methanethiosulfonate (MTS)-biotin, i stedet for biotin-HPDP, øger udbyttet af gendannede RNA38. Men ifølge ikke-offentliggjorte resultater fra denne forskningsgruppe og resultater fra Rutkowski og Dölken, MTS-biotin er ikke fuldt thiol-specifikke, førende til rensning af umærket RNA, som er særligt problematisk, når lavt beløb af mærket RNA er renset39. En anden begrænsning af den metaboliske mærkning ved hjælp af 4tU/4sU er den iboende hastighed på hvilke RNA polymerase elongates. Den gennemsnitlige hastighed for RNA polymerase II blev anslået til at være ca 3,5 kb/min.40,41,42. Derfor vil polymerasen i en 6 min mærkning, har kapacitet til at transskribere 15 – 20 kb. Således, i et eksperiment med en kort puls-mærkning med 4tU/4sU, kun 3' ende del af nyligt transskriberede RNA er mærket, mens regionerne 5' enden blev præ-eksisterende før tilsætning af 4tU/4sU. Således, rensning af mærket RNA'er også beriger allerede eksisterende 5' ender af udskrifter, især for lange udskrifter som i pattedyrsceller. For at overvinde denne skævhed i en raffineret protokol kaldet TT-FF., er den ekstraherede mærket RNA fragmenteret ved hjælp af sonikering inden rensning af nyligt syntetiserede arter43.

Helt, 4tU-seq er en glimrende måde at adresse transcriptional ændringer i en given kontekst. Ikke desto mindre, og mens protokollen er forholdsvis enkel, det består af flere forskellige trin, der i sidste ende relativt omfattende. Først og fremmest, da denne protokol håndterer RNA fra start til slut, er det obligatorisk at alle de krav, der er nødvendige for en ren og nedbrydning-gratis prøve er opfyldt. Derfor, alle reagenser skal være fri for RNase, og alle materialer skal være dedikeret til at manipulere RNA, rengøring alt grundigt og regelmæssigt med RNase dekontaminering løsning. For det andet, mens biotin reaktion er meget specifikke, overskud af biotin-HPDP, der ikke reagerede bør fjernes fra prøven (for at undgå mætningen af streptavidin perler med biotin, der ikke er kovalent bundet til RNA, for eksempel). Tredje, som beskrevet i protokollen, anvendelsen af de angivne streptavidin-belagt magnetiske perler er stærkt anbefales, da det flere forskergrupper har vi talte at have alle viste at disse perler ført til lavere baggrundsværdier. Fjerde, passende kvalitet og eksperimenterende kontrol bør anvendes. Omfatte prøver afledt af celler, der ikke var udsat for 4tU/4sU. Disse prøver vil være af stor værdi for adresse baggrundsniveauer og for at sikre, at under eksperimentet, en forurening med ikke-mærket RNA forekommer ikke. Også, en anden glimrende alternativ til at teste, om prøven er beriget for nyligt syntetiserede RNA er at udføre en RT-qPCR ved hjælp af primere mod en intro-holdige genet. Primere bør supplere de 3' enden og 5' enden af to på hinanden følgende exon og intron, eller vice versa. Endelig, før sekventering af microarray hybridisering, validere prøver af RT-qPCR. For dette, bør forskellige gener med forskellige niveauer af udtryk og regulering valgt og analyseret. Optimalt, skal dette udføres for de to forskellige fraktioner af RNA (steady-state og nyligt syntetiserede RNA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Laszlo Tora for hans støtte og V. Fisher, K. Schumacher og F. El Saafin for deres drøftelser. T.B. blev støttet af et Marie Curie-ITN fellowship (PITN-GA-2013-606806, NN-NET) og Fondation ARC. Dette arbejde blev støttet af midler fra den Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Denne undersøgelse blev også støttet af ANR-10-LABX-0030-INRT, en fransk statens fond forvaltet af Agence Nationale de la Recherche under ramme program Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Tags

Adfærd spørgsmål 140 S. cerevisiae RNA transskription syntetiserede nyligt RNA 4-thiouracil RNA polymerase II SAGA komplekse
<em>Saccharomyces cerevisiae</em> Metaboliske mærkning med 4-thiouracil og kvantificering af nyligt syntetiserede mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baptista, T., Devys, D.… More

Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter