Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metaboliska märkning med 4-thiouracil och kvantifiering av nyligen syntetiseras mRNA som en Proxy för RNA-polymeras II aktivitet

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57982
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

Protokollet beskrivs här baseras på genome-wide kvantifiering av nyligen syntetiserade mRNA renas från jästceller märkta med 4-thiouracil. Denna metod gör det möjligt för att mäta mRNA-syntesen bortkopplat mRNA förfall och ger således en exakt mätning av RNA-polymeras II transkription.

Abstract

Globala defekter i RNA-polymeras II transkription kan vara förbises av transcriptomic studier analysera steady state RNA. Den globala minskningen av mRNA-syntesen har faktiskt visat sig kompenseras av en samtidig minskning av mRNA nedbrytning att återställa normala steady state nivåer. Genome-wide kvantifiering av mRNA-syntesen, oberoende av mRNA förfall, är därför den bästa direkt återspegling av RNA-polymeras II transkriptionell aktivitet. Här diskuterar vi en metod med icke störande metabola märkning av begynnande RNAs i Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifikt, cellerna odlas för 6 min med en uracil analoga, 4-thiouracil, och märkt nyligen transkriberas RNASEN är renat och kvantifieras för att fastställa de syntes av alla enskilda mRNA. Dessutom använder märkt Schizosaccharomyces pombe celler som intern standard gör det möjligt att jämföra mRNA syntes i olika S. cerevisiae stammar. Använder det här protokollet och passande data med en dynamisk kinetiska modell, kan de motsvarande mRNA decay priserna fastställas.

Introduction

Celler svarar på endogena och exogena ledtrådar, genom dynamisk ändring av deras gen uttryck program. Under senare år har tillåter en enorm utveckling av genome-wide metoder den exakt och övergripande beskrivningen av transkriptom förändringar i olika förhållanden. I de flesta transcriptomic studier, microarray hybridisering eller hög genomströmning sekvensering för att kvantifiera RNA-nivåer från en total steady state RNA bråkdel. Transkriptionell förändringar under en specifik störning kan visa ett brett spektrum av möjliga utfall, med antingen specifik gen uttryck ändringar eller ett stort spektrum av gener som antingen upp - eller nedreglerade. Genernas uttryck är resultatet av en finjusterad jämvikt — eller steady state — mellan RNA-syntes av RNA polymeraser och andra processer som påverkar RNA-nivåer. RNA-polymeras II transkription, inklusive dess tre olika faser (initiering, töjning och uppsägning), är mycket och intrikat associerad med mRNA bearbetning, cytoplasmiska export, översättning och nedbrytning.

Flera nyare studier visat att mRNA-syntesen och förfall är kopplat mekanismer och visade att transkriptionell effekter vid mutation eller under stimuli kan förbises när kvantifiera totala steady state RNA. Först, detektion av transkriptionell förändringar genom analyser av steady state nivåer av mRNA alltid beror på mRNA halveringstid. När störning introduceras, påverkas steady-state nivåerna av mRNA med långa halveringstider mycket mindre än de av mRNA med kort halveringstid. Därför är upptäcktsrisken förändringar i RNA-syntes starkt partisk till förmån för kortlivade avskrifter, medan analysen av hållbarare mRNA arter kan misslyckas att påvisa dynamiska förändringar i priset för transkription. För det andra, flera rapporter har visat att både i jäst och däggdjur, kan globala förändringar i transkription förbises när man analyserar steady-state nivåerna av mRNA. Detta beror sannolikt på de mekanismer som länk mRNA syntes och nedbrytning resulterar i mRNA buffring. Detta föranledde utvecklingen av nya protokoll att kvantifiera mRNA-syntesen bortkopplat nedbrytning, genom analys av nyligen transkriberas mRNA. Under senare år har har flera alternativ lagts fram, inklusive globala kör sekvensering (GRO-seq)1och infödda töjning avskrift sekvensering (NET-seq)2,3. Här presenterar vi ett protokoll från början utvecklades i däggdjursceller4,5,6 och sedan anpassas till jäst7,8,9,10, 11, som är baserad på RNA märkning med en thiolated nukleosid eller bas analog, 4-thiouridine (4sU) eller 4-thiouracil (4tU), respektive.

Denna metod renar specifikt nyligen transkriberade RNA från celler i vilka RNA är pulse-märkt med 4sU i princip ingen störning i cell homeostas. Därför, när celler utsätts för 4sU, molekylen är snabbt uptaken, fosforyleras till 4sU-trifosfat och införlivas i RNAs transkriberas. När puls-märkt, det är möjligt att extrahera totala cellulära RNA (motsvarande steady state nivåer av RNA), och, därefter, den 4sU-märkt RNA fraktionen är thiol-specifikt ändras, vilket leder till bildandet av en disulfide bond mellan biotin och Nyligen transkriberade RNA4,5. 4sU kan dock endast uptaken av de celler som uttrycker en nukleosid transportör, som mänsklig equilibrative nukleosid transportören (hENT1), förhindra dess omedelbar användning i spirande eller fission jäst. Medan en kunde uttrycka hENT1 i S. pombe eller S. cerevisiae, kan ett enklare förhållningssätt uppnås med den modifierade bas 4tU, eftersom jästcellerna kan 4tU, utan behov av uttryck för en nukleosid transportör10, 11 , 12 , 13. I själva verket metabolismen av 4tU kräver aktiviteten av enzymet uracil phosphoribosyltransferase (UPRT). I flera organismer, inklusive jäst men inte däggdjur, är UPRT avgörande för en pyrimidin bärgning väg, återvinning uracil till uridin monofosfat.

En viktig partiskhet i transcriptomic studier kan införas genom normalisering mellan olika prover analyseras parallellt. Faktiskt, många avvikande faktorer kan påverka den jämförande analysen av transkriptom mutant och vildtyps-stammar: effektiviteten av cellys, skillnader i utvinning och återvinning av RNA, och avvikelser i scanner kalibrering för microarray-analyser , bland annat. Som diskuterats ovan, kan sådana variationer vara särskilt vilseledande när globala effekter på RNA-polymeras II transkription förväntas. En elegant menar att noggrant jämföra mRNA syntes priser mellan olika prover utformades med avlägset besläktade fission jästen Schizosaccharomyces pombe som intern standard. För att ett fast antal märkt S. pombe celler läggs till S. cerevisiae proverna, antingen vildtyp eller muterade celler, före cell lysis och RNA extraktion10. Därefter är både steady-state och nyligen syntetiserade RNAs från S. pombe och S. cerevisiae kvantifierade antingen genom RT-qPCR eller via användning av microarray chips eller hög genomströmning sekvensering10. Kombinera dessa data med kinetic modellering, kan absoluta priser av mRNA-syntesen och förfall i spirande jäst mätas.

Inom ramen för detta manuskript, kommer vi att visa hur analysen av nyligen transkriberade RNA tillåtet för att avslöja en global roll för de coactivator komplex SAGA och TFIID i RNA-polymeras II transkription i spirande jäst14,15, 16. Ännu viktigare, tidigare studier kvantifieras steady state mRNA nivåer i S. cerevisiae och föreslog att SAGA spelar en dominerande funktion på en begränsad uppsättning jäst gener som är starkt påverkade av mutationer i SAGA men relativt resistenta mot TFIID mutationer17,18,19. Överraskande, visades SAGA enzymatiska aktiviteter att agera på hela transkriberas genomet, vilket tyder på en bredare roll för detta samarbete aktivator i RNA-polymeras II transkription. Minskad RNA-polymeras II rekrytering på mest uttryckt gener observerades vid inaktivering av SAGA eller TFIID, vilket tyder på att dessa coactivators fungerar tillsammans på de flesta gener. Kvantifiering av nyligen transkriberas mRNA avslöjade därför att SAGA och TFIID är nödvändiga för transkriptionen av nästan alla gener RNA-polymeras II14,15,16. Genomförandet av kompensationsmekanismer framstår som ett sätt för cellerna att klara av en global minskning av mRNA-syntesen som buffras av en samtidig global minskning av mRNA nedbrytning. SAGA läggs till i listan av faktorer som har en global inverkan på RNA-polymeras II transkription, såsom RNA Pol II subenheter10, medlare coactivator komplexa20och allmänna transkription faktorn TFIIH21,22 , och indirekt, element av mRNA nedbrytning maskiner9,10,23. Sådana kompenserande händelser observerades allmänt i SAGA mutanter, redovisning för de blygsamma och begränsade förändringarna i steady state mRNA nivåer trots en global och kraftig minskning av mRNA syntes14. Liknande analyser utfördes också i en BRE1 radering stam, vilket resulterar i en fullständig förlust av Histon H2B ubikvitinering. Intressant, kunde en mycket mildare men konsekvent global effekt på RNA-polymeras II transkription detekteras i avsaknad av Bre1, som anger att metabola märkning av nyligen transkriberade RNA i jäst kan detektera och kvantifiera ett brett utbud av förändringar i mRNA syntes priser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell odling och Rapamycin utarmning av en SAGA subenhet

  1. För varje S. cerevisiae stam och replikera Inokulera inklusive vildtyp eller kontroll stammar, en enda koloni från en färsk plattan på 5 mL YPD medium (2% pepton, 1% jästextrakt och 2% glukos).
  2. Odla S. cerevisiae cellerna övernattning på 30 ° C med konstant agitation (150 rpm).
  3. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) och späd kulturen till en OD600 av cirka 0,1 i 100 mL YPD medium och låta det växa fram till OD600 är runt 0,8.
  4. Parallellt Inokulera en enda koloni av S. pombe celler från en färsk platta på 50 mL Ja medium (0,5% jästextrakt; 250 mg/L adenin, histidin, uracil, leucin och lysin; 3% glukos) och odla cellerna övernattning på 32 ° C med konstant agitation (150 rpm).
  5. Mäta den OD600 S. pombe övernattning kultur och späd kulturen till en OD600 av cirka 0,1 i 500 mL Ja medium och låta det växa fram till OD600 är cirka 0,8.
  6. För varje S. cerevisiae ankare-away stam och replikera Inokulera inklusive vildtyp eller kontroll stammar, en enda koloni från en färsk plattan på 5 mL YPD medium (2% pepton, 1% jästextrakt och 2% glukos).
  7. Odla cellerna övernattning på 30 ° C med konstant agitation (150 rpm).
  8. Nästa morgon, mäta OD600, späd kulturen till en OD600 av cirka 0,1 i 100 mL YPD medium och låta det växa tills den OD600≈ 0,8.
  9. Tillsätt 100 µL av rapamycin till kulturen från en stamlösning av 1 mg/mL (slutliga rapamycin koncentrationen 1 µg/ml) och låt cellerna Inkubera vid 30 ° C med konstant agitation för tid som krävs för protein av intresse att vara villkorligt utarmat från den nucleus ( 30 min är vanligen tillräckligt). För kontroll, använder en liknande jästkultur, men istället för att lägga rapamycin, tillsätt motsvarande volym av dimetyl sulfoxid (DMSO).

2. 4tU märkning med S. pombe som en Spike-i (inventering)

  1. Förbered en ny lösning av 2 M 4-thiouracil. När förberett, hålla den i rumstemperatur och bort från ljuset.
    1. Exakt väger 64,1 mg 4-thiouracil för varje S. cerevisiae kultur och lös upp den i 250 µL av dimetylformamid (DMF) eller 250 µL av DMSO.
    2. För S. pombe kulturen som ska användas som spike, väger 320.5 mg för 4-thiouracil och Lös det i 1250 µL av DMSO.
  2. Tillsätt 4-thiouracil lösningen till S. cerevisiae och S. pombe kulturer för en slutlig koncentration på 5 mM och inkubera dem för 6 minuters konstant skakning vid 30 ° C och 32 ° C, respektive.
  3. Efter 6 min, ta bort en liten alikvot av varje kultur för cell inventering. Räkna cellerna med en automatisk cell räknare eller en Neubauer kammare.
  4. Samla in cellerna genom centrifugering (2500 x g) under 5 minuter vid 4 ° C.
  5. Tag bort supernatanten, tvätta cellerna med iskall 1 x PBS och centrifugera igen (2500 x g, 4 ° C, 5 min).
  6. Beräkna det totala antalet celler i varje prov S. cerevisiae och S. pombe .
  7. Att resuspendera cellerna i 5 mL iskallt 1 x PBS och blanda S. cerevisiae med S. pombe celler med förhållandet 3:1.
  8. Centrifugera cellerna (2 500 x g, 4 ° C, 5 min), ta bort PBS, flash-frysa cellerna i flytande N2och lagra provet vid-80 ° C tills vidare användning.

3. RNA-extraktion och DNAS behandling

  1. Tina cellerna på is för cirka 20 – 30 min.
  2. Fortsätt med den RNA-extraktion med en jäst-RNA extraktion kit (Tabell för material) med några anpassningar.
  3. Per varje prov, häll 750 µL av iskall zirkonia pärlor i ett 1,5 mL skruvlock rör levereras med setet. Tänk på att per varje rör, RNA från upp till 109 celler kan effektivt extraheras. Därför förbereda antalet rör behövs för varje prov. Exempelvis en S. cerevisiae kultur 100 ml (OD600≈ 0,8) kan återge cirka 2 x 109 3 x 109 celler, fram till totalt 2,7 x 109 4 x 109 celler totalt (efter spike-modulen med en tredjedel av den S. pombe celler). I detta fall skulle upp till 3-4 reaktionsrören per varje prov/skick/mutant/replikat krävas.
  4. Per varje 1 x 109 celler, lägga till 480 µL av den lyseringsbuffert som medföljer satsen, 48 µL 10% SDS och 480 µL av fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1, v/v/v).
  5. Blanda de celler som använder en vortex mixer och överföra dem till rören som innehåller iskall zirkonia pärlor.
  6. Rymma rören på en vortex mixer adapter, slå virveln med maximal hastighet och slå i 10 min till lyse jästceller (i ett rum vid 4 ° C). Alternativt utföra Lysering av cellerna i en automatisk pärla-visp.
  7. Centrifugera rören vid 16 000 x g i 5 min i rumstemperatur och omsorgsfullt samla den övre fasen (RNA-innehållande fas) till en färsk 15 mL falconrör. Volymen återvinnas per varje rör är vanligtvis runt 500 – 600 µL.
  8. 15 mL rör som innehåller delvis renat RNA, lägga till bindande bufferten som tillhandahålls med kit och blanda noggrant. Per varje 100 µL av RNA lösning, tillsätt 350 µL av bindande buffert (dvsnär vattenfasen lösning volymen är 600 µL, 2,1 mL av bindande bufferten bör läggas).
  9. Till föregående blandningen, tillsätt 100% etanol och blanda noggrant. Per varje 100 µL av RNA lösning, tillsätt 235 µL av 100% etanol (dvs.när vattenfasen lösning volymen är 600 µL, tillsätt 1,41 mL etanol).
  10. Applicera upp till 700 µL av blandningen från steg 3,9 till en filterpatron monteras i en samling tube, både som medföljer kitet.
  11. Centrifugera i 1 minut vid 16 000 x g. Om centrifugering varaktighet inte var tillräckligt för den totala volymen att passera genom filtret, upprepa centrifugeringen för 30 s.
  12. Kassera genomströmmande och återanvända samma samling röret. Lägga till en annan 700 µL av RNA-bindande buffert-etanol lösningen filtret och centrifugera igen vid 16 000 x g i 1 min.
  13. Kassera genomströmmande och upprepa steg 3.11 och 3.12 tills den RNA-lösningen är klar.
  14. Tvätta filtret 2 x med 700 µL av tvättlösningen 1. Samla tvätt lösning via centrifugering vid 16 000 x g i 1 min och alltid hålla samling röret.
  15. Tvätta filtret 2 x med 500 µL av tvätt lösning 2. Samla tvätt lösning via centrifugering vid 16 000 x g i 1 min och alltid hålla samling röret.
  16. Centrifugera rören igen vid 16 000 x g för 1 min helt torka filtret.
  17. Överföra filterpatronen till sista samling röret (RNA-lämpligt rör) och eluera RNA med 50 μl DEPC-behandlad, RNase-fri H2O (förvärmd till 100 ° C).
  18. Centrifugera i 1 minut vid 16 000 x g.
  19. Eluera RNA igen (till en och samma tub) med 50 µL av förvärmd DEPC-behandlad, RNase-fri H2O. se till att alla volymen har passerat genom filtret; Annars, Centrifugera under längre perioder.
  20. Om flera rör för ett enda prov används, pool dem alla i en tub.
  21. Kvantifiera och kontrollera renheten i provet med hjälp av lämplig utrustning.
    Obs: Medan 4tU ingår endast inom nyligen syntetiserade RNA, finns det en chans för mindre kontaminering med DNA. Därför är det alltid klokt att behandla av prov med DNAS jag. För att använda reagenserna som tillhandahålls med RNA-extraktion kit (Tabell för material) efter tillverkarens rekommendationer.

4. thiol-specifika Biotinylation nyligen syntetiserade RNA

  1. Justera det RNA som erhållits med avsnitt 3 i protokollet till 2 mg/mL koncentration. Alikvotens 200 µg totalt RNA, värm den i 10 min vid 60 ° C, och omedelbart chill det på is i 2 min.
  2. Alikvoten som RNA, lägga till de reagens som nämns nedan i följande ordning: 600 μl DEPC-behandlad, RNase-fri H2O, 100 µL av biotinylation buffert (100 mM Tris-HCl [pH 7,5] och 10 mM EDTA, i DEPC-behandlad, RNase-fri H2O) och 200 µL Biotin-HPDP från ett lager av 1 mg/mL biotin-HPDP i DMSO eller DMF.
    1. I vissa situationer tenderar biotin-HPDP lösningen att fällningen, sannolikt på grund av dess låga vattenlöslighet. I det här fallet öka volymen av DMSO/DMF upp till 40% av volymen reaktion (till RNA-prov, tillsätt 400 µL DEPC-behandlad H2O, 100 µL av biotinylation buffert och 400 µL av biotin-HPDP lagervara en 0,5 mg/mL).
  3. Inkubera provet vid rumstemperatur och skyddas från ljus för 3 h, med försiktig skakning.
  4. Efter inkubation, lägga till en ungefär lika stor volym av kloroform i rören och blanda kraftigt.
  5. Snurra provet vid 13 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C. Detta steg kan avlägsnande av överskott biotin som gjorde inte biotinylate RNA. Alternativt utföra detta steg med hjälp av fas-lock rör (tung). För att snurra ner fas-lock rören för 1 min på 13 000 x g, lägga till RNA blandningen och en lika stor mängd kloroform, blanda dem kraftfullt och centrifugera dem 13 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C.
  6. Försiktigt över den övre fasen till nya 2 mL rör.
  7. Lägg till en tiondel av mängden 5 M NaCl och blanda provet.
  8. Tillsätt en motsvarande volym av isopropanol, blanda provet grundligt och spinna vid 13 000 x g i minst 30 min, vid 4 ° C.
  9. Försiktigt avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL iskallt 75% etanol.
  10. Snurra på 13 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C.
  11. Försiktigt bort supernatanten, quick-spin röret, och ta bort återstående etanol lösningen. Kontrollera att RNA pelleten inte torkar.
  12. Avbryta RNA i 100 µL av DEPC-behandlad, RNase-fri H2O.

5. rening av nyligen syntetiserade fraktionen från totalt och omärkt RNA med hjälp av streptividin-belagda magnetiska pärlor

  1. Värm biotinylerade RNA för 10 min vid 65 ° C och sedan chill proverna på is för 5 min.
  2. Tillsätt 100 µL av streptividin-belagda magnetiska pärlor till biotinylerade RNA (på en slutlig volym av 200 µL). Specifikt, rekommenderas det att använda pärlorna anges i Tabell för material, sedan, efter samtal med andra laboratorier, dessa verkade vara mer konsekvent och pålitlig.
  3. Inkubera provet med liten skakning i 90 minuter i rumstemperatur.
  4. Placera de kolumner som medföljer satsen (Tabell för material) i magnetiska monter.
  5. Tillsätt 900 µL av rumstemperatur tvätt buffert (100 mM Tris-HCl [pH 7,5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, och 0,1% Tween-20, i DEPC-behandlad, RNase-fri H2O) till kolumner (pre kör och temperera).
  6. Applicera pärlor/RNA blandningen (200 µL) till kolumner.
  7. Samla genomströmmande i 1,5 mL rör och tillämpa den igen på samma magnetiska kolumn. Om nödvändigt, hålla denna genomströmning eftersom det utgör den omärkta RNA-fraktionen.
  8. Tvätta kolonnerna 5 x med ökande volymer av tvätt buffert (600, 700, 800, 900 och 1000 µL).
  9. Eluera de nyligen syntetiserade RNA med 200 µL 0,1 M DTT.
  10. Utföra en andra eluering, 3 min senare, med en lika stor volym av 0,1 M DTT.
  11. Efter eluering RNA, Lägg 0,1 volymer av 3 M NaOAc (pH 5.2), 3 volymer av iskall 100% etanol och 2 µL av 20 mg/mL glykogen (RNA-grad) och låt den fällning över natten RNA, vid-20 ° C.
  12. Återställa RNA genom centrifugering (13 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C) och återsuspendera det i 15 μl DEPC-behandlad, RNase-fri H20. Andelen märkt-till-totalt RNA förväntas vara omkring 2-4% (vanligtvis mer mot den nedre änden), rendering cirka 2,0 µg nyligen syntetiserade RNA. Denna kvantitet är nog att göra flera qPCR experiment, samt för microarray/sekvensering analyser.

6. RT-qPCR validering av olika fraktioner

  1. Syntetisera cDNA från 2 µg totalt RNA eller 10 µL märkt RNA med hjälp av slumpmässiga hexamers och i omvänt transkriptas val, enligt tillverkarens instruktioner (Tabell för material).
  2. Förstärka cDNA av realtids qPCR använder ett standardprotokoll (Tabell för material).
    Obs: Alla prover bör köras i tre exemplar från minst två biologiska replikat. Korrigera alla rå värden av uttryck för S. pombe tubulin.

7. Microarray hybridisering

  1. Hybridisera RNA prover på Rekommenderad microarray marker enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell av materialför detta specifika protokoll). Kort, förbereda biotinylerade cRNA mål från 150 ng av RNA med hjälp av Premier RNA förstärkning Kit (Tabell för material), enligt tillverkarens instruktioner. Hybridisera 4 mg fragmenterade cRNAs för 16 h vid 45 ° C och 60 rpm på microarray marker.
  2. Tvätta fläcken och skanna marker med hjälp av angivna station och scanner (Tabell för material). Extrahera rådata (CEL intensitet filer) från de skannade bilderna använda kommandokonsolen (AGCC, version 4.1.2).
  3. Bearbeta ytterligare CEL filer med uttrycket konsolen programvaruversion 1.4.1 att beräkna sonden ange signal stödnivåer, med statistik-baserade algoritmer MAS 5.0 med standardinställningarna och globala skalning som normalisering metod.
    Obs: Trimmade genomsnittliga mål intensiteten i varje chip var godtyckligt satt till 100. Utföra alla experiment med hjälp av minst två oberoende biologiska replikat. Normalisera rådata till S. pombe signalen och beräkna fold förändringar i totala och nyligen syntetiserade RNA-nivåer.

8. data analys med hjälp av en befintlig gasledning på R

  1. Beräkna syntes och förfalla priser med en pipeline och R/Bioconductor paket tillgänglig för allmänheten, som tidigare beskrivits8,10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När du utför metabola märkning av nyligen transkriberade RNA, flera aspekter behöver kontrolleras: tid och effektivitet av märkning, spike-i andel, protokollet utvinning och biotinylation effekt (inklusive signal-brus-förhållande), bland andra. Dessa villkor har varit omfattande och metodiskt visas av andra7,10,11. Här fokuserar vi främst på tolkning och omedelbara analyser som kan utföras när proverna har behandlats, antingen genom RT-qPCR, microarray eller sekvensering. Analyser av olika muterade stammar visar kraften av metoden att upptäcka inte bara en dramatisk global minskning mRNA syntes, som i fallet med SAGA mutant S. cerevisiae stammar, men också en mycket mild minskning av RNA-polymeras II aktivitet vid dämpning av Histon H2B monoubiquitination.

Våra analyser av SAGA enzymatiska aktiviteter föreslog en bred rekrytering till kromatin15, som inte avslöjades av analysen av steady state mRNA nivåer i SAGA mutant stammar. Som RNA-polymeras II rekrytering var nedsatt på SAGA inaktivering, beslutade vi att analysera om mRNA syntes priser skulle påverkas globalt. Därför vildtyp eller muterade S. cerevisiae stammar utsattes för 4tU under 6 min, att märka nyligen transkriberas RNAs. Efter blandning med spike-i märkta celler (S. pombe) i en del av 3:1, totalt RNA extraherades, och nyligen syntetiserade RNA var biotinylerade och renas enligt protokollet presenteras här, liksom i den chronogram som visas i figur 1. Märkt RNAs var renat från totalt 200 µg av RNA, säkerställa att mängden renad produkt skulle räcka för alla efterföljande program. Som ett inledande och systematisk steg innan någon genome-wide analys validerades nyligen syntetiserade RNA rening av RT-qPCR. Gener har valts enligt olika parametrar, inklusive en nivå av uttryck, föreskrivande vägar och ett beroende på olika RNA-polymeraser.

För att bekräfta att detta protokoll specifikt renar märkta RNA, kvantifierade vi nivåerna av avskrifter i fraktioner som renats från vildtyp celler som odlades med eller utan 4tU. Försumbar halterna av de analyserade RNAs upptäcktes från celler som inte utsattes för 4tU (figur 2A). Nyligen transkriberade RNA rening validerades ytterligare av observerade anrikningen av intron-innehållande ÄRV1 pre-mRNA (inga data anges). Efter validering av kvaliteten på proven testade vi om mRNA syntes skulle påverkas vid radering av SPT20, som är känd att störa den SAGA komplex sammansättningen. Som rapporterats av andra, visade mRNA kvantifiering utförs på total (steady state)-RNA från den spt20Δ stammen mestadels oförändrad eller milt nedsatt nivåer för de testa generna (figur 2B). Liknande resultat erhölls för stammar tas bort för BRE1 (figur 2B). Däremot analysen av nyligen transkriberade RNA från den spt20Δ stammen visade en dramatisk minskning av mRNA-syntesen av tre-till fivefold för alla testat gener (figur 2C). Förlusten av Bre1 ledde till en mer diskret men ändå synlig minskning nyligen syntetiserade mRNA nivåer för de studera generna (figur 2C). I bra avtal med en roll av SAGA och Bre1 i RNA-polymeras II transkription, förlusten av antingen Spt20 eller Bre1 inte påverkar uttrycket av gener som RDN25 eller snR6 , transkriberas av RNA-polymeras jag och RNA-polymeras III, respektive ( Figur 2C).

Stammar tas bort för strukturella subenheter av SAGA komplex, som SPT7 eller SPT20, visas dock svår långsam tillväxt fenotyper som kan redogöra för de observerade transkriptionell förändringarna. För att utesluta oönskade bieffekter, vi villkorligt utarmat Spt7 från kärnan, med ankare-away S. cerevisiae stammar14,24. Vid 60 min rapamycin behandling, före puls-märkning med 4tU (se figur 1 för en schematisk representation), nyligen transkriberas mRNA nivåer reducerades till en liknande grad som observerats i radering stam (figur 2D och 2E ). Denna analys, alltså bekräftade våra tidigare resultat och validerade protokoll för inducerbara utarmning systemet. I en tid-kursen analys, där celler utsattes för rapamycin för en tid som sträcker sig från 0 till 240 min, var reducerade uttrycket framgår omedelbart efter 15 min exponering för läkemedlet. Mer intressant, steady state mRNA nivåer tenderat att minska initialt men återgick till normala nivåer efter 60 min, en indikation på att en kompenserande mekanism sker under tiden (figur 2E).

Sammantaget tillåtna den märkning och kvantifiering av nyligen syntetiserade RNA avslöjar nya föreskrivande roller för SAGA komplexet. Protokollet beskrivs också kunde avslöja måttliga effekter på RNA-polymeras II aktivitet och var framgångsrikt tillämpas villkorlig utarmning jäststammar.

En av de efterföljande program för renat nyligen syntetiserade RNA är en genome-wide kvantifiering av avskrifter med hjälp av microarray hybridisering eller sekvensering (4tU-seq). Hög genomströmning sekvensering är mer kvantitativa, känslig och informativ, kan microarray hybridisering vara till stor hjälp att avgöra om de globala mRNA nivåerna ändras. I detta sammanhang där normalisering är avgörande, lagt vi en spike-i organismen till provet som vi syftar till att analysera. Specifikt, blandade vi S. cerevisiae celler till S. pombe celler i förhållandet 3:1, båda tidigare utsätts för 4tU. När renat, märkt RNASEN utsätts för hög genomströmning sekvensering, kan standardbiblioteket förberedelse protokoll användas, oftast efter ribosomalt RNA utarmning. Normalisering mellan 4tU-seq data från olika prover har utförts genom att lägga till antingen märkt RNA från olika arter (dvs blandning S. cerevisiae och S. pombe celler som ovan)22 eller in vitro- «««transkriberas, thiolated spike-i RNA12,25,26,27. Kommersiellt tillgängliga microarray chips innehåller sonder för den hela transkriptom av både blivande och fission jäst, tillåter kvantifiering av mRNA från båda organismerna i en enda experiment. Microarray hybridizations utfördes med totalt och nyligen syntetiserade RNA valideras av RT-qPCR som anges ovan (vildtyp, spt20Δ och bre1Δ). Dessutom ingår vi en stam som inte stöder monoubiquitination av Histon H2B, genom punktmutation av ubiquitinable rester (K123R). Eftersom exakt samma andel av S. pombe celler användes i olika prover och replikat, det är möjligt att linjärt skala arrayer intensiteter så att den totala och märkt S. pombe sonder har samma median intensitet. Denna normalisering, eller skalas, kan utföras med ett Bioconductor paket som utvecklats av laboratoriet för Patrick Cramer och används parallellt i alla analyserade prover, totala och märkt fraktioner och vildtyp och mutanter stammar8. Kortfattat, inmatning av denna rörledning är en Excel-fil som innehåller sonderna och deras intensitet (MAS5 eller RMA) för alla prover och fraktioner. Efter exklusive sonder som är utanför intervallet för upptäckt, är signalintensitet skalas, med hänsyn till intensitetsvärden för S. pombe sonderna. Slutligen kan du mappa sonderna till det spirande eller fission jäst, slutar med en matris som innehåller uttrycket värdena normaliseras för spike-modulen. Dessa värden kan vara ytterligare bearbetas (se nästa avsnitt) eller som används som. I följande exempel bestäms vi luckan ändra av varje avskrift mellan mutant och vildtyps-stammen.

Analyserna utfördes för båda steady state eller nyligen syntetiseras nivåer av RNA och plottas mot deras statistisk signifikans (p-värde) (figur 3). Överens med andra studier, när totalt RNA nivåer analyserades, bara några gener hade deras uttryck ändras, antingen upp- eller nedreglerade (figur 3A-3 C). Men analysen av nyligen transkriberade RNA lett till påfallande olika slutsatser. Nyligen transkriberas mRNA nivåer av mer än 4 000 gener minskade signifikant med minst dubbla vid radering av SPT20, vilket tyder på en global positiv effekt av SAGA på RNA-polymeras II transkription i spirande jäst (figur 3D ). Dessutom i bre1Δ och K123R mutanter, resultaten var mer diskret: de flesta gener tycktes ha deras uttryck som minskat, men omfattningen av nedreglering och antalet betydligt påverkade gener (≈ 300-500) var faktiskt mer begränsad (figur 3E och 3F).

Som tidigare nämnts, steady state eller totala nivåer av mRNA dikteras av snäva jämvikten mellan syntes och förfall (figur 4A). När RNA-polymeras II transkription är globalt nedsatt, två scenarier kan vara bilden: (i) antingen totala mRNA nivåer minska globalt, som ett svar på minskad syntes men konstant förfall, eller (ii) mRNA nedbrytning är minskat i samma utsträckning, resulterande mestadels oförändrat steady state mRNA nivåer. Det andra scenariot har rapporterats för flera villkor, inklusive i samband med SAGA eller TFIID störningar9,10,14,16,22. En procedur som kallas komparativ dynamiska transkriptom analys (cDTA) utifrån 4tU märkning och dynamiska kinetiska modellering tillåter oss att bestämma mRNA-syntesen och härleda de förfalla priserna för varje avskrift8,10. Återigen, drog vi fördel av de insamlade för de tidigare nämnda stammarna (vildtyp, spt20Δ, bre1Δ och K123R). Som förväntat, vid radering av SPT20, observerat vi en samtidig minskning av mRNA syntes och nedbrytning priser i jämförelse med vildtyp stammen. I denna mutant stam, ersättningen var nästan optimal, med en genomsnittlig minskning av syntes av 3.8-fold och en genomsnittlig minskning av förfalla av 4.1-fold (figur 4B), bekräftar varför endast begränsade transkriptionell förändringar skulle kunna upptäckts på totalt mRNA nivåer (figur 3A). I de två andra muterade stammarna (bre1Δ och K123R), observerades också samtidig förändringar i mRNA-syntesen och förfall, men ändringarna var i mycket mindre skala och mer spridda (figur 4 c och 4 D).

Figure 1
Figur 1 : Schematisk framställning av metabola märkning av RNA som använder 4tU. Nylagade 4tU läggs till odlingsmediet och celler är märkta för 6 min. märkt S. cerevisiae och S. pombe cellerna blandas i förhållandet 3:1 och total-RNA utvinns. Efteråt, nyligen syntetiseras RNA är biotinylerade och kan renas med hjälp av streptividin-belagda magnetiska pärlor. Slutligen, total (steady state) RNA och märkt nyligen syntetiserade RNA kan användas i en mängd nedströms tillämpningar, inklusive RT-qPCR och microarray hybridisering eller sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Analys som skildrar transkriptionell förändringar i båda steady-state och nyligen transkriberade RNA bestäms av RT-qPCR. (A), RNA nivåer av fem olika gener kvantifierades från den märkta RNA fraktionen renas från vildtyp celler som var antingen utsatta eller inte 4tU. De nästa två panelerna visar (B) total och (C) syntetiseras nyligen RNA kvantifiering av RT-qPCR för vildtyp (WT), spt20Δ och bre1Δ jästceller. Spt7 ankare-away stammar, obehandlade eller behandlade med rapamycin för 60 min, var märkt med 4tU och (D) totalt eller (E) nyligen transkriberade RNA kvantifierades genom RT-qPCR. (F) panelen visar tid-kursen analys av förändringar i steady-state och nyligen syntetiseras mRNA vid Spt7 nukleära utarmning. För alla prover kvantifierades mRNA nivåer för fem RNA-polymeras II gener av RT-qPCR. RNA-polymeras jag och RNA-polymeras III gener (RDN25 och snR6, respektive) användes som kontroll. Uttryckets värden (genomsnitt ± SD av tre oberoende experiment) var normaliserade till den spetsade-i S. pombe signal och ange 1 i referensprovet. Paneler D-F har ändrats från Baptista o.a. 14. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Genome-wide analys av mRNA nivåer med totalt eller märkt RNA bråkdelar. Dessa paneler Visa vulkanen tomter visar vik förändringar i (A-C) steady state mRNA nivåer eller (D-F) nyligen syntetiseras mRNA nivåer i förhållande till deras betydelse (p-värde). Fold ändringarna (FC) beräknades som log2 av förhållandet av uttrycksvärdet av varje gen efter normalisering till S. pombe signalen i den (A och D) spt20Δ, ( EochB ) bre1Δ eller () C och F) K123R stam kontra Uttryckets värde av samma gen i vildtyp S. cerevisiae. 5,385 gener totalt analyserades och tröskelvärdena för dubbla ändra (blå prick: mer än ett tvåfaldigt minska; gula prickar: mer än en fördubbling) och 0,05 p-värden var ansedda. Paneler A och D har ändrats från Baptista o.a. 14. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Parallella förändringar i mRNA-syntesen och mRNA decay resultat i mRNA buffring. (A) denna panel visar en schematisk representation av resultatet av RNA syntes störning på steady-state RNA-nivåer. (B-D) Dessa paneler visar beräkningen av mRNA-syntesen och de förfalla priserna från analyser av total och nyligen syntetiserade RNA. Syntes och förfall priser fastställdes för varje S. cerevisiae avskrift i (B) spt20Δ, (C) bre1Δ och (D) K123R. -Förändringar (beräknat som log2 av förhållandet mellan mutant och vildtyp) syntes var plottas mot förfall-förändringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Samtidigt genome-wide verktyg för att analysera förändringar i transkription fortfarande förbättras, kanske den enda analysen av transkriptom genom kvantifiering av steady state nivåer av RNA inte korrekt återspeglar förändringar i RNA-polymeras II aktivitet. Faktiskt, mRNA nivåer regleras inte bara av RNA-syntes, utan även av deras mognad och nedbrytning. För att mäta mRNA-syntesen bortkopplat mRNA nedbrytning, har distinkta protokoll utvecklats under de senaste åren för analys av begynnande transkription i både jäst och däggdjur.

En av de mest använda protokollen för kvantifiering av begynnande transkription är GRO-seq1. Medan GRO-seq's främsta fördel är dess kapacitet att avslöja transcriptionally engagerade och aktiva polymeras på hög upplösning och låg bakgrund, har två distinkta punkter som minskar dess attraktionskraft: (i) det är tekniskt utmanande och kräver den isolering av kärnor och, (ii) atomkärnor manipulationer införa vissa störningar till systemet28. Ett annat alternativ är NET-seq, som bygger på sekvensering av 3' ände avskrifter som erhålls vid immunoprecipitation den extremt stabilt ternära komplex som bildas mellan begynnande RNA, mall DNA och RNA-polymeras II. Denna metod tillåter karakterisering av begynnande RNAs i baspar upplösning och kan utforska mRNA bearbetning händelser genom immunoprecipitation modifierade RNA-polymeras II (serin-5 fosforylering, till exempel)2,3 , 29. Trots det presenterar några hinder, från vilken vi belysa tre. Först, medan antikroppar riktade RNA-polymeras II är oftast mycket specifika, det beror på antikroppar effektivitet. Det andra RNA kan vara benägna att nedbrytning under inkubation perioder, vilket leder oss tillbaka till den föregående punkten (mindre effektiva antikroppar kan kräva längre inkubation gånger, lämnar RNA mer mottagliga för nedbrytning)29. Tredje och särskilt i däggdjur, MNase matsmältningen och storlek urval kan utesluta unik teckensekvens justering29,30.

Här presenterade vi ett detaljerat protokoll för metabola märkning av nyligen syntetiserade RNA med 4tU i S. cerevisiae som har olika fördelar i jämförelse med andra tillgängliga metoder. Eftersom transkription är mycket känslig för störningar, bör celler bibehållas i de mest fysiologiska förhållandena. Exempelvis innebär GRO-seq gripandet av transcriptionally engagerade RNA-polymeras II genom exponering av celler/atomkärnor till sarkosyl. Sarkosyl behandling har dock beskrivits som hämmande av flera cellulära processer11. I det här fallet metabola märkning med 4tU eller 4sU beskrivs koncentration är icke störande och påverkar inte synbart cell homeostas, särskilt för korta perioder av exponering. Till skillnad från andra metoder som använder transkription hämning för att mäta mRNA halveringstider, avgör cDTA eller 4tU-seq och montering med dynamisk modellering nedbrytningshastigheten av varje enskild mRNA i ostörda celler. Därför kan en enda metod samtidigt adressera både syntes och decay räntesatserna för den hela transkriptom på en viss celltyp. Eftersom cDTA eller 4tU-seq utnyttjar mycket tillförlitlig normalisering metoder, nämligen genom användningen av spike-i, kan olika dataset man analyseras tillsammans och direkt. Slutligen, metabola märkning och kvantifiering av nyligen syntetiserade RNA är en teknik som enkelt kan implementeras i någon molekylärbiologiska laboratoriet eftersom det inte kräver någon särskild utrustning. Detta förklarar sannolikt ganska stor spridning av denna teknik, som tenderar att användas mer systematiskt att utforska RNA produktion och nedbrytning i jäst samt i högre Eukaryoter.

RNA kan märkas i levande celler med andra nukleosidanaloger analoger, nämligen 5-bromouridine (BrU)31,32 eller 5-ethynyluridine (EU)33,34. Isolering av BrU puls-märkt RNA är beroende av anti-BrdU antikropp rening som kan ha olika effektivitetsvinster mellan experiment. EU-märkt RNA kan vara kovalent konjugerad till biotin med klick-kemi som leder till en icke-reversibla konjugering motsats thiol ändring, som kan vändas med reduktionsmedel. BrU och EU-märkning har använts i däggdjursceller att bestämma genome-wide RNA decay priser31,32 eller att bedöma begynnande RNA syntes34,35. Dock har BrU eller EU märkning inte beskrivits i S. cerevisiae. Faktiskt, upptag av nukleosid analoger kräver uttryck för nukleosid transportör och således dessa metoder visas mindre flexibla i spirande jäst än märkning med 4tU.

Varaktigheten av 4tU märkning kan anpassas och varierar beroende på frågan. Vid bedömningen av mRNA som syntes i S. cerevisiae, en kort märkning puls 6 min säkerställer att påverkas minimalt nyligen transkriberas mRNA nivåer av RNA nedbrytning. Med tanke på att fördröjning innan den modifierade nukleotid kan införlivas i den begynnande RNA är mindre än 1 min, garanterar denna 6-min märkning varaktighet att en rimlig mängd nyligen syntetiserade RNA kan renas. Sådana protokoll, som definieras av Miller et al. 11, har använts i olika S. cerevisiae mutanter att avslöja globala förändringar i mRNA-syntesen och RNA förfalla9,10,22,26,27, 36. en längre märkning varaktighet (3 h) användes i en metabolisk puls-chase märkning med 4tU Fastställ decay priser av alla mRNA i S. cerevisiae12. Slutligen, extremt kort (från 1,5 min) 4tU märkning har använts att undersöka RNA bearbetning kinetics i spirande och fission jäst13,25,37.

Denna metod har dock vissa begränsningar, såsom den relativt låga avkastningen av märkt RNA återhämtade sig i slutet av hela protokollet. Medan i jäst, det finns ingen begränsning i utgångsmaterialet, och detta kan vara ett problem när du analyserar metazoan celler, särskilt om detta protokoll är att utnyttjas i vivo. En av de begränsande stegen i protokollet är biotinylation märkt RNA poolen, vars effektivitet är långt ifrån komplett och uppskattades för att ändra en av tre 4sU rester i märkta RNA5. Det nyligen visade att användning av methanethiosulfonate (MTS)-biotin, i stället för biotin-HPDP, ökar avkastningen av återvunna RNA38. Enligt opublicerade resultat från denna forskargrupp och resultat från Rutkowski och Dölken är MTS-biotin dock inte fullt thiol-specifika, leder till rening av omärkta RNA, vilket är särskilt problematiskt när låga mängder märkt RNA är renat39. En annan begränsning av metabola märkning använder 4tU/4sU är inneboende hastigheten vid vilken RNA polymeras förlänger. Den genomsnittliga hastigheten för RNA-polymeras II uppskattades till cirka 3,5 kb/min40,41,42. Alltså i en 6 minuters märkning, kommer att polymerasen ha kapacitet att transkribera 15 – 20 kb. Således i ett experiment med en kort puls-märkning med 4tU/4sU, endast den 3' slut del av nyligen transkriberade RNA är märkt, medan Regionkommittén 5' slutet var redan existerande före tillsats av 4tU/4sU. Således, rening av märkt RNAs också berikar existerande 5' ändarna av avskrifter, särskilt för lång avskrifter som i däggdjursceller. För att övervinna denna bias, i en raffinerad protokoll som kallas TT-seq, är den extraherade märkt RNA splittrad av ultraljudsbehandling före rening av nyligen syntetiserade arter43.

Alldeles, 4tU-seq är ett utmärkt sätt att transkriptionell adressändringar i en given kontext. Ändå, och protokollet är ganska enkel, den består av flera olika steg, som i slutändan relativt omfattande. Först och främst eftersom detta protokoll hanterar RNA från början till slut, är det obligatoriskt att alla krav som är nödvändiga för en ren och nedbrytning-fri prov är uppfyllda. Därför alla reagens bör vara RNase-fri, och allt material bör användas för att manipulera RNA, rengöring allt noggrant och regelbundet med RNase sanering lösning. För det andra, medan biotin reaktion är mycket specifika, överskottet av biotin-HPDP som inte reagerade bör tas bort från provet (för att undvika mättnad av streptividin pärlor med biotin som inte är kovalent bunden till RNA, till exempel). Tredje, som beskrivs i protokollet, användning av de angivna streptividin-belagda magnetiska pärlorna rekommenderas starkt, eftersom flera forskargrupper har vi pratat att ha alla anges att dessa pärlor lett till lägre bakgrundsnivå. Fjärde, lämplig kvalitet och experimentella kontroller bör användas. Inkludera prover från celler som inte utsattes för 4tU/4sU. Dessa prover kommer att vara av stort värde för adress bakgrundsnivåerna och för att säkerställa att, under experimentet, en förorening med icke-märkt RNA uppstår inte. Ett annat utmärkt alternativ att testa om provet är berikad för nyligen syntetiserade RNA är också att utföra en RT-qPCR med primers mot en intro-innehållande gen. Primers bör komplettera 3' slutet och 5' slutet av två på varandra följande exon och intron, eller vice versa. Slutligen, innan sekvenseringen av microarray hybridisering, validera proverna med RT-qPCR. För detta, bör olika gener med olika uttryck och förordning valts och analyseras. Optimalt, bör detta utföras för de två olika fraktionerna av RNA (steady-state och nyligen syntetiserade RNA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Laszlo Tora för hans stöd och V. Fisher, K. Schumacher och F. El Saafin för sina diskussioner. T.B. stöddes av ett Marie Curie-ITN-stipendium (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) och Fondation ARC. Detta arbete stöds av medel från Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Denna studie stöddes också av ANR-10-LABX-0030-INRT, en franska statens fond som förvaltas av den Agence Nationale de la Recherche under den ram program Investissements pris ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Tags

Beteende fråga 140 S. cerevisiae RNA transkription syntetiseras nyligen RNA 4-thiouracil RNA-polymeras II SAGA komplexa
<em>Saccharomyces cerevisiae</em> Metaboliska märkning med 4-thiouracil och kvantifiering av nyligen syntetiseras mRNA som en Proxy för RNA-polymeras II aktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baptista, T., Devys, D.… More

Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter