Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolsk merking med 4-thiouracil og kvantifisering av nylig syntetisert mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57982
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

Protokollen beskrevet her er basert på genomet hele kvantifisering av nylig syntetisert mRNA renset fra gjærceller merket med 4-thiouracil. Denne metoden gjør det mulig for å måle mRNA syntese uncoupled fra mRNA forfall, og dermed gir en nøyaktig måling av RNA polymerase II transkripsjon.

Abstract

Globale defekter i RNA polymerase II transkripsjon kan bli oversett av transcriptomic studier analysere stabil RNA. Faktisk har den globale nedgangen i mRNA syntese vist å bli kompensert av en samtidige nedgang i mRNA fornedrelse å gjenopprette normal stabil nivåer. Derfor er genomet hele kvantifisering av mRNA syntese, uavhengig av mRNA forfall, den beste direkte refleksjonen av RNA polymerase II transcriptional aktivitet. Her diskuterer vi en metode som bruker ikke-perturbing metabolske merking av begynnende RNAs i Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Spesielt cellene er kultivert for 6 min med en uracil analog, 4-thiouracil, og de merket nylig transkribert RNAs er renset og kvantifisert for å fastslå syntese satsene for alle personlige mRNA. Videre bruker merket Schizosaccharomyces pombe celler som interne standarden gjør det mulig å sammenligne mRNA syntese i forskjellige S. cerevisiae stammer. Bruker denne protokollen og tilpasse dataene med en dynamisk kinetic modell, kan tilsvarende mRNA forfall priser bestemmes.

Introduction

Cellene reagerer endogene og eksogene Stikkordene, gjennom dynamisk endring av gene expression programmet. De siste årene tillater en enorm utvikling av genomet hele metoder presis og omfattende beskrivelse av transcriptome endringer i ulike forhold. I de fleste transcriptomic studier brukes microarray hybridisering eller høy gjennomstrømming sekvensering å kvantifisere RNA nivåer fra en total stabil RNA brøkdel. Transcriptional endringer under en bestemt forstyrrelsene kan vise en rekke mulige utfall, bestemte genet uttrykk endringer eller et stort spekter av gener enten opp - eller downregulated. Genuttrykk er resultatet av en finjustert likevekt- eller stabil-mellom RNA syntese av RNA-polymerases og andre prosesser påvirker RNA nivåer. RNA polymerase II transkripsjon, inkludert sine tre distinkte faser (initiering, forlengelse, og oppsigelse), er svært og intrikat knyttet mRNA behandling, cytoplasmatiske eksport, oversettelse og fornedrelse.

Flere studier har vist at mRNAs syntese og nedbrytning er kombinert mekanismer og viste at transcriptional effekter på mutasjon eller under stimuli kan bli oversett når kvantifisere totale stabil RNA. Først avhenger gjenkjenning av transcriptional endringer gjennom analysene av stabil mRNA alltid mRNAs half-life. Når forstyrrelsene er innført, vil stabil nivåene av mRNAs med lang halv-liv bli mye mindre påvirket enn mRNAs med kort halv-liv. Derfor er detectability av endringene i RNA syntese sterkt partisk i favør av kortvarige transkripsjoner, mens analyse av longer-lived mRNA arter svikter å avsløre dynamiske endringer i transkripsjon rate. Andre flere rapporter har vist at både i gjær og pattedyr, globale endringer i transkripsjon kan overses når du analyserer stabil nivåer av mRNA. Det skyldes sannsyligvis mekanismer som kobler mRNA syntese og nedbrytning resulterer i mRNA bufring. Dette bedt om utviklingen av nye protokoller for å kvantifisere mRNA syntese uncoupled fra fornedrelse, gjennom analysen av nylig transkribert mRNA. De siste årene har flere alternativer er blitt presentert, inkludert globale løpe sekvensering (GRO-seq)1og opprinnelig forlengelse transkripsjon sekvensering (NET-seq)2,3. Her presenterer vi en protokoll opprinnelig utviklet i pattedyrceller4,5,6 og deretter tilpasset gjær7,8,9,10, 11, som er basert på RNA merking med thiolated nukleosid eller base analog, 4-thiouridine (4sU) eller 4-thiouracil (4tU), henholdsvis.

Denne metoden spesielt renser nylig transkribere RNA fra cellene i hvilke RNA er puls-merket med 4sU med faktisk nei innblandingen i cellen homeostase. Derfor, når cellene er utsatt for 4sU, molekylet er raskt uptaken, fosforylert til 4sU-trifosfat, og innlemmet i RNAs blir transkriberte. Når puls-merket, er det mulig å trekke samlede mobilnettet RNA (tilsvarende stabil nivåer av RNA), og deretter 4sU-merket RNA brøkdel er thiol-spesielt endret, fører til dannelsen av en disulfide obligasjon mellom biotin og nylig transkribere RNA4,5. 4sU kan imidlertid bare uptaken av celler som uttrykker en nukleosid transporter, som den menneskelige equilibrative nukleosid transporter (hENT1), hindrer dens bruk i spirende eller fisjon gjær. Mens man kunne uttrykke hENT1 S. pombe eller S. cerevisiae, kan lettere tilnærming oppnås ved hjelp av den endrede base 4tU, siden gjærceller kan ta opp 4tU, uten behovet av uttrykk for en nukleosid transporter10, 11 , 12 , 13. faktisk metabolismen av 4tU krever aktiviteten av enzymet uracil phosphoribosyltransferase (UPRT). I flere organismer, inkludert gjær men ikke pattedyr, er UPRT avgjørende for en pyrimidine berging sti, gjenvinning uracil å uridine monofosfat.

En viktig skjevhet i transcriptomic studier kan bli introdusert ved normalisering mellom forskjellige prøver analysert parallelt. Faktisk mange avvikende faktorer kan påvirke komparativ analyse av transcriptome mutant og vill-type stammer: effektiviteten av cellen lysis, forskjeller i utvinning og gjenoppretting av RNA og varians i skannerkalibrering for microarray analyser , blant andre. Som drøftet over, kan slike variasjoner være spesielt villedende når global effekter på RNA polymerase II transkripsjon forventes. En elegant betyr å nøyaktig sammenligne mRNA syntese priser mellom ulike eksempler ble utviklet ved hjelp av fjernt beslektede fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe som interne standard. For at et bestemt antall merket S. pombe celler legges til S. cerevisiae prøvene, vill-type eller mutant celler, før cellen lyse og RNA utvinning10. Deretter er både stabil og nylig syntetisk RNAs S. pombe og S. cerevisiae kvantifisert RT-qPCR eller via bruken av microarray chips eller høy gjennomstrømming sekvensering10. Kombinere disse dataene med kinetic modellering, kan absolutt priser mRNA syntese og nedbrytning i spirende gjær måles.

I rammen av dette manuskriptet, vil vi vise hvordan analyse av nylig transkribere RNA lov for å avsløre en global rolle for coactivator komplekser SAGA og TFIID i RNA polymerase II transkripsjon i spirende gjær14,15, 16. Viktigst, tidligere studier kvantifisert stabil mRNA nivåer i S. cerevisiae og foreslo at SAGA spiller en dominerende funksjon på et begrenset sett med gjær gener som er sterkt berørt av mutasjoner i SAGA, men relativt motstandsdyktig mot TFIID mutasjoner17,18,19. Overraskende, ble SAGA enzymatisk aktiviteter vist å handle på hele transkribert genomet, antyder en bredere rolle for denne co aktivator i RNA polymerase II transkripsjon. Redusert RNA polymerase II rekruttering på mest uttrykt gener ble observert på inaktivering av SAGA eller TFIID, noe som tyder på at disse coactivators samarbeider på de fleste gener. Derfor viste kvantifisering av nylig transkribert mRNA at SAGA og TFIID er nødvendig for transkripsjon av nesten alle gener av RNA polymerase II14,15,16. Gjennomføringen av kompenserende mekanismer fremstår som en måte for cellene å takle en global reduksjon i mRNA syntese som er bufret av en samtidige global nedgang i mRNA degradering. SAGAEN legger til listen over faktorer å ha en global effekt på RNA polymerase II transkripsjon, for eksempel RNA Pol II underenheter10, megler coactivator komplekse20, generelt transkripsjon faktor TFIIH21,22 , og indirekte, elementer av mRNA fornedrelse maskiner9,10,23. Slike kompenserende hendelser ble universelt observert i SAGA mutanter, regnskap for beskjeden og begrenset endringene i stabil mRNA nivåer til tross for en global og alvorlig nedgang i mRNA syntese14. Lignende analyser ble også utført i en BRE1 sletting belastning, som resulterer i et fullstendig tap av histone H2B ubiquitination. Interessant, en mye mildere men konsekvent global effekt på RNA polymerase II transkripsjon ble oppdaget i fravær av Bre1, som indikerer at metabolsk merking av nylig transkribere RNA i gjær kan oppdage og kvantifisere en rekke endringer i mRNA syntese priser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle dyrking og Rapamycin utarming av en SAGA undergruppe

  1. For hver S. cerevisiae stamme og kopiere vaksinere inkludert vill-type eller kontroll stammer, en enkelt koloni fra en frisk plate på 5 mL av YPD medium (2% pepton, gjærekstrakt for 1% og 2% glukose).
  2. Vokse S. cerevisiae celler overnatting på 30 ° C med konstant agitasjon (150 rpm).
  3. Måle optisk densitet ved 600 nm (OD600) og fortynne kulturen en OD600 ca 0,1 i 100 ml YPD middels og la det vokse inntil OD600 er rundt 0,8.
  4. Parallelt, vaksinere en enkelt koloni av S. pombe celler fra en frisk plate på 50 mL av Ja medium (0,5% gjærekstrakt, 250 mg/L adenine, histidin, uracil, leucine og lysin; 3% glukose) og vokse cellene overnatting på 32 ° C med konstant agitasjon (150 RPM).
  5. Måle OD600 S. pombe natten kultur og fortynne kulturen en OD600 ca 0,1 i 500 ml av Ja medium og la det vokse inntil OD600 er ca 0,8.
  6. For hver S. cerevisiae anker-bort belastninger og kopiere vaksinere inkludert vill-type eller kontroll stammer, en enkelt koloni fra en frisk plate på 5 mL av YPD medium (2% pepton, gjærekstrakt for 1% og 2% glukose).
  7. Vokse cellene overnatting på 30 ° C med konstant agitasjon (150 rpm).
  8. Neste morgen, måle OD600, fortynne kulturen en OD600 ca 0,1 i 100 ml YPD middels og la det vokse før OD600≈ 0,8.
  9. Legge til 100 µL av rapamycin kulturen fra en lagerløsning 1 mg/ml (siste rapamycin konsentrasjon av 1 µg/mL) og la cellene ruge på 30 ° C med konstant agitasjon for tiden er nødvendig for protein av interesse å bli betinget tømt fra kjernen ( 30 min er vanligvis tilstrekkelig). For kontrollen bruker en lignende gjær kultur, men i stedet for å rapamycin, legger du til tilsvarende volumet av dimethyl sulfoxide (DMSO).

2. 4tU merking med S. pombe som et Spike (Counting)

  1. Utarbeide en fersk løsning av 2 M 4-thiouracil. Når forberedt, holde det ved romtemperatur og fra lys.
    1. Nøyaktig veie 64.1 mg av 4-thiouracil for hver S. cerevisiae kultur og oppløse den i 250 µL av vannistedenfor (DMF) eller 250 µL av DMSO.
    2. For S. pombe kultur som topp-in, veier 320.5 mg av 4-thiouracil og oppløse den i 1250 µL av DMSO.
  2. Legge til 4-thiouracil løsningen S. cerevisiae og S. pombe kulturer for en siste konsentrasjon av 5 mM og ruge dem for 6 min med konstant agitering på 30 ° C og 32 ° C, henholdsvis.
  3. Etter 6 min, fjerne en liten aliquot i hver kultur for cellen opptelling. Telle celler ved hjelp av en automatisk celle teller eller en Neubauer kammer.
  4. Samle cellene til sentrifugering (2500 x g) i 5 min på 4 ° C.
  5. Forkaste nedbryting, vask cellene med iskald 1 x PBS og sentrifuger igjen (2500 x g, 4 ° C, 5 min).
  6. Beregne antall celler i hver av de S. cerevisiae og S. pombe prøvene.
  7. Resuspend cellene i 5 mL av iskalde 1 x PBS og bland S. cerevisiae S. pombe cellene med forholdet 3:1.
  8. Sentrifuge celler (2500 x g, 4 ° C, 5 min), fjerne PBS, flash-fryse cellene i flytende N2og lagre prøven ved-80 ° C til fremme bruk.

3. RNA utvinning og DNase behandling

  1. Tine cellene på is ca 20-30 min.
  2. Fortsett med RNA utvinning en gjær-RNA utvinning kit (Tabell for materiale) med noen tilpasninger.
  3. Per hver prøve, hell 750 µL av iskalde Zirconia perler i en 1.5-mL skrukork tube følger med kit. Husk på at per hver tube, RNA fra opptil 109 celler kan være effektivt ut. Derfor forberede antall rør nødvendig for hvert utvalg. For eksempel en S. cerevisiae kultur 100 ml (OD600≈ 0,8) kan gjengi rundt 2 x 109 -3 x 109 celler, fører til totalt 2.7 x 109 på 4 x 109 celler totalt (etter spike-i med en tredjedel av S. pombe celler). I dette tilfellet ville opp til 3-4 reaksjon rørene per hver prøve/tilstand/mutant/gjenskape være nødvendig.
  4. Per hver 1 x 109 celler, legger du til 480 µL av lyseringsbuffer leveres med kit, 48 µL av 10% SDS og 480 µL av fenol: kloroform: isoamyl alkohol (25:24:1, v/v/v).
  5. Bland cellene med en vortex blandebatteri og overføre dem til rør som inneholder iskald Zirconia perler.
  6. Imøtekomme rør på en vortex blandebatteri adapter, slå virvelen med maksimal hastighet, og slo for 10 min å lyse gjærceller (i et rom på 4 ° C). Eventuelt utføre lysis av celler i en automatisk perle-beater.
  7. Sentrifuge rør 16.000 x g i 5 minutter ved romtemperatur og nøye samle den øvre fasen (RNA-inneholder fase) til en frisk 15 mL falcon tube. Volumet gjenopprettet per hver tube er vanligvis rundt 500-600 µL.
  8. 15 mL rør som inneholder den delvis renset RNA, legge bindende bufferen følger med kit og bland godt. Per hver 100 µL av RNA løsning, legger du til 350 µL av bindende buffer (dvs.når det den vandige fasen løsning er 600 µL, 2.1 mL bindende bufferen skal legges).
  9. Til forrige blanding, Legg 100% etanol og bland godt. Per hver 100 µL av RNA løsning, legge 235 µL av 100% etanol (dvs.når det den vandige fasen løsning er 600 µL, legge 1.41 mL av etanol).
  10. Bruke opptil 700 µL av blandingen fra trinn 3.9 å et filterelement samlet i en samling rør, begge utstyrt med kit.
  11. Sentrifuge for 1 min 16.000 x g. Hvis sentrifugering varigheten ikke var nok for det totale volumet passerer gjennom filteret, kan du gjenta sentrifugering for 30 s.
  12. Forkaste gjennomflytsenhet og bruke samme samling rør. Legge til en annen 700 µL av RNA-bindende buffer-etanol løsning filteret og sentrifuge igjen på 16.000 x g for 1 min.
  13. Forkaste gjennomflytsenhet og gjentar trinn 3.11 og 3.12 til RNA løsningen er fullført.
  14. Filteren 2 x med 700 µL vaske løsning 1. Samle vask løsning via sentrifugering 16.000 x g for 1 min, og alltid holde samling røret.
  15. Filteren 2 x med 500 µL vaske løsning 2. Samle vask løsning via sentrifugering 16.000 x g for 1 min, og alltid holde samling røret.
  16. Sentrifuge rør igjen på 16.000 x g for 1 min til å tørke helt filteret.
  17. Overføre filterelementet til den endelige innsamling tuben (RNA-passende rør) og elute RNA med 50 µL DEPC-behandlet, RNase-fri H2O (forvarmet til 100 ° C).
  18. Sentrifuge for 1 min 16.000 x g.
  19. Elute RNA igjen (til samme rør) med 50 µL av forvarmet DEPC-behandlet, RNase-fri H2O. sikre at alle volumet har passert gjennom filteret; ellers sentrifuge for lengre perioder.
  20. Hvis flere rør for én enkelt prøve, basseng dem alle i en tube.
  21. Kvantifisere og sjekk renheten på prøven ved hjelp av riktig utstyr.
    Merk: Mens 4tU er bare innarbeidet i nylig syntetisert RNA, det er en sjanse for mindre forurensning med DNA. Derfor er det alltid lurt å behandle prøvene med DNase jeg. For at bruk reagensene leveres med RNA-utvinning kit (Tabell for materiale) følge anbefalingene fra produsenten.

4. thiol-spesifikke Biotinylation av nylig syntetisert

  1. Justere konsentrasjonen av RNA med del 3 av protokollen til 2 mg/mL. Aliquot 200 µg av totale varme den i 10 minutter til 60 ° C, og umiddelbart chill det på is 2 min.
  2. RNA-aliquot legger til reagensene nevnt nedenfor i følgende rekkefølge: 600 µL av DEPC-behandlet, RNase-fri H2O, 100 µL biotinylation bufferen (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] og 10 mM EDTA, DEPC-behandlet, RNase-fri H2O), og 200 µL av biotin-HPDP fra et lager av 1 mg/mL biotin-HPDP i DMSO eller DMF.
    1. I noen situasjoner biotin-HPDP løsningen tendens til å fremkalle, sannsynligvis på grunn av sin lav oppløselighet i vann. I denne situasjonen, øke volumet av DMSO/DMF opp til 40% av reaksjon (RNA prøven, legge til 400 µL DEPC-behandlet H2O, 100 µL av biotinylation buffer og 400 µL av biotin-HPDP fra en 0,5 mg/mL lager).
  3. Inkuber prøven ved romtemperatur og beskyttet fra lys for 3 h, med milde agitasjon.
  4. Etter inkubasjon Legg et tilnærmet like volum av kloroform til rør og bland kraftig.
  5. Spin prøven 13.000 x g i 5 min, på 4 ° C. Dette trinnet gjør at fjerning av overflødig biotin som gjorde ikke biotinylate RNA. Du kan også utføre dette trinnet med fase-lock rør (tung). For at spinne ned fase-lock rør for 1 min 13 000 x g, legge RNA blandingen en lik mengde kloroform, bland dem kraftig og sentrifuge dem 13.000 x g i 5 min, på 4 ° C.
  6. Nøye overføre den øvre fasen til nye 2 mL rør.
  7. Legg en tidel av volumet av 5 M NaCl og bland prøven.
  8. Legge til en lik mengde isopropanol bland prøven godt og spinne den 13.000 x g i minst 30 min, på 4 ° C.
  9. Forsiktig fjerne nedbryting og legger 1 mL av iskalde 75% etanol.
  10. Spinn på 13000 x g for 10 min, på 4 ° C.
  11. Nøye fjerne nedbryting, rask-spinn røret, og fjerne den gjenværende etanol løsningen. Kontroller at RNA pellet ikke tørke.
  12. Avbryte RNA 100 µL DEPC-behandlet, RNase-fri H2O.

5. rensing av nylig syntetisert brøkdel fra Total og umerkede RNA bruker Streptavidin-belagt magnetiske perler

  1. Varme biotinylated RNA i 10 min på 65 ° C og deretter chill prøvene på is 5 min.
  2. Legge til 100 µL av streptavidin-belagt magnetiske perler biotinylated RNA (på et endelig antall 200 µL). Spesielt anbefales å bruke perlene angitt i Tabellen for materiale, siden, etter samtaler med andre laboratorier, disse syntes for å være mer konsekvent og pålitelig.
  3. Inkuber prøven med liten risting i 90 min, ved romtemperatur.
  4. Plass kolonnene med kit (Tabell for materiale) i magnetiske standen.
  5. Legge til 900 µL romtemperatur vaske bufferen (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, og 0,1% mellom 20, i DEPC-behandlet, RNase-fri H2O) til kolonnene (pre kjøre og equilibrate).
  6. Perler/RNA blanding (200 µL) gjelde kolonnene.
  7. Samle gjennomflytsenhet i 1,5-mL rør og bruke det på nytt i samme magnetiske kolonnen. Eventuelt holde dette gjennomflytsenhet som representerer umerkede RNA brøken.
  8. Vask kolonnene 5 x med økende mengder vaske bufferen (600, 700, 800, 900 og 1000 µL).
  9. Elute den nylig syntetisert RNA med 200 µL 0.1 m DTT.
  10. Utføre en andre elueringsrør, 3 min senere, med en lik mengde 0.1 M DTT.
  11. Etter eluting i RNA, legge til 0,1 mengder 3 M NaOAc (pH 5.2), 3 bind av iskalde 100% etanol, og 2 µL av 20 mg/mL glykogen (RNA-grade) og la RNA bunnfall overnatting, på 20 ° C.
  12. Gjenopprette RNA med sentrifugering (13 000 x g for 10 min, på 4 ° C) og resuspend det i 15 µL DEPC-behandlet, RNase-fri H20. Andelen av merket-til-sum RNA forventes å være rundt 2-4% (vanligvis mer mot den nedre enden), rendering ca 2.0 µg av nylig syntetisert. Dette antallet er nok til å gjøre flere qPCR eksperimenter, samt for microarray/sekvensering analyser.

6. RT-qPCR validering av ulike fraksjoner

  1. Syntetisere cDNA fra 2 µg av totalt eller 10 µL av merket med tilfeldig hexamers og revers transkriptase valgfrihet, i henhold til produsentens instruksjoner (Tabell for materiale).
  2. Forsterke cDNA av sanntids qPCR bruker en standardprotokoll (Tabell for materiale).
    Merk: Alle prøvene skal kjøres i tre eksemplarer av minst to biologiske gjentak. Korrigere alle rå verdiene for uttrykket av S. pombe tubulin.

7. Microarray hybridisering

  1. Hybridize RNA eksempler på foretrukne microarray chips i henhold til produsentens instruksjoner (for denne bestemte protokollen, se Tabellen for materiale). Kort, forberede biotinylated cRNA mål fra 150 ng av ved hjelp av Premier RNA forsterkning Kit (Tabell for materiale), i henhold til produsentens instruksjoner. Hybridize 4 mg fragmentert cRNAs 16 h 45 ° c og 60 rpm microarray sjetonger.
  2. Vask, flekker, og Skann chips med angitt stasjon og skanner (Tabell for materiale). Ekstra rådataene (CEL intensitet filer) fra skannede bilder bruke kommandokonsollen (AGCC, versjon 4.1.2).
  3. Viderebehandle CEL filene med uttrykket konsollen programvaren 1.4.1 beregne sonde satt signal intensitet, bruke statistikk-basert algoritmer MAS 5.0 med standardinnstillinger og global skalering som normalisering.
    Merk: Trimmet mener målet intensiteten av hver flis var vilkårlig satt til 100. Utfør alle eksperimenter med minst to uavhengige biologiske gjentak. Normalisere rådata på S. pombe signalet og beregne kaste endringer i total og nylig syntetisert RNA nivåer.

8. dataanalyse ved hjelp av en eksisterende rørledning R

  1. Beregn syntese og forfalle priser ved bruk av en rørledning og R/Bioconductor pakken offentlig tilgjengelig, som beskrevet tidligere8,10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når du utfører metabolske merking av nylig transkribere RNA, flere aspekter må kontrolleres: tid og effektiviteten av merkingen, spiker i andelen, utvinning protokollen og biotinylation effekten (inkludert signal-til-støy forholdet), blant andre. Disse betingelsene vist grundig og metodisk av andre7,10,11. Her fokusere vi hovedsakelig på tolkningen og umiddelbar analyser som kan utføres når prøvene er behandlet, enten av RT-qPCR, microarray eller sekvenser. Analyser av ulike mutant stammer demonstrere makt metoden å oppdage ikke bare en dramatisk global nedgang i mRNA syntese, som i tilfelle av SAGA mutant S. cerevisiae stammer, men også en svært mild reduksjon av RNA polymerase II aktiviteten undertrykkelse av histone H2B monoubiquitination.

Våre analyser av SAGA enzymatisk aktiviteter foreslo en bred rekruttering til chromatin15, som ikke ble avslørt av analyse av stabil mRNA nivåer i SAGA mutant stammer. RNA polymerase II rekruttering var svekket på SAGA inaktivering, besluttet vi å analysere om mRNA syntese priser berøres globalt. Derfor vill-type eller mutant S. cerevisiae stammer ble utsatt for 4tU for en 6 min periode, merke nylig transkribert RNAs. Etter blanding med de spike merket cellene (S. pombe) i en del 3:1, totalt RNA ble pakket ut, og nylig syntetisert RNA ble biotinylated og renset i henhold til protokollen presenteres her, som chronogram som vist i figur 1. Merket RNAs var renset fra totalt 200 µg av sikrer at mengden renset produkt ville være tilstrekkelig for nedstrøms programmer. Som et første og systematisk skritt før noen genomet hele analyse, var nylig syntetisert RNA rensing godkjent av RT-qPCR. Gener ble valgt etter ulike parametere, inkludert et uttrykk, regulatoriske veier og en avhengighet av ulike RNA-polymerases.

For å bekrefte at denne protokollen spesielt renser merket RNA, kvantifisert vi nivåer av utskrifter i fraksjoner renset fra vill-type celler som ble kultivert med eller uten 4tU. Ubetydelig bakgrunn nivåer av analyserte RNAs ble oppdaget fra celler som ikke var eksponert for 4tU (figur 2A). Nylig transkribere RNA rensing ble ytterligere bekreftet av observerte anriking av det intron inneholder ACT1 pre-mRNA (data ikke vist). Etter validering av kvaliteten på prøvene testet vi om mRNA syntese berøres ved sletting av SPT20, som er kjent for å forstyrre SAGA komplekse samlingen. Som rapportert av andre, avslørte mRNA kvantifisering på totalt (stabil) RNA fra spt20Δ belastningen stort sett uendret eller mildt reduserte nivåer for testet arvestoffet (figur 2B). Lignende resultater ble oppnådd for stammer slettet på BRE1 (figur 2B). I kontrast, analyse av nylig transkribere RNA fra spt20Δ belastningen avslørte en dramatisk nedgang i mRNA syntese av tre-til femdoblet for alle testet gener (figur 2C). Tap av Bre1 førte til en mer diskret, men likevel synlig nedgang i nylig syntetisert mRNA nivåer for studerte genene (figur 2C). God avtale med en rolle av SAGA og Bre1 i RNA polymerase II transkripsjon, tap av enten Spt20 eller Bre1 ikke påvirke uttrykket av RDN25 eller snR6 gener, transkribert av RNA polymerase jeg og RNA polymerase III, henholdsvis ( Figur 2C).

Imidlertid vise stammer slettet for strukturelle underenheter av SAGAEN komplekset, som SPT7 eller SPT20, alvorlig tregest voksende fenotyper som kan forklare de observerte transcriptional endringene. Hvis du vil utelukke uønskede sekundære effekter, vi betinget utarmet Spt7 fra kjernen, ved hjelp av anker-bort S. cerevisiae påkjenningen14,24. På 60 min rapamycin behandling, før puls-merking med 4tU (se figur 1 for en skjematisk fremstilling), nylig transkribert mRNA nivåer ble redusert tilsvarende grad som observert i sletting belastningen (figur 2D og 2E ). Denne analysen, dermed bekreftet vår tidligere resultater og validert protokollen for induserbart uttømming systemet. I en tid-retters analyse, der celler ble utsatt for rapamycin for en tid som spenner fra 0 til 240 min, var redusert uttrykk dokumentert umiddelbart etter 15 min eksponering til stoffet. Mer interessant, stabil mRNA nivåer tendens til å først redusere men tilbake til normale nivåer etter 60 minutter, en indikasjon på at en kompenserende mekanisme finner sted i mellomtiden (figur 2E).

Helt, merking og kvantifisering av nylig syntetisert tillatt avsløre nye regulatoriske roller for SAGA komplekset. Beskrevet protokollen kunne også røpe moderat effekter på RNA polymerase II aktivitet og var med hell brukes til betinget uttømming gjær påkjenningen.

En av nedstrøms søknadene for den renset nylig syntetisert RNA er et genom hele kvantifisering av transkripsjoner bruker microarray hybridisering eller sekvensering (4tU-seq). Mens høy gjennomstrømming sekvensering er mer kvantitativ, følsom og informativ, kan microarray hybridisering være svært nyttig å finne ut om globale mRNA nivåene er endret. I denne sammenheng der normalisering er avgjørende, lagt vi en spiker i organisme til prøven som vi som mål å analysere. Spesielt blandet vi S. cerevisiae celler til S. pombe celler i forholdet 3:1, begge tidligere utsettes for 4tU. Når renset, merket RNAs er utsatt for høy gjennomstrømming sekvensering, kan alle standardbiblioteket forberedelse protokoller brukes, ofte etter ribosomal RNA uttømming. Normalisering mellom 4tU-seq data fra forskjellige prøver er utført ved å legge til enten merket RNA fra ulike arter (dvs miksing S. cerevisiae og S. pombe celler som ovenfor)22 eller i vitro- transkribert, thiolated pigg i RNA12,25,26,27. Kommersielt tilgjengelige microarray chips inneholder sonder for hele transcriptome av både spirende og fisjon gjær, tillater kvantifisering av mRNA fra begge organismer i ett enkelt eksperiment. Microarray hybridizations ble utført med total og nylig syntetisert RNA godkjent av RT-qPCR som angitt ovenfor (vill-type, spt20Δ og bre1Δ). I tillegg har vi inkludert en stamme som ikke støtter monoubiquitination av histone H2B, gjennom punkt mutasjon av ubiquitinable rester (K123R). Fordi eksakt samme andelen S. pombe celler ble brukt i forskjellige prøver og gjentak, er det mulig å Skaler lineært Matrisenes på nytt innhold slik at den totale og merket S. pombe sonder har samme median intensitet. Denne normalisering, eller rescaling, utføres med en Bioconductor pakke utviklet ved laboratoriet Patrick Cramer brukt parallelt i alle analyserte prøvene, totalt og merket fraksjoner og vill-type og mutanter stammer8. Kort er av denne rørledningen en Excel-fil som inneholder sonder og intensitet (MAS5 eller RMA) for alle prøvene og brøker. Etter eksklusive sonder som er utenfor området for gjenkjenning, er signalet intensiteten skala, hensyntatt intensitetsverdiene for S. pombe sonder. Til slutt, kan du tilordne sonder spirende og fisjon gjær genomer, med en matrise som inneholder uttrykket verdiene normalisert for pigg i. Disse verdiene kan være ytterligere behandlet (se neste avsnitt) eller brukes. I eksemplet nedenfor har bestemt vi fold endring av hver transkripsjon mellom mutant og vill-type belastningen.

Analysene ble utført for både stabil eller nylig syntetisert nivåer av RNA og plottet mot deres statistiske betydning (p-verdi) (Figur 3). Med andre studier, når totalt RNA nivåer ble analysert, bare noen få gener hadde sitt uttrykk endres, enten opp- eller downregulated (figur 3A-3 C). Analyse av nylig transkribere RNA førte til påfallende ulike konklusjoner. Nylig transkribert mRNA nivåene av mer enn 4 000 gener ble betydelig redusert med minst todelt ved sletting av SPT20, foreslå en global positiv effekt av SAGA på RNA polymerase II transkripsjon i spirende gjær (Figur 3D ). I tillegg i bre1Δ og K123R mutanter, resultatene var mer diskret: de fleste gener syntes å ha deres uttrykk redusert, men omfanget av downregulation og antall betydelig berørte gener (≈ 300-500) var faktisk mer begrenset (figur 3E og 3F).

Som tidligere nevnt, stabil eller totale nivåer av mRNA dikteres av tett likevekt mellom syntese og nedbrytning (Figur 4A). Når RNA polymerase II transkripsjon er globalt svekket, to scenarier kan bli avbildet: (i) enten den totale mRNA nivåer reduseres globalt, som svar på redusert syntese men konstant decay, eller (ii) mRNA fornedrelse er redusert i samme grad, resulterende i stort sett uendret stabil mRNA nivåer. Det andre scenariet er rapportert for flere forhold, herunder i forbindelse med SAGA eller TFIID avbrudd9,10,14,16,22. En prosedyre som kalles sammenlignende dynamisk transcriptome analyse (cDTA) basert på 4tU merking og dynamisk kinetic modellering tillater oss å bestemme mRNA syntese og antyde forfall priser for hver utskrift8,10. Igjen, tok vi fordel av data som samles inn for de tidligere nevnte stammene (vill-type, spt20Δ, bre1Δ og K123R). Som forventet, ved sletting av SPT20, observerte vi en samtidig nedgang i mRNA syntese og nedbrytning priser sammenlignet med vill-type belastningen. Denne mutert stamme, kompensasjon ble nesten optimal med gjennomsnittlig reduksjon i syntese av 3.8-fold og gjennomsnittlig reduksjon i forfallet av 4.1-fold (Figur 4B), bekrefter hvorfor bare begrenset transcriptional endringer kan være oppdaget på totalt mRNA nivåer (Figur 3A). I de to andre mutant belastninger (bre1Δ og K123R), samtidig endringer i mRNA syntese og forfall ble også observert, men endringene var i mye mindre skala og mer spredt (figur 4C og 4 D).

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av metabolske merkingen av RNA bruker 4tU. Ferskt tilberedte 4tU legges til kultur medium og celler er merket for 6 min. merket S. cerevisiae og S. pombe celler er blandet i forholdet 3:1 og totale RNA trekkes. Etterpå nylig syntetisert RNA er biotinylated og kan bli renset ved hjelp av streptavidin-belagt magnetiske perler. Til slutt, totalt (stabil) RNA og merket nylig syntetisert RNA kan brukes i en rekke nedstrøms programmer, inkludert RT-qPCR og microarray hybridisering eller sekvenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Analyse viser transcriptional endringer i både fast-state og nylig transkribert RNA bestemmes av RT-qPCR. (A) RNA nivåer av fem ulike gener kvantifisert fra merket RNA brøkdel renset fra vill-type celler som var enten eller ikke 4tU. De neste to panelene viser (B) totalt, og (C) syntetisert nylig RNA kvantifisering av RT-qPCR for vill-type (WT), spt20Δ og bre1Δ gjærceller. Spt7 anker plassering stammer, ubehandlet eller behandlet med rapamycin for 60 min, ble merket med 4tU, og (D) total eller (E) nylig transkribert RNA ble kvantifisert ved RT-qPCR. (F) dette panelet viser tid-retters analyse av endringer i stabil og nylig syntetisert mRNA på Spt7 kjernefysiske uttømming. For alle prøver kvantifisert mRNA nivåer for fem RNA polymerase II gener av RT-qPCR. RNA polymerase jeg og RNA polymerase III gener (RDN25 og snR6, henholdsvis) ble brukt som kontroll. Uttrykket verdier (mener ± SD tre uavhengige eksperimenter) var normalisert til piggete i S. pombe signal og satt til 1 på kontroll prøven. Paneler D-F er endret fra Baptista et al. 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Genomet hele analyser av mRNA nivåer ved hjelp av total eller merket RNA brøker. Disse skjermbildene viser vulkanen tomter med brett endringer i (Vekselstrøm) stabil mRNA nivåer eller (D-F) nylig syntetisert mRNA nivåer i forhold til deres betydning (p-verdi). Fold endringene (FC) ble beregnet som log2 av forholdet mellom uttrykket verdien av hver genet etter normalisering på S. pombe signalet i (A og D) spt20Δ, (B og E) bre1Δ eller () C og F) K123R press mot uttrykket verdien av det samme genet i vill-type S. cerevisiae. Totalt 5,385 gener ble analysert, og terskler av todelt endre (blå prikk: mer enn en nedgang, gule prikkene: mer enn en todelt økning) og 0,05 p-verdier ble vurdert. Paneler A og D er endret fra Baptista et al. 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Parallelle endringer i mRNA syntese og mRNA forfall resultater mRNA bufring. (A) dette panelet viser en skjematisk fremstilling av utfallet av RNA syntese forstyrrelsene på stabil RNA nivåer. (B-D) Disse skjermbildene viser beregning av mRNA syntese og nedbrytning priser fra analyser av total og nylig syntetisert. Syntese og nedbrytning prisene var bestemt for hver S. cerevisiae transkripsjon (B) spt20Δ, (C) bre1Δ og (D) K123R. Endringer (beregnet som log2 av forholdet mellom mutant og vill-type) i syntese priser var plottet mot endringer i forfall priser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens genomet hele verktøy for å analysere endringer i transkripsjon er fortsatt bedre, kan eneste analyse av transcriptome gjennom kvantifisering av stabil RNA nøyaktig gjenspeiler ikke endringer i RNA polymerase II aktivitet. Faktisk er mRNA nivåer regulert ikke bare av RNA syntese, men også av sin modning og fornedrelse. For å måle mRNA syntese uncoupled fra mRNA fornedrelse, har forskjellige protokoller blitt utviklet i de senere årene for analyse av begynnende transkripsjon både gjær og pattedyr.

En av de vanligste protokollene for kvantifisering begynnende transkripsjon er GRO-seq1. Mens GRO-seq Hovedfordelen er dens evne til å avsløre transcriptionally engasjert og aktiv utvalg på høy oppløsning og lav bakgrunn, har to punkter som reduserer sin attraktivitet: (i) det er teknisk utfordrende og krever det isolering av kjerner, og (ii) kjerner manipulasjoner introdusere noen forstyrrelser til systemet28. Et annet alternativ er NET-seq, som bygger på sekvensering av 3 transkripsjoner oppnådd ved immunoprecipitation av ekstremt stabil trefoldig komplekset dannet mellom begynnende RNA mal DNA og RNA polymerase II. Denne tilnærmingen lar karakterisering av begynnende RNAs base par oppløsning og kan utforske mRNA behandlingshendelser gjennom immunoprecipitation av endrede RNA polymerase II (serine-5 fosforylering, for eksempel)2,3 , 29. likevel det gir noen hindringer, som vi markere tre. Først, mens antistoffer målretting RNA polymerase II er vanligvis svært spesifikke, det avhenger av antistoff effektivitet. Andre RNA kan være utsatt for degradering inkubasjon perioder dermed fører oss tilbake til forrige punkt (mindre effektiv antistoffer kreve lengre inkubasjon ganger, forlater RNA mer utsatt for degradering)29. Tredje, og spesielt i pattedyr, MNase fordøyelsen og størrelse kan utelukke unik bokstavkombinasjon justering29,30.

Her presentert vi en detaljert protokoll for metabolske merkingen av nylig syntetisert bruker 4tU i S. cerevisiae som har ulike fordeler i forhold til andre tilgjengelige tilnærminger. Transkripsjon er svært følsom for forstyrrelser, bør celler opprettholdes i mest fysiologiske forhold. For eksempel innebærer GRO-seq arrestasjonen av transcriptionally engasjert RNA polymerase II gjennom eksponering av celler/kjerner for sarkosyl. Men har sarkosyl behandling blitt beskrevet som hemmende av flere cellulære prosesser11. I dette tilfellet metabolske merking med 4tU eller 4sU på beskrevet konsentrasjonen er ikke-perturbing og påvirker ikke synlig celle homeostase, særlig i korte perioder av eksponering. I motsetning til andre metoder som bruker transkripsjon hemming for å måle mRNA halv-liv, bestemmer cDTA eller 4tU-seq og montering med dynamisk modellering fornedrelse priser for hver enkelt mRNA i Uaffisert celler. Derfor kan en enkelt metode samtidig ta både syntese og nedbrytning tallene for hele transcriptome til en bestemt celle. Siden cDTA eller 4tU-seq bruker pålitelig normalisering metoder, nemlig gjennom bruk av spike-i kan forskjellige datasets analyseres sammen og direkte forhold. Endelig, metabolske merking og kvantifisering av nylig syntetisert er en teknikk som lett kan implementeres i noen molekylær biologi laboratorium som det ikke krever noe bestemt utstyr. Dette forklarer trolig ganske stor spredning av denne teknikken, som pleier å bli brukt mer systematisk å utforske RNA produksjon og nedbrytning i gjær og høyere eukaryoter.

RNA kan merkes i levende celler ved hjelp av andre nukleosid analogs, nemlig 5-bromouridine (BrU)31,32 eller 5-ethynyluridine (EU)33,34. Isolasjon av BrU puls-merket RNA er avhengig av anti-BrdU antistoff rensing som kan ha ulik effektivitet mellom eksperimenter. EU-merket RNA kan være covalently konjugert til biotin bruker Klikk kjemi fører til en ikke-reversibel Bøyning kontrast thiol endringer, som kan reverseres med reduksjonsmidler. BrU og EU merking har blitt brukt i pattedyrceller bestemme genomet hele RNA forfall priser31,32 eller vurdere begynnende RNA syntese34,35. Imidlertid har BrU eller EU merking ikke blitt beskrevet i S. cerevisiae. Faktisk opptak av nukleosid analogs krever uttrykk for nukleosid transporter, og dermed disse metodene vises mindre fleksible i spirende gjær enn merking med 4tU.

Hele 4tU merkingsteknikker kan tilpasses og varierer etter spørsmålet. Når du vurderer mRNA syntese i S. cerevisiae, en kort merking puls av 6 min sikrer at påvirkes minimal nylig transkribert mRNA nivåene av RNA degradering. Tatt i betraktning at forsinkelse før den endrede nukleotid kan innarbeides i den gryende RNA er mindre enn 1 min, garanterer denne 6 minutters merking varigheten at en rimelig mengde nylig syntetisert RNA kan bli renset. Slike protokollen, som definert av Miller et al. 11, har vært brukt i forskjellige S. cerevisiae mutanter å avsløre globale endringer i mRNA syntese og RNA forfalle9,10,22,26,27, 36. en lenger merking varighet (3 h) ble brukt i en metabolsk puls-jage merking med 4tU for å fastslå forfall priser av alle mRNAs i S. cerevisiae12. Til slutt, ekstremt kort (fra 1,5 min) 4tU merking er brukt til å undersøke RNA behandling kinetics spirende og fisjon gjær13,25,37.

Likevel, denne metoden har noen begrensninger, for eksempel den relativt lav avkastningen av merket etter at hele protokollen. Mens i gjær, det er ingen begrensning i utgangsmaterialet, og dette kan være et problem når du analyserer metazoan celler, spesielt hvis denne protokollen er blir utnyttet i vivo. En begrensende trinnene av protokollen er biotinylation av merket RNA bassenget, der effektivitet er langt fra fullstendig og ble anslått til å endre en av tre 4sU rester i merket RNA5. Det nylig viste at bruk av methanethiosulfonate (MTS)-biotin, i stedet for biotin-HPDP, øker avkastningen av gjenopprettede RNA38. Men ifølge upubliserte resultater fra Faggruppen og resultater fra Rutkowski og Dölken er MTS-biotin ikke fullt thiol-spesifikk, fører til rensing av umerkede som er særlig problematisk når lave mengder merket RNA er renset39. En annen begrensning metabolske merkingen ved hjelp 4tU/4sU er iboende hastigheten på hvilke RNA polymerase elongates. Gjennomsnittlig hastighet for RNA polymerase II ble anslått til ca 3.5 kb/min40,41,42. Derfor, i en 6 min merking, utvalg har kapasitet til å transkribere 15-20 kb. Dermed i et eksperiment med en kort puls-merking med 4tU/4sU, bare de 3' ende del av nylig transkribere RNA er merket, mens regionene 5' slutten var eksisterende før en 4tU/4sU. Dermed er beriker rensing av merket RNAs også eksisterende 5' endene av transkripsjoner, spesielt for lange utskrifter i pattedyrceller. For å overvinne denne skjevhet, i en raffinert protokoll kalt TT-seq, er den utpakkede merket RNA fragmentert av sonication før rensing av nylig syntetisert arter43.

Sammen er 4tU-seq en utmerket måte å ta transcriptional endringer i en gitt kontekst. Likevel, og protokollen er ganske enkel, den består av flere ulike tiltak, som til slutt relativt omfattende. Først og fremst siden denne protokollen håndterer RNA fra start til slutt, er det obligatorisk at alle de nødvendige kravene for en ren og fornedrelse-fri prøven er oppfylt. Derfor reagenser skal RNase-fri, og alle materialer skal være dedikert til å manipulere RNA, rengjøring alt grundig og regelmessig RNase dekontaminering løsning. Andre biotin reaksjon er svært spesifikke, burde overskytende av biotin-HPDP som ikke reagerer bli fjernet fra utvalget (for å unngå metning av streptavidin perler med biotin som ikke covalently er bundet til RNA, for eksempel). Tredje, som beskrevet i protokollen, bruk av de angitte streptavidin-belagt magnetiske perlene anbefales, siden flere forskningsgrupper vi har snakket å ha alle indikerte at disse perlene førte til lavere bakgrunn nivåer. Fjerde, riktig kvalitet og eksperimentelle kontroller bør brukes. Ta prøver fra celler som ikke var eksponert for 4tU/4sU. Disse prøvene blir av stor verdi for adressen bakgrunn nivåer og sikre at under eksperimentet, oppstår ikke en forurensning med ikke-merket RNA. Også et annet utmerket alternativ å teste om prøven er beriket for nylig syntetisert RNA er å utføre en RT-qPCR bruker primere mot en intro inneholder genet. Primerne bør være utfyllende til 3 slutten og 5' slutten av to påfølgende ekson og intron, eller omvendt. Til slutt, før sekvensering av microarray hybridisering, validere prøvene av RT-qPCR. For dette, skal ulike gener med ulike nivåer av uttrykk og regulering være valgt og analysert. Optimalt, bør dette utføres for to forskjellige fraksjoner av RNA (stabil og nylig syntetisert RNA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Laszlo Tora underhold og V. Fisher, K. Schumacher og F. El Saafin for diskusjonene. TB ble støttet av et Marie Curie-ITN fellesskap (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) og Fondation buen. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Denne studien ble også støttet av ANR-10-LABX-0030-INRT, en fransk Statens fondet forvaltes av Agence Nationale de la Recherche under ramme programmet Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Tags

Atferd problemet 140 S. cerevisiae RNA transkripsjon syntetisert nylig RNA 4-thiouracil RNA polymerase II SAGA komplekse
<em>Saccharomyces cerevisiae</em> Metabolsk merking med 4-thiouracil og kvantifisering av nylig syntetisert mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baptista, T., Devys, D.… More

Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter