Summary
Le but de cet article est de présenter une méthode qui permet une reconstruction en 3 dimensions de l’arbre vasculaire cérébrale chez la souris après que micro calculé tomographie et détermination des volumes de segments de tout navire qui peuvent être utilisés pour quantifier le vasospasme cérébral dans modèles murins de l’hémorragie sous-arachnoïdienne.
Abstract
Hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est un sous-type d’AVC hémorragique. Vasospasme cérébral qui survient à la suite de l’hémorragie est un important facteur déterminant des résultats pour les patients et est donc souvent pris comme un paramètre de l’étude. Toutefois, dans les études animales petites sur SAH, quantification du vasospasme cérébral est un défi majeur. Ici, ex vivo présente une méthode qui permet la quantification des volumes des segments vasculaires ensemble, ce qui peuvent être utilisés comme une mesure objective pour quantifier le vasospasme cérébral. Dans un premier temps, coulée endovasculaire de la vascularisation cérébrale est effectuée à l’aide d’un agent de casting radio-opaque. Ensuite, les données d’imagerie transversales sont acquises par micro tomographie. L’étape finale consiste à reconstruire 3 dimensions de l’arbre vasculaire virtuel, suivie d’un algorithme pour calculer les lignes et les volumes des segments vaisseau sélectionné. La méthode a abouti à une reconstruction virtuelle très précise de l’arbre vasculaire cérébrale montré une comparaison axée sur le diamètre des tissus anatomiques avec leurs reconstructions virtuelles. Par rapport aux diamètres de navire seuls, les volumes de navire en évidence les différences entre les navires vasospastique et non-vasospastique montrés dans une série de SAH et souris opérés.
Introduction
Anévrismale hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA), un sous-type d’un AVC hémorragique, est une maladie courante dans les unités de soins neurointensive. En plus des lésions cérébrales précoces (EBI), qui comprend les dommages cérébraux causés par l’événement saignement lui-même, un autre important facteur déterminant des résultats pour les patients est l’ischémie cérébrale retardée (DCI), définie par la clinique détérioration par atteinte cérébrale perfusion ou infarctus cérébral associé non interventionnelle ou chirurgicales1,2,3. Des mécanismes importants qui contribuent à la DCI sont angiospasmes des gros vaisseaux cérébraux d’une part ; en revanche, la dysfonction microcirculatoire avec vasospasme des microvaisseaux microthrombose et ischémie associés à des dépressions propagation corticales jouent un rôle (examiné par Macdonald 20141). Par conséquent, diagnostic de spasme des vaisseaux cérébraux grands est crucial dans la pratique clinique et affiche un point de terminaison important dans de nombreuses études cliniques et expérimentales.
Malgré le fait que les caractéristiques du vasospasme dans les modèles murins de SAH ne sont pas directement transférable aux modèles homme patients, murins de SAH vasospasme connexe ont été d’une importance croissante ces dernières années. Dans ces modèles SAH est induite par endovasculaire filament perforation4,5,6,7,8, transection de saccules bateaux9ou l’injection de sang dans le CSF10 ,11,12. Contrairement aux grands modèles animaux de SAH, qui ont été traditionnellement conçus pour étudier le vasospasme13, modèles murins ont le grand avantage qu’il existe de nombreuses souches de souris transgéniques. Cela fait d’eux un excellent outil pour l’étude des mécanismes moléculaires conduisant à un spasme vasculaire et DCI. Toutefois, la détermination du vasospasme cérébral chez la souris est difficile. C’est parce que contrairement aux grands modèles animaux dans lequel vasospasme peut être examiné à l’aide de techniques d’imagerie cliniques, in vivo de l’imagerie pour analyser un vasospasme cérébral chez la souris n’est pas encore disponible. Par conséquent, vasospasme est déterminée couramment à l’aide de deux coupes histologiques10,11 ou au microscope après coulée des vaisseaux cérébraux7,9,12. Toutefois, ces techniques ont l’inconvénient ce navire diamètres sont examinées à des moments définis uniquement.
Selon une précédente étude7, ce manuscrit présente une méthode d’analyse objective et reproductible du vasospasme dans un modèle murin de la SAH. La méthode se base sur la perfusion et le moulage des vaisseaux cérébraux, ex vivo micro-TDM, reconstruction numérique de l’arbre de navire et ultérieures évaluation des volumes des vaisseaux cérébraux ensemble.
Protocol
Les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité de protection des animaux responsable (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) et effectuées conformément à la loi allemande de bien-être Animal (TierSchG). Toutes les directives internationales, nationales et institutionnelles pour le soin et l’utilisation d’animaux ont été suivies.
Dans cette étude, des souris C57BL6 mâles (âgés de 10 à 12 semaines) ont été utilisés. En bref, l’hémorragie sous-arachnoïdienne est induite par la perforation filament endovasculaire sous anesthésie à l’isoflurane. L’artère carotide externe gauche a été préparé par chirurgie. Ensuite, un filament a été inséré dans l’artère carotide externe et avancé de données par l’intermédiaire de l’artère carotide interne qui a été perforé à la carotide T, induisant une hémorragie méningée. Une augmentation de la pression intracrânienne a été prise comme un indicateur de succès endovasculaire perforation. Un protocole détaillé d’un modèle de perforation endovasculaire filament de SAH chez la souris a été publié par d’autres8,14.
1. la perfusion et endovasculaires Casting
- Dans cette étude, la perfusion a été effectuée 72 heures après l’induction de la SAH. Induire l’anesthésie par injection intrapéritonéale de 5 µg/g corps poids corporel midazolam, 30 ng/g poids corporel fentanyl et 0,5 µg/g p.c. medetomidin. Continuez seulement après qu’un niveau suffisant d’anesthésie a été atteint, ce qui est confirmé par l’absence de réactions à des stimuli de douleur.
- Ouvrir le thorax, ponction le ventricule gauche avec une canule de 21G, ouvrez l’oreillette droite et borne l’aorte décrit ailleurs15.
- Effectuer une perfusion de transcardiac en utilisant les solutions suivantes : Phosphate Buffered Saline de Dulbecco (i) contenant du MgCl2 et CaCl2 à pH 7,4 avec 1 g/L de glucose et (ii) solution paraformaldéhyde à 4 %.
- Commencer la perfusion avec solution (i) pendant 2 minutes et passez à la solution (ii) pendant 4 minutes.
- Faire infuser les solutions à une température de 37 ° C et à l’aide d’une pompe sous pression contrôlée avec taux de perfusion variable à perfuse avec une pression constante de 70 mmHg, qui s’est avéré pour être la pression de perfusion optimale pour analyser le vasospasme dans souris16. Éviter une perte de pression lors du passage de la solution (i) à la solution (Ii).
- Après la perfusion de solutions (i) et (ii), continuer la perfusion pendant 20 minutes à température ambiante avec l’agent de distribution radio-opaque (voir Table des matières) à un taux constant de 0,2 ml/min.
- Permettent de polymérisation du matériau radio-opaque coulée à 4 ° C durant la nuit. Puis enlever le cerveau du crâne comme décrit précédemment17, transférer l’échantillon dans la solution à 4 % PFA et stocker l’échantillon à 4 ° C jusqu’au micro de la tomodensitométrie.
2. micro tomographie
- Placer le cerveau au centre d’un tube en plastique avec une pince anatomique émoussée. Choisir un tube avec un diamètre légèrement supérieur à l’échantillon pour s’assurer que l’objet ne bouge pas lors de l’acquisition de l’image. Gaze permet de fermer le tube.
- Fixer le tube en plastique pour le moteur pas à pas micro sur le système de positionnement de-navigation-commande par ordinateur (CNC) dans la cabine de rayons x, dans lequel l’objet pivote autour de son axe horizontal.
- Aligner l’échantillon dans le champ de vision sous radiographie aux rayons x. Pour obtenir le grossissement maximal, placez l’objet aussi près que possible de la source de rayons x et maximiser la distance et le détecteur dans la mesure du possible.
- Utiliser un protocole d’acquisition image étape-and-shoot avec les paramètres de numérisation suivants : définir la durée d’exposition à 1 s pour chaque projection optimiser le rapport signal sur bruit (SNR), tube tension 80 kV (actuel 38 µA), rotation de 360°, résultant en des projections 1 000.
- Pour la reconstruction des données RAW utiliser un algorithme de projection arrière filtré appliquant le filtre Shepp-Logan avec une matrice de voxels 1024 x 1024 x 1024 en utilisant des logiciels de reconstruction (voir Table des matières). Pour une analyse ultérieure importer les données DICOM dans logiciel de visualisation 3D (voir la Table des matières).
3. 3-dimensional Reconstruction de l’arbre vasculaire intracrânienne et la détermination des Volumes de navire
Remarque : Informations générales sur les fonctions du logiciel de visualisation de la trouvera en utilisant la fonction aide.
- Importer données Dicom dans un logiciel de visualisation à l’aide de la fonction Importer.
- Visualiser l’arborescence du navire avec la fonction Volren. Choisissez le seuil de visualisation afin que les grandes artères cérébrales sont représentés en contours pointus. Il est important d’utiliser le même seuil de visualisation pour tous les ensembles de données appartenant à la série expérimentale.
- Pratiquement disséquer les artères cérébrales basales (cercle de Willis) avec la fonction VolumeEdit en entourant les vaisseaux avec le curseur. Ensuite, pratiquement disséquer le segment du navire pour être analysés. Par conséquent, faire pivoter le modèle 3-dimensionnel de l’arbre vasculaire afin de séparer précisément toutes les petites branches de l’artère principale. Il est essentiel pour l’analyse de supprimer tous les navires à l’exception du segment de navire à analyser.
- Appliquer la fonction Autoskeleton avec seuil la valeur seuil de visualisation, qui génère une centre-line -base SpatialGraph.
- Ensuite, appliquez la fonction SpatialGraphToLineSet pour créer un jeu de ligne. Diviser la ligne définie dans ses sous-segments unique en choisissant les sous-segments unique avec le curseur manuellement en cliquant sur « split ». Cette étape est cruciale afin de calculer les volumes de l’unique sous-segments.
- Utilisez la fonction LineSetToSpatialGraph pour créer un graphique spatiale à nouveau.
- Utilisez la fonction SpatialGraphStatistics pour déterminer la longueur, volume et le diamètre de chaque sous-segment. Pour la visualisation de couleur représentant le cours du diamètre du vaisseau, utilisez la fonction SpatialGraphView. La valeur segment Coloriage « épaisseur », qui est en corrélation avec le diamètre du vaisseau. Il est important de choisir la carte de même couleur pour tous les ensembles de données appartenant à la série expérimentale.
- Ajouter les longueurs des sous-segments de déterminer quels sous-segments sont à inclure dans l’analyse. Dans la présente étude, nous avons évalué un segment de vaisseau composé de 1 mm de l’artère carotide interne proximal de la carotide T et 2,5 mm de l’artère cérébrale moyenne et distale de la carotide T. Ajoutez ensuite les volumes afin de déterminer le volume du navire du segment défini navire.
Representative Results
Reconstruction virtuelle de l’arbre vasculaire intracrânienne 3 dimensions
Les 3 dimensions reconstituées arbres vasculaires intracrâniennes fourni une anatomie vasculaire très précise (Figure 1). Afin d’évaluer l’exactitude, nous avons effectué une comparaison de base diamètre entre les diamètres de navire déterminés au microscope et des 3-dimensional reconstructions virtuelles en 2 points anatomiquement définies (1 : gauche artère cérébrale moyenne (MCA) 1 mm distal de la carotidien T ; 2 : droit de MCA distale de la carotide T 1 mm). Détermination microscopique des diamètres de navire, on a utilisé une caméra à haute résolution (Infinity X-21, Deltapix) DeltaPix Insight logiciel version 2.0.1 étalonné par rapport à une échelle du micromètre. Pour cette évaluation, 10 échantillons de cerveau (5 SAH, sham 5) ont été analysés. Il s’agissait d’une série de 12 souris, 7 dont un SAH a été induite, alors que 5 sham opéré (2 animaux du groupe SAH mourut le postopératoires jours 1 et 2, respectivement). Il n’y a aucune différence significative entre les diamètres déterminés au microscope et pratiquement, ce qui indique une reconstruction virtuelle précise de l’anatomie vasculaire intracrânienne (détermination microscopique vs reconstitution virtuelle, moyenne ± écart-type : quitté MCA 150 ± 9 µm vs gauche MCA 150 ± 8 µm ; ce MCA 153 ± 8 µm contre154 ± 9 µm, voir Figure 2).
Quantification du vasospasme cérébral chez des souris au SAH
Afin de quantifier le vasospasme cérébral, (i) le volume d’un segment de vaisseau prédéfinies représentant 3,5 mm, composé de l’artère carotide interne (ICA) de 1 mm et 2,5 mm MCA sur la gauche et (ii) le navire diamètres en 2 points anatomiquement définies (gauche et droite MCA) ont été déterminées dans des échantillons de cerveau de la SAH et animaux opérés (n = 5). Le volume du navire était significativement plus faible dans le SAH comparée à sham (36 ± 4 nL vs 71 ± 9 nL, p < 0,05). Diamètres de navire étaient plus faibles dans le SAH comparée à sham (quitté MCA : 140 µm à ± 11 vs 160 µm ± 10, p = 0,11 ; droit MCA : 130 ± 16 µm contre 158 ± 13 µm, p < 0,05 ; Voir Figure 3), tandis que le niveau de signification a été atteint seulement pour analys est de la bonne MCA.
La figure 1. Reconstruction virtuelle de l’arbre vasculaire intracrânienne. (A) montre un échantillon représentatif de cerveau ; (B) montre le correspondant pratiquement reconstruit arbre vasculaire. (C) code couleur visualisation du diamètre de la gauche MCA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Précision de la reconstruction numérique du système vasculaire. Diamètre moyen mesuré à partir des échantillons de cerveau reconstruit 3D comparées à celles déterminées au microscope. Les données apparaissent comme moyenne ± écart-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Volume du navire et le diamètre du vaisseau après SAH. (A) Comparaison de MCA diamètres mesurés de 3D vascularisation reconstituée en SAH et simulacre de souris. (B) volume de navire en SAH et simulacre de souris. Les données apparaissent comme moyenne ± écart-type de la moyenne. p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Les modèles murins de SAH constituent un outil important pour la recherche fondamentale de SAH. Vasospasme cérébral est fréquemment utilisé comme un point de terminaison dans des études expérimentales étudie les mécanismes conduisant à la DCI après SAH9,11. Cependant, la quantification du vasospasme cérébral chez la souris ou autres petits modèles animaux du SAH sont difficiles. Communément, vasospasme est quantifiée par ex vivo détermination des diamètres de navire aux points anatomiques définis après perfusion endovasculaires et coulée7,9,12 ou par détermination de la circonférence des navires définis sur histologique des sections10,11. Cependant, ces méthodes présentent certains inconvénients : vasospasme est évaluée uniquement à des points anatomiques définis ; vasospasme des voisins des segments vasculaires peut s’échapper d’évaluation. Artefacts histologiques présentent une autre source d’erreurs. En outre, l’évaluation peut être plutôt subjective, parce que la position exacte où le diamètre des vaisseaux est mesuré est déterminée par l’enquêteur.
L’objectif était donc de mettre en place une méthode qui quantifie le vasospasme cérébral en calculant le volume de navire de segments de tout vaisseau cérébral provenant de données d’imagerie transversales7. Le principal avantage de la méthode volumétrique présentée ici est que tout navire segments peuvent être examinés. Ceci évite la nécessité de la définition d’un point où le diamètre des vaisseaux est mesuré. Un autre avantage de l’évaluation des segments de la totalité du bateau, c’est qu’il présente sans doute un paramètre plus objectif afin de quantifier l’angiospasme que la détermination des diamètres de navire à des moments définis où peut échapper à un spasme vasculaire du navire plus proximal ou distal Evaluation. Représentation numérique des diamètres de navire à l’aide d’un code couleur permet d’estimer le degré de vasospasme intuitive. En outre, évaluation volumétrique entraîne des différences plus grandes entre les navires vasospastique par rapport à l’évaluation des diamètres de navire comme le montre les résultats représentatifs. La reconstitution virtuelle obtenue avec la méthode présentée ici reflète l’anatomie vasculaire de façon précise. Ceci est démontré par l’évaluation de la série représentative, de bâtiment, diamètres mesurées au microscope et des reconstitutions numériques ont été similaires, reproduisant les observations d’une précédente étude7. Cependant, malgré ses avantages, autres études sont nécessaires pour évaluer si la méthode présentée ici est supérieure aux méthodes classiques d’analyse de vasospasme.
Une limitation de la méthode présentée ici est qu’il accorde plus de temps par rapport à l’analyse microscopique des échantillons de cerveau coulé ou de faire une analyse histologique (micro tomodensitométrie fois 90 minutes par échantillon de cerveau, traitement des données 45 min par échantillon de cerveau). En outre, la disponibilité des tomodensitomètres micro peut limiter son application. Le nombre d’animaux examinés ici ne suffisait pas à démontrer la faisabilité du protocole décrit dans ce manuscrit. Toutefois, si le protocole doit être utilisé dans les études sur les traitements, animal nombre devra être calculé basé sur les effets attendus sur les volumes de navire et diamètres. Une autre limitation de ceci et d’autres études utilisant des modèles murins de SAH est que ce vasospasme est déterminée ex vivo. Ce qui rend impossible les études longitudinales qui examinent les valeurs de base avant l’induction de la SAH et vasospasme à différents moments. Bien que des études ont démontré qu’il est possible de décrire l’anatomie des gros vaisseaux intracrâniens de souris in vivo à l’aide de la tomographie par résonance magnétique18, tomodensitométrie angiographie19ou soustraction numérique l’angiographie20, ces méthodes, à notre connaissance, n’ont pas encore été utilisés pour analyser le vasospasme cérébral en murine SAH modèles in vivo. À noter, la reconstruction numérique du système vasculaire cérébral avec évaluation volumétrique ultérieure du vasospasme cérébral présentée ici n’est pas limitée à l’usage sur des données ex vivo micro CT. Si l’imagerie vasculaire cérébrale sectionnelle croix haute résolution chez les souris devienne disponible à l’avenir, il pourrait être utilisé pour effectuer une analyse volumétrique de vasospasme in vivo.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Parties de cette étude font partie de la thèse de doctorat de T. Pantel, présenté à la faculté de médecine de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence. L’étude a été financée par la Stiftung libère de Friedhelm et par la Stiftung Neurochirurgische Forschung (subventions aux A.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
| Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
| Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
| Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
| Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
| Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
| PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
| anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
| Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
| DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
| C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |
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