Summary
Цель этой статьи заключается в настоящее время метод, который позволяет 3-мерной реконструкции цереброваскулярные дерева в мышей после микро компьютерная томография и определение объемов всего судна сегментов, которые могут использоваться для количественного определения церебрального спазм сосудов в мышиных моделях субарахноидальное кровоизлияние.
Abstract
Субарахноидальное кровоизлияние (сах) является подтипом геморрагического инсульта. Церебральный спазм сосудов, которая возникает в результате кровотечения является важным фактором, определяющим пациента исход и поэтому часто воспринимается как конечной точкой исследования. Однако в небольших исследованиях на животных на SAH, количественная оценка спазм сосудов головного мозга является серьезной проблемой. Здесь представлен ex vivo метод, который позволяет количественной оценки объемов всего судна сегментов, которые могут быть использованы как объективная мера для количественного определения церебрального спазм сосудов. В качестве первого шага эндоваскулярные литья мозгового сосудистую осуществляется с помощью рентгеноконтрастных литья агента. Затем поперечного сечения визуализации данных приобретают Микро Компьютерная томография. Последний шаг включает 3-мерной реконструкции виртуального сосудистой дерева, следуют алгоритм для вычисления центра линии и объемы сегментов выбранного корабля. Метод в результате высокоточные виртуальная реконструкция цереброваскулярные дерева показано сравнение на основе диаметр анатомических образцов с их виртуальных реконструкций. По сравнению с диаметрами судно только, судно томов выделить различия между вазоспастической и не вазоспастической судов, показано в серии сах и Шам действовали мышей.
Introduction
Aneurysmatic субарахноидальное кровоизлияние (сах), подтип геморрагического инсульта, является распространенным заболеванием в интенсивной терапии neurointensive. Кроме раннего черепно-мозговой травмы (ЕИБ), который включает мозга ущерб, причиненный кровотечение само событие, другим важным фактором, определяющим пациентов результат является задержка церебральной ишемии (DCI), определяется клинической ухудшения через нарушениями мозгового перфузии или ишемии миокарда, не связанные с инвазивной или хирургические процедуры1,2,3. Важные механизмы способствуют DCI являются vasospasms крупных сосудов головного мозга, с одной стороны; с другой стороны микроциркуляторных дисфункции с спазм сосудов микрососудов и microthrombosis и ишемии, связанных с корковой распространяя депрессий играют роль (обзор в Madonald 20141). Таким образом диагностика спазм сосудов большого церебральных сосудов имеет решающее значение в клинической практике и отображает конечную важным во многих клинических и экспериментальных исследованиях.
Несмотря на тот факт, что особенности спазм сосудов в мышиных моделях SAH не непосредственно переданы человеческого пациента, мышиных моделях SAH связанных спазм сосудов были все большее значение в последние годы. В этих моделях SAH индуцируется эндоваскулярных накаливания перфорация4,5,6,7,8, перерезка cisternal судов9, или инъекции крови в спинномозговой жидкости10 ,,1112. В отличие от крупных животных моделей SAH которые традиционно были предназначены для изучения спазм сосудов13мышиных моделях имеют большое преимущество, что многочисленные трансгенных мышей штаммы доступны. Это делает их отличным инструментом для изучения молекулярных механизмов, ведущих к спазм сосудов и DCI. Однако определение мозгового спазм сосудов у мышей является сложной задачей. Это потому, что в отличие от крупных животных моделей, в которых могут рассматриваться спазм сосудов, используя клинические методы визуализации, в естественных условиях imaging для анализа мозгового спазм сосудов в мышах пока недоступна. Таким образом спазм сосудов обычно определяется с помощью либо Гистологические срезы10,11 или микроскопически после литья церебральных сосудов7,9,12. Однако эти методы имеют недостаток этого судна, который диаметры рассматриваются только в определенных точках.
Основываясь на предыдущем исследовании7, эта рукопись представляет метод для объективной и воспроизводимость анализа спазм сосудов в мышиных SAH модели. Метод на основе перфузии и литья церебральных сосудов, ex vivo микро КТ сканирование, цифровой реконструкции дерева судна и последующие оценки объемов всего церебральных сосудов.
Protocol
Эксперименты на животных были утверждены Комитетом ответственного ухода за животными (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) и осуществляется в соответствии с Закон о животных благосостояния Германии (TierSchG). Были соблюдены все применимые международные, национальные и институциональные руководящие принципы ухода и использования животных.
В этом исследовании были использованы C57BL6 мышей-самцов (возраст 10-12 недель). Короче говоря субарахноидальное кровоизлияние было вызвано эндоваскулярных накаливания перфорации под наркозом с изофлюрановая. Левой наружной сонной артерии был подготовлен хирургическим путем. Затем нити был вставлен в наружной сонной артерии и расширенный интракраниально через внутренней сонной артерии, который был перфорированный на сонной артерии T, вызывая субарахноидальное кровоизлияние. Повышение внутричерепного давления было принято как показатель успешного эндоваскулярных перфорации. Подробный протокол эндоваскулярных накаливания перфорация модели SAH мышей был опубликован другими8,14.
1. перфузии и эндоваскулярных литья
- В этом исследовании перфузии была исполнена 72 часа после индукции сах. Вызвать обезболивание, внутрибрюшинно инъекций 5 мкг/г тела вес (bw) мидазолама, 30 фентанила bw нг/г и 0,5 мкг/г bw medetomidin. Продолжить только после того, как достигнут достаточный уровень анестезии, что подтверждается отсутствие реакции на боль раздражителей.
- Откройте грудной клетки, пункции левого желудочка с 21G канюля, открыть правое предсердие и зажим нисходящей аорты, как описано в другом месте15.
- Выполнить transcardiac перфузии, используя следующие решения: (i) Дульбекко фосфат буфер солевой содержащие MgCl2 и2 CaCl при рН 7,4 с глюкозы 1 г/Л и (ii) параформальдегида 4% раствор.
- Запустите перфузии раствором (i) в течение 2 минут и продолжите решение (ii) в течение 4 минут.
- Влить решения при температуре 37 ° C и с помощью насоса под контролем давления с переменной перфузии курс для perfuse с постоянным давлением 70 мм рт.ст., которое было установлено оптимальное перфузии давления для анализа спазм сосудов в мышей16. Избегайте потери давления при переходе из раствора (i) раствор (Ii).
- После перфузии с решениями (i) и (ii), по-прежнему перфузии для 20 минут при комнатной температуре с рентгеноконтрастными литья агентом (см. Таблицу материалы) с постоянной скоростью 0,2 мл/мин.
- Разрешить для отверждения рентгеноконтрастных литье материала при температуре 4 ° C на ночь. Затем удалите мозг от черепа как описано17, передать образец 4% раствор PFA и хранить образца при температуре 4 ° C до микро КТ сканирование.
2. Микро Компьютерная томография
- Место мозга в центре пластиковой трубки с тупым анатомический пинцет. Выбор труб с диаметром чуть больше чем образца убедитесь, что объект не двигаться во время захвата изображений. Используйте марлю, чтобы закрыть трубку.
- Прикрепите пластиковую трубку в микро степпинг мотор на системе позиционирования (CNC) компьютера переход управления в кабине рентгеновского, в котором объект вращается вокруг горизонтальной оси.
- Выровняйте образец в поле зрения под рентгенография. Для достижения максимального увеличения, поместите объект ближе как можно источник рентгеновского излучения и максимально увеличить расстояние до детектора, насколько это возможно.
- Использовать протокол приобретение шаг и стрелять изображения со следующими параметрами сканирования: установите время экспозиции 1 s для каждого проекции оптимизировать соотношение сигнал шум (SNR), трубки напряжение 80 кв (текущий 38 МКА), поворот 360°, что приводит к 1000 прогнозов.
- Для реконструкции RAW-данных использовать отфильтрованную обратной проекции алгоритм применения фильтра МГЭС-Логан с матрицей 1024 x 1024 x 1024 вокселей с помощью восстановления программного обеспечения (см. Таблицу материалы). Для дальнейшего анализа импортировать получившиеся данные DICOM в 3D визуализации программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
3. 3-мерной реконструкция Внутричерепных сосудистых дерево и определение объемов судна
Примечание: Справочная информация о функциях визуализации программного обеспечения можно найти с помощью функции помочь.
- Импорт данных Dicom в визуализации программного обеспечения с помощью функции импорта.
- Визуализируйте судно дерево с помощью функции Volren. Выберите порог визуализации, так что большой церебральных артерий изображены в острые очертания. Важно использовать тот же самый порог визуализации для всех наборов данных, принадлежащих к экспериментальной серии.
- Практически вскрыть базальной церебральных артерий (круг Уиллис) с помощью функции VolumeEdit , окружив судов с курсором. Тогда практически вскрыть сегмента судна для анализа. Таким образом вращайте 3-мерной модели сосудистой дерева для того, чтобы четко отделить все мелкие ветви от основной артерии. Это необходимо для дальнейшего анализа для удаления всех судов, за исключением сегмента судна для анализа.
- Примените функцию Autoskeleton с порогом, равным визуализации порог, который генерирует центр-line -на основе SpatialGraph.
- Затем примените функцию SpatialGraphToLineSet для создания линия набор. Разделите линии в одной подсегментов, вручную выбрав один подсегменты с курсором и на «Сплит». Этот шаг имеет решающее значение для того, чтобы рассчитать объемы одного подсегменты.
- Используйте функцию LineSetToSpatialGraph для создания пространственных график снова.
- Используйте функцию SpatialGraphStatistics для определения длины, объем и диаметр каждого подсегмента. Для цветных визуализации представляющих курс судна диаметра, используйте функцию SpatialGraphView. Установите сегмент окраски «толщина», который коррелирует с диаметром судна. Важно выбрать же карта цветов для всех наборов данных, принадлежащих к экспериментальной серии.
- Добавьте длины подсегменты для определения, какие подсегменты должны быть включены в дальнейшем анализе. В настоящем исследовании мы оценивали судно сегмент, состоящий из 1 внутренней сонной артерии, проксимальной сонной артерии T и 2,5 мм средней мозговой артерии, дистальная сонной артерии т. Затем добавьте тома для определения объема судна определенных судно сегмента.
Representative Results
Виртуальная реконструкция 3-мерной Внутричерепных сосудистых дерева
3-размерно реконструированный Внутричерепных сосудистых деревья предоставил высокоточные сосудистой анатомии (рис. 1). Для оценки точности, мы провели на основе диаметр сравнение диаметров судно, определяется микроскопически и от 3-мерной виртуальных реконструкций в 2 анатомически определенных точках (1: левой средней мозговой артерии (MCA) 1 мм дистальной из сонной T; 2: право MCA 1 мм дистальной сонной артерии T). Микроскопические определения диаметров судна был использован Камера высокого разрешения (Infinity X-21, Deltapix) с DeltaPix понимание программного обеспечения версии 2.0.1 калиброванные к шкале микрометра. Для этой оценки были проанализированы 10 образцов мозга (5 SAH, 5 Шам). Это были из серии 12 мышей, 7 из которых были наведены SAH, хотя 5 прооперировали Шам (2 животных группы SAH умер на послеоперационных суток 1 и 2, соответственно). Без существенных различий между диаметры определяется микроскопически и практически, указав точное виртуальная реконструкция Внутричерепных сосудистых анатомии (микроскопических определение против виртуальная реконструкция, средняя погрешность ± стандарт: слева 150 МКА ± 9 мкм vs. левый 150 МКА ± 8 мкм; прямо 153 МКА ± 8 мкм против154 ± 9 мкм, см Рисунок 2).
Количественная оценка мозгового спазм сосудов у мышей с сах
Для количественного определения церебрального спазм сосудов, являются (i) объем предопределенные представитель 3,5 мм судно сегмент, состоящий из 1 мм внутренней сонной артерии (МКА) и 2,5 мм MCA слева, и (ii судна диаметром в 2 анатомически определенных точках (левый и правый MCA) обнаружены в пробах мозга от сах и Шам эксплуатируемых животных (n = 5). Объем судна был значительно ниже по сравнению с фиктивным SAH (36 ± 4 nL против 71 ± 9 nL, p < 0,05). Диаметры судна были ниже в сах, по сравнению с Шам (слева MCA: 140 мкм ± 11 против 160 ± 10 мкм, p = 0,11; право MCA: 130 ± 16 мкм против 158 ± 13 мкм, p < 0,05; см. Рисунок 3), в то время как уровень значимости был достигнут только для анализ имеет право MCA.
Рисунок 1. Виртуальная реконструкция Внутричерепных сосудистых дерева. (A) показывает пример представителя мозга; (B) показывает, что соответствующие практически реконструкции сосудов дерево. (C) цветом визуализации диаметра слева MCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Точность цифровых реконструкции сосудистую. Средний диаметр измеряется от образцы 3D реконструированный мозга по сравнению с теми микроскопически определяется. Данные отображаются в виде среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Объем судно и судно диаметр после SAH. (A) сравнение MCA диаметров измеряется от 3D реконструированный сосудистую в сах и липовые мышей. (B) судна тома в сах и липовые мышей. Данные отображаются в виде среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Мышиных SAH модели являются важным инструментом для фундаментальных исследований сах. Спазм сосудов головного мозга часто используется в качестве конечной точки в ходе экспериментальных исследований, изучение механизмов, ведущих к DCI после SAH9,11. Однако количественной оценке церебрального спазм сосудов в мышах или других мелких животных моделей SAH является сложной задачей. Обычно спазм сосудов количественно ex vivo определения диаметров судна на определенные Анатомические точки после эндоваскулярного перфузии и литья7,9,12 или определение длины окружности определенных судов на гистологических разделы10,11. Однако, эти методы имеют ряд недостатков: спазм сосудов оценивается только в определенных точках анатомические; спазм сосудов соседних сегментов судно может избежать оценки. Гистологические артефакты представить еще один источник ошибок. Кроме того оценка может быть довольно субъективный, потому что точное положение, где измеряется диаметр сосуда определяется следователь.
Поэтому цель – создать метод, который дает количественную оценку спазм сосудов головного мозга путем расчета объема судна сегментов всего головного судна от поперечного сечения визуализации данных7. Наиболее важным преимуществом объемным методом, представленные здесь является что весь сосуд, которую сегменты могут рассматриваться. Это позволяет избежать необходимости определения точки, где измеряется диаметр сосуда. Еще одно преимущество оценки сегментов всего судна является, что он предположительно представляет более объективного параметра для количественного определения спазм сосудов, чем определения диаметров судна в определенных точках, где спазм сосудов более проксимальных и дистальных судна может бежать оценки. Цифровое представление судна диаметров с использованием цветовой код позволяет интуитивно оценки степени спазм сосудов. Кроме того объемные оценки приводит к более крупные различия между вазоспастической судов, по сравнению с оценки судно диаметра, как показано в результатах представителя. Виртуальная реконструкция, достигнутые с помощью метода, представленные здесь точно отражает сосудистой анатомии. Это показано в ходе оценки представитель серии, в которой судно диаметров измеряется микроскопически и от цифровой реконструкции были похожи, воспроизводя замечания предыдущего исследования7. Однако несмотря на свои преимущества, дополнительные исследования необходимы для оценки ли представленные здесь метод превосходит традиционные методы анализа спазм сосудов.
Ограничение метода, представленные здесь заключается, что он дает больше времени по сравнению с микроскопический анализ образцов литые мозга или гистологический анализ (микро КТ 90 минут в мозг выборки, обработки данных 45 мин на сэмпл мозга). Кроме того наличие микро томографов может ограничить его применение. Количество животных, рассматриваемых здесь было достаточно, чтобы продемонстрировать возможности протокола, описанные в этой рукописи. Однако если протокол должен быть использован в лечении исследования, животных, у чисел будет рассчитываться на основе ожидаемого воздействия на судно томов и диаметров. Еще одним ограничением этого и других исследований, с использованием мышиных моделях SAH — это что спазм сосудов определяется ex vivo. Это делает невозможным продольных исследований, которые расследуют исходных значений перед SAH индукции и спазм сосудов в разное время точках. Хотя исследования показали, что это можно изобразить анатомии большой внутричерепных сосудов мышей в естественных условиях с помощью магнитно-резонансной томографии18, компьютерная томография ангиография19или цифровой вычитание Ангиография20, эти методы, чтобы наши знания, анализировать мозгового спазм сосудов в мышиных SAH модели в vivoпока не используется. Следует отметить цифровой реконструкция мозга сосудистую с последующей объемной оценки мозгового спазм сосудов, представленные здесь не ограничивается использованием ex vivo микро КТ данных. Если изображений высокого разрешения сосудистой крест секционные мозга мышей должны стать доступны в будущем, она может использоваться для выполнения объемный анализ спазм сосудов в естественных условиях.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Части этого исследования являются частью докторской диссертации Pantel т., представленные на медицинский факультет Йоханнеса Гутенберга-университет Майнца. Это исследование было поддержано Фридхельм освобождает Stiftung и Штифтунг Neurochirurgische Тюрингия (гранты для а.н.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
| Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
| Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
| Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
| Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
| Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
| PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
| anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
| Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
| DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
| C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |
References
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Dorsch, N. A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture. Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Friedrich, B., et al. CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).
- Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).
- Terpolilli, N. A., et al. Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).
- Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), e0172010 (2017).
- Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
- Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
- Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M.
- Marjamaa, J., et al. Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries. Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).
- Schambach, S. J., et al. Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels. Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).
- Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
