Summary
Målet med denna artikel är att presentera en metod som möjliggör en 3-dimensionell rekonstruktion av cerebrovaskulära trädet hos möss efter mikro beräknat tomografi och bestämning av volymer av hela fartygssegment som kan användas för att kvantifiera cerebral vasospasm i murina modeller av subarachnoidalblödning.
Abstract
Subarachnoidalblödning (SAH) är en undertyp av hemorragisk stroke. Cerebral vasospasm som uppstår i efterdyningarna av blödningen är en viktig faktor att avgöra patientens resultatet och därför tas ofta som en slutpunkt för studien. Dock i liten djurstudier på SAH är kvantifieringen av cerebral vasospasm en stor utmaning. Här presenteras en ex vivo -metod som tillåter kvantifiering av volymer av hela fartygssegment, som kan användas som ett objektivt mått för att kvantifiera cerebral vasospasm. I ett första steg utförs endovaskulär gjutning av de cerebrala kärl med en röntgentät gjutning agent. Sedan, imaging tvärsnittsdata förvärvas av micro datortomografi. Det sista steget innebär 3-dimensionell rekonstruktion av virtuella vaskulär trädet, följt av en algoritm för att beräkna center linjer och volymer av de valda fartygssegment. Metoden gav en mycket noggrann virtuell rekonstruktion av cerebrovaskulära trädet visas genom en diameter-baserade jämförelse av anatomiska prover med sin virtuella rekonstruktioner. Fartyg volymerna jämfört med fartyget diametrar ensam, och belysa skillnader mellan vasospastisk och icke-vasospastisk fartyg visas i en serie av SAH och sham manövrerade möss.
Introduction
Aneurysmatic subarachnoidalblödning (SAH), en undertyp av hemorragisk stroke, är en vanlig sjukdom i neurointensivvård intensivvårdsavdelningar. Förutom tidig hjärnskada (EBI), som består av cerebral skada orsakad av blödning händelsen i sig, en annan viktig faktor att avgöra patientens resultatet är fördröjd cerebral ischemi (DCI), definieras av klinisk försämring genom nedsatt cerebral perfusion eller cerebral infarkt inte associerade med interventionella eller kirurgiska förfaranden1,2,3. Viktiga mekanismer bidrar till DCI är vasospasms av stora cerebrala kärl dels; Däremot, mikrocirkulatoriska dysfunktion med vasospasm av microvesselsna och microthrombosis och ischemi besläktade kortikala fördelande fördjupningar med en roll (ses i Madonald 20141). Därför, diagnos av vasospasm i de stora cerebrala kärl är avgörande i klinisk praxis och visar en viktig slutpunkt i många kliniska och experimentella studier.
Trots att funktionerna i vasospasm i murina SAH modeller inte är direkt överförbar till mänskliga patienten, murina modeller av SAH relaterade vasospasm har varit av växande betydelse under de senaste åren. I dessa modeller framkallas SAH av endovaskulära glödtråden perforering4,5,6,7,8, transection av cisternal fartyg9eller injektion av blod i GSR10 ,11,12. I motsats till stora djurmodeller av SAH som var traditionellt utformade att studera vasospasm13, har murina modeller den stora fördelen att det finns många transgena möss stammar. Detta gör dem ett utmärkt verktyg för att studera molekylära mekanismer leder till vasospasm och DCI. Bestämning av cerebral vasospasm hos möss är dock utmanande. Detta beror på att i motsats till stora djurmodeller där vasospasm kan undersökas med hjälp av kliniska avbildningstekniker, i vivo imaging för att analysera cerebral vasospasm hos möss inte är ännu tillgängliga. Därför bestäms vanligen vasospasm använder antingen histologiska sektioner10,11 eller mikroskopiskt efter gjutning av cerebrala kärl7,9,12. Dessa tekniker har dock nackdelen att fartyget diametrar undersöks vid definierade punkter endast.
Detta manuskript baserat på en tidigare studie7, och presenterar en metod för mål och reproducerbara analys av vasospasm i en murin SAH-modell. Metoden är baserat på perfusion och gjutning av cerebrala kärl, ex vivo mikro-datortomografi, digital rekonstruktion av fartyget trädet, och efterföljande utvärdering av volymer av hela cerebrala kärl.
Protocol
I djurförsök godkändes av utskottet ansvarig djurvård (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) och utförs i enlighet med tyska djurskyddslagen (TierSchG). Alla tillämpliga internationella, nationella och institutionella riktlinjer för skötsel och användning av djur följs.
I denna studie användes C57BL6 hanmöss (ålder 10-12 veckor). I korthet var subarachnoidalblödning induceras av endovaskulära glödtråden perforering under anestesi med isofluran. Vänster yttre halspulsådern förbereddes kirurgiskt. Sedan var en glödtråd infogas i den yttre halspulsådern och avancerade intracranially genom den interna halspulsådern som var perforerade på halspulsådern T, förmå en subarachnoidalblödning. Intrakraniell tryckökning togs som en indikator på lyckad endovaskulär perforation. Ett detaljerat protokoll av en endovaskulär glödtråden perforering modell för SAH i möss har varit publicerad av andra8,14.
1. perfusion och endovaskulär gjutning
- I denna studie utfördes perfusion 72 timmar efter induktion av SAH. Inducera anestesi genom intraperitonealt injicera 5 µg/g kropp vikt (bw) midazolam, 30 ng/g bw fentanyl och 0,5 µg/g bw medetomidin. Fortsätt bara efter en tillräcklig anestesi har uppnåtts, vilket bekräftas av avsaknad av reaktioner på smärta stimuli.
- Öppna bröstkorgen, punktering vänster kammare med en 21G kanyl, öppna höger förmak och klämma den fallande aortan som beskrivs på annat håll15.
- Utföra en transcardiac perfusion med hjälp av följande lösningar: a Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning innehållande MgCl2 och CaCl2 vid pH 7,4 med 1 g/L glukos och (ii) 4% PARAFORMALDEHYD lösning.
- Starta perfusionen med lösning a i 2 minuter och fortsätt med lösning (ii) i 4 minuter.
- Ingjuta lösningarna vid en temperatur av 37 ° C och med en tryckstyrda pumpen med variabel perfusion ränta för att BEGJUTA med ett konstant tryck på 70 mmHg, som befanns vara den optimala perfusionstrycket att analysera vasospasm i möss16. Undvika en förlust på trycket när du byter från lösning (i) till lösning (Ii).
- Efter perfusion med lösningar (i) och (ii) fortsätta perfusion i 20 minuter vid rumstemperatur med röntgentäta gjutning agent (se Tabell för material) med en konstant hastighet på 0,2 ml/min.
- Tillåt för att bota den röntgentäta gjutning material vid 4 ° C över natten. Ta sedan bort hjärnan från skallen som tidigare beskrivna17, överföra provet till 4% PFA lösning och lagra provet vid 4 ° C tills micro datortomografi.
2. micro datortomografi
- Placera hjärnan i mitten av ett plaströr med en trubbig anatomiska pincetten. Välja en tub med en något större diameter än provet att säkerställa att objektet inte rör sig under bild förvärv. Använd gasväv för att stänga röret.
- Fäst plast röret mikro-stepping motorn på det dator-navigerade-kontroll (CNC) positioneringssystemet i röntgen kabinen, där objektet roteras runt längs dess horisontella axel.
- Rikta in provet i den fält-of-view under röntgen radiografi. För att uppnå maximal förstoring, placera objektet så nära som möjligt till röntgen källan och maximera avståndet till detektorn så långt som möjligt.
- Använda ett steg-och-skjuta bild förvärv protokoll med parametrarna av följande: Ange exponeringstid 1 s för varje projektionen att optimera det signal-brus-förhållandet (SNR), tube spänning 80 kV (nuvarande 38 µA), 360° rotation vilket resulterar i 1.000 prognoser.
- För återuppbyggnad av RAW-Data använda en filtrerad tillbaka projektion algoritm använder Shepp-Logan filtret med en matris av 1024 x 1024 x 1024 voxlar med återuppbyggnad programvara (se Tabell för material). För vidare analys importera resulterande DICOM data till 3D visualiseringsprogram (se Tabell för material).
3. 3-dimensionell rekonstruktion av intrakraniell vaskulära träd och bestämning av fartyget volymer
Obs: Bakgrundsinformation om funktioner av programvaran visualisering kan hittas med hjälp av den funktion som hjälpen.
- Importera Dicom data till visualisering programvara med hjälp av funktionen Importera.
- Visualisera kärl trädet med funktionen Volren. Välja visualisering tröskeln så att den stora cerebrala artärer skildras i skarpa konturer. Det är viktigt att använda samma visualisering tröskelvärde för alla datauppsättningar som tillhör den experimentella serien.
- Praktiskt taget dissekera den basala cerebrala artärer (Circle of Willis) med funktionen VolumeEdit genom att omge kärlen med markören. Sedan nästan dissekera segmentet fartyg ska analyseras. Därför, rotera den 3-dimensionella modellen av vaskulär trädet för att just skilja alla små grenar från pulsådern. Det är viktigt för ytterligare analys att ta bort alla fartyg utom segmentet fartyg ska analyseras.
- Använd funktionen Autoskeleton med tröskelvärde anges till visualisering tröskel, som genererar en center-line -baserat SpatialGraph.
- Applicera sedan, funktionen SpatialGraphToLineSet att skapa en linje set. Dela upp raden Ställ in dess enda delsegmenten genom manuellt välja de enda delsegmenten med markören och klicka på ”split”. Detta steg är avgörande för att beräkna volymerna av de enda delsegmenten.
- Använda funktionen LineSetToSpatialGraph för att skapa en rumslig graf igen.
- Använda funktionen SpatialGraphStatistics för att bestämma längd, volym och diameter på varje delsegment. För färgkodade visualisering som motsvarar kursen av fartyget diameter, använda funktionen SpatialGraphView. Ställ in segmentet färg till ”tjocklek”, som korrelerar med fartyget diameter. Det är viktigt att välja samma färgkarta för alla datamängder tillhör den experimentella serien.
- Lägg längderna på de delsegmenten att avgöra vilka delsegmenten som ska ingå i den vidare analysen. I den aktuella studien utvärderat vi ett fartyg segment bestående av 1 mm av den inre halspulsådern proximala av halspulsådern T och 2,5 mm av den mellersta cerebral artären distala av halspulsådern T. Sedan lägga till volymerna för att bestämma volymen fartyget för segmentet definierade fartyget.
Representative Results
Virtuell rekonstruktion av 3-dimensionell intrakraniell vaskulära trädet
3-dimensionellt rekonstruerade intrakraniell vaskulära träden gav en mycket noggrann vaskulära anatomin (figur 1). För att bedöma riktigheten, vi utfört en diameter-baserade jämförelse mellan fartyget diametrar bestäms mikroskopiskt och från de 3-dimensionella virtuella rekonstruktionerna vid 2 anatomiskt definierade punkter (1: vänster mellersta cerebral artär (MCA) 1 mm distala av den halspulsådern T; 2: höger MCA 1 mm distala av halspulsådern T). För mikroskopisk bestämning av fartyget diametrar användes en högupplöst kamera (Infinity X-21, Deltapix) med DeltaPix Insight programvaruversion 2.0.1 kalibreras till en mikrometer skala. För denna utvärdering analyserades 10 hjärnan prover (5 SAH, 5 sham). Dessa var från en rad 12 möss, i 7 varav en SAH förmåddes, medan 5 sham opererades (2 djur i gruppen SAH dog postoperativ dag 1 och 2, respektive). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan diametrarna bestäms mikroskopiskt och virtuellt, vilket indikerar en korrekt virtuell rekonstruktion av intrakraniell vaskulära anatomin (mikroskopisk bestämning vs. virtuell rekonstruktion, menar ± medelfel: lämnade MCA 150 ± 9 µm vs vänster MCA 150 ± 8 µm; just MCA 153 ± 8 µm vs.154 ± 9 µm, se figur 2).
Kvantifiering av cerebral vasospasm i möss med SAH
För att kvantifiera cerebral vasospasm, a volymen av en fördefinierad representativa 3,5 mm fartyget segment, bestående av 1 mm inre halspulsådern (ICA) och 2,5 mm MCA till vänster, och (ii) fartygets diametrar på 2 anatomiskt definierade punkter (vänster och höger MCA) var bestäms i hjärnan prover från SAH och sham manövrerade djur (n = 5). Fartyget var signifikant lägre i SAH än med placebo (36 ± 4 nL vs. 71 ± 9 nL, p < 0,05). Fartyg diametrar var lägre i SAH än med placebo (lämnade MCA: 140 ± 11 µm vs 160 ± 10 µm, p = 0,11; höger MCA: 130 ± 16 µm vs. 158 ± 13 µm, p < 0,05; se figur 3), medan signifikansnivå nåddes endast för analys är av rätt MCA.
Figur 1. Virtuell rekonstruktion av intrakraniell vaskulära trädet. (A) visar ett representativt hjärnan prov; (B) visar motsvarande nästan rekonstruerade vaskulär träd. (C) färgkodade visualisering av diametern på vänster MCA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Riktigheten av den digital rekonstruktionen av vaskulatur. Genomsnittlig diameter mätt från 3D rekonstruerade hjärnan prover jämfört med dem som fastställts mikroskopiskt. Data visas som medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Fartyg volym och fartyget diameter efter SAH. (A) jämförelse av MCA diametrar mätt från 3D rekonstruerade kärlsystemet i SAH och sham möss. (B) fartygets volym i SAH och sham möss. Data visas som medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet. p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Murina SAH modeller är ett viktigt verktyg för SAH grundforskning. Cerebral vasospasm används ofta som en slutpunkt i experimentella studier som undersöker de mekanismer som leder till DCI efter SAH9,11. Kvantifiering av cerebral vasospasm hos möss eller andra små djurmodeller av SAH emellertid utmanande. Vanligen, kvantifieras vasospasm genom ex vivo bestämning av fartyget diametrar på definierade anatomiska punkter efter endovaskulär perfusion och gjutning7,9,12 eller genom bestämning av omkretsen definierade fartyg på histologiska avsnitt10,11. Dessa metoder har dock vissa nackdelar: Vasospasm utvärderas på definierade anatomiska ställen; vasospasm på angränsande fartygssegment kan undgå utvärdering. Histologiska artefakter presenterar en annan källa till fel. Utvärderingen kan dessutom vara ganska subjektiva, eftersom den exakta positionen där fartyget diametern mäts bestäms av prövaren.
Målet var därför att fastställa en metod som kvantifierar cerebral vasospasm genom beräkning av fartyget volymen av hela cerebral fartygssegment från tvärsnittsdata imaging data7. Den viktigaste fördelen av volymkontrollmetoden som presenteras här är hela fartyget segment kan undersökas. Detta undviker behovet av definitionen av en punkt där fartyget diameter mäts. En ytterligare fördel med utvärderingen av hela fartygssegment är att det förmodligen innehåller en mer objektiv parameter för att kvantifiera vasospasm än bestämning av fartyget diametrar på definierade punkter där vasospasm mer proximala eller distala fartygets kan fly utvärdering. Digital representation av fartyget diametrar med en färgkod tillåter en intuitiv uppskattning av graden av vasospasm. Dessutom leder volymetriska utvärdering till större skillnader mellan vasospastisk fartyg jämfört med utvärdering av fartyget diametrar som visas i de representativa resultat. Virtuella återuppbyggnaden uppnås med metoden presenteras här återspeglar den vaskulära anatomin korrekt. Detta framgår av utvärderingen av representativa serien, i vilka kärl diametrar mätt mikroskopiskt och från de digitala rekonstruktionerna var liknande, reproducera observationerna av en tidigare studie7. Men trots sina fördelar behövs ytterligare studier för att utvärdera huruvida metoden presenteras här är överlägsen konventionella metoder för vasospasm analys.
En begränsning av den metod som presenteras här är att det ger mer tid jämfört med Mikroskopisk analys av gjuten hjärnan prover eller histologiska (micro CT scanning tid 90 minuter per hjärnan prov, databehandling 45 min per hjärnan prov). Tillgängligheten av micro CT scanners kan dessutom begränsa dess användning. Antalet djur undersökt här var tillräcklig för att demonstrera genomförbarheten av det protokoll som beskrivs i detta manuskript. Dock om protokollet bör användas i behandlingsstudier, baserat djur nummer skulle behöva beräknas på de förväntade effekterna på fartyget volymer och diametrar. En annan begränsning av denna och andra studier murina SAH-modeller är att vasospasm är beslutsam ex vivo. Detta gör longitudinella studier omöjligt att undersöker originalplansvärden innan SAH induktion och vasospasm vid olika tidpunkter. Även om studier har visat att det är möjligt att skildra de stora intrakraniella kärl av möss i vivo som med magnetisk resonans tomografi18, datortomografi angiografi19eller digital subtraktion anatomi angiografi20, dessa metoder, att vår kunskap, har ännu inte använts att analysera cerebral vasospasm i murina SAH modeller i vivo. Notera är den digital rekonstruktionen av det cerebrala kärl med efterföljande volymetriska utvärdering av cerebral vasospasm som presenteras här inte begränsat till användning på ex vivo micro CT data. Om hög upplösning vaskulär cross sectional hjärnavbildning hos möss blir tillgängliga i framtiden, kan det användas för att utföra en volymetrisk analys av vasospasm i vivo.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Delar av denna studie är en del av doktorsavhandlingen av T. Pantel, presenteras för den medicinska fakulteten av Johannes Gutenberg-universitetet i Mainz. Studien har finansierats genom den Friedhelm frigör Stiftung och den Stiftung Neurochirurgische Forschung (bidrag till A.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
| Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
| Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
| Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
| Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
| Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
| Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
| PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
| anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
| Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
| DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
| C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |
References
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Dorsch, N. A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture. Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Friedrich, B., et al. CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).
- Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).
- Terpolilli, N. A., et al. Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).
- Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), e0172010 (2017).
- Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
- Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
- Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
- Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M.
- Marjamaa, J., et al. Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries. Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).
- Schambach, S. J., et al. Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels. Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).
- Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
