L’obiettivo di questo articolo è di presentare un metodo che consente una ricostruzione 3-dimensionale dell’albero cerebrovascolare in topi dopo micro tomografia computata e determinazione dei volumi di segmenti vascolari intero che possono essere utilizzati per quantificare il vasospasm cerebrale in modelli murini di emorragia subaracnoidea.
L’emorragia subaracnoidea (SAH) è un sottotipo di ictus emorragico. Vasospasm cerebrale che si verifica all’indomani del sanguinamento è un fattore importante per determinare il risultato paziente e pertanto è spesso preso come un endpoint dello studio. Tuttavia, negli studi sugli animali piccoli su SAH, quantificazione di vasospasm cerebrale è una sfida importante. Qui, viene presentato un metodo ex vivo che permette la quantificazione dei volumi dei segmenti intera imbarcazione, che possono essere utilizzati come una misura oggettiva per quantificare vasospasm cerebrale. In una prima fase, colata di endovascular del vasculature cerebrale viene eseguita utilizzando un agente radiopaco. Quindi, dati a sezione trasversale di formazione immagini sono acquisiti tramite micro tomografia computata. Il passaggio finale consiste nella ricostruzione 3-dimensionale dell’albero vascolare virtuale, seguita da un algoritmo per calcolare il centro linee e volumi dei segmenti vaso selezionato. Il metodo ha provocato una ricostruzione virtuale altamente accurata dell’albero cerebrovascolare mostrato da un confronto basato sul diametro di campioni anatomici con loro ricostruzioni virtuali. Confrontato con diametri di nave da solo, i volumi di nave evidenziano le differenze tra vasi angiospastiche e non angiospastica mostrati in una serie di SAH e topi falsità-azionati.
Aneurysmatic emorragia subaracnoidea (SAH), un sottotipo di ictus emorragico, è una malattia comune nelle unità di cura di neurointensive. Oltre a lesione cerebrale precoce (EBI), che comprende il danno cerebrale causato da spurgo evento stesso, un altro fattore importante determinare l’outcome del paziente è ischemia cerebrale in ritardo (DCI), definito dalla clinica deterioramento attraverso alterata cerebrale aspersione o infarto cerebrale non associato a interventi chirurgici o interventistica1,2,3. Meccanismi importanti che contribuiscono a DCI sono vasospasmo di grandi vasi cerebrali da un lato; d’altra parte, disfunzioni microcircolatorie con vasospasmo di microvasi e microthrombosis e di ischemia legate alla depressione di diffusione corticale svolgono un ruolo (rivisto in Martini 20141). Pertanto, diagnosi di vasospasmo dei grandi vasi cerebrali è di fondamentale importanza nella pratica clinica e viene visualizzato un endpoint importante in molti studi clinici e sperimentali.
Nonostante il fatto che le caratteristiche di vasospasm in modelli murini di SAH non sono direttamente trasferibili ai modelli murini, pazienti umani di SAH vasospasmo correlato sono stati di crescente importanza negli ultimi anni. In questi modelli SAH è indotta da endovascular filamento perforazione4,5,6,7,8, transection del citernale vasi9o iniezione di sangue nel CSF10 ,11,12. Contrariamente ai grandi modelli animali di SAH, che tradizionalmente sono stati progettati per studiare vasospasmo13, modelli murini hanno il grande vantaggio che numerosi ceppi di topi transgenici sono disponibili. Questo li rende un ottimo strumento per studiare i meccanismi molecolari che portano al vasospasmo e DCI. Tuttavia, la determinazione di vasospasm cerebrale nei topi è impegnativo. Infatti, contrariamente ai grandi modelli animali in cui vasospasmo può essere esaminato tramite tecniche di imaging clinici, in vivo imaging per analizzare vasospasm cerebrale nei topi non è ancora disponibile. Di conseguenza, vasospasmo comunemente è determinato usando entrambi di10,di sezioni istologiche11 o microscopicamente dopo fusione dei vasi cerebrali7,9,12. Tuttavia, queste tecniche hanno lo svantaggio di tale nave diametri sono esaminati in punti definiti solo.
Basato su un precedente studio7, questo manoscritto presenta un metodo per obiettivo e analisi riproducibili di vasospasm in un modello murino di SAH. Il metodo si basa sulla perfusione e fusione dei vasi cerebrali, ex vivo l’esame micro-CT, ricostruzione digitale dell’albero della nave e successiva valutazione dei volumi dei vasi cerebrali intero.
Modelli murini di SAH sono uno strumento importante per la ricerca di base SAH. Vasospasm cerebrale è usato frequentemente come un endpoint negli studi sperimentali che studiano i meccanismi che conducono alla DCI dopo SAH9,11. Tuttavia, la quantificazione di vasospasm cerebrale in topi o altri piccoli modelli animali di SAH sono impegnativi. Comunemente, vasospasmo è quantificato tramite ex vivo determinazione dei diametri di nave in punti definiti anatomiche dopo aspersione endovascular e colata7,9,12 o tramite determinazione della circonferenza delle navi definite su istologico sezioni10,11. Tuttavia, questi metodi presentano alcuni svantaggi: Vasospasm viene valutato solo in determinati punti anatomici; vasospasmo delle vicine segmenti vascolari può fuoriuscire la valutazione. Reperti istologici presentano un’altra fonte di errori. Inoltre, la valutazione può essere piuttosto soggettiva, perché la posizione esatta dove viene misurato il diametro del vaso è determinata dallo sperimentatore.
L’obiettivo era pertanto di stabilire un metodo che quantifica il vasospasm cerebrale calcolando il volume del vaso di segmenti di intero vaso cerebrale da formazione immagine a sezione trasversale dati7. Il vantaggio più importante del metodo volumetrico qui presentato è quella intera imbarcazione segmenti possono essere esaminati. Questo evita la necessità della definizione di un punto dove si misura il diametro del vaso. Un ulteriore vantaggio della valutazione di segmenti vascolari intero è che presumibilmente presenta un parametro più oggettivo per quantificare il vasospasmo di determinazione dei diametri di nave in determinati punti dove può fuoriuscire del vasospasmo della nave più prossimale o distale valutazione. Rappresentazione digitale dei diametri vaso utilizzando un codice di colori consente una stima intuitiva del grado di vasospasmo. Inoltre, la valutazione volumetrica conduce a più grandi differenze fra vasi angiospastiche rispetto alla valutazione dei diametri vaso come mostrato nei risultati rappresentativi. La ricostruzione virtuale ottenuta con il metodo presentato qui rispecchia fedelmente l’anatomia vascolare. Ciò è dimostrato dalla valutazione della serie rappresentativa, in cui la nave diametri misurato microscopicamente e dalle ricostruzioni digitali erano simili, che riproduce le osservazioni di un precedente studio7. Tuttavia, nonostante i suoi vantaggi, ulteriori studi sono necessari per valutare o meno il metodo presentato qui è superiore ai convenzionali metodi di analisi di vasospasmo.
Una limitazione del metodo presentato qui è che essa offre più tempo rispetto all’analisi microscopica di campioni di cervello fuso o analisi istologica (micro CT scansione tempo 90 minuti per campione di cervello, elaborazione dati 45 min per campione del cervello). Inoltre, la disponibilità di micro scanner CT può limitarne l’applicazione. Il numero di animali esaminati qui era sufficiente a dimostrare la fattibilità del protocollo descritto in questo manoscritto. Tuttavia, se il protocollo deve essere utilizzato negli studi di trattamento, animale numeri avrebbe dovuto essere calcolato basato sugli effetti attesi sul vaso volumi e diametri. Un’altra limitazione di questo e altri studi utilizzando modelli murini di SAH è che il vasospasm è determinato ex vivo. Questo rende impossibile di studi longitudinali che indagano i valori basali prima di induzione di SAH e vasospasmo in diversi momenti. Anche se gli studi hanno dimostrato che è possibile rappresentare l’anatomia di grandi vasi intracranici di topi in vivo mediante risonanza magnetica tomografia18, angiografia di tomografia computata19o sottrazione digitale L’angiografia20, questi metodi, a nostra conoscenza, non sono ancora stati utilizzati per analizzare vasospasm cerebrale in murino SAH modelli in vivo. Della nota, la ricostruzione digitale del vasculature cerebrale con successiva valutazione volumetrica di vasospasm cerebrale qui presentato non è limitata all’uso su ex vivo micro CT dati. Se alta risoluzione vascolare croce componibile imaging cerebrale in topi dovrebbe diventare disponibile in futuro, potrebbe essere utilizzato per eseguire un’analisi volumetrica del vasospasmo in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Parti di questo studio sono parte della tesi dottorale di T. Pantel, presentata alla facoltà di medicina dell’Università Johannes-Gutenberg di Magonza. Lo studio è stato sostenuto dalla Stiftung Friedhelm libera e la Stiftung Neurochirurgische Forschung (sovvenzioni di A.N.).
Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |