Flyt cytometric analyse har vist verdifull for undersøke ren kulturer og overvåking av mikrobielle samfunn dynamics. Vi presenterer tre omfattende arbeidsflyter fra prøvetaking data analyse, for ren kulturer og komplekse samfunn i klart medium så vel som utfordrende matriser, henholdsvis.
Etterforskningen av ren kulturer og overvåking av mikrobielle samfunn dynamics er avgjørende å forstå og styre naturlige økosystemer og tekniske programmer drevet av mikroorganismer. Neste generasjons sekvensering metoder benyttes mye for å løse microbiomes, men de er generelt ressurs og tid intensiv og levere det meste kvalitativ informasjon. Flyt cytometric microbiome analyse ikke lider av de ulempene og kan gi relativ subcommunity antall og absolutt cell tall på linje. Selv om det ikke leverer direkte Fylogenetiske informasjon, kan det forbedre analyse dybden og oppløsning på sekvensering tilnærminger. I skarp kontrast til medisinske anvendelser i både forskning og praksis innstillinger, er flowcytometri fortsatt ikke mye brukt for microbiome analyse. Mangler informasjon om eksempel forberedelse og data analyse rørledninger kan opprette en barriere for oppføring for forskerne overfor microbiome analyse utfordringer som vil ofte være lærebok flow cytometri programmer. Her presenterer vi tre omfattende arbeidsflyter for ren kulturer, komplekse miljøer i fjerne middels og komplekse samfunn i utfordrende matriser, henholdsvis. Vi beskrive personlige prøvetaking og fiksering prosedyrer og optimalisert Fargeprotokoller for de respektive Prøvesett. Vi detaljerte cytometric analyse med en kompleks forskning sentrert og en søknad fokusert benk toppen enhet, beskriver cellen sortering prosedyre og foreslå analyse datapakker. Vi videre foreslå viktige eksperimentelle kontroller og presentert arbeidsflytene gjelder de respektive Prøvesett.
Mikroorganismer spille en viktig rolle i mange aspekter av menneskelig live. De er de viktigste biotiske driverne av planetene karbon, nitrogen, fosfor og svovel sykluser1og fungere som nedverdigende2,3 , i tillegg til å syntetisere4 biocatalysts i ulike bransjer, som avløpsvann 5 eller bioteknologi6. De utgjør selv den menneskelige microbiome, som direkte påvirker helse og metabolisme7,8. Informasjon om struktur, funksjon og dynamiske oppførselen til mikroorganismer, svar på deres nærmiljø, er derfor nødvendig hvis vi som mål å forstår og manipulere disse systemene. Neste generasjons sekvensering (NGS) er etablert teknologi for å løse microbiome struktur og funksjon9. Imidlertid analyse og evaluering av NGS data kan ikke gi kvantitativ informasjon, og er fortsatt dyrt, tidkrevende og ikke klar til å gi stedet resultater innen ytelse korridorer. Noen bakterier vise generasjon ganger under 1 h og forårsake forandrer samfunnet strukturer i visse miljøer10. Følge slike dynamikk, vil bruke sekvensering tilnærminger overskride av økonomiske og arbeidsstyrke antall mest vitenskapelige laboratorier.
I motsetning kan flowcytometri gi samfunnet fingeravtrykk ligner NGS data, samtidig som en høyere tid-, arbeids- og kostnad-effektiv. Her presenterer vi flyt cytometric teknikker kunne følge mikrobielle samfunn dynamics på linje på enkeltcelle nivå. I motsetning til NGS, flowcytometri gir ikke Fylogenetiske tilknytning eller informasjon på funksjonell gener, men leverer kvantitative cellen tallene. Bruker flowcytometri, kan mikrobielle samfunn som løses inn i subcommunities med forskjellige lys scatter og fluorescens egenskaper (fremover scatter (FSC) og siden xy (SSC) gir indikasjoner på Cellestørrelse og detaljnivå, henholdsvis). Presentert tilnærming benytter hovedsakelig celle størrelse – og DNA beløp relatert informasjon som er knyttet til bestemte celletyper og fysiologiske (vekst) stater. DNA innholdet er kvantifisert bruker UV-nervøs 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fargestoff, som binder seg til A-T rike regioner av DNA og kan selv løse ulike chromosomal nivåer. Ved å kombinere DAPI fluorescens og FSC kan mer enn 50 subcommunities skilles og overvåket for å endre antall over tid11. Subcommunity overflod variasjoner kan være korrelert med endringer i micro-miljøbestemt omgivelsene, for eksempel pH og produkt titers12, med globale parametere, for eksempel vær13,14, eller ved gut eller spytt microbiomes med visse medisinske behandlinger15. Slike sammenhenger avsløre nøkkel subcommunities ansvarlig for bestemte funksjoner i metabolske nettverket av hele samfunnet. De sentrale subcommunities kan deretter være spesielt forfremmet undertrykt ved å endre de omkringliggende mikro-miljøene eller sortert for påfølgende sekvensering15 eller proteomic undersøkelse16.
Imidlertid er mikrobielle samfunn flowcytometri ikke ennå mye etablert av ganske lav mange vannføring cytometric enheter i stand til å løse mikrobielle populasjoner eller samfunn riktig. Videre kan mangel på erfaring, samfunnet analyse rørledninger og effektiv data evaluering utgjøre en barriere for oppføring for forskere overfor microbiome analyse utfordringer. Vi har etablert omfattende arbeidsflyter for å håndtere disse spørsmålene. For å illustrere sin generelle anvendelige, vil vi presentere dem på tre eksemplarisk eksempel sett (supplerende fil 1-S1), nemlig jeg) en ren kultur (PC) for bioteknologisk programmer vokst i definerte klart medium (Pseudomonas putida KT 2440 på glukose), ii) en kompleks lab samfunnet i klart medium (aktivslam samfunnet (ASC) i syntetisk avløpsvann) og iii) en kompleks samfunnet fra naturlige omgivelser i en tett matrise (biogass samfunnet (BC) i mais ensilasje).
Flere faktorer påvirker protokollen valg for hver av disse Prøvesett. Dype fryser avkall på bruk av giftige kjemikalier, men er stort sett begrenset til lab-miljøer på grunn av bruk av flytende nitrogen for sjokk frosting. Formaldehyd stabilisering og påfølgende etanol fiksering lar bulk prøvetaking uten behov for aliquot forberedelse og har vist seg for å være stabil over lengre perioder. Imidlertid kan proteinrik prøver som humant spytt15 være problematisk, fordi protein flocs, denaturized av formaldehyd, kan forårsake ugunstige signal til støy forhold. Eksempel tørking tar mest tid (ca 1 time totalt) av prosedyrene i denne sammenligningen, men kan utføres på nettstedet uten giftige kjemikalier. Det gir stabil pellets i rør, som lett kan transporteres uten kjøling eller ekstra fare forholdsregler. I tillegg er mange alternativ fiksering metoder foreslått11. Vi anbefaler for å teste forskjellige protokoller oppløsning og fiksering stabilitet når introdusere nye Prøvesett.
Vi brukte to forskjellige strømnings cytometers analysere settene: i) en svært sofistikert og dyrt, forskning sentrert cellen sorter og ii) et program fokusert benk toppen analyserer som synes mer passende for på stedet program5. BC ble målt med benk toppen analysator, mens PC og ASC ble målt med cellen sorter. Analyse av tre eksemplarisk eksempel angir nødvendige ulike prosedyrer for optimalisert reproduserbarhet, utvalg stabilitet og arbeidsflyt bekvemmelighet. Følgende protokollen angir delene for tre ulike systemer.
En vellykket analyse av mikrobielle populasjoner og samfunn krever godt avstemt cytometers, et passende valg av cellen og en pålitelig arbeidsflyt fra prøvetaking og fiksering mot mål og data evalueringen. Parameterne merkede cellen må consort med tilgjengelig eksitasjon bølgelengdene. Vi bruker og anbefaler DAPI, som er svært følsomme i lave konsentrasjoner; men må bli opphisset av en UV-laser, som vanligvis ikke består i standard cytometer set-ups. Andre fargestoffer, som SYBR grønne jeg også flekken hele befolkninger og samfunn, men generelt leverer dårligere oppløsninger. Vi anbefaler ikke bruke fisk prosedyrer eller levedyktighet tester i mikrobielle samfunn. Disse metodene er umulig å kvantifisere, kontrollere og styre fordi deres effekter på individuelle arter i samfunnet er usikker. De kan ikke være pålitelig testet, så lenge en betydelig andel av de typiske samfunnene er fortsatt ikke tilgjengelig som en ren kultur.
Avgjørende skritt i protokollen inkludere prøvetaking og fiksering prosedyrer samt celle sortering. Prøvetaking kan kompliseres av tendensen til visse ren kulturer og mikrobielle samfunn å samle til flocs eller følge partikler av prøven matrix. Det er viktig å spre disse aggregater og skille cellene i en prøve før du introduserer dem til flyt cytometric analyse garantere pålitelige resultater. Presentert forberedelse protokollene var optimalisert for å aktivere enkelt celle analyse. Et siste 50 µm filtreringssystem utføres før målet å fjerne eventuelle gjenværende aggregater og forhindre 70 µm munnstykket av cellen sorter og flyt cuvette av analysator tetter. Celle flocs fra renseanlegg er spesielt rikelig, robust og avgjørende for funksjonen av systemet. Vi undersøkt den planktoniske og slam basert mikrobielle samfunn i forskjellige tanker med et fullskala avløpsrenseanlegg, teste i etablerte protokollen. Slam danne celle aggregater var tydelig utsvevende og samfunnet sammensetningen stabilt. Videre vist planktoniske og slam-basert samfunn bemerkelsesverdig likhet mellom dem i alle tre samplet tanker (Figur 8, utfyllende fil 1-S10). Disse resultatene ble bekreftet av komparative 16S rDNA amplicon sekvensering av en frisk-, en formaldehyd behandlet-, en formaldehyd og etanol fikserte-, og en sortert eksempel10. Likevel kan svært utfordrende miljøprøver, som sterke biofilm eller bakterier som vokser i tett koblet kjeder, være umulig å forsvinne. Jordprøver kan være spesielt problematisk, allestedsnærværende partikler vises i histogrammet og kan skjule cellene av ren overflod. I slike tilfeller må tradisjonelle sekvensering metoder brukes.
Fiksering stabiliteten i hver nye Prøvesett bør testes før utforme eksperimentet garantere resultat gyldighet. God fiksering stabilitet aktiverer også gruppert flekker og måling av flere fargeprøver tid på en enkelt dag. Dessuten muliggjør replikering målinger og retrospektiv celle sortering av avgjørende tidspunkt etter konklusjonen og endelige evalueringen av eksperimentet. Fiksering stabiliteten av ren kultur ble bekreftet over 28 dager (figur 9). For på stedet eksperimenter inkludert eksempel transport, bør fiksering stabiliteten testes over lengre perioder (i dette tilfellet 60 dager for aktivslam samfunnet, 195 dager for biogass samfunnet, utfyllende fil 1-S9).
Den flekker er vanligvis ikke problematisk, men må kontrolleres med biologiske standard at program bioinformatic evaluering verktøy. Vi brukte narr belastningen E. coli BL21 (DE3), som var fiksert i henhold til ASC-protokollen og stockpiled for bruk i alle flekker batch.
Bortsett fra DAPI, SYBR Green jeg har vært anvendt for å løse mikrobielle samfunn for flere år14,23,24,25,26. SYBR Green kan jeg løse samfunn i høy og lav nukleinsyre delsett (HNA og LNA) bruke levende celler i en online modus. DAPI, men er mer spesifikk i sin binding til DNA og gjør æren av over 50 subcommunities i en Prøvesett men krever litt fiksering før flekker.
Cellen sortering er en enestående funksjon av denne tilnærmingen og kan brukes hvis visse subcommunities videre rundt. Det må understrekes at verken PFA-(utført i bare 30 min) eller etanol behandling eller DAPI flekker10 hadde en negativ effekt på den påfølgende 16S amplicon sekvensering. Potensialet påvirker av fiksering og Ning-prosedyrer på subcommunity metagenome analyser fortsatt må testes.
Mye informasjon på samfunnet funksjoner og trend dynamics kan fås uavhengig av sortering tilnærming når den involverer Bioinformatikk verktøy som løse samfunnsfunksjoner på en virtuell celle for celle-nivå og koble disse funksjonene med abiotiske parametere.
Nylig, mange nye bioinformatikk evaluering verktøy, nyttig for både SYBR grønne jeg og DAPI tilnærminger, er utviklet for å løse cytometric samfunnet mønstre. Dette er FlowFP27, pakker brukt i denne studien (flowCHIC20, flowCyBar28) deconvolution modell etablert med ferskvann samfunn29 og et verktøy som brukes til å diskriminere stammer ifølge deres fysiologiske egenskaper30. I tillegg cytometric mangfold kan være bestemt25 og selv stabilitet egenskaper av mikrobielle samfunn kan nå bli etterfulgt med en online verktøyet10.
Flow cytometric analyser har dermed en stor fordel når det gjelder rask vurdering av mikrobielle samfunn og mulig abiotiske parameteren sammenhenger. Det er imidlertid fortsatt begrensninger for metoden. Det kan ikke brukes virkelig online med flowCyBar verktøyet, på grunn av erfarne basert gate innstilling prosedyren. Videre forhånd utvikling av skreddersydde, brukervennlig flyt cytometers sterkt spredning av flyt cytometric microbiome analyse tilnærming. Første skritt i denne retningen er foretatt28.
Fremtidige anvendelser av mikrobielle flowcytometri kan være seg i microbial ecology, som det tillater høyfrekvent overvåking innen bakteriell generasjon ganger og det har vist at økologiske paradigmer gjelder cytometric data5 ,10. Metoden er veldig nyttig for rutinemessig screenings av som obligatorisk drikkevann kontrollene i Sveits31. Det kan også være et verdifullt verktøy for medisinske anvendelser som menneskelige15 eller dyr32 microbiome screening. Siste utviklingen i bioinformatikk kan i tillegg aktivere mikrobiell flowcytometri å være en integrert sensor i prosessen kontrollene administrerte mikrobiell systemer. Mikrobiell samfunnet cytometri gir også en screening verktøyet celle sortering, hvilke innrømmer høyere oppløsning genomisk undersøkelser av bestemt samfunnet delsett.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner takknemlig Michael Jahn og Yuting Guo for å gi framgangsmåten og datasett ren kulturen og aktivert slam samfunnet, henholdsvis. Vi takker ytterligere Katrin Mörters for å analysere biogass samfunnet prøvene. Dette arbeidet ble finansiert av Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, prosjektet biogass-fingeravtrykk Nr. 22008313) på vegne av det tyske føderale ministeriet for mat og landbruk (BMEL), det sentrale innovasjonsprogram for SMB (ZIM) føderale departementet økonomiske saker og energi (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, prosjektet behovsbetinget produksjon von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), det tyske føderale ministeriet for utdanning og Forskning (BMBF) (FZK 03XP0041G) og Helmholtz foreningens Program-orientert finansiering (POF III R31 tema 3 bioenergi).
Milli-Q system Synthesis A10 | Merck, Darmstadt, (GER) | ||
BioPak Ultrafiltration Cartridge | Merck, Darmstadt, (GER) | CDUF BI0 01 | |
MoFlo Legacy cell sorter | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
Innova 90C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 334 nm – 364 nm, 100 mW | |
Innova 70C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Genesis MX488-500 STM OPS | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Xcyte CY-355-150 | Lumentum, Milpitas, California, USA | 355 nm, 150 mW | |
Photomultiplier tubes R928 and R3896 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
Summit 4.3 software | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
1 µm FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F8815 | 350/440 blue fluorescent |
2 μm YG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-8827 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 18339 | 360/407 |
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 17458 | 360/407 blue fluorescent |
1 µmYG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-13081 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7447-40-7 | |
Cyflow Space | Sysmex Corporation, Kobe (Japan) | ||
UV Laser Genesis CX, | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 355 nm, 150 mW | |
H6779-32 series PMTs | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
FloMax software | Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER) | ||
all optical filters | Carl Zeiss, Jena (GER) | ||
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6781.3 | |
FlowJo 10.0.8r1 | FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) | Build number: 42398 | |
R-software v.3.4.3 | R Core Team | ||
flowCHIC | http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html | ||
flowCyBar | http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html |