Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Karakterisere Microbiome Dynamics-flowcytometri basert arbeidsflyter fra ren kulturer naturlig samfunn

doi: 10.3791/58033 Published: July 12, 2018

Summary

Flyt cytometric analyse har vist verdifull for undersøke ren kulturer og overvåking av mikrobielle samfunn dynamics. Vi presenterer tre omfattende arbeidsflyter fra prøvetaking data analyse, for ren kulturer og komplekse samfunn i klart medium så vel som utfordrende matriser, henholdsvis.

Abstract

Etterforskningen av ren kulturer og overvåking av mikrobielle samfunn dynamics er avgjørende å forstå og styre naturlige økosystemer og tekniske programmer drevet av mikroorganismer. Neste generasjons sekvensering metoder benyttes mye for å løse microbiomes, men de er generelt ressurs og tid intensiv og levere det meste kvalitativ informasjon. Flyt cytometric microbiome analyse ikke lider av de ulempene og kan gi relativ subcommunity antall og absolutt cell tall på linje. Selv om det ikke leverer direkte Fylogenetiske informasjon, kan det forbedre analyse dybden og oppløsning på sekvensering tilnærminger. I skarp kontrast til medisinske anvendelser i både forskning og praksis innstillinger, er flowcytometri fortsatt ikke mye brukt for microbiome analyse. Mangler informasjon om eksempel forberedelse og data analyse rørledninger kan opprette en barriere for oppføring for forskerne overfor microbiome analyse utfordringer som vil ofte være lærebok flow cytometri programmer. Her presenterer vi tre omfattende arbeidsflyter for ren kulturer, komplekse miljøer i fjerne middels og komplekse samfunn i utfordrende matriser, henholdsvis. Vi beskrive personlige prøvetaking og fiksering prosedyrer og optimalisert Fargeprotokoller for de respektive Prøvesett. Vi detaljerte cytometric analyse med en kompleks forskning sentrert og en søknad fokusert benk toppen enhet, beskriver cellen sortering prosedyre og foreslå analyse datapakker. Vi videre foreslå viktige eksperimentelle kontroller og presentert arbeidsflytene gjelder de respektive Prøvesett.

Introduction

Mikroorganismer spille en viktig rolle i mange aspekter av menneskelig live. De er de viktigste biotiske driverne av planetene karbon, nitrogen, fosfor og svovel sykluser1og fungere som nedverdigende2,3 , i tillegg til å syntetisere4 biocatalysts i ulike bransjer, som avløpsvann 5 eller bioteknologi6. De utgjør selv den menneskelige microbiome, som direkte påvirker helse og metabolisme7,8. Informasjon om struktur, funksjon og dynamiske oppførselen til mikroorganismer, svar på deres nærmiljø, er derfor nødvendig hvis vi som mål å forstår og manipulere disse systemene. Neste generasjons sekvensering (NGS) er etablert teknologi for å løse microbiome struktur og funksjon9. Imidlertid analyse og evaluering av NGS data kan ikke gi kvantitativ informasjon, og er fortsatt dyrt, tidkrevende og ikke klar til å gi stedet resultater innen ytelse korridorer. Noen bakterier vise generasjon ganger under 1 h og forårsake forandrer samfunnet strukturer i visse miljøer10. Følge slike dynamikk, vil bruke sekvensering tilnærminger overskride av økonomiske og arbeidsstyrke antall mest vitenskapelige laboratorier.

I motsetning kan flowcytometri gi samfunnet fingeravtrykk ligner NGS data, samtidig som en høyere tid-, arbeids- og kostnad-effektiv. Her presenterer vi flyt cytometric teknikker kunne følge mikrobielle samfunn dynamics på linje på enkeltcelle nivå. I motsetning til NGS, flowcytometri gir ikke Fylogenetiske tilknytning eller informasjon på funksjonell gener, men leverer kvantitative cellen tallene. Bruker flowcytometri, kan mikrobielle samfunn som løses inn i subcommunities med forskjellige lys scatter og fluorescens egenskaper (fremover scatter (FSC) og siden xy (SSC) gir indikasjoner på Cellestørrelse og detaljnivå, henholdsvis). Presentert tilnærming benytter hovedsakelig celle størrelse - og DNA beløp relatert informasjon som er knyttet til bestemte celletyper og fysiologiske (vekst) stater. DNA innholdet er kvantifisert bruker UV-nervøs 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fargestoff, som binder seg til A-T rike regioner av DNA og kan selv løse ulike chromosomal nivåer. Ved å kombinere DAPI fluorescens og FSC kan mer enn 50 subcommunities skilles og overvåket for å endre antall over tid11. Subcommunity overflod variasjoner kan være korrelert med endringer i micro-miljøbestemt omgivelsene, for eksempel pH og produkt titers12, med globale parametere, for eksempel vær13,14, eller ved gut eller spytt microbiomes med visse medisinske behandlinger15. Slike sammenhenger avsløre nøkkel subcommunities ansvarlig for bestemte funksjoner i metabolske nettverket av hele samfunnet. De sentrale subcommunities kan deretter være spesielt forfremmet undertrykt ved å endre de omkringliggende mikro-miljøene eller sortert for påfølgende sekvensering15 eller proteomic undersøkelse16.

Imidlertid er mikrobielle samfunn flowcytometri ikke ennå mye etablert av ganske lav mange vannføring cytometric enheter i stand til å løse mikrobielle populasjoner eller samfunn riktig. Videre kan mangel på erfaring, samfunnet analyse rørledninger og effektiv data evaluering utgjøre en barriere for oppføring for forskere overfor microbiome analyse utfordringer. Vi har etablert omfattende arbeidsflyter for å håndtere disse spørsmålene. For å illustrere sin generelle anvendelige, vil vi presentere dem på tre eksemplarisk eksempel sett (supplerende fil 1-S1), nemlig jeg) en ren kultur (PC) for bioteknologisk programmer vokst i definerte klart medium (Pseudomonas putida KT 2440 på glukose), ii) en kompleks lab samfunnet i klart medium (aktivslam samfunnet (ASC) i syntetisk avløpsvann) og iii) en kompleks samfunnet fra naturlige omgivelser i en tett matrise (biogass samfunnet (BC) i mais ensilasje).

Flere faktorer påvirker protokollen valg for hver av disse Prøvesett. Dype fryser avkall på bruk av giftige kjemikalier, men er stort sett begrenset til lab-miljøer på grunn av bruk av flytende nitrogen for sjokk frosting. Formaldehyd stabilisering og påfølgende etanol fiksering lar bulk prøvetaking uten behov for aliquot forberedelse og har vist seg for å være stabil over lengre perioder. Imidlertid kan proteinrik prøver som humant spytt15 være problematisk, fordi protein flocs, denaturized av formaldehyd, kan forårsake ugunstige signal til støy forhold. Eksempel tørking tar mest tid (ca 1 time totalt) av prosedyrene i denne sammenligningen, men kan utføres på nettstedet uten giftige kjemikalier. Det gir stabil pellets i rør, som lett kan transporteres uten kjøling eller ekstra fare forholdsregler. I tillegg er mange alternativ fiksering metoder foreslått11. Vi anbefaler for å teste forskjellige protokoller oppløsning og fiksering stabilitet når introdusere nye Prøvesett.

Vi brukte to forskjellige strømnings cytometers analysere settene: i) en svært sofistikert og dyrt, forskning sentrert cellen sorter og ii) et program fokusert benk toppen analyserer som synes mer passende for på stedet program5. BC ble målt med benk toppen analysator, mens PC og ASC ble målt med cellen sorter. Analyse av tre eksemplarisk eksempel angir nødvendige ulike prosedyrer for optimalisert reproduserbarhet, utvalg stabilitet og arbeidsflyt bekvemmelighet. Følgende protokollen angir delene for tre ulike systemer.

Protocol

1. prøvetaking og fiksering

  1. Ren kultur: dype fryser15,17
    1. Ta 2 mL celle suspensjon, sentrifuge for 5 min ved romtemperatur (RT) og 5000 x g og kast nedbryting.
      Merk: Samplet celle suspensjon beskrives supplerende fil 1-S1.
    2. Resuspend cellene i 1 mL av fosfat bufret saltvann (PBS, 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl med bi-destillert H2O, pH 7.2) i tillegg som inneholder 15% (v/v) glyserol som en cryoprotective agent.
    3. Inkuber i 10 min på is og sjokk fryse i flytende nitrogen for påfølgende lagring på-80 ° C.
      Merk: Protokollen kan pauses her. Prøvene er stabile i minst en måned.
  2. Aktivert slam samfunnet: formaldehyd stabilisering + etanol fiksering5,10,18
    1. Ta 4 mL i cellen suspensjon sentrifuge for 20 min på 15 ° C og 3200 x g og kast nedbryting.
      Merk: Samplet celle suspensjon beskrives supplerende fil 1-S1.
    2. Legg 4 mL 2% formaldehyd i PBS og ruge i 30 min på RT.
      1. Forberede 8% formaldehyd lagerløsning fra paraformaldehyde å unngå spare additiv metanol lagt til formaldehyd i flytende form. Legge til 4 g paraformaldehyde 50 mL av PBS på 70 ° C. Legge til ca 125 µL av 10 M NaOH løsning. Rør til paraformaldehyde har helt oppløst og la det så avkjølt til RT. justere pH-verdi til 7.0 med omtrent 100 µL 37% HCl. fryse formaldehyd løsningen i 15 mL dele for lagring. Ikke bruk tint dele lengre enn 10 dager.
        FORSIKTIG: Formaldehyd må håndteres og kastes med forsiktighet på grunn av giftige og mutagene egenskapene. Alltid bruk hansker under behandling av den. Bruk en eksos hette mens oppløsning på paraformaldehyde for å hindre eksponering for giftige gasser.
    3. Sentrifuge utvalget for 10 min 15 ° C og 3200 x g og kast nedbryting.
    4. Resuspend prøven i 4 mL 70% etanol og butikk på 20 ° C.
      Merk: Protokollen kan pauses her. Prøvene er stabile i minst 2 måneder. Avhengig av egenskapene eksempel kan sentrifugering trinnet i 1.2.1 også utføres for 10 min på 4 ° C å spare tid.
  3. Biogass samfunnet: tørking
    1. Bruk et avkuttet 1000 µL pipette tips å prøve 200 µL av flytende digestate til en 2 mL tube.
    2. Legg 1700 µL PBS bufferen og bland godt.
    3. Plassere rør i ultralydbad på 35 kHz og 80 W effektiv utgangseffekt for 1 min for å oppløse store celle aggregater og koble celler stikker for å plante celle rester.
    4. Bland prøven grundig, filtrere utvalget gjennom en 50 µL maske filter og dele filtratet i fire dele 400 µL.
      Merk: Forbereder dele på dette punktet gir to store fordeler. Første, mindre volumer er enklere og raskere å dewater mekanisk (sentrifuger) og termisk (tørking), men prøvetaking av små volumer fra vanligvis tykk biogass slam kan være svært utfordrende. Andre, ekstra prøver kan brukes for påfølgende celle sortering, backup mål eller kontroller.
    5. Sentrifuge dele to ganger for 10 min på 10 ° C og 4000 x g og kast nedbryting helt begge ganger til mekanisk dewater prøven så grundig som mulig.
    6. Tørr eksemplene i en oppvarmet vakuum centrifuge for 40 minutter til 35 ° C, ca-97 kPa og 2500 x g opprette stabil pellets. Lagre pellets på 4 ° C i mørket.
      Merk: Protokollen kan pauses her. Pellets er stabile i minst 6 måneder.

2. flekk

Merk: DAPI flekker har vist seg for å levere høy oppløsning dot tomter og er derfor spesielt fordelaktig når du analyserer samfunn. DAPI konsentrasjonen i flekker løsningen må optimaliseres for å garantere en celle gate fluorescens intensitet godt over støynivået men under perler. Optimal avhengig av instrumentet følsomhet og perlen valg, kan variere mellom Prøvesett på grunn av G/C innhold av inneholdt mikroorganismer og generelt bør testes for nylig introduserte Prøvesett. Testing konsentrasjoner mellom 0,24 µM DAPI og 1 µM DAPI anbefales for presentert oppsett. Andre fargestoffer brukes for bestemte programmer. Bruk av en SYBR grønn jeg flekker protokollen anbefales når absolutte cellereferansen teller nøyaktighet prioriteres over fingeravtrykk analyse (supplerende fil 1-S1)6,15. Den inneholder mindre eksempel håndtering og sentrifugering trinn gjelder både faste og viktig cellene. Bruk av vitale celler ytterligere reduserer eksempel håndtering trinn ved å hoppe over fiksering og dermed krever bare én sentrifugering for cellen høsting. Dette minimerer mulig tap av cellen og følgelig systematisk måling feil. PBS permeabilization buffer og flekker løsning brukes under alle følgende skal filtreres gjennom 0,2 µm sprøyte filtre for å redusere ytterligere partikkel belastning i utvalget. Farging av ett utvalg som inneholder Escherichia coli BL21 (DE3) som en biologisk standard med hver prøve pool anbefales.

  1. Ren kultur
    1. Defrost prøvene, sentrifuge for 5 min på RT og 5000 x g og forkaste nedbryting.
    2. Resuspend celle pellet i iskaldt PBS av gjentatte pipettering og justere OD700nm til 0.035 (banen lengdecuvette = 0,5 cm).
    3. Forberede cellene flekker.
      1. Sentrifuge 1 mL av justert celle suspensjon for 5 min på RT og 5000 x g og kast nedbryting.
      2. Resuspend cellene i 1 mL av permeabilization buffer med 0,3 M sitronsyre og 4.1 mM Tween20 og bland godt.
      3. Inkuber utvalget for 10 min på is opprette permeable cellemembraner for påfølgende flekker.
      4. Sentrifuge utvalget for 5 min på RT og 5000 x g og kast nedbryting.
    4. Legg 1 mL av flekker løsning som inneholder 0.68 µM DAPI 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffer (289 mM Na2HPO4, 128 mM NaH2PO4 med bi-destillert H2O, pH 7), mikse og Inkuber i minst 15 min på RT i mørket.
      Merk: Presis OD justering er avgjørende å garantere sammenlignbare målinger fordi DAPI fluorescens varierer med cellen tetthet hvis DAPI konsentrasjonen holdes konstant. Nedbryting bør fjernes nøye på grunn av generelt skjøre pellets å hindre tap av cellen.
      FORSIKTIG: Håndtere og kast DAPI med forsiktighet på grunn av egenskapene mutagene.
  2. Aktivert slam samfunnet
    1. Bland fast prøven godt og overføre 0,6 mL i røret. Legg til 1,4 mL PBS og sonicate i 10 min på RT som beskrevet i trinn 1.3.3. Sentrifuge utvalget for 10 min 4 ° C og 3200 x g og fjerne nedbryting. Legg 2 mL PBS og bland godt. Sonicate i 5 minutter.
    2. Justere OD700nm til 0.035 (banen lengdecuvette = 0,5 cm) med PBS.
    3. Forberede cellene flekker.
      1. Sentrifuge utvalget for 10 min 4 ° C og 3200 x g og fjerne nedbryting.
      2. Resuspend cellene i 1 mL av permeabilization buffer inneholder 0,11 M sitronsyre og 4.1 mM Tween20 og bland godt.
      3. Inkuber etter 20 min på RT opprette permeable cellemembraner for påfølgende flekker.
      4. Sentrifuge prøven igjen for 10 min 4 ° C og 3200 x g og fjerne nedbryting.
    4. Legg 2 mL flekker løsning som inneholder 0.68 µM DAPI og 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffer, bland godt og ruge minst 60 min på RT i mørket.
      Merk: Bruk av BILLEDRØR rådet, visse mikroorganismer gjerne overholde plastrør veggene og gå tapt under prosessen. Rugende er natten også mulig og vanligvis forenkler laboratorium prosedyrer.
      Advarsel: DAPI må være behandlet og solgt med forsiktighet på grunn av egenskapene mutagene.
  3. Biogass samfunnet
    1. Avbryte tørket celle pellet PBS.
      1. Legg 800 µL av PBS, bland godt og la pellet suge i 15 min.
      2. Sug opp flytende fase med en 1000 µL pipette og gå til gjennomvåt pellets til sylindriske av rør med Pipetter spissen. Det bør holde det.
      3. Flytte pipette spissen i en sirkelbevegelse å squash pellet langs røret veggene.
      4. Vask den resulterende slurry av rør veggene ved dispensering flytende fase fra pipette spissen langs røret veggen.
      5. Agitere suspensjon av aspirating og deaktivere det i pipette tre ganger.
    2. Vask prøven med PBS to ganger.
      1. Sentrifuge for 5 min på 10 ° C og 4000 x g og kast nedbryting.
      2. Legg 1500 µL av PBS og bland godt.
      3. Gjenta de to trinnene ovenfor en gang.
    3. Plassere rør i ultralydbad for 1 min som beskrevet i trinn 1.3.3, og deretter filtrere hver prøve gjennom en 50 µL maske filter i en individuell røret.
    4. Fortynne 2 mL prøve å OD700nm 0.035 (banen lengdecuvette = 0,5 cm) med PBS.
    5. Forberede cellene flekker som forklart i trinn 2.2.3 ovenfor.
    6. Legg 2 mL flekker løsning som inneholder 0,24 µM DAPI og 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffer, bland godt og ruge over natten på RT i mørket.
      Advarsel: DAPI må være behandlet og solgt med forsiktighet på grunn av egenskapene mutagene.

3. måling

Merk: De eksemplarisk Prøvesett ble analysert med to forskjellige strømnings cytometers. PC og ASC ble analysert med mer komplekse, svært justerbar og lett tilpasses, sentrert celle sortering. For PC analyse, denne enheten var utstyrt med en laser satt opp som beskrevet i forrige publikasjonen16, kort sagt en blå (488 nm, 400 mW) og en ultrafiolett (334-364 nm, 100 mW) argon ion laser. For ASC analyse, nyere blå (488 nm, 400 mW) og ultrafiolett (355 nm, 150 mW) semiconductor lasere ble installert. I begge tilfeller forårsaket blå laser FSC (Båndpassdesign filter 488 nm ± 5 nm, Nøytralfilter 1,9) og SSC (Båndpassdesign filter 488 nm ± 5 nm, Nøytralfilter 1,9, utløser). Disse optiske kjennetegn er knyttet til Cellestørrelse og celle tetthet, henholdsvis. UV lasere glade DAPI fluorescens (Båndpassdesign filter 450 nm ± 32,5 nm) for kvantifisering av mobilnettet DNA innhold. Fluidic systemet ble kjørt på 56 psi (3.86 bar) med eksempel overtrykk på maksimal 0,3 psi og en 70 μm dyse. Alle parametrene innspilt som topp høydene istedet for topp områder å forbedre måling oppløsningen. Langsiktig overvåking av biogass samfunnet ble gjennomført med den mindre kompleks, flyt cuvette basert, benk toppen analyzer. En ultrafiolett semiconductor laser (355 nm, 50 mW) ble brukt til å indusere FSC (Båndpassdesign filter 355 nm ± 5 nm) og SSC (Båndpassdesign filter 355 nm ± 5 nm, utløser) signaler og opphisse DAPI fluorescens (Båndpassdesign filter 455 nm C). Vann brukt til skjede bufferen for begge enhetene var bi-destillert og 0,1 µm filtrert. PBS brukes for eksempel fortynning skal filtreres gjennom 0,2 µm sprøyte filtre for å fjerne partikkel støy i målinger som mulig.

  1. Ren kultur og aktivert slam samfunnet
    1. Starte instrument, laser, datamaskin og programvare, og forberede seg for eksempel analyse.
      1. Slå på lasere og kjøre i 15 min å nå brukstemperaturen og sikre strålen stabilitet.
      2. Fyll på slire med 10 x skjede buffer (19 mM KH2PO4, 38 mM KCl, 166 mM Na2HPO4, 1.39 M NaCl med bi-destillert H2O) fortynnet med bi-destillert H2O til en 0,2 x fungerende løsning (cell sortering: 0,5 x fungerende løsning).
      3. Prime fluidic systemet med 56 psi press og avfall tanken med ca 6 psi vakuum.
      4. Kjøre instrumentet for minimum 15 min i etterskuddsvis for å skylle eksempel havnen, rør og munnstykke.
    2. Kalibrere med standard perler.
      1. Forberede perle mikser kalibreringen i den lineære (1 μm blå + 2 μm gul-grønne fluorescerende) og logaritmisk utvalg (0,5 μm og 1 μm blå fluorescerende). Fortynne perle suspensjon fra de opprinnelige lager suspensjoner å oppnå like konsentrasjoner.
      2. Kontinuerlig måler lineær perle mix og passer perle toppene til en forhåndsinnstilt kalibrering mal ved å manipulere munnstykket og laser optikk posisjoner før kalibrering apparatet lineær området.
      3. Bytt til logaritmisk området og kontinuerlig måler logaritmisk perle mix. Passe perle toppene til deres forhåndsinnstilte kalibrering mal å finjustere maskinvaren i maskinen. Siste justeringene til perle posisjon bruke innstillingen gevinst av photomultiplier tuber (PMTs).
      4. Kontroller posisjonen til instrumental støy og muligens Juster den tilpasses malen kalibrering.
        Merk: En fast kalibrering mal for plasseringen av perler må være forberedt før en måling prosjektet og kan ikke endres (se utfyllende fil 1-S4)! Instrumental støy kan indusert ved partikler i utvalget eller elektronisk støy av i PMTs og alltid registreres til en viss grad. Det er ikke tilrådelig å skjule støy helt gevinst justering eller plottet forskyvning. Overflod og plasseringen av støy hendelser kan være en verdifull kilde til informasjon og bør derfor oppbevares i rådataene. Veldig partikkel intensiv prøver kan nødvendiggjøre påfølgende fjerning av støy for plotting og data analyse grunner. Kontrollere kalibreringen i regelmessig under en måling dag å garantere instrument stabilitet og derfor prøve sammenlignbarhet.
    3. Måle et utvalg som inneholder biologiske standarden som beskrevet i 2.1.4 (DAPI farget Escherichia coli BL21 (DE3), samplet og fast i stillestående fasen (16 h) i henhold til ASC protokollen beskrevet i 1.2). Sjekk toppen posisjon i forhold til deres forhåndsinnstilte kalibrering mal (se utfyllende fil 1-S5).
      Merk: Rutinemessig flekker og måling av biologiske standard med hver pool av prøvene vil også tjene som en intern kontroll for farging prosedyren. Hvis enheten er kalibrert med perler og biologiske standarden ikke passer forhåndsinnstilte kalibrering malen, må farging prosedyren sannsynligvis gjentas.
    4. Prøven oppkjøp.
      1. Kjør flekker løsningen for 10 min å skyll eksempel havnen og rør og sikre stabilitet i DAPI fluorescens i etterfølgende prøvene.
      2. Filtrere farget prøven med en 50 μm maske filter før målet å forhindre tilstopping av cytometer munnstykket eller flyte kapillær.
      3. Legge til logaritmisk perle mix prøven overvåker instrument stabiliteten og gir muligheten for en retrospektiv kalibrering sjekk. Prøvene skal inneholde mellom 1000 og 2500 begivenheter i hver av de to perle portene.
      4. Opprette en celle gate i Maskinprogramvar under første prøve målinger av nye Prøvesett. Denne porten skal inneholde farget cellene og utelate støy og perler.
      5. Bland prøvene og måle med en maksimal hastighet på 3000 hendelser s-1 til 250 000 celler (fellesskap) eller 50 000 celler (ren kulturer) er funnet innenfor cellen porten.
        Merk: Disse celletall velges basert på erfaring med Prøvesett. Forskjellige antall kan brukes å skifte bakdelen mellom måler effektiviteten og gjenkjenning av lav overflod subcommunities i begge retninger.
        Feilsøking: Plutselig intra-måling Skift av perle og celle posisjon kan være forårsaket av luftbobler fanget i munnstykket. Dette nødvendiggjør fjerning og rengjøring av munnstykket og skylling av fluidic med slire buffer. Apparatet må justeres etter remounting munnstykket (start med trinn 3.1.2).
      6. Etterskuddsvis apparatet grundig med slire buffer før avslutning og bytte prøver.
  2. Biogass samfunnet
    1. Start apparatet, laser, datamaskin og programvare for å forberede for eksempel analyse.
      1. Etterskuddsvis minst 6 mL skjede bufferen (bi-destillert H2O) gjennom rør og prøve port inn en løst tilknyttet tube funksjonen "skjede væske prime" instrument programvaren.
      2. Måle bi-destillert H2O på 5 µL s-1 skylle fluidic systemet til mindre enn 200 hendelser s-1 er oppdaget på den vanlige strømningshastighet på 0,5 µL s-1.
    2. Kalibrere systemet.
      1. Klargjør perle blandingen (0,5 μm og 1 μm blå fluorescerende). Fortynne perle suspensjon fra de opprinnelige lager løsningene for å oppnå samme konsentrasjoner.
      2. Kontinuerlig måler perle blandingen i logg4 området og passer perle toppene til deres forhåndsinnstilte kalibrering mal ved å manipulere flyt cuvette og laser optikk stillingene. Utføre endelige justeringer i perle posisjon med innstillingen gevinst i PMTs.
    3. Kontrollere kalibreringen med biologiske standarden som beskrevet i trinn 3.1.3.
    4. Prøven oppkjøp.
      1. Fortynne 400 µL av farget utvalg i 1600 µL av PBS, måle det og overvåke hendelsesteller for å teste konsentrasjon.
        Merk: Justert fortynning priser kan være nødvendig for andre prøvekilder. Hendelsesantallet må ikke overstige 1200 hendelser s-1 i partikkel rike prøver å hindre oppløsning tap i fremover scatter (negativ eksempel i supplerende fil 1-S2). Ren kulturer kan måles med opptil 2000 hendelser s-1.
      2. Opprette en celle gate i Maskinprogramvar under disse første prøve målingene. Denne porten skal inneholde farget cellene og ekskludere støy og perler.
      3. Fortynne prøven Ifølge resultatene av konsentrasjon testen kjøres på maks 1200 totale hendelser s-1 og legge perle blandingen til prøven overvåker instrument stabilitet og gir muligheten for en retrospektiv kalibrering sjekk. Prøvene skal inneholde mellom 1000 og 2500 begivenheter i hver av de to perle portene.
      4. Bland og måle prøven til 250 000 celler (fellesskap) eller 50 000 celler (ren kulturer) er funnet innenfor cellen porten.
      5. Skyll apparatet grundig med bi-destillert H2O før avslutning og bytte eksempler.

4. celle sortering

Merk: Cellen sortering prosedyren krever ekstra instrument satt opp og utføres etter publiserte protokoller12.

  1. Oppstart og kalibrere maskinen som beskrevet i trinn 3.1.1-3.1.3, men bruke en 0,5 x fungerende løsning skjede bufferen.
  2. Angi DD frekvens og DD amplituden finne brekke-av slippverktøy.
  3. Montere nedbøyning platene, lader dem og avgjøre for 2 - eller 4-veis sorteringsmodus.
  4. Utføre intern slipp forsinkelse kalibreringen med 2 μm gul-grønne perler å definere tidsrommet som tar en partikkel eller cellen å reise fra avhør Velg (laser hits celle) den siste dråpen knyttet til datastrømmen.
  5. Sortere 6 ganger 20 perler på et glass lysbilde og telle dem med et mikroskop for å kontrollere slipp forsinkelse kalibreringen.
  6. Forbered malen for sortering gate.
  7. Bruk av "single-og en-slipp: høyeste renhet 99%" med en hastighet ikke høyere enn 2500 totalt hendelser s-1 hvis du vil sortere 500.000 celler i maksimalt 4 porter samtidig (4-veis Sorteringsmodus).
  8. Høste celler med sentrifugering (20 000 x g, 6 ° C, 25 min) og fryse pellet på 20 ° C for senere DNA isolasjon og sekvenser.
    Merk: Unngå sortering celler i porten med mindre enn 5% relativ overflod, som sortering er omvendt forhold til relative overflod. De individuelle trinnene er beskrevet i detalj i cellen sorter manuelt. Nødvendig cellen tallene er sterkt avhengig av de respektive brukstilfeller og utvinning protokoller. Mange metoder er brukt: ddPCR (1000 celler17,19), 16S rDNA eller mcrA amplicon sekvenser (500.000 celler6,10,15) og Proteomikk (opp til 1,1 x 107 celler 16,17). Cellen sorteringen vil være spesielt fordelaktig kombinert med en metagenomics tilnærming på grunn av lavere mangfoldet i de sorterte subcommunities.
    Forsiktig: Berør ikke deflektor platene under sortering prosedyren på grunn av høye spenninger.

5. analyse

Merk: Cytometric målingen gir "flowcytometri standard".fcs datafiler med en generelt uniform datastruktur. Men forskjellige cytometer produsenter bruker litt tilpasset versjoner og eldre instrumenter kan predate 2010 innføring av siste FCS standard 3.1. Dette kan føre til dot tomten skalering problemer, hvilke forhindre direkte sammenligning av resultatene samlet med instrumenter. De individuelle datapunktene lagres imidlertid alltid på linjene i en matrise med de respektive scatter og fluorescens intensitet verdier i forskjellige kolonner. Presentert microbiome analyse rørledningene bruker den karakteristiske Cellestørrelse og DNA innhold for å beskrive mikrobiell subcommunities. Disse parameterne er korrelert til FSC og DAPI fluorescens kanal intensiteten (cellen sorter: FL-4, analyzer: FL-1) og resultatet i subcommunity klynger når visualisert todimensjonal FSC vs DAPI fluorescens tomter. Disse dot tomter tillate tolkningen og analyse av flyt cytometri data og skaleres vanligvis logaritmisk. De kan vises fra .fcs filer ved hjelp av proprietære cytometer programvare eller tredjepart løsninger og er grunnlaget for automatisert (Cytometric histogrammet bilde sammenligningen ELEGANTE) og semi-automatisert (Cytometric Barcoding, CyBar) fellesskapet analyse.

  1. Cytometric histogrammet bilde sammenligning
    Merk: Koden, detaljert dokumentasjon og en håndbok for denne pakken er tilgjengelig på http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. De har også blitt publisert20.
    1. Installere og laste inn R-pakke, arbeidsmappen som inneholder .fcs filer og sette opp en filliste ved å kjøre:
      > kilde ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Angi arbeidsmappen til banen der filene dine FCS ligger
      > # Skriver du inn banen i anførselstegn
      > setwd("")
      > # Hente en liste over filnavnene til FCS filene ligger i arbeidsmappen
      > filer <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Hente en liste over filnavnene på FCS-filene som er inkludert i pakken
      > filer <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + full = sann, mønster = "*.fcs")
      > # Lese filen for første FCS som flowFrame
      > ramme < - Les. FCS(files[1],alter.Names=True,Transformation=False)
      > # Hente en liste med parameteren/kanal navn
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. Opprette bilder for cytometric rådata ved å kjøre funksjonen "fcs_to_img" pakken:
      > # Opprette histogrammet bildene benytter standardparametere
      > fcs_to_img(files)
    3. Definere delsett av histogrammet bildene ved å kjøre funksjonen "img_sub" pakken:
      > # Opprette histogrammet bilde delsett med standardparametere
      > img_sub (filer, ch1 = "FS. Log",CH2="fl.4.log")
    4. Beregn verdiene overlapping og XOR å gjennomføre bildeanalyse av funksjonen "calculate_overlaps_xor" pakken:
      > # Lagre navnene på alle delsett bildene som en liste
      > delsett <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Beregne overlapping og XOR bilder og skrive verdiene til to nye filer
      > resultatene <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. Opprette ikke-metrisk flerdimensjonale skalering (NMDS) tomter for likheten analyse av funksjonen "plot_nmds" pakken:
      > # Viser en NMDS tomt prøvene
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. Cytometric Barcoding
    Merk: Koden, detaljert dokumentasjon og en håndbok for denne pakken er tilgjengelig på http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. De har også blitt publisert11,12.
    1. Utvikle en master gate mal for bruk på alle prøvene.
      1. Legg .fcs filene i analyseprogramvare ved hjelp av dra og slipp-funksjonalitet.
      2. Dobbeltklikk et mål og velg x - og y - aksen parameterne respektive rullegardinlistene åpne et FSC vs DAPI fluorescens plott.
      3. Bruk polygonverktøyet for å reprodusere celle porten tidligere å kontrollere antall analysert celler i trinn 3.1.4.5 og 3.2.4.4 og navn deretter. Dra oppføringen celle gate i eksempellisten gruppen for alle prøver å samle det.
      4. Dobbeltklikk cellen porten og korrigere aksen oppgaven med å visualisere celle gate hendelsene.
      5. Definerer subcommunities utbredt i eksempelsettet med verktøyet for elliptisk gates etter de publiserte retningslinjer12 bruk skanning av SSC eller en annen tredje parameteren21 til å sikre integriteten til malen gate. Basseng, kontrollere og justere subcommunity tildeling på andre prøvene.
    2. Eksportere de relative subcommunity antall i en txt-fil for bruk i skriptet R.
      1. Åpne tabellen redaktøren med Rediger-kategorien.
      2. Legge til kolonner for hver subcommunity som ble definert i trinn 5.2.1.5 og angi utgang statistikken til "frekvens overordnede" og navngi dem.
      3. Opprette tabellen i "Tabellredigering" etter velger lagring format og målmappen.
        Merk: Analyseprogramvare gir direkte relativ subcommunity dyp. De kan også fås gjennom delingen av hendelsesantallet i individuelle subcommunity porten av hendelsesantallet i cellen porten. Verdiene må lagres i en tabulatordelt matrise i en txt-fil som ikke kan inneholde n.a. felt og må noen ekstra kravene å bli lest av R koden (se bruksanvisningen og FAQ for spesifikke instruksjoner).
    3. Installere og laste inn R-pakke og laste dataene ved å kjøre:
      > kilde ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Skriver du inn banen i anførselstegn
      > setwd("")
      > # Last datasett
      > data(Cell_number_sample)
      > # Vis data
      > Cell_number_sample [, -1]
    4. Normalisere den relative abundances av funksjonen "normalisere" pakke:
      # Normalisere data, skrive ut 2 sifre
      Normalize(Cell_number_sample[,-1],Digits=2)
    5. Opprette en strekkode av den normaliserte og en Bokstegning av den opprinnelige relative abundances av funksjonen "cybar_plot" pakken:
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Plot med standardparametere
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. Opprette en NMDS handlingen i den opprinnelige relative abundances.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # NMDS tomt normalisert cel tall
      > nmds(Normalized_mean)
    7. Opprette korrelasjon analyse av den normaliserte relative abundances og andre parametere av funksjonen "sammenheng" pakke:
      > # Last datasett
      > data(Corr_data_sample)
      > # Viser korrelasjon verdier
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Kjør korrelasjon analyse
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Merk: CHIC og CyBar bruker relative antall. Men kan flowcytometri også bestemme absolutt tall, som kan være av stor interesse for bioteknologisk programmer. For å fastslå hvor absolutt, deles antall celler i porten rundt analysert utvalg volumet. Analysert utvalg volumet kan bestemmes ved å legge perle hjuloppheng med en kjent konsentrasjon i prøven (formelen i supplerende fil 1-S7). Benk toppen analysatoren er i tillegg utstyrt med en ekte volumetriske telling funksjon som direkte kvantifiserer volumet i prøven røret under målingen. Det anbefales å bruke en SYBR grønn flekker protokollen for cellen opptelling.

Representative Results

Følgende representant resultater understreke på nødvendigheten av replikat og eksemplifiserer ulike data visualisering og analyse teknikker på hver av de tre Prøvesett. De viser resultatene av mulige data evaluering rørledninger egnet for standard forskning spørsmål om settet. Presentert teknikker er imidlertid ikke eksklusivt til prøven som de blir presentert med. Flow cytometri rådata ble gjort offentlig tilgjengelig med FlowRepository ID FR-FCM-ZY46. Tidligere er lastet opp ASC-data tilgjengelig under ID FR-FCM-ZYD7.

Biologiske og tekniske gjentak ble tatt, forberedt og analysert ifølge publiserte protokoller11. Biologiske gjentak fra PC og ASC ble tatt fra tre parallelle flasker. Biologiske gjentak av ble tatt som tre påfølgende prøvetaking på ett sted i en pilot skala plante. Tre dele ett utvalg var fast, beiset og analysert slik teknisk reproduserbarhet. Metoder reproduserbarhet ble vurdert i henhold til tidligere publiserte prosedyrer11. En gate mal for alle prøver av en Prøvesett (supplerende fil 1-S6) ble brukt til å beregne standardavviket (%) per port.

For PC var maksimal standardavviket for relative overflod 3.44%, mens gjennomsnittlig standardavviket var 2.13% (figur 1). ASC og BC var de maksimale standardavvikene av den relative abundances 1.27% og 0,88%, mens gjennomsnitt av på standardavvikene var 2.13% og 0,21% (supplerende fil 1-I8).

En standard prosedyre når undersøker en ren belastning kultur, er utarbeidelsen av en vekstkurve analysere lag fase, generasjon ganger og celle tetthet under bestemte forhold. Vi kombinerte denne prosedyren med flyt cytometric analyse arbeidsflyten å oppnå en dypere forståelse av systemet (figur 2). The FSC vs DAPI fluorescens plott avslører celle syklus statene kultur på ulike tidspunkter i batch kultur. En master gate mal (supplerende fil 1-S6) ble etablert for å kvantifisere andelen av celler med en (c1n), to (c2n) og flere kromosomene (cXn, figur 2B). Den dominerende andelen av inokulerte celler hadde bare ett kromosom (93.7% på 0 h). Dette endret seg drastisk under eksponentiell vekst, der nesten alle celler inneholdt mer enn én (99.6%, 4 h) og over halvparten av befolkningen (53.1%) selv inneholdt mer enn to kromosomer. Dette illustrerer P. putidas evne til å reprodusere sine kromosomene raskere enn sin generasjon.

Flyt cytometric analyse har vist seg svært nyttig for å overvåke utviklingen av mikrobielle samfunn. Det kan følge samfunnet dynamics mye nærmere enn mer ressurs intensiv genetiske metoder5,10. Vi merket denne dynamikken i en film og fikk en oversikt av aktivslam samfunnet endringer over tid. Hver ett sekund ramme viser en FSC vs DAPI fluorescens tomt et prøvepunkt (supplerende fil 2). En veldig distinkt skifte mellom 0 og dagen 4 ble fulgt av etableringen av en kjerne samfunnet etter dag 7. Ytterligere subcommunities kom i dag 21. Vi etablert en master gate mal (supplerende fil 1-S6) aktivert evalueringen av mikrobielle dynamics på subcommunity nivå. De dominerende subcommunities i ulike stadier av eksperimentet ble klart identifisert ved hjelp av verktøyet CyBar (Figur 3). Kombinere det med frekvens distribusjon av de relative subcommunity antall hjalp å velge portene som er interessant (betydelig endring i overflod utløst på et viktig tidspunkt) og levedyktig (over 5% relativ overflod) for sortering og ytterligere analyse22.

Industriell skala bioreactor programmer kan møte potensielle romlige heterogeneities på grunn av agitasjon begrensninger. De er også ofte utsatt for skiftende operative parametere, som muligheter i kvaliteten på ikke-syntetisk underlag. BC representerer et slikt system og samplede fra ulike lokaliteter i dynamiske plug flyt reaktoren. The FSC vs DAPI fluorescens tomter (Figur 4) eksemplarisk prøvepunktene viser bare litt romlig, men uttales timelige heterogenitet. BC ble videre undersøkt med både det rask automatisert elegant og mer detaljert master gate malen CyBar tilnærming.

Den automatiserte, raske og upartiske naturen gjør elegant spesielt interessant for på stedet kontroll av bioprocesses i en industriell setting. Den sammenligner rå .fcs dataene for alle tilgjengelige prøver. To av disse sammenligningene vises i figur 5. Resultatverdiene dissimilarity bekrefter forrige observasjoner om romlige og tidsmessige heterogenitet. NMDS tomter generert skjemaet ELEGANTE verktøy dissimilarity matrix (figur 6) videre substantiates dette resultatet og visualiserer den tilsvarende.

I tillegg beregnet vi den relative abundances av 23 subcommunities av hjelp av en master gate mal (supplerende fil 1-S6). En korrelasjon analyse av 48 prøver fra en ett års periode ble utført for å forstå funksjonelle relasjoner i mikrobiell samfunnet. Dette kan bidra til å identifisere portene av interesse for videre undersøkelser (4 celle sortering). Sterke positive eller negative sammenhenger med abiotiske parametere som produktet titers kan hjelpe å forstå og optimalisere økosystemer og bioteknologisk prosesser. Organisk lasting hastigheten i denne sammenhengen (figur 7) eksemplifiserer slik en abiotiske parameter. G5, G4 og G10 exhibit sterke positive sammenhenger og muligens kan inneholde fermentative arter, stund det negative korrelasjonen i G8 kan hint mot konsentrasjonen archaea.

Figure 1
Figur 1: reproduserbarhet av cytometric analyse av ren kulturen. FSC vs DAPI fluorescens tegnes med kontroll perler (A, B) og bar tomter 3 subcommunity antall [%] med feilfelt representerer ± ett standardavvik (C, D). Den relative abundances var bestemt med malen gate i supplerende fil 1-S6. Tre biologiske gjentak A, B og C ble tatt av vekstkurve på 4 h og tre tekniske gjentak P1, P2, P3 var forberedt fra utvalg A og målt tre ganger, henholdsvis: M1, M2, M3, og deres respektive standardavvik. 50.000 hendelser ble innspilt i cellen porten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: cellen syklus analyse av ren kultur tatt under en vekstkurve eksperimentere over 12 h. (A). FSC vs DAPI fluorescens tomter av bi-time prøvetaking som viser et skifte av DNA innholdet i eksponensiell vekst fasen. Denne målingen serien inkluderer ikke perler (se utfyllende fil 1-S3). (B). optisk tetthet-baserte vekstkurve med feilfelt representerer ± ett standardavvik og relative antall i subcommunities over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: utviklingen av aktivslam samfunnet over 24 dager. (A) flowCyBar med overliggende frekvens distribusjoner visualisert i boxplots for individuelle porter som er ordnet av likheten av trender, tilsvarende farge nøkkel (B) og en likhet analyse i en NMDS plot vidd R < 0,001 ( C). de underliggende tomtene vises i filmen rekkefølgen supplerende fil 2. Relative antall ble bestemt ved hjelp av malen gate i supplerende fil 1 - S6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: romlige og tidsmessige heterogenitet av mikrobielle samfunn i industriell skala plugg flyt biogass reaktoren. (A) sammenligningen av mikrobielle samfunn fire prøvetaking porter I-IV dag 223. (B) sammenligningen av tid avhengig fellesskap strukturen varianter fra dag 0 dag 384 port II. Støy har blitt kuttet belatedly for å forsterke effekten. 250.000 hendelser ble målt i cellen porten (supplerende fil 1-S6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Cytometric histogrammet bilde sammenligning-CHIC. Prinsippet om ELEGANTE algoritmen er eksemplifisert ved å sammenligne to utvalgene som representerer romlige og tidsmessige heterogenitet, henholdsvis. (i) ELEGANTE bilder opprettes fra .fcs filer når du har valgt to parametere for å vise (FSC vs DAPI fluorescens). I gråtoner (0-255) koder hendelsesantallet i en piksel. (ii) ELEGANTE delsett genereres etter angir området med celler (her: 200 < x < 4000, 200 < y < 2200). (iii) XOR kombinasjon bildet opprettet ved å sammenligne piksler mellom delsettene. Ingen forskjell er lik 0, og vises som svart. Maksimal forskjell er lik 200 og vises som hvite. Den tilsvarende XOR-verdien beregnes ved å legge grå skaleringsverdiene for alle pikslene i bildet XOR. (iv) kombinasjon overleggsbildet opprettes ved å legge til gråskala verdiene for bildepunktene delsettene. Tilsvarende overlegg verdien beregnes ved å telle pikslene i et overleggsbilde som ikke er lik null og derfor inneholde opplysninger. (v) dissimilarity verdiene beregnes ved å dele XOR og overlegg. Dette er grunnlaget for NMDS handlingen i figur 6. Både dissimilarity verdiene og NMDS handlingen Vis en ubetydelig romlig- og en uttalt timelige samfunnet heterogenitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: CHIC basert likheten analyse av biogass samfunnet prøvene. 0 dager prøven ble ekskludert fra denne tomten på grunn av svært forskjellige samfunnet strukturen forvrenge analysen (supplerende fil 1-S11). NMDS handlingen bekrefter forutsetningen om lav romlig- og høyere timelige heterogenitet laget ved hjelp av verktøyet CHIC og forklart i figur 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: korrelasjon analyse på biogass samfunnet. Matrix ble beregnet med Spearmans stigende rekkefølge koeffisient og er basert på den relative abundances av 23 subcommunities som var med master gate malen i supplerende fil 1-S6. De var korrelert med organisk lasting hastighet (OLR) for 48 prøver fra en ett-års periode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: likheten analyse av planktoniske (P) og slam basert (S) lokalsamfunn i avløpsvann. Prøvene ble tatt fra den primære clarifier (PCL), aktivert slam bassenget (AS) og digester tank (DT) av et fullskala avløpsrenseanlegg (dot tomter i supplerende fil 1-S10). Relative antall ble bestemt ved hjelp av malen gate i supplerende fil 1-S6. Disse subcommunity antall ble også analysert med flowCyBar for å opprette en CyBar (supplerende fil 1-S10) og NMDS plot (R < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: fiksering stabilitet av ren kultur. Prøver fra vekst kurve eksperimentet tatt på 0t ble lagret over 28 dager ved-80 ° C etter fixation i 15% glyserol. FSC vs DAPI fluorescens tegnes med kontroll perler vises. Måling serien inkluderer ikke perler (supplerende fil 1-S3). 50.000 hendelser ble innspilt i cellen porten (supplerende fil 1-S6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende fil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 2: Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

En vellykket analyse av mikrobielle populasjoner og samfunn krever godt avstemt cytometers, et passende valg av cellen og en pålitelig arbeidsflyt fra prøvetaking og fiksering mot mål og data evalueringen. Parameterne merkede cellen må consort med tilgjengelig eksitasjon bølgelengdene. Vi bruker og anbefaler DAPI, som er svært følsomme i lave konsentrasjoner; men må bli opphisset av en UV-laser, som vanligvis ikke består i standard cytometer set-ups. Andre fargestoffer, som SYBR grønne jeg også flekken hele befolkninger og samfunn, men generelt leverer dårligere oppløsninger. Vi anbefaler ikke bruke fisk prosedyrer eller levedyktighet tester i mikrobielle samfunn. Disse metodene er umulig å kvantifisere, kontrollere og styre fordi deres effekter på individuelle arter i samfunnet er usikker. De kan ikke være pålitelig testet, så lenge en betydelig andel av de typiske samfunnene er fortsatt ikke tilgjengelig som en ren kultur.

Avgjørende skritt i protokollen inkludere prøvetaking og fiksering prosedyrer samt celle sortering. Prøvetaking kan kompliseres av tendensen til visse ren kulturer og mikrobielle samfunn å samle til flocs eller følge partikler av prøven matrix. Det er viktig å spre disse aggregater og skille cellene i en prøve før du introduserer dem til flyt cytometric analyse garantere pålitelige resultater. Presentert forberedelse protokollene var optimalisert for å aktivere enkelt celle analyse. Et siste 50 µm filtreringssystem utføres før målet å fjerne eventuelle gjenværende aggregater og forhindre 70 µm munnstykket av cellen sorter og flyt cuvette av analysator tetter. Celle flocs fra renseanlegg er spesielt rikelig, robust og avgjørende for funksjonen av systemet. Vi undersøkt den planktoniske og slam basert mikrobielle samfunn i forskjellige tanker med et fullskala avløpsrenseanlegg, teste i etablerte protokollen. Slam danne celle aggregater var tydelig utsvevende og samfunnet sammensetningen stabilt. Videre vist planktoniske og slam-basert samfunn bemerkelsesverdig likhet mellom dem i alle tre samplet tanker (Figur 8, utfyllende fil 1-S10). Disse resultatene ble bekreftet av komparative 16S rDNA amplicon sekvensering av en frisk-, en formaldehyd behandlet-, en formaldehyd og etanol fikserte-, og en sortert eksempel10. Likevel kan svært utfordrende miljøprøver, som sterke biofilm eller bakterier som vokser i tett koblet kjeder, være umulig å forsvinne. Jordprøver kan være spesielt problematisk, allestedsnærværende partikler vises i histogrammet og kan skjule cellene av ren overflod. I slike tilfeller må tradisjonelle sekvensering metoder brukes.

Fiksering stabiliteten i hver nye Prøvesett bør testes før utforme eksperimentet garantere resultat gyldighet. God fiksering stabilitet aktiverer også gruppert flekker og måling av flere fargeprøver tid på en enkelt dag. Dessuten muliggjør replikering målinger og retrospektiv celle sortering av avgjørende tidspunkt etter konklusjonen og endelige evalueringen av eksperimentet. Fiksering stabiliteten av ren kultur ble bekreftet over 28 dager (figur 9). For på stedet eksperimenter inkludert eksempel transport, bør fiksering stabiliteten testes over lengre perioder (i dette tilfellet 60 dager for aktivslam samfunnet, 195 dager for biogass samfunnet, utfyllende fil 1-S9).

Den flekker er vanligvis ikke problematisk, men må kontrolleres med biologiske standard at program bioinformatic evaluering verktøy. Vi brukte narr belastningen E. coli BL21 (DE3), som var fiksert i henhold til ASC-protokollen og stockpiled for bruk i alle flekker batch.

Bortsett fra DAPI, SYBR Green jeg har vært anvendt for å løse mikrobielle samfunn for flere år14,23,24,25,26. SYBR Green kan jeg løse samfunn i høy og lav nukleinsyre delsett (HNA og LNA) bruke levende celler i en online modus. DAPI, men er mer spesifikk i sin binding til DNA og gjør æren av over 50 subcommunities i en Prøvesett men krever litt fiksering før flekker.

Cellen sortering er en enestående funksjon av denne tilnærmingen og kan brukes hvis visse subcommunities videre rundt. Det må understrekes at verken PFA-(utført i bare 30 min) eller etanol behandling eller DAPI flekker10 hadde en negativ effekt på den påfølgende 16S amplicon sekvensering. Potensialet påvirker av fiksering og Ning-prosedyrer på subcommunity metagenome analyser fortsatt må testes.

Mye informasjon på samfunnet funksjoner og trend dynamics kan fås uavhengig av sortering tilnærming når den involverer Bioinformatikk verktøy som løse samfunnsfunksjoner på en virtuell celle for celle-nivå og koble disse funksjonene med abiotiske parametere.

Nylig, mange nye bioinformatikk evaluering verktøy, nyttig for både SYBR grønne jeg og DAPI tilnærminger, er utviklet for å løse cytometric samfunnet mønstre. Dette er FlowFP27, pakker brukt i denne studien (flowCHIC20, flowCyBar28) deconvolution modell etablert med ferskvann samfunn29 og et verktøy som brukes til å diskriminere stammer ifølge deres fysiologiske egenskaper30. I tillegg cytometric mangfold kan være bestemt25 og selv stabilitet egenskaper av mikrobielle samfunn kan nå bli etterfulgt med en online verktøyet10.

Flow cytometric analyser har dermed en stor fordel når det gjelder rask vurdering av mikrobielle samfunn og mulig abiotiske parameteren sammenhenger. Det er imidlertid fortsatt begrensninger for metoden. Det kan ikke brukes virkelig online med flowCyBar verktøyet, på grunn av erfarne basert gate innstilling prosedyren. Videre forhånd utvikling av skreddersydde, brukervennlig flyt cytometers sterkt spredning av flyt cytometric microbiome analyse tilnærming. Første skritt i denne retningen er foretatt28.

Fremtidige anvendelser av mikrobielle flowcytometri kan være seg i microbial ecology, som det tillater høyfrekvent overvåking innen bakteriell generasjon ganger og det har vist at økologiske paradigmer gjelder cytometric data5 ,10. Metoden er veldig nyttig for rutinemessig screenings av som obligatorisk drikkevann kontrollene i Sveits31. Det kan også være et verdifullt verktøy for medisinske anvendelser som menneskelige15 eller dyr32 microbiome screening. Siste utviklingen i bioinformatikk kan i tillegg aktivere mikrobiell flowcytometri å være en integrert sensor i prosessen kontrollene administrerte mikrobiell systemer. Mikrobiell samfunnet cytometri gir også en screening verktøyet celle sortering, hvilke innrømmer høyere oppløsning genomisk undersøkelser av bestemt samfunnet delsett.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.
 

Acknowledgments

Vi erkjenner takknemlig Michael Jahn og Yuting Guo for å gi framgangsmåten og datasett ren kulturen og aktivert slam samfunnet, henholdsvis. Vi takker ytterligere Katrin Mörters for å analysere biogass samfunnet prøvene. Dette arbeidet ble finansiert av Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, prosjektet biogass-fingeravtrykk Nr. 22008313) på vegne av det tyske føderale ministeriet for mat og landbruk (BMEL), det sentrale innovasjonsprogram for SMB (ZIM) føderale departementet økonomiske saker og energi (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, prosjektet behovsbetinget produksjon von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), det tyske føderale ministeriet for utdanning og Forskning (BMBF) (FZK 03XP0041G) og Helmholtz foreningens Program-orientert finansiering (POF III R31 tema 3 bioenergi).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5, (1), 17445 (2015).
  2. Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).
  3. Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5, (1), 8-19 (2017).
  4. Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35, (12), 1158-1166 (2017).
  5. Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18, (12), 4862-4877 (2016).
  6. Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16, (1), 180 (2017).
  7. Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486, (7402), 207-214 (2012).
  8. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
  9. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17, (6), 333-351 (2016).
  10. Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3, (1), e00564-e00517 (2018).
  11. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8, (1), 190-202 (2013).
  12. Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47, (3), 1753-1760 (2013).
  13. Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36, (1), 243-258 (2014).
  14. Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462 (2016).
  15. van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
  16. Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88, (2), 575-584 (2010).
  17. Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86, (12), 5969-5976 (2014).
  18. Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
  19. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15, (1), 211 (2016).
  20. Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83, (6), 561-567 (2013).
  21. Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87, (7), 661-664 (2015).
  22. Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).
  23. Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64, (2), 197-224 (2000).
  24. Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. 159-187 (2016).
  25. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, (11), 1376-1385 (2016).
  26. Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
  27. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46, (3), 907-919 (2012).
  28. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).
  29. Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93, (2), 194-200 (2017).
  30. Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93, (2), 201-212 (2017).
  31. Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8, (1900), (2017).
  32. Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46, (5), 1300-1303 (2016).
Karakterisere Microbiome Dynamics-flowcytometri basert arbeidsflyter fra ren kulturer naturlig samfunn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter