Flöde flödescytometrisk analys har visat sig vara värdefull för att utreda rena kulturer och övervakning mikrobiell gemenskapen dynamics. Vi presenterar tre omfattande arbetsflöden, från provtagning till analys av data, för rena kulturer och komplexa samhällen i tydlig medium samt som i utmanande matriser, respektive.
Utredningen av rena kulturer och övervakning av mikrobiell gemenskapens dynamik är viktigt att förstå och kontrollera naturliga ekosystem och tekniska applikationer drivs av mikroorganismer. Nästa generation används allmänt sekvenseringsmetoder för att lösa microbiomes, men de är i allmänhet resurs och tid intensivt och leverera mestadels kvalitativ information. Flödesanalys flödescytometrisk mikrobiomet inte lider av dessa nackdelar och kan ge relativ subcommunity sammansättning och absolut cell nummer på-line. Även om det inte levererar direkt fylogenetiska information, kan det förbättra analys djup och upplösning av sekvensering metoder. I skarp kontrast till medicinska tillämpningar inom både forskning och rutin inställningar används flödescytometri fortfarande inte flitigt för mikrobiomet analys. Information saknas på prov förberedelse och data analys rörledningar kan skapa ett inträdeshinder för forskarna utmaningar mikrobiomet analys som ofta skulle vara lärobok flöde flödescytometri applikationer. Här presenterar vi tre omfattande arbetsflöden för rena kulturer, komplexa samhällen i rensa respektive medellång och komplexa samhällen i utmanande matriser. Vi beskriver enskilda förfaranden för provtagning och fixering och optimerad Färgprotokoll för de respektive provningssatser. Vi utarbeta flödescytometrisk analys med en komplex forskning centrerad och en ansökan fokuserad bänk översta enhet, beskriva cellen sortera förfarande och föreslå data analys paket. Vi vidare föreslå viktiga experimentella kontroller och gälla de respektive provningssatser presenterade arbetsflöden.
Mikroorganismer spelar en viktig roll i många aspekter av mänskliga levande. De är de viktigaste biotiska drivkrafterna för de planeter kol, kväve, fosfor och svavel cykler1och lagen som förnedrande2,3 samt syntetisera4 biokatalysatorer i olika branscher, såsom behandling av avloppsvatten 5 eller bioteknik6. De utgör även den mänskliga microbiom, som direkt påverkar människors hälsa och metabolism7,8. Information om struktur, funktion och dynamiska beteende av mikroorganismer, som svar på deras närmiljö, därför nödvändigt om vi vill förstå och manipulera dessa system. Nästa generation sequencing (NGS) är den etablerade tekniken för att lösa mikrobiomet struktur och funktion9. Men, analys och utvärdering av NGS data inte kan ge kvantitativa uppgifter och är fortfarande dyrt, tidskrävande och ingalunda redo att ge Hotellets resultat inom prestanda korridorer. Vissa bakterier Visa generation gånger under 1 h och orsaken ständigt föränderliga samhällsstrukturer i vissa miljöer10. Efter sådan dynamik, skulle med sekvensering metoder överstiga den finansiella och arbetskraft kapaciteten av de flesta vetenskapliga laboratorier.
Flödescytometri kan däremot lämna gemenskapen fingeravtryck liknar NGS data, samtidigt som du behåller en tids-, arbets- och verkningsgrad. Här presenterar vi flödet flödescytometrisk tekniker kunna följa mikrobiell gemenskapen dynamics på-line på den enda cell-nivån. Till skillnad från NGS, flödescytometri ger inte fylogenetiska tillhörighet eller information om funktionella gener, men levererar kvantitativa cell nummer. Med hjälp av flödescytometri, kan mikrobiella samhällen lösas in subcommunities med distinkta ljusspridning och fluorescens egenskaper (framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) ger indikationer på Cellstorlek och kornighet, respektive). Den presenterade metoden använder huvudsakligen cell storlek – och DNA uppgå relaterad information som är associerade till vissa celltyper och fysiologiska (tillväxt) staterna. DNA innehållet kvantifieras med hjälp av UV-retbara 4′, 6-diamidin-2′-fenylindol (DAPI) färgämne, som binder till A-T rika regioner av DNA och kan även lösa olika kromosomala nivåer. Genom att kombinera DAPI fluorescens och FSC kan mer än 50 subcommunities distingerat och övervakas för att ändra sammansättning över tid11. Subcommunity överflöd variationerna kan vara korrelerade med förändringar i mikro-miljön omgivningarna, såsom pH och produkten titrar12, med globala parametrar, såsom väder13,14, eller vid gut eller saliv microbiomes med vissa medicinska behandlingar15. Dessa korrelationer avslöja viktiga subcommunities ansvarar för särskilda funktioner i det metaboliska nätverket av hela samhället. De viktigaste subcommunities kan sedan särskilt främjas eller undertryckt genom att förändra de omgivande mikromiljöer, eller sorteras för efterföljande sekvensering15 eller proteomiska utredning16.
Dock är mikrobiell gemenskapen flödescytometri inte ännu allmänt etablerad på grund av ett ganska lågt antal flöde flödescytometrisk enheter kan lösa mikrobiella populationer eller samhällen ordentligt. Dessutom kan bristen på erfarenhet, gemenskapens analys pipelines och effektiva data utvärdering utgöra ett inträdeshinder för forskare mikrobiomet analys utmaningar. Vi har upprättat omfattande arbetsflöden för att hantera dessa frågor. För att illustrera deras allmänna tillämplighet, kommer vi att presentera dem på exemplariska tre provningssatser (kompletterande fil 1-S1), nämligen jag) en ren kultur (PC) för biotekniska tillämpningar vuxit i definierade tydliga medium (Pseudomonas putida KT 2440 på glukos), ii) en komplex lab gemenskap i tydlig medium (aktiverat slam gemenskapen (ASC) i syntetiskt avloppsvatten) och iii) en komplex gemenskap från naturliga miljöer i en tät matris (biogas gemenskapen (BC) i majs ensilage).
Flera faktorer påverkar protokollet valet för varje av dessa provningssatser. Djupfrysning avstår användning av giftiga kemikalier men är mestadels begränsad till labbmiljöer på grund av användningen av flytande kväve för chock glasyr. Den formaldehyd stabilisering och efterföljande etanol fixering tillåter bulk provtagning utan behov av alikvotens förberedelse och har visat sig vara stabil under långa perioder. Proteinrika prover såsom mänsklig saliv15 kan dock problematiskt, eftersom protein flockar, denaturized av formaldehyd, kan orsaka ogynnsamma signal till brus förhållande. Prov torkning tar mest tid (cirka 1 h totalt) av förfarandena i denna jämförelse, men kan utföras på plats utan giftiga kemikalier. Det ger stabil pellets i rör, som enkelt kan levereras utan kylning eller ytterligare fara försiktighetsåtgärder. Dessutom har gott om alternativ fixering metoder föreslagna11. Vi rekommenderar starkt för att testa olika protokoll upplösning och fixering stabilitet när man inför en ny provuppsättning.
Vi använde två olika flöde cytometers för att analysera uppsättningar: i) en mycket sofistikerade och dyra, forskning centrerad cell sorterare och ii) en ansökan fokuserade bänk topp analysator som förefaller mer lämpligt för hotellets ansökan5. BC mättes med bänk topp analyzer, medan PC och ASC mättes med cell Sorteraren. Analys av de tre exemplariskt provet fastställs olika förfaranden som krävs för optimerad reproducerbarhet, prov stabilitet och arbetsflöde bekvämlighet. Följande protokoll anger avsnitten för de tre olika systemen.
En framgångsrik analys av mikrobiella populationer och samhällen kräver väl avstämd cytometers, ett lämpligt val av cell parametrar och ett pålitligt arbetsflöde från provtagning och fixering mot mätning och data utvärderingen. Markerade cellen parametrarna måste umgås med de tillgängliga excitation våglängderna. Vi använder och rekommenderar DAPI, som är mycket känsligt vid låga koncentrationer. men behöver vara upphetsad av en UV-laser, vilket inte är vanligtvis består i standard cytometer uppställningar. Andra färgämnen, såsom SYBR Green I, också fläcken hela befolkningar eller samhällen men generellt leverera sämre resolutioner. Vi rekommenderar inte med fisk förfaranden eller genomförbarhet tester i mikrobiella samhällen. Dessa strategier är omöjligt att kvantifiera, kontrollera och styra eftersom deras effekter på enskilda arter i gemenskapen är osäkert. Tillförlitligt de kan inte testas, så länge en betydande andel av de typiska samhällena är fortfarande inte tillgänglig som en ren kultur.
Kritiska steg i protokollet omfattar provtagnings-och fixering samt cell sortering. Provtagningen kan kompliceras av tendensen hos vissa rena kulturer och mikrobiella samhällen att aggregera till flockar eller följa partiklar av prov matris. Det är viktigt att skingra dessa aggregat och separata celler i ett prov innan att introducera dem till flöde flödescytometrisk analys att garantera tillförlitliga resultat. Presenterade förberedelse protokollen var optimerad för att aktivera enda cell analys. En sista 50 µm filtrering utförs före mätningen att avlägsna eventuella kvarvarande aggregat och förhindra 70 µm munstycket på cell Sorteraren och det flöde kyvetten av analyzer från igensättning. Cell flockar från reningsverken är särskilt riklig, robusta och avgörande för funktionen av systemet. Vi undersökte den plankton och slam baserad mikrobiella samhällen i olika tankar av en fullskalig avloppsreningsverket, att testa det etablerat protokollet. Det slam som bildas cell aggregat var tydligt skingras och gemenskapens sammansättning förblev stabil. Dessutom uppvisade plankton och slam-baserade samhällen anmärkningsvärd likhet mellan dem i alla tre samplade stridsvagnar (figur 8, kompletterande fil 1-S10). Dessa resultat var verifieras genom jämförande 16S rDNA amplikon sekvensering av en färsk-, en formaldehyd behandlade-, en formaldehyd och etanol fixerade-, och en sorterad prov10. Ändå kan det vara omöjligt att försvinna utomordentligt utmanande miljöprov, såsom stark biofilmer eller bakterier växer i tätt anslutna kedjor. Jordprover kan vara särskilt problematiskt, som allestädes närvarande partiklarna visas i histogrammet och kan dölja cellerna av ren överflöd. I sådana fall måste traditionella sekvenseringsmetoder tillämpas.
Varje ny provuppsättning fixering stabilitet bör testas innan utforma experimentet att garantera resultatet giltighet. Bra fixering stabilitet möjliggör också poolade färgning och mätning av flera tidpunkter för prov på en enda dag. Det kan vidare replikering mätningar och retrospektiv cell sortering av avgörande tidpunkter efter ingående och slutlig utvärdering av experimentet. Fixering stabiliteten i ren kultur kontrollerades under 28 dagar (figur 9). För hotellets experiment inklusive transport av prover, bör fixering stabilitet testas över längre perioder (i detta fall, 60 dagar för aktiva slammet gemenskapen, 195 dagar för biogas gemenskapen, kompletterande fil 1-S9).
Färgningen är oftast inte problematiskt men behöver styras med en biologisk standard att tillåta tillämpning av de bioinformatiska verktyg för utvärdering. Vi använde den mock stammen E. coli BL21 (DE3), som var fixerade enligt ASC protokollet och lagrade för användning i varje färgning batch.
Apart från DAPI, SYBR Green jag har framgångsrikt tillämpats lös mikrobiella samhällen för flera år14,23,24,25,26. SYBR Green jag kan lösa samhällen i hög- och låg nukleinsyra underuppsättningar (HNA och LNA) med hjälp av levande celler i en online modus. DAPI, men är mer specifikt i dess bindning till DNA och gör skillnaden av över 50 subcommunities i en provuppsättning men kräver en fixering steg före färgning.
Cell sortering är en utmärkande egenskap hos detta synsätt och kan användas om vissa subcommunities är av intresse. Det måste understrykas att varken PFA-(framförd i endast 30 min) eller etanol behandling eller DAPI färgning10 hade en negativ effekt på den efterföljande 16S amplikon sekvenseringen. Potentiella påverkan av fixering och färgning förfaranden på subcommunity metagenome analyser måste fortfarande testas.
En hel del information om gemenskapens funktioner och trend dynamics kan erhållas oberoende från metoden sortering när bioinformatiska verktyg som lösa community-funktioner på en virtuell cell för cell nivå och ansluta dessa funktioner med abiotiska parametrar.
Nyligen har ett antal nya bioinformatik utvärderingsverktyg, allt användbart för båda SYBR Green jag och DAPI metoder, har utvecklats för att lösa flödescytometrisk gemenskapen mönster. Dessa är FlowFP27, paketen används i denna studie (flowCHIC20, flowCyBar28), en avfaltning förebild som upprättats med färskvatten samhällen29 och ett verktyg som används för att diskriminera stammar enligt deras fysiologiska egenskaper30. Dessutom flödescytometrisk mångfald kan vara beslutsam25 och även stabiliteten boenden av mikrobiella samhällen kan nu följas med ett online-verktyg10.
Flödescytometrisk flödesanalyser har alltså en stor fördel när det gäller snabb utvärdering av mikrobiella samhällen och möjliga abiotiska parametern korrelationer. Dock finns det fortfarande begränsningar till metoden. Den kan inte tillämpas verkligen online med verktyget flowCyBar, på grund av erfarna baserat gate inställningsproceduren. Dessutom skulle utvecklingen av skräddarsydda, lätt att använda flöde cytometers kraftigt förväg spridning av metoden flöde flödescytometrisk mikrobiomet analys. Första stegen i denna riktning är företa sig28.
Framtida tillämpningar av mikrobiell flödescytometri kan vara tankegångarna i mikrobiell ekologi, eftersom det tillåter hög frekvens övervakning inom spänna av bakteriell generation gånger och det har visat att ekologiska paradigm är tillämpliga på flödescytometrisk data5 ,10. Metoden är mycket användbar för rutinmässig filmvisningar av naturliga miljöer som obligatoriska dricksvatten ljudkontroller i Schweiz31. Det kan också vara ett värdefullt verktyg för medicinska tillämpningar som mänskliga15 eller animaliska32 mikrobiomet screening. Senaste utvecklingen inom bioinformatik kan dessutom göra det möjligt för mikrobiell flödescytometri att vara en integrerad sensor i processen kontroller av hanterade mikrobiella system. Mikrobiell gemenskapen flödescytometri ger också ett screeningverktyg för cell sortering, vilket tillåter högre upplösning genomisk utredningar av specifika gemenskapen delmängder.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner tacksamt Michael Jahn och Yuting Guo för ger förfarandet och datamängder ren kultur och aktiverat slam gemenskapens, respektive. Vi tackar ytterligare Katrin Mörters för att analysera biogas gemenskapen proverna. Detta arbete finansierades av den Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, projektet Biogas-Fingerprint Nr. 22008313) på vägnar det tyska federala ministeriet för livsmedel och jordbruk (BMEL), Central Innovation-programmet för små och medelstora företag (ZIM) av det federala departementet ekonomi-och energi (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), den Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, projektet behovsstyrd Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), det tyska federala ministeriet för utbildning och Finansiering av forskning (BMBF) (FZK 03XP0041G), och Helmholtz föreningens Program-orienterade (POF III R31 ämne 3 bioenergi).
Milli-Q system Synthesis A10 | Merck, Darmstadt, (GER) | ||
BioPak Ultrafiltration Cartridge | Merck, Darmstadt, (GER) | CDUF BI0 01 | |
MoFlo Legacy cell sorter | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
Innova 90C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 334 nm – 364 nm, 100 mW | |
Innova 70C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Genesis MX488-500 STM OPS | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Xcyte CY-355-150 | Lumentum, Milpitas, California, USA | 355 nm, 150 mW | |
Photomultiplier tubes R928 and R3896 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
Summit 4.3 software | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
1 µm FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F8815 | 350/440 blue fluorescent |
2 μm YG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-8827 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 18339 | 360/407 |
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 17458 | 360/407 blue fluorescent |
1 µmYG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-13081 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7447-40-7 | |
Cyflow Space | Sysmex Corporation, Kobe (Japan) | ||
UV Laser Genesis CX, | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 355 nm, 150 mW | |
H6779-32 series PMTs | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
FloMax software | Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER) | ||
all optical filters | Carl Zeiss, Jena (GER) | ||
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6781.3 | |
FlowJo 10.0.8r1 | FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) | Build number: 42398 | |
R-software v.3.4.3 | R Core Team | ||
flowCHIC | http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html | ||
flowCyBar | http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html |