Akış sitometrik çözümlemesi saf kültürler araştıran ve mikrobiyal topluluk dinamikleri izleme için değerli kanıtlamıştır. Biz üç kapsamlı iş akışları, örnekleme veri analizi için saf kültürler ve net Orta de olduğu gibi zorlu matrisler, karmaşık toplulukları için gelen sırasıyla mevcut.
Saf kültürler incelenmesi ve mikrobiyal topluluk dinamiklerini izleme doğal ekosistemler ve teknik uygulamaları mikroorganizmalar tarafından tahrik anlama ve denetleme için çok önemlidir. Yeni nesil sıralama yöntemleri yaygın olarak microbiomes gidermek için kullanılmaktadır, ancak genellikle kaynak ve zaman yoğun ve çoğunlukla nitel bilgi sunmak. Akış sitometrik microbiome analiz bu dezavantajları zarar vermez ve göreli subcommunity zenginliği ve mutlak sağlayabilir hücre, satır numaraları. Her ne kadar doğrudan filogenetik bilgi teslim etmez, analiz derinliği ve çözünürlük yaklaşımlar sıralama, geliştirebilirsiniz. Araştırma ve rutin ayarları tıbbi uygulamalar keskin aksine, akış sitometresi microbiome analiz için hala yaygın olarak kullanılır. Örnek hazırlama ve veri analiz boru hatları üzerinde eksik bilgileri bir giriş engeli sık ders kitabı akış sitometresi uygulamaları olurdu microbiome analiz sorunlarla karşı karşıya araştırmacılar için oluşturabilir. Burada, biz üç kapsamlı iş akışları saf kültürler için mevcut, karmaşık topluluklarda zorlu matrisler, orta ve karmaşık topluluklarda sırasıyla temizleyin. Biz bireysel örnekleme ve fiksasyon yordamlar açıklar ve ilgili örnek kümeleri için protokolleri boyama en iyi duruma getirilmiş. Biz merkezli karmaşık bir araştırma ile sitometrik Analizi ve bir uygulama odaklı tezgah üst aygıt ayrıntılı yordam sıralama hücre tanımlamak ve veri analiz paketleri öneririz. Ayrıca önemli deneysel kontrolleri teklif ve sunulan iş akışları ilgili örnek kümeleri için geçerlidir.
Mikroorganizmaların insan birçok yönden canlı hayati bir rol oynamaktadır. Onlar gezegen karbon, azot, fosfor ve kükürt döngüsü1ve2,3 aşağılayıcı yanı sıra4 Biyokatalizörler Atıksu arıtma tesisleri gibi çeşitli sektörlerde sentezleme olarak hareket ana biyotik sürücüleri vardır 5 ya da biyoteknoloji6. Onlar bile insan sağlığı ve metabolizma7,8doğrudan etkileyen insan microbiome oluşturmaktadır. Bu nedenle, yapı, fonksiyon ve yakın çevreleri, yanıt olarak mikroorganizmaların dinamik davranış hakkında bilgi, amacımız tam olarak anlamak ve bu sistemlerin manipüle etmek gereklidir. Yeni nesil (NGS) sıralama microbiome yapısı ve fonksiyonu9çözmek için kurulan teknoloji değildir. Ancak, analiz ve değerlendirme NGS veri Niceliksel bilgileri verim değil ve hala pahalı, zaman alıcı ve hiçbir şekilde performans koridorları içinde yerinde sonuçlar sağlamak hazır. Bazı bakteri üretimi kez 1 h ve sürekli değişen toplum yapıları bazı ortamlar10neden aşağıdaki görüntüler. Böyle dynamics sıralama yaklaşımları kullanarak en bilimsel labs mali ve iş gücü kapasitesi aşabilir.
Buna ek olarak, akış sitometresi daha yüksek bir zaman, işgücü ve maliyet verimliliği koruyarak topluluk parmak NGS veri için benzer sağlar. Burada, akış sitometrik teknikleri mikrobiyal topluluk dinamikleri,-line tek hücre düzeyde uygulayabilmek için mevcut. NGS, aksine akış sitometresi filogenetik ilişki veya bilgi fonksiyonel genler sağlamaz ancak nicel hücre sayıları sunar. Akış Sitometresi kullanılarak, mikrobiyal toplulukları içine subcommunities farklı ışık saçılım ve floresan özellikleri (hücre boyutu ve parçalı yapı, sırasıyla ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) sağlamak) ile çözülebilir. Sunulan yaklaşım ağırlıklı olarak hücre boyutu – kullanır ve DNA belirli hücre tipleri ve fizyolojik (büyüme) Birleşik ilişkili ilgili bilgileri tutar. DNA içeriği UV telaşlı 4′, A-T zengin DNA bölgelerine bağlanır ve hatta farklı kromozom düzeyleri çözümlemek için 6-diamidino-2′-phenylindole (DAPI) boya kullanarak sayılabilir. DAPI floresans ve FSC birleştirerek 50’den fazla subcommunities seçkin ve zenginliği saat11üzerinde değiştirmek için izlenir. Subcommunity bereket varyasyonları pH ve ürün titreleri gibi12, genel parametrelerini, hava13,14gibi veya bağırsak ya da tükürük ile mikro çevre çevresinde değişikliklerle ilişkili olabilir bazı tıbbi tedaviler15ile microbiomes. Bu korelasyonlar anahtar subcommunities sorumlu tüm toplumun metabolik ağdaki belirli işlevleri için ortaya koyuyor. Anahtar subcommunities daha sonra özellikle terfi veya çevredeki mikro-ortamları değiştirerek bastırılır veya sonraki sıralama15 veya proteomik soruşturma için16sıralanmış.
Ancak, mikrobiyal toplum akış sitometresi henüz yaygın olarak oldukça düşük sayıda akış sitometrik aygıtları mikrobiyal nüfus veya topluluklar düzgün çözme yeteneğine sahip olması nedeniyle kurulmuş değildir. Ayrıca, deneyim, topluluk analiz boru hatları ve etkili veri değerlendirme eksikliği microbiome analiz sorunlarla karşı karşıya araştırmacılar için bir giriş bariyeri oluşturabilecek. Biz bu sorunları çözmek için kapsamlı iş akışları kurduk. Onların genel uygulanabilirliği göstermek için biz onları üç örnek örnek setlerinde (ek dosya 1-S1), yani ben sunacak) tanımlanmış net Orta (Pseudomonas putida KT 2440 üzerinde yetiştirilen biyoteknolojik uygulamaları için saf Kültür (PC) glikoz), II) net Orta (aktif çamur topluluğa (ASC) sentetik Atıksu) ve III karmaşık laboratuvar toplumda) yoğun matris (Biyogaz topluluğa (M.Ö.) Mısır Silaj) doğal ortamlarda karmaşık bir topluluktan.
Çeşitli faktörler her bu örnek kümeleri için protokol seçimi etkiler. Derin dondurucu zehirli kimyasalların kullanımı forgoes ama çoğunlukla kullanılması dolayısıyla laboratuvar ortamlarına şok buzlanma için sıvı azot sınırlıdır. Formaldehit istikrar ve sonraki etanol fiksasyon toplu örnekleme aliquot hazırlık için gerek kalmadan sağlar ve uzun sürelerle kararlı olduğu ispatlanmıştır. Ancak, protein flocs, denaturized formaldehit tarafından olumsuz sinyal-gürültü oranı neden olabilir çünkü insan tükürük15 gibi protein açısından zengin örnekleri sorunlu olabilir. Örnek kurutma yordamlar en zaman (yaklaşık toplam 1 h) Bu karşılaştırmada alacak ama sitesinde toksik kimyasallar olmadan yapılabilir. Soğutma veya ek tehlike önlemler kolayca gönderilebilir tüpler istikrarlı granül verimleri. Buna ek olarak, alternatif fiksasyon yöntemleri bol önerilen11olmuştur. Güçlü yeni örnek kümesi sokarken farklı protokolleri çözünürlük ve fiksasyon kararlılığını test etmek için tavsiye ederiz.
Biz iki farklı akış cytometers kümeleri olarak çözümlemeye: i) bir son derece karmaşık ve pahalı, araştırma hücre sıralayıcısı ve yerinde uygulama5için daha uygun görünen II) bir uygulama odaklı tezgah üst analizörü merkezli. PC ve ASC hücre sıralayıcısı ile ölçüldü iken M.Ö tezgah üst analyzer ile ölçüldü. Üç örnek örnek analizi en iyi duruma getirilmiş tekrarlanabilirlik, örnek istikrar ve iş akışı kolaylık sağlamak için gerekli farklı yordamlar ayarlar. Aşağıdaki protokol için üç farklı sistem bölümleri belirtir.
Mikrobiyal nüfus ve toplulukların başarılı bir analizini iyi ayarlanmış cytometers, hücre parametreleri uygun bir seçim ve örnekleme ve fiksasyon ölçüm ve veri değerlendirme doğru güvenilir bir iş akışı gerektirir. Seçili hücre parametreler kullanılabilir uyarma dalgaboyu ile eşi gerekir. Biz kullanmak ve çok düşük konsantrasyonlarda hassas DAPI öneririz; Ama bir UV-hangi genellikle standart sitometresi set-up oluşur değil lazer, heyecanlı gerekiyor. Diğer boya, SYBR gibi yeşil ben, aynı zamanda leke bütün nüfus veya topluluklar ama genellikle düşük kaliteli çözümler sunmak. Balık yordamlar veya canlılık testleri mikrobiyal topluluklarda kullanma önerilmez. Bu yaklaşımlar ölçmek, doğrulamak ve toplumda bireysel türler üzerindeki etkileri belirsiz olduğundan denetlemek imkansız. Tipik topluluklar önemli bir kısmı hala saf bir kültür olarak kullanılabilir olduğu sürece onlar güvenilir, sınanamıyor.
Kritik adımlar protokolündeki hücre sıralama yanı sıra, örnekleme ve fiksasyon yordamlar içerir. Örnekleme eğilimi bazı saf kültürler ve flocs için toplamak veya örnek matris parçacıklar için uygun mikrobiyal topluluklar tarafından karmaşık. Bu toplamları dağılımı ve güvenilir sonuçlar güvence altına almak için akış sitometrik çözümlemesi için giriş önce ayrı bir hücreler için gereklidir. Sunulan hazırlık protokolleri tek hücre Analizi etkinleştirmek için optimize. Son 50 µm filtrasyon daha önce herhangi bir kalıntı toplamları kaldırmak ve hücre sıralayıcısı 70 µm meme ve akış küvet Çözümleyicisinin tıkanma dan engellemek için ölçüm gerçekleştirilir. Hücre flocs gelen Atıksu arıtma tesisleri özellikle bol, sağlam ve sisteminin işlevi için çok önemli. Biz planktonik araştırdık ve çamur oluşturulmuş protokol test etmek için bir tam ölçekli Atıksu arıtma tesisi farklı tankları mikrobiyal topluluklarda dayalı. Toplamları açıkça harcanmış hücre şekillendirme çamur ve topluluk kompozisyon sabit kalmıştır. Ayrıca, planktonik ve çamur tabanlı toplulukların aralarındaki tüm üç örneklenen tank (Şekil 8, ek dosya 1-S10) olağanüstü benzerlik sergiledi. Bu sonuçlar bir formaldehit ve etanol fiksasyonlu karşılaştırmalı 16S rDNA amplicon sıralama, bir taze-, bir formaldehit tedavi-, tarafından doğrulanmadı-ve sıralanmış örnek10. Yine de, olağanüstü güçlü biyofilmler veya sıkıca bağlı zincirler içinde büyüyen bakteriler gibi çevre örnekleri zorlu dağıtmak mümkün olabilir. Her yerde parçacıklar histogram içinde görünür ve hücreleri tarafından dik bereket karanlık gibi toprak örnekleri özellikle sorunlu olabilir. Bu gibi durumlarda, geleneksel sıralama yöntemleri uygulanması gereken.
Her yeni örnek kümesi fiksasyon istikrar sonucu geçerliliği garanti için deney tasarlamadan önce test edilmelidir. İyi fiksasyon istikrar da havuza alınan boyama ve birden çok örnek zaman puan ölçümü tek bir günde sağlar. Ayrıca çoğaltma ölçümleri ve geriye dönük olarak hücre belirleyici zaman noktaları sonuç ve denemenin son değerlendirme sonra sıralama sağlar. Saf kültür fiksasyon kararlılığını 28 gün içinde (Şekil 9) doğrulandı. Örnek taşıma dahil olmak üzere yerinde deneyler için fiksasyon istikrar (Bu durumda, aktif çamur topluluk için 60 gün Biyogaz toplum, ek dosya 1-S9 için 195 gün) daha uzun süre üzerinde test edilmelidir.
Boyama genellikle sorunlu değil ama bioinformatic değerlendirme araçları izin vermek için biyolojik bir standart ile kontrol gerekmektedir. Biz sahte zorlanma E. coli BL21 kullanılan (DE3), hangi ASC protokole göre saplantısı ve boyama her toplu olarak kullanılmak üzere depolanmış.
DAPI, SYBR yeşil dışında ben başarılı bir şekilde birkaç yıl14,23,24,25,26mikrobiyal topluluklar gidermek için uygulanmıştır. SYBR yüksek ve düşük nükleik asit alt kümeleri (HNA ve LNA) topluluklar çözmek yeşil bir online modus canlı hücrelerde kullanma. DAPI, DNA için onun bağlamada daha belirlidir ve 50’den fazla subcommunities bir örnek küme ayrım sağlar ancak boyama önce bir fiksasyon adım gerektirir.
Hücre sıralama bu yaklaşımın dikkat çekici bir özelliği ve bazı subcommunities daha fazla ilgi varsa uygulanabilir. Bu ne PFA-(sadece 30 dk yapılır) ne de etanol tedavi veya10 boyama DAPI sonraki 16S amplicon sıralama üzerinde olumsuz bir etkisi olduğunu vurguladı gerekiyor. Potansiyel fiksasyonu etkiler ve subcommunity metagenome ilgili yordamlar boyama analizleri hala test edilmesi gerekir.
Topluluk işlevlerine ve eğilim dinamikleri hakkında bilgi bir sürü bağımsız sıralama yaklaşım toplumun özellikleri sanal bir hücre hücre düzeyinde çözümlemek ve bu özellikleri ile abiyotik bağlanmak Biyoinformatik araçlarını içeren ne zaman elde edilebilir parametreleri.
Son zamanlarda, bir dizi yeni Biyoinformatik değerlendirme aracı, her iki SYBR için tüm yararlı yeşil ben ve DAPI yaklaşımlar, sitometrik topluluk desenleri gidermek için geliştirilmiştir. Bunlar FlowFP27, paketleri bu çalışmada (flowCHIC20, flowCyBar28), tatlı su topluluklar29 ile kurulan bir deconvolution model ve suşların kendi fizyolojik göre ayrımcılık için kullanılan bir araç kullanılan özellikleri30. Ayrıca, sitometrik çeşitlilik kararlı25 olabilir ve mikrobiyal topluluklar hatta istikrar özelliklerini şimdi bir çevrimiçi araç10ile takip edilebilir.
Böylece, akış sitometrik analizleri mikrobiyal topluluklar ve olası abiyotik parametre korelasyon hızlı değerlendirilmesi konusunda büyük bir avantaj var. Ancak, hala yöntemine sınırlamalar vardır. Gerçekten online flowCyBar aracıyla nedeniyle deneyimli tabanlı kapı ayarı yordam uygulanamaz. Ayrıca, özel yapım, kullanımı kolay akışı cytometers gelişimi büyük ölçüde akış sitometrik microbiome analiz yaklaşımı yayılması ilerlemek. Bu yönde ilk adım üstlenmiş28vardır.
Mikrobiyal akış sitometresi gelecekteki uygulamalar mikrobiyal ekoloji, bakteri üretimi kez aralığında yüksek frekans izleme sağlar ve ekolojik paradigmalar sitometrik veri5 tabidir gösterilmiştir gibi öngörülen ,10. İsviçre31yılında zorunlu içme suyu denetimleri gibi doğal ortamlarının rutin izlemek için çok yararlı bir yöntemdir. Bu da insan15 veya hayvan32 microbiome tarama gibi tıbbi uygulamalar için değerli bir araç olabilir. Buna ek olarak, biyoinformatik son gelişmeleri işlem denetimleri, yönetilen mikrobiyal sistemlerinin ayrılmaz bir sensör olmak mikrobiyal akış sitometresi sağlayabilir. Mikrobiyal topluluk sitometresi da belirli topluluk alt kümeleri genomik araştırmalar daha yüksek çözünürlük sağlayan hücre sıralama, bir tarama aracı sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Biz minnetle Michael Jahn ve Yuting Guo yordam ve datasets saf kültür ve aktif çamur topluluk, sırasıyla sağlamak için kabul. Biz daha fazla Katrin Mörters Biyogaz toplum örnekleri analiz etmek için teşekkür ederim. Bu eser Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, proje Biyogaz-parmak izi Nr. 22008313) tarafından Alman Federal Bakanlığı adına gıda ve Tarım (BMEL), merkezi yenilik programı için KOBİ’lerin (ZIM) federal bakanlık için finanse edildi ekonomik işler ve enerji (BMWi) (INAR ABO’lar, 16KN043222), Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, proje isteğe bağlı cep von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve Araştırma (BMBF) (FZK 03XP0041G) ve Program odaklı Helmholtz Derneği’nin finansman (POF III R31 konu 3 Biyoenerji).
Milli-Q system Synthesis A10 | Merck, Darmstadt, (GER) | ||
BioPak Ultrafiltration Cartridge | Merck, Darmstadt, (GER) | CDUF BI0 01 | |
MoFlo Legacy cell sorter | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
Innova 90C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 334 nm – 364 nm, 100 mW | |
Innova 70C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Genesis MX488-500 STM OPS | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Xcyte CY-355-150 | Lumentum, Milpitas, California, USA | 355 nm, 150 mW | |
Photomultiplier tubes R928 and R3896 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
Summit 4.3 software | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
1 µm FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F8815 | 350/440 blue fluorescent |
2 μm YG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-8827 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 18339 | 360/407 |
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 17458 | 360/407 blue fluorescent |
1 µmYG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-13081 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7447-40-7 | |
Cyflow Space | Sysmex Corporation, Kobe (Japan) | ||
UV Laser Genesis CX, | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 355 nm, 150 mW | |
H6779-32 series PMTs | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
FloMax software | Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER) | ||
all optical filters | Carl Zeiss, Jena (GER) | ||
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6781.3 | |
FlowJo 10.0.8r1 | FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) | Build number: 42398 | |
R-software v.3.4.3 | R Core Team | ||
flowCHIC | http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html | ||
flowCyBar | http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html |