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Bioengineering

अपमानजनक पाड़ आधारित ऊतक के विनाशकारी निगरानी-इंजीनियर रक्त वाहिका ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग विकास

doi: 10.3791/58040 Published: October 3, 2018

Summary

गुणवाला उत्तेजना के साथ biodegradable पॉलिमर पाड़ आधारित ऊतक-इंजीनियर रक्त वाहिकाओं के वास्तविक समय संस्कृति में संवहनी और पाड़ गिरावट की प्रक्रिया की निगरानी के लिए विनाशकारी और लंबी अवधि के लिए प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग यहां वर्णित है ।

Abstract

संरचनात्मक और यांत्रिक गुणों के साथ इंजीनियर संवहनी भ्रष्टाचार प्राकृतिक रक्त वाहिकाओं के लिए इसी तरह की धमनी बाईपास की बढ़ती मांग को पूरा करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं । विकास की गतिशीलता और क्षरण बहुलक पाड़ आधारित ऊतक-इंजीनियर रक्त वाहिकाओं (TEBVs) गुणवाला उत्तेजना के साथ remodeling प्रक्रिया का लक्षण संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग के लिए महत्वपूर्ण है । ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक इंजीनियर ऊतक के vascularization की निगरानी के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में बाहर खड़ा करने के लिए वास्तविक समय संस्कृति में उच्च संकल्प इमेजिंग सक्षम । यह कागज एक विनाशकारी और तेजी से वास्तविक समय इमेजिंग के विकास की निगरानी और दीर्घकालिक संस्कृति में TEBVs ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT) का उपयोग करके remodeling रणनीति को दर्शाता है । ज्यामितीय आकृति विज्ञान प्रक्रिया, दीवार मोटाई, और अलग संस्कृति समय अंक और गुणवाला उत्तेजना की उपस्थिति में TEBV मोटाई की तुलना सहित, मूल्यांकन किया जाता है । अंत में, OCT गुणवाला उत्तेजना या नहीं और प्रत्येक पोत क्षेत्र में, के तहत पुनर्निर्माण के ऊतकों में बहुलक के क्षरण के वास्तविक समय अवलोकन के लिए व्यावहारिक संभावनाओं प्रदान करता है बहुलक गिरावट का उपयोग कर के आकलन के साथ तुलना में स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप ।

Introduction

ऊतक इंजीनियर रक्त वाहिकाओं (TEBVs) एक आदर्श संवहनी भ्रष्टाचार के रूप में सबसे होनहार सामग्री की है1. आदेश में भ्रष्टाचार के विकास के लिए मूल जहाजों के रूप में समान संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों के साथ चिकित्सकीय उपयोगी हो, कई तकनीकों को संवहनी समारोह2,3बनाए रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है । यद्यपि वहां प्रत्यारोपण के दौरान स्वीकार्य प्रत्यक्षता दरों के साथ जहाजों इंजीनियर गया है और चरण III नैदानिक अध्ययन4में, दीर्घकालिक संस्कृति और उच्च लागत भी TEBVs के विकास की निगरानी की आवश्यकता दिखा । extracellular मैट्रिक्स की समझ (ECM) विकास, रिमॉडलिंग, और biomimetic chemo में TEBVs में अनुकूलन प्रक्रियाओं-यांत्रिक वातावरण संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग के विकास के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं.

आदर्श छोटे व्यास इंजीनियर जहाजों के विकास को ट्रैक करने के लिए रणनीति5 , विनाशकारी बाँझ, अनुदैर्ध्य, तीन आयामी और मात्रात्मक होना चाहिए । TEBVs विभिंन संस्कृति शर्तों के तहत इस इमेजिंग रूपरेखा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, यहां तक कि परिवर्तन से पहले और संवहनी प्रत्यारोपण के बाद भी शामिल है । रणनीतियां इंजीनियर जहाजों के रहने की सुविधाओं का वर्णन करने की जरूरत है । ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक दृश्य और ऊतक जमाव और ठहराव की सामग्री की अनुमति देते हैं । अंय लाभ की संभावना को सक्षम करने के लिए कर रहे है गहरे ऊतक और उच्च संकल्प6,7के साथ लेबल मुक्त इमेजिंग । हालांकि, छवि विशेष अणुओं और वास्तविक समय की निगरानी के लिए कम आसानी से सुलभ ऑप्टिकल उपकरण एक महत्वपूर्ण व्यावहारिक बाधा है, जो रैखिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के व्यापक आवेदन सीमित है. ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) हृदय हस्तक्षेप चिकित्सा8गाइड करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया नैदानिक उपकरण के रूप में intravascular इमेजिंग रूपरेखा के साथ एक ऑप्टिकल दृष्टिकोण है । साहित्य में अक्टूबर की विधि TEBVs9,10, संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग अनुसंधान के लिए सकारात्मक इमेजिंग विधियों के साथ युग्मित की दीवार की मोटाई का आकलन करने के लिए एक तरह के रूप में सूचित किया गया था । जबकि, इंजीनियर संवहनी विकास और remodeling की गतिशीलता नहीं देखा गया था ।

इस पांडुलिपि में, हम चार सप्ताह संस्कृति के लिए biodegradable बहुलक पाड़ आधारित TEBVs की तैयारी का विस्तार । मानव गर्भनाल संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (HUASMCs) का विस्तार कर रहे है और एक छिद्रित ह्रास polyglycolic एसिड (पीजीए) पाड़ों में उपप्रतिक्रिया में वरीयता प्राप्त । Biodegradable पॉलिमर ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक अस्थायी सब्सट्रेट में भूमिका निभाते हैं और एक निश्चित गिरावट दर11है । आदेश में पाड़ गिरावट और नव ऊतक गठन, ECM और पीजीए पाड़ के बीच एक उचित मैच सुनिश्चित करने के लिए प्रभावी संवहनी remodeling के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं । छिड़काव प्रणाली देशी जहाजों के यांत्रिक microenvironment simulates और दबाव उत्तेजना के तहत एक सुसंगत विकृति बनाए रखता है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य TEBVs इमेजिंग और संस्कृति की दीर्घकालिक निगरानी के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और गैर विनाशकारी रणनीति का वर्णन है । इस प्रोटोकॉल रूपात्मक परिवर्तन और विभिंन संस्कृति की स्थिति के तहत इंजीनियर जहाजों की मोटाई माप के दृश्य के लिए उपयोग किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ों में बहुलक आधारित सामग्री क्षरण का विश्लेषण पहचान के लिए किया जा सकता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और इस प्रोटोकॉल, सहसंबंध और extracellular मैट्रिक्स वितरण और पीजीए गिरावट के ठहराव में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो पाड़ का आकलन की सुविधा कर सकते है खुर्दबीन स्कैनिंग के तरीकों के संयोजन से गिरावट अक्टूबर इमेजिंग के साथ संयुक्त ।

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Protocol

1. क्षरण पीजीए पाड़ आधारित ऊतक-इंजीनियर जहाजों संस्कृति

  1. पीजीए पाड़ निर्माण
    1. ईथीलीन ऑक्साइड (17 सेमी लंबाई, ५.० मिमी व्यास, और ०.३ मिमी मोटी) का उपयोग 5-0 टांका द्वारा निष्फल के आसपास सिलिकॉन टयूबिंग (19 मिमी व्यास और 1 मिमी मोटी) पीजीए मेष सीना ।
    2. polytetrafluoroethylene सीना (ePTFE, 1cm लंबाई) पीजीए मेष और छा के प्रत्येक छोर पर 2 मिमी से 4-0 सीवन के साथ ।
    3. 1 के लिए जाल के स्थानिक संरचना को समायोजित करने और ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी के साथ सोख 2 मिनट के लिए तीन बार एक मिनट के लिए NaOH में हाथ के साथ पीजीए पाड़ डुबकी । धीरे पैट एक टिशू पेपर हर बार के साथ सुपाड़ा सूखी । तो एक डाकू में मचान के लिए 1 एच के लिए एक धौंकनी के साथ सूखी ।
  2. विधानसभा के लिए प्रतिक्रिया और वाई-अक्टूबर इमेजिंग के लिए जंक्शन
    1. स्व-विकसित ग्लास बेलनाकार प्रतिक्रियाकर्ता (10 सेमी व्यास और चार होठों के अंदर और चार पक्ष-हथियार रिएक्टर के बाहर के रूप में चित्र 1में दिखाया गया है), पीजीए पाड़, सिलिकॉन ट्यूब (बाहरी व्यास 5 मिमी, मोटाई ०.३ मिमी) के साथ ऊंचाई में भिगोएं, संगत ट्यूबों, connectors, हलचल बार और विधानसभा के लिए एक ९५% 2 घंटे के लिए इथेनॉल टैंक में उपकरण
    2. साइड के माध्यम से पीजीए पाड़ खींचो एक संबंधक के साथ साथ एक तरफ से जुड़े प्रतिक्रिया के हथियार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वाई के साथ एक और पक्ष को अक्टूबर guidewire वितरित किया जंक्शन । एक ही रास्ते में एक और पीजीए पाड़ में प्रतिक्रिया में इकट्ठा । कृपया चित्रा 1को देखें ।
    3. 4-0 टांके के साथ कस द्वारा ePTFE के लिए फिट करने के लिए प्रतिक्रियाकर्ता होंठ ।
    4. 1 घंटे के लिए फिर से इथेनॉल टैंक में प्रतिक्रियात्मक रखो और पर धौंकनी के साथ हुड में रात भर सूखी ।
  3. HUASMCs और स्थैतिक प्रतिक्रियात्मक कंडीशनिंग का सीडिंग
    1. मानक explant तकनीक से मानव गर्भनाल धमनियों से अलग HUASMCs ।
    2. विस्तृत करें और बनाए रखने कोशिकाओं चिकनी मांसपेशी सेल विकास मध्यम में DMEM माध्यम से बना है, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम, २.३६ मिलीग्राम/एमएल HEPES, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन जी, ५० µ ग्राम/एमएल रेखा, 20 µ जी/एमएल alanine, ५० µ जी/एमएल glycine, १.५ µ जी/एमएल CuSO4, ५० µ जी/एमएल ascorbic एसिड , 10 एनजी/एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक और 10 एनजी/एमएल प्लेटलेट व्युत्पंन वृद्धि कारक ।
    3. 5 × 106 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में बीज HUASMCs पर ऊपर संस्कृति माध्यम में पीजीए पाड़ों पर एमएल ।
    4. एक बार हलचल (१.५ सेमी लंबाई) में प्रतिक्रिया के लिए रखो । डालें एक खिला ट्यूब (5 मिमी व्यास, 15 सेमी लंबाई) और तीन लघु टयूबिंग क्षेत्रों (5 मिमी व्यास, 7 सेमी लंबाई) सिलिकॉन डाट ढक्कन के माध्यम से गैस विनिमय के लिए ।
    5. प्रत्येक हवा में परिवर्तन ट्यूब और खिला ट्यूब के लिए एक हेपरिन टोपी के लिए PTFE ०.२२ µm फिल्टर देते हैं । प्रति मिनट 13 राउंड की सरगर्मी गति के साथ हलचल बार समायोजित करें । संस्कृति प्रणाली में कांच प्रतिक्रियाकर्ता, सिलिकॉन डाट ढक्कन और पीजीए पाड़ इकट्ठा ।
    6. HUASMCs की अनुमति दें ४५ मिनट के लिए का पालन करने के लिए खड़े के साथ हर 15 मिनट झुकाव, छोड़ दिया और सही करने के लिए । रिएक्टर बंदरगाहों और जोड़ों सभी आयल फिल्म के साथ बंद कर रहे हैं ।
    7. लुओ-सुनो पंप, पंजाबियों बैग, छिड़काव प्रणाली के रूप में संगत ट्यूबों के साथ चालक कनेक्ट । पंजाबियों के साथ ट्यूबों को भरने के लिए ड्राइव खोलें ।
    8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ एक humidified मशीन में समग्र प्रतिक्रियात्मक प्लेस । HUASMCs संस्कृति माध्यम के ४५० मिलीलीटर के साथ संस्कृति चैंबर भरें ।
    9. रोकें बटन दबाएं और ड्राइव डिवाइस की पावर बंद कर दें । एक सप्ताह के लिए स्थिर संस्कृति के तहत अस्तव्यस्त पाड़ों हो जाना ।
    10. संस्कृति माध्यम हर 3-4 दिन बदल खिला ट्यूब के माध्यम से पुराने माध्यम के आधे aspirating और ताजा संस्कृति माध्यम के एक समकक्ष राशि के साथ रिएक्टर refilling ।
  4. OCT इमेजिंग के लिए छिड़काव सिस्टम तैयार करना
    1. पंजाबियों बैग में तरल पदार्थ पंप करने के लिए संगत और वापस बैग के माध्यम से प्रसारित करने के लिए ।
    2. चालक की शक्ति खोलें और प्रति मिनट ६० धड़कता है और १२० mmHg के उत्पादन सिस्टोलिक दबाव की एक आवृत्ति के साथ पंप की स्थापना को विनियमित । ऊतक इंजीनियरिंग संवहनी संस्कृति की जरूरतों के अनुसार यांत्रिक मापदंडों को समायोजित करें ।
    3. छिड़काव सिस्टम कार्य करने के लिए चलाएँ बटन क्लिक करें । iteratively ज़ोर द्वारा 3 सप्ताह के लिए जहाजों के लिए ऊपर फिक्स्ड गुणवाला उत्तेजना प्रदान करें संगत ट्यूब10,12 स्थैतिक संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद ।

2. अक्टूबर के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग प्रदर्शन

  1. आवृत्ति-डोमेन OCT intravascular इमेजिंग सिस्टम9के आधार पर TEBV की संरचना की पहचान करने के लिए 10-20 µm के अक्षीय रिज़ॉल्यूशन और 1-2 mm की इमेज गहराई सुनिश्चित करने के लिए एक प्रकाश स्रोत का उपयोग करें ।
  2. पावर स्विच चालू करें और छवि कैप्चर सॉफ़्टवेयर खोलें ।
  3. ड्राइव मोटर और ऑप्टिकल नियंत्रक (डॉक्टर) कैथेटर स्वचालित रिट्रीट समारोह के साथ करने के लिए फाइबर ऑप्टिक इमेजिंग कैथेटर कनेक्ट ।
  4. 10 मिमी की एक स्वचालित pullback गति के साथ प्रति सेकंड 10 तख्ते के लिए छवि अधिग्रहण दर के मापदंडों सेट/
  5. एक 18G सुई के साथ हेपरिन टोपी के माध्यम से Y-जंक्शन के लिए इमेजिंग कैथेटर देते हैं ।
  6. सिलिकॉन ट्यूब में कैथेटर प्लेस और कैनवास पर पीजीए पाड़ लोड करने से पहले पीजीए मेष के टांका जकड़न की पहचान ।
  7. ब्याज के क्षेत्र पर कैथेटर टिप प्लेस । pullback डिवाइस को समायोजित करें और छवि गुणवत्ता8के लिए जांचें ।
  8. प्रत्येक व्यक्ति TEBV के लिए संस्कृति में 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 दिनों में छवियों को प्राप्त करें और सतह आकृति विज्ञान, आंतरिक संरचना और संरचना सहित TEBV microstructure के वास्तविक समय अवलोकन के साथ क्रमिक रूप से सहेजें ।
  9. हर बार इंजीनियर जहाजों के विश्वसनीय माप पाने के लिए 3 बार के लिए माप दोहराएँ । छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परीक्षण भर में छवियों की एक श्रृंखला पर कब्जा ।

3. इमेजिंग विश्लेषण

  1. TEBV दीवार मोटाई को मापने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । विश्लेषण करने के लिए छवि का चयन करें । सॉफ्टवेयर द्वारा TEBV के भीतरी हिस्से को स्वचालित रूप से पहचानने के लिए ट्रैकिंग टूल पर क्लिक करें और मैन्युअल रूप से बाहरी पक्ष को स्केच करे. मोटाई का एक आरेख स्क्रीन पर दिखाई देगा ।
  2. 5 बार के लिए माप दोहराने के लिए निर्माण की विश्वसनीय माप पाने के लिए । प्राप्त जानकारी के अनुसार दो स्वतंत्र जांचकर्ताओं द्वारा OCT विश्लेषण किया गया था ।

4. TEBV और ऊतक प्रसंस्करण की फसल

  1. जब संस्कृति समाप्त हो गया है और संस्कृति माध्यम को त्यागने के लिए इस पर रखा सिलिकॉन डाट ढक्कन खुला । ePTFE प्रतिक्रियाकर्ता होंठ से ढीला और कैंची के साथ ePTFE के बाहरी पक्ष से सिलिकॉन ट्यूबों में कटौती । हार्वेस्ट TEBVs और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी परीक्षा स्कैनिंग के लिए वर्गों में कटौती से प्रतिक्रिया ।
  2. TEBVs के बाकी बाहर ले जाओ और 4 µm मोटी वर्गों में कटौती । समर्थन सिलिकॉन ट्यूब बाहर खींचो और 4% paraformaldehyde के साथ वर्गों को ठीक । Masson के trichrome और Sirius लाल रंग के नित्य ऊतकवैज्ञानिक धुंधला करने के लिए कोलेजन और पीजीए10,13,14की आकृति विज्ञान की जांच करें ।
  3. पीजीए सामग्री और कोलेजन घटक का आकलन करने के लिए, एक ध्रुवीय सूक्ष्मदर्शी द्वारा Sirius लाल दाग के साथ histologic नमूनों का निरीक्षण । पीजीए अवशेष birefringence के माध्यम से स्पष्ट रूप से demarcated हैं और अवशेष क्षेत्र को क्रॉस-सेक्शनल एरिया10के आधार पर quantified किया जा सकता है ।

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Representative Results

तीन आयामी संस्कृति प्रणाली एक बंद द्रव चक्र10,13 (चित्रा 1) के साथ प्रतिक्रिया और छिड़काव प्रणाली में एक संस्कृति चैंबर के शामिल थे । OCT इमेजिंग कैथेटर Y-जंक्शन के बाहर के छोर में डाला गया था और इमेजिंग के लिए सिलिकॉन ट्यूब में वापस खींच लिया । अक्टूबर इमेजिंग पहले biodegradable बहुलक पाड़ के संरचनात्मक लक्षण वर्णन चित्रित के लिए इस्तेमाल किया गया था आधारित TEBVs के दौरान प्रतिक्रिया की खेती ।

चित्रा 2 इन पार-वास्तविक समय में ऊतक microstructure के अनुभागीय इमेजिंग के माध्यम से इंजीनियर संवहनी रिमॉडलिंग की प्रक्रिया को दिखाया । ज्यामितीय आकृति विज्ञान, दीवार मोटाई, क्षरण पीजीए सामग्री, और अलग संस्कृति समय अंक में TEBV मोटाई की तुलना के साथ ही गुणवाला उत्तेजना की उपस्थिति सहित मूल्यांकन किया गया था । कम मोटाई की एक प्रवृत्ति है और नाटकीय रूप से संस्कृति के पहले दो हफ्तों के भीतर इंजीनियर ऊतक के परिवर्तन देखा था, संकेत अमीर पीजीए क्रमिक क्षरण और ढीली से तंग नए ऊतक की संरचना का सुझाव । संस्कृति में 21 दिनों में, vasculature extracellular मैट्रिक्स समान रूप से वितरित और उच्च संकेत घटकों के साथ एक चिकनी संरचना का गठन किया था ज्यादातर अपव्यय । यहां तक कि संकेत के साथ TEBVs की दीवार की मोटाई में वृद्धि हुई संस्कृति के तीन सप्ताह के बाद धीरे । इस remodeling पहले हुई और रूपात्मक परिवर्तन गतिशील समूह (चित्रा 3) में और अधिक स्पष्ट रूप से प्रकट । इस प्रकार अक्टूबर इंजीनियर संवहनी आकृति विज्ञान की इमेजिंग सक्षम बनाता है और लंबे समय से चल रहे संस्कृति के पाठ्यक्रम में सीटू में कल्पना की है ।

चित्रा 4 histopathological के साथ अक्टूबर छवियों की तुलना में TEBV की संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद । है Masson trichrome धुंधला कोलेजन फाइबर इंजीनियर जहाजों की मीडिया परत में पीजीए अवशेष के साथ एक निश्चित दिशा में वितरित (चित्रा 4B) प्रदर्शित करता है । Sirius लाल दाग एक ध्रुवीय माइक्रोस्कोप (चित्रा 4c) का उपयोग करके पीजीए अवशेष और कोलेजन घटक से पता चला. कॉंपैक्ट microstructure के साथ इंजीनियर जहाजों की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ ऊतकवैज्ञानिक आकलन (चित्रा 4d) के साथ तुलना में थे । एक साथ ले लिया, अक्तूबर छवियां पीजीए दिखाया विभिंन आकारों और असुरक्षित नेटवर्क संरचना के साथ था । पीजीए पाड़ की संरचना कोई स्पष्ट परिवर्तन और संस्कृति के प्रारंभिक चरण में संस्कृति माध्यम के साथ सीधे संपर्क द्वारा सूजन है । लेकिन पीजीए के सिग्नल की तीव्रता कम हो गई । पीजीए अवयव और विघटित कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स के साथ प्रतिस्थापित किया गया । चार सप्ताह की अवधि में कम अंशों को देखा गया । क्रॉस-अनुभागीय इंजीनियर जहाजों की SEM छवियां गर्मी समय के विस्तार के लिए फाइबर टूटना का प्रदर्शन किया । सामग्री और extracellular मैट्रिक्स कंपोजिट और अधिक कॉंपैक्ट और कम पारदर्शिता के साथ छत्ते की तरह संरचना में थे ।

Figure 1
चित्रा 1 . के योजनाबद्ध ऊतक इंजीनियरिंग संवहनी संस्कृति प्रणाली है, जो एक संस्कृति चैंबर के शामिल में और छिड़काव प्रणाली के लिए प्रतिशब्द के लिए अक्टूबर इमेजिंग । गुणवाला पंप एक स्थिर द्रव यांत्रिक microenvironment का अनुकरण प्रवाह प्रदान की है । अक्टूबर इमेजिंग कैथेटर वापस संस्कृति चैंबर में सिलिकॉन ट्यूब में खींच लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . ऊतक के microstructure संस्कृति के दौरान रक्त वाहिकाओं इंजीनियर । संस्कृति समय से अधिक, संकेत संपंन पीजीए धीरे से नीचा और नए ऊतक की संरचना ढीली से तंग था । TEBVs एक चिकनी सतह और प्रचुर मात्रा में extracellular मैट्रिक्स समान रूप से संस्कृति के चार सप्ताह के बाद वितरित किया था । यह वास्तविक समय में पार अनुभागीय छवियों के माध्यम से इंजीनियर संवहनी remodeling की प्रक्रिया को दिखाया । यह आंकड़ा चेन, डब्ल्यू एट अलसे संशोधित किया गया है । 10 सिलिकॉन ट्यूब की मोटाई यहां इस्तेमाल किया 0.8 मिमी है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . TEBV दीवार की मोटाई परिवर्तन के दौरान संवहनी remodeling गतिशील और स्थैतिक समूहों में OCT माप से प्राप्त की । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि इंगित करती हैं । यह आंकड़ा चेन, डब्ल्यू एट अलसे संशोधित किया गया है । 10 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . biodegradable बहुलक आधारित ऊतक के इमेजिंग-इंजीनियर रक्त वाहिकाओं । (क) संस्कृति के चार सप्ताह के बाद TEBV की छवि OCT । एम: संस्कृति माध्यम; एस: सिलिकॉन ट्यूब; यहां इस्तेमाल किए गए सिलिकॉन ट्यूब की मोटाई 0.8 मिमी है । सफेद तीर TEBV संकेत दिया । लाल तीर पीजीए टुकड़ा संकेत दिया । (ख) है Masson trichrome दाग अच्छी तरह से प्रदर्शन किया-इंजीनियर जहाजों की मीडिया परत में पीजीए के अवशिष्ट सामग्री के साथ कोलेजन फाइबर का आयोजन किया । स्केल बार = 100 µm. (ग) Sirius लाल दाग एक ध्रुवीय माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पता चला पीजीए अवशेष । हरे तीर पीजीए टुकड़ा इंगित करता है । स्केल बार: १०० µm । (घ) कॉंपैक्ट microstructure के साथ इंजीनियर पोत की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ ऊतकवैज्ञानिक आकलन के साथ तुलना करने के लिए दिखाया गया । स्केल बार = 50 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

संरचनात्मक और यांत्रिक मूल रक्त वाहिकाओं के उन लोगों के लिए इसी तरह के गुणों के साथ इंजीनियर जहाजों उत्पन्न करने के लिए नैदानिक उपयोग के लिए समय को कम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और संवहनी इंजीनियरिंग का अंतिम लक्ष्य है. ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के दृश्य की अनुमति ऊतक इंजीनियर संवहनी विशिष्ट घटक है, जो की निगरानी नहीं कर सकते व्यक्ति के निर्माण में संस्कृति और निवेश के भ्रष्टाचार के लिए एक संस्कृति वातावरण के बिना बाँझ समझौता7. इस आलेख में, कल्चर चैंबर छिड़काव सिस्टम से अलग है । अपेक्षाकृत स्वतंत्र छिड़काव प्रणाली संस्कृति और अक्टूबर guidewire के स्थान के दौरान प्रदूषण के कम जोखिम की गारंटी देता है । इस बीच इस intraluminal इमेजिंग मोडल को अपनाया उच्च संकल्प है कि histopathology है, जो TEBV वृद्धि की स्थिति का आकलन किया और अधिक व्यावहारिक और भी पहले इस्तेमाल किया जा उंमीद थी के साथ सीटू में TEBVs की आसान और सुरक्षा निगरानी प्रत्यारोपण प्लेसमेंट के बाद ।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक आसानी से उपलब्ध है, तेजी से वास्तविक समय और गैर विनाशकारी इमेजिंग रणनीति का मूल्यांकन करने के लिए अपमानजनक बहुलक आधारित इंजीनियर पोत विकास का उपयोग कैथेटर आधारित अक्टूबर इंगित करता है । गतिशील प्रक्रिया के अवलोकन के माध्यम से, कुछ मुख्य संवहनी इंजीनियरिंग को प्रभावित करने वाले कारकों, जैसे संदूषण या बेजोड़ सेल-सामग्री ऊतक हानि के नेतृत्व में बातचीत, जल्दी पता लगाने के साथ प्रतिष्ठित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम NaOH-संशोधित पीजीए पाड़ के निर्माण में शामिल हैं, सुपाड़ा में HUASMCs के सफल बोने की व्यवस्था, जुदाई बाँझ संस्कृति प्रणाली से निगरानी प्रणाली, तेज और कुशल कैथेटर आपरेशन प्रक्रिया .

इस तकनीक का क्षरण राज्यों और पीजीए पाड़ों के नए ऊतक के साथ मिश्रित के जटिल संरचना का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । छिद्रित नेटवर्क संरचना के साथ बहुलक पाड़ धीरे-धीरे और पहले तीन हफ्तों, जो सेल आसंजन और extracellular मैट्रिक्स के लिए एक तीन आयामी संरचना के साथ विन्यास के लिए महत्वपूर्ण है में संवहनी remodeling की प्रक्रिया पर हावी पोषक मुद्रा और एक संकेत वाहक के रूप में15,16। इंजीनियर जहाजों में पीजीए अवशेष के ठहराव के लिए स्पष्ट रूप से Sirius लाल से सना हुआ छवियों की पहचान की, क्षरणीय पाड़ में17 ध्रुवीकरण के उपयोग के लिए आधारित संवहनी इंजीनियरिंग क्षमता के बाद मानक मूल्यांकन हो गया है खेती. इसलिए अक्टूबर इमेजिंग नाड़ी के रूप में, संवहनी इंजीनियरिंग में पीजीए क्षरण का आकलन करने के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक तरीकों के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

इस तकनीक की कमी इंजीनियर संवहनी remodeling के दौरान सेल प्रसार, वितरण, सेल सेल और सेल-ECM बातचीत का आकलन करने के लिए संकल्प सीमा है । हम सेलुलर या उपसेलुलर स्तर18 पर TEBVs microstructure की जांच करने के लिए उपयुक्त विधि खोजने की उंमीद है और विकास कैनेटीक्स यों तो । अक्टूबर इमेजिंग के औसत ऑप्टिकल संकेतों के मात्रात्मक विश्लेषण के साथ, हम संवहनी इंजीनियरिंग में सामग्री क्षरण के तंत्र के बारे में अधिक जानकारी हो सकती है । ऐसे प्रयोगों को हमारे भविष्य की पढ़ाई के लिए माना जा रहा है ।

कुल मिलाकर, हमारे परिणाम बताते है कि अक्टूबर एक आसानी से उपलब्ध है, तेजी से वास्तविक समय और गैर विनाशकारी इमेजिंग के विकास और TEBVs के remodeling की निगरानी की रणनीति है । यह संरचनात्मक स्थापत्य सुविधाओं और इंजीनियर जहाजों की लंबी अवधि के remodeling प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है । ध्रुवीय माइक्रोस्कोप जो इंजीनियर जहाजों में बहुलक अवशेष के ठहराव के लिए अनुपूरक सबूत प्रदान की आवेदन पाड़ अक्टूबर इमेजिंग के साथ संयुक्त क्षरण का आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकता है । एक साथ ले लिया, वर्तमान प्रोटोकॉल संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग में अपने आवेदन के लिए अक्टूबर के मूल्य का वादा रखती है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम इस काम के समर्थन के लिए चीन के गुआंग्डोंग प्रांत (2016B070701007) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PGA mesh Synthecon
silicone tube Cole Parmer
connector Cole Parmer
intravascular OCT system St. Jude Medical, Inc ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic Philips FEI Philips XL-30
polarized microscope Olympus Olympus BX51
sutures Johnson & Johnson
pulsatile pump Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software St. Jude Medical, Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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अपमानजनक पाड़ आधारित ऊतक के विनाशकारी निगरानी-इंजीनियर रक्त वाहिका ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग विकास
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Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).More

Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).

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