本文描述了一种逐步操作方案，利用光学相干断层扫描技术，对在脉动刺激条件下基于可生物降解聚合物支架构建的组织工程血管进行实时培养过程中的血管重塑及支架降解进行非破坏性、长周期的动态监测。
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本文内容
摘要
摘要
具有与天然血管相似结构和力学性能的工程化血管移植物有望满足日益增长的动脉旁路手术需求。在搏动性刺激条件下，对基于可降解聚合物支架的组织工程血管（TEBV）的生长动态及重塑过程进行表征，是血管组织工程研究中的关键环节。光学成像技术作为一种强大的工具，能够实现对工程化组织血管化过程的实时监测，并提供高分辨率的成像结果。本文展示了一种非破坏性、快速的实时成像策略，利用光学相干断层扫描（OCT）技术对TEBV在长期培养过程中的生长与重塑进行连续监测。通过该方法可评估血管的几何形态，包括血管重塑过程、管壁厚度，以及在不同培养时间点、有无搏动性刺激条件下TEBV厚度的比较。最后，与扫描电子显微镜（SEM）和偏光显微镜对聚合物降解的评估结果相比，OCT技术为在有无搏动性刺激条件下、以及在各个血管节段中实时观察重建组织内聚合物的降解过程提供了切实可行的手段。
引言
组织工程血管（TEBVs）是作为理想血管移植物最具前景的材料之一1。为了开发出在结构和功能特性上与天然血管相似且具有临床应用价值的移植物，研究人员已设计出多种技术以维持血管功能2,3。尽管已有工程化血管在植入后表现出可接受的通畅率，并进入III期临床研究4，但长期培养需求和高昂成本仍凸显了对TEBVs发育过程进行监测的必要性。深入了解在仿生化学-力学环境中，TEBVs中细胞外基质（ECM）的生长、重塑及适应过程，可为血管组织工程的发展提供关键信息。
追踪小直径组织工程血管发育的理想策略应具备无创性、无菌性、纵向性、三维性和定量性5。该成像方式可用于评估不同培养条件下组织工程血管（TEBV），甚至包括血管移植前后发生的变化。目前亟需能够描述活体组织工程血管特征的策略。光学成像技术可实现对组织沉积物和生物材料的可视化与定量分析。其他优势还包括能够实现高分辨率的深层组织成像和无需标记的成像6,7。然而，特定成像分子的使用以及用于实时监测的光学设备较难获取，这一实际障碍限制了非线性光学显微镜的广泛应用。光学相干....
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方案
1. 基于可降解PGA支架的组织工程血管培养
- PGA支架的制备
- 使用5-0缝线将经环氧乙烷灭菌的硅胶管（长17 cm，直径5.0 mm，厚0.3 mm）周围缝合聚羟基乙酸（PGA）网片（直径19 mm，厚1 mm）。
- 将膨体聚四氟乙烯（ePTFE，1 cm 长）用 4-0 缝线缝合至 PGA 网片的每一端，两端各重叠 2 mm。
- 将PGA支架用手浸入1 mol/L NaOH溶液中1分钟，以调节网格的空间结构，随后用组织培养级水浸泡3次，每次2分钟。每次浸泡后用纸巾轻轻拍干支架。然后在通风橱中用吹风机干燥1小时。
- 生物反应器与用于OCT成像的Y型接头的组装
- 将自制的圆柱形玻璃生物反应器（直径10 cm，高11.7 cm，反应器内部有四个凸缘，外部有四个侧臂，如图所示）浸泡于 图1），PGA支架、硅胶管（外径5 mm，壁厚0.3 mm）、生物相容性导管、连接器、搅拌子，以及在95%乙醇溶液中浸泡2小时所需的组装设备。
- 将PGA支架通过连接器从生物反应器的一侧臂穿过，另一侧则通过Y型接头穿过，该Y型接头用于输送OCT导丝。以相同方式在生物反应器中组装另一根PGA支架。请参考 图1.
- 用4-0缝线将ePTFE固定在生....
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结果
三维培养系统由生物反应器中的培养室和具有闭合液体循环的灌注系统组成10,13（图1）。将OCT成像导管插入Y型接头的远端，并在硅胶管内回撤以进行成像。在生物反应器培养过程中，首次采用OCT成像技术对基于可降解聚合物支架的组织工程血管的结构特征进行表征。
图2展示了通过实时横断面成像观察工程化血管重塑的过程。评估了几何形态学特征，包括管壁厚度、可降解PGA含量，以及不同培养时间点组织工程血管（TEBV）厚度的比较，并分析了是否存在脉动刺激的影响。在培养的前两周内，观察到厚度逐渐减小以及工程化组织发生显著变化的趋势，提示富含信号的PGA逐渐降解，新生组织结构由疏松向致密转变。培养至21天时，血管已形成结构平滑的组织，细胞外.......
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讨论
构建具有与天然血管相似结构和力学特性的工程化血管，有望缩短其临床应用所需时间，这也是血管组织工程的最终目标。光学成像技术能够可视化组织工程血管中的特定组分，但传统方法难以在不破坏无菌环境的前提下，对单个构建物在整个培养过程及移植物暴露期间进行连续监测7。本文中，培养室与灌注系统相互分离。相对独立的灌注系统不仅降低了培养过程中污染的风险，也便于光学相干断层成像（OCT）导丝的放置。同时，这种管腔内成像方式可实现对原位组织工程血管（TEBV）安全、便捷的高分辨率监测，其分辨率接近组织病理学水平，使得对TEBV生长状态的评估更加切实可行，并有望在植入前或植入后加以应用。
本方案介绍了一种易于获取、快速、实时且非破坏性的成像策略，用于评估基于可降解聚合物的组织工程血管的发育情况，该方法采用基于导管的光学相干断层扫描（OCT）。通过观察动态过程，可及早发现影响血管组织工程的一些主要因素，例如污染或细胞-材料相互作用不匹配所导致的组织丢失。确保本方案有效性的关键步骤包括：制备经NaOH修饰的PGA支架、成功在支架上接种人脐动脉平滑肌细胞（HUAS.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢中国广东省科学技术计划项目（2016B070701007）对本工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PGA 网片 | Synthecon | ||
| 硅胶管 | Cole Parmer | ||
| 连接器 | Cole Parmer | ||
| 血管内 OCT 系统 | St. Jude Medical, Inc | ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM | |
| 扫描电子显微镜 | Philips | FEI Philips XL-30 | |
| 偏光显微镜 | Olympus | Olympus BX51 | |
| 缝合线 | Johnson & Johnson | ||
| 脉动泵 | 广东省心血管病研究所 | ||
| LightLab Imaging 软件 | St. Jude Medical, Inc |
参考文献
- Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
- Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-gui....
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重印与许可
