Summary
可生物降解高分子支架组织工程血管脉冲刺激实时培养过程中的非破坏性和长周期监测的步进协议本文介绍了光学相干层析成像方法。
Abstract
具有类似天然血管的结构和机械性质的工程化血管移植有望满足日益增长的动脉旁路需求。用脉冲刺激对可降解高分子支架基组织工程血管 (TEBVs) 的生长动力学和重塑过程进行表征, 对血管组织工程具有重要意义。光学成像技术是监测工程组织血管化的有力工具, 能够实现实时文化中的高分辨率成像。本文通过光学相干层析成像 (OCT) 对 TEBVs 在长期培养中的生长和重塑进行了无损、快速的实时成像策略。评价几何形态学, 包括血管重塑过程、壁厚、不同培养时间点的 TEBV 厚度比较和脉动刺激的存在。最后, OCT 提供了实际的可能性, 实时观察在重建组织中的聚合物在脉动刺激或不和在每一个容器段, 通过与评估聚合物降解使用扫描电子显微镜 (SEM) 和偏光显微镜。
Introduction
组织工程血管 (TEBVs) 是最有希望的材料作为理想的血管移植1。为了使移植物在临床上有用, 以类似的结构和功能特性作为本机血管, 多项技术的设计, 以维持血管功能2,3。虽然在植入和 III 期临床研究4中, 已有工程血管可接受的通畅率, 但长期培养和高成本也显示了监测 TEBVs 发展的必要性。对仿生化学-机械环境中 TEBVs 细胞外基质 (ECM) 的生长、重塑和适应过程的理解可以为血管组织工程的发展提供重要的信息。
跟踪小直径工程船舶发展的理想策略5应为无损、无菌、纵向、三维和定量。TEBVs 在不同的培养条件下可以用这种成像方式评估, 甚至包括血管移植前后的变化。描述生活工程船的特征的策略是必要的。光学成像技术允许组织沉积和生物材料的可视化和量化。其他优点是可以使深组织和无标签成像与高分辨率6,7。然而, 图像特异分子和不易接近的光学设备用于实时监测是一个重要的实际障碍, 限制了非线性光学显微学的广泛应用。光学相干层析成像 (OCT) 是一种用于指导心脏介入治疗8的广泛应用的临床工具, 具有血管内成像方式。文献报道了 OCT 的方法, 以评估 TEBVs9,10的壁厚, 加上肯定成像方式的血管组织工程研究。然而, 没有观察到工程血管生长和重塑的动力学。
本论文详细介绍了四周培养的生物降解高分子支架 TEBVs 的制备方法。人脐动脉血管平滑肌细胞 (HUASMCs) 在生物反应器中扩展并播种成多孔可降解羟基酸 (PGA) 支架。生物降解聚合物在组织工程的临时基质中发挥作用, 并具有一定的降解率11。为了保证支架降解与新组织形成之间的适当匹配, ECM 和 PGA 支架是有效血管重塑的关键因素。该灌注系统模拟了本机的生物力学微环境, 在压力刺激下保持了一致的变形。
提出的协议的目的是描述一个相对简单和无损的战略, TEBVs 成像和长期监测的文化。该协议可用于不同培养条件下工程船舶形态变化和厚度测量的可视化。此外, 还可以对组织工程支架中聚合物基材料的降解进行分析, 以进行鉴定。采用扫描电子显微镜 (SEM) 和偏光显微镜相结合的方法, 对细胞外基质分布和 PGA 降解的相关和定量进行了研究, 有助于评估脚手架退化与 OCT 成像相结合。
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Protocol
1. 可降解 PGA 支架基组织工程容器培养
- PGA 脚手架制作
- 将 PGA 网 (19 毫米直径和1毫米厚), 用0.3 缝合环氧乙烷 (17 厘米长, 5.0 毫米直径, 5-0 毫米厚) 消毒。
- 将聚四氟乙烯 (聚四氟乙烯, 1cm 长度) 缝合到 PGA 网格的每一端, 重叠2毫米。
- 在1摩尔/升氢氧化钠中用手蘸 PGA 支架1分钟, 调整网格的空间结构, 用组织培养级水浸泡三次, 每组2分钟。每次用纸巾轻轻拍干脚手架。然后用鼓风机将支架干燥1小时。
- 生物反应器的组装与 OCT 成像的 Y 结
- 浸泡自已开发的玻璃圆柱形生物反应器 (10 厘米直径和11.7 厘米的高度与四唇内和四侧臂外的反应堆, 如图 1), PGA 脚手架, 硅胶管 (外径5毫米, 厚度0.3 毫米),95% 乙醇罐中装配的生物相容管、连接器、搅拌杆和设备2小时。
- 拉 PGA 脚手架通过与连接器一侧连接的生物反应器的侧臂, 以及另一侧与用于提供 OCT 导丝的 Y 连接。用同样的方法在生物反应器中组装另一个 PGA 脚手架。请参阅图 1。
- 用4-0 缝线收紧聚四氟乙烯以适应生物反应器的嘴唇。
- 再将生物反应器放在乙醇罐中1小时, 用鼓风机将其干燥一夜。
- HUASMCs 与静态生物反应器调节的播种
- 用标准外植体技术分离人脐动脉中的 HUASMCs。
- 扩张和维持平滑肌细胞生长培养基中由 DMEM 培养基组成的细胞, 20% 胎牛血清, 2.36 毫克/毫升 HEPES, 100 的 U/毫升青霉素 G, 50 µg/毫升脯氨酸, 20 µg/毫升丙氨酸, 50 µg/毫升甘氨酸, 1.5 µg/毫升 CuSO4, 50 µg/毫升抗坏血酸, 10 ng/毫升碱性成纤维细胞生长因子和10的血小板衍生生长因子。
- 种子 HUASMCs 在 5×106细胞/毫升的浓度在上述培养基上的 PGA 支架上。
- 在生物反应器中放入搅拌杆 (1.5 厘米长)。插入一个加料管 (5 毫米直径, 15 厘米长) 和三短油管段 (5 毫米直径, 7 厘米长度), 用于气体交换通过硅胶塞子盖子。
- 将聚四氟乙烯0.22 µm 过滤器连接到每一个空气变化管和一个肝素帽的喂养管。调整搅拌杆的搅拌速度为每分钟13回合。将玻璃生物反应器、硅胶塞子盖和 PGA 脚手架组装成养殖系统。
- 允许 HUASMCs 坚持45分钟, 通过倾斜的生物反应器每15分钟与立场, 在左侧和右侧。反应器的端口和接头都用石蜡膜密封。
- 连接螺叶泵, PBS 袋, 驱动程序与生物相容管作为灌注系统。打开驱动器, 用 PBS 填充管道。
- 将整个生物反应器放在一个加湿的孵化器中, 5% CO2在37摄氏度。用450毫升的 HUASMCs 培养基填充培养腔。
- 按 "停止" 按钮并关闭驱动器设备的电源。在静态培养下种植种子支架一周。
- 每3-4 天将培养基中的一半通过加料管吸气, 再用同等数量的新鲜培养基重新填充反应器, 以改变培养培养基。
- OCT 成像灌注系统的研制
- 在 PBS 袋中泵浦流体通过生物相容的管子循环, 回到袋子里。
- 打开驱动程序的电源, 调节泵的设置, 频率为每分钟60次, 输出收缩压力为 120 mmHg。根据组织工程血管培养的需要, 调整机械参数。
- 单击 "运行" 按钮, 使灌注系统正常工作。通过迭代加压生物相容管10,12在静态培养1周后, 提供上述固定的脉动刺激对血管3周。
2. 利用 OCT 进行光学成像
- 利用光源保证10-20µm 的轴向分辨率和 1-2 mm 的图像深度, 以识别基于频域 OCT 血管成像系统9的 TEBV 结构。
- 开启电源开关并打开图像采集软件。
- 将光纤成像导管连接到驱动马达和光学控制器 (DOC) 中, 并配以导管自动撤退功能。
- 将图像采集率的参数设置为每秒10帧, 自动回撤速度为10毫米/秒。
- 用18G 针将成像导管连接到 Y 形接头。
- 将导管放入硅胶管中, 在将 pga 脚手架装入生物反应器之前, 确定 pga 网格的缝合密性。
- 把导管尖放在感兴趣的区域。调整回撤装置, 检查图像质量8。
- 获取图像在 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 天在文化为每个单独 TEBV 和保存按顺序 TEBV 显微组织的实时观察, 包括表面形态, 内部结构和构成。
- 重复测量3次, 以获得可靠的测量工程船舶每次。使用图像捕获软件在整个测试过程中捕获一系列图像。
3. 成像分析
- 使用图像分析软件测量 TEBV 壁厚。选择要分析的图像。单击跟踪工具可自动识别 TEBV 的内侧, 并手动绘制外部侧面。屏幕上将显示一个厚度图。
- 重复测量5次, 以获得可靠的结构测量。OCT 分析是由两名独立调查员对获得的信息视而不见。
4. TEBV 和组织加工的收获
- 在培养完成后, 打开放置在生物反应器上的硅胶塞子盖并丢弃培养基。从生物反应器的嘴唇松开聚四氟乙烯, 用剪刀把聚四氟乙烯外侧的硅胶管切开。从生物反应器中收获 TEBVs, 并切割成切片进行扫描电镜检查。
- 取出其余的 TEBVs, 切成4µm 厚的部分。拉出支撑硅胶管和固定部分与4% 多聚甲醛。对马尾三色和天狼星红进行常规组织学染色, 检查胶原蛋白和 PGA10、13、14的形态学。
- 为了评估 PGA 含量和胶原成分, 用偏光显微镜观察小天狼星红染色的组织学标本。PGA 残留物通过双折射明显标定, 剩余面积可根据断面面积10进行量化。
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Representative Results
三维培养系统由生物反应器中的一个培养室和一个封闭流体循环10、13 (图 1) 的灌注系统组成。OCT 成像导管插入到 Y 形接头的远端, 并将其拉回硅胶管中进行成像。在生物反应器培养过程中, OCT 成像首次被用于描述生物降解高分子支架基 TEBVs 的结构表征。
图 2显示了通过这些对组织显微结构的实时的横断面成像进行工程化血管重塑的过程。对几何形态学进行了评价, 包括壁厚、可降解 PGA 含量、不同培养时间点的 TEBV 厚度比较以及脉动刺激的存在。在前两周的培养中, 出现了厚度下降和工程组织急剧变化的趋势, 这意味着富含信号的 PGA 逐渐退化, 新组织的结构从松散到紧。在21天的培养中, 血管形成了一个平滑的结构, 细胞外基质分布均匀, 高信号分量大多消散。经过三周的培养, TEBVs 的壁厚随均匀信号的增加而逐渐增大。这种重塑发生的较早, 形态学的变化表现出更明显的动态组 (图 3)。因此, OCT 使工程化血管形态学成像在长期运行的文化过程中能够就地、实时地可视化。
图 4在4周的文化背景下, 将 OCT 图像与 TEBV 的病理学发现进行比较。马尾松的三色染色表明胶原纤维分布在一定的方向与 PGA 残留在媒体层的工程船舶 (图 4B)。天狼星红染色显示 PGA 残留物和胶原成分使用偏光显微镜 (图 4C)。将结构紧凑的工程血管扫描电子显微图与组织学评价进行了比较,如 4D。同时, OCT 图像显示 PGA 具有不同的大小和多孔网络结构。在早期培养过程中, PGA 支架的结构没有明显的变化, 直接与培养基接触后肿胀。但 PGA 的信号强度降低。PGA 组分被分解并且替换与细胞和细胞外基质。在四周的时间里, 发现的碎片较少。横断面工程化容器的 SEM 图像显示纤维破裂到潜伏期延长。材料和胞外基质复合材料在蜂窝状结构中更紧凑, 透明度更低。
图 1.组织工程血管培养系统示意图, 由生物反应器中的培养室和 OCT 成像的灌注系统组成.脉动泵提供了模拟生物力学微环境的稳定流体流动。OCT 成像导管被拉回在硅胶管在文化室。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.组织工程化血管在培养过程中的显微组织.在培养时间上, 信号丰富的 PGA 逐渐退化, 新组织的结构从松散到紧。TEBVs 在四周的培养后, 表面光滑, 细胞外基质均匀分布。通过剖面图像实时显示了工程化血管重塑过程。这一数字已由陈、W等人修改。10在这里使用的硅胶管的厚度是0.8mm。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.从 OCT 测量得到的动态和静态组血管重塑过程中 TEBV 壁厚度变化的比较.错误条表示标准错误。这一数字已由陈、W等人修改。10请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.生物降解聚合物基组织工程血管的成像.(一) 四周的文化 TEBV 的华侨城形象。M: 培养基;S: 硅胶管;这里使用的硅胶管的厚度是0.8mm。白色箭头表示 TEBV。红色箭头表示 PGA 碎片。(B) 马尾松的三色染色显示出组织良好的胶原纤维, 以及在工程容器介质层中的 PGA 残留量。鳞片 bar=100 µm. (C) 天狼星红染色用偏光显微镜显示 PGA 残留物。绿色箭头表示 PGA 碎片。刻度条: 100 µm. (D) 对结构紧凑的工程化容器进行扫描电子显微图的比较, 并与组织学评定进行对比。缩放 bar=50 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
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Discussion
生成具有类似于原生血管的结构和机械特性的工程容器, 可缩短临床使用时间, 是血管工程的终极目标。光学成像技术允许可视化组织工程化的血管特异成分, 它不能监测整个文化和暴露移植到一个文化环境中的个体结构, 而不损害不孕7。本文将培养室与灌注系统分离。相对独立的灌流系统, 保证了养殖过程中污染风险的降低和导丝的安置。同时, 该腔内成像方式采用了 TEBVs 的简便安全监测, 在高分辨率接近病理组织学的情况下, 使 TEBV 生长状况的评估更加实用, 甚至预期在之前或植入后放置。
目前的协议表明了一个现成的, 快速的实时和无损成像策略, 以评估可降解聚合物为基础的工程船舶开发使用导管为基础的 OCT。通过对动态过程的观察, 影响血管工程的一些主要因素, 如污染或不匹配的细胞材料相互作用导致组织损失, 可与早期发现区分开来。确保该协议有效性的关键步骤包括制备氢氧化钠修饰的 PGA 脚手架、在脚手架中成功播种 HUASMCs、从监测系统分离无菌培养系统、快速和熟练的导管操作过程。.
该技术可用于评估与新组织混合的 PGA 支架的降解状态和复杂结构。多孔网络结构的高分子支架在头三周内逐渐退化, 主导了血管重塑过程, 对细胞黏附和细胞外基质沉积具有三维结构具有重要意义。营养素交换并且作为信号载体15,16。对于由天狼星红染图像明确识别的工程船舶中 PGA 残留物的量化, 使用偏光显微镜17在可降解支架基血管工程中的应用有可能成为标准评价后,培养。因此, OCT 成像与偏光显微镜相结合, 可作为评价血管工程中 PGA 降解的定性和定量方法。
该技术的局限性是在工程化血管重塑过程中评估细胞增殖、分布、细胞和细胞 ECM 相互作用的分辨率限制。我们希望找到合适的方法来调查 TEBVs 显微组织在细胞或亚型18级和量化的增长动力学。通过对 OCT 成像平均光信号的定量分析, 可以更清楚地了解血管工程材料退化的机理。这些实验正在考虑我们的未来研究。
总体上, 我们的结果表明 OCT 是一个现成的, 快速的实时和无损成像策略, 以监测 TEBVs 的生长和重塑。它被用来描述结构特征和工程船舶的长期重塑过程。偏光显微镜的应用为工程船舶中聚合物残留的定量化提供了补充证据, 可用于评估与 OCT 成像相结合的脚手架退化。同时, 本协议在血管组织工程中的应用具有很有前景的意义。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢广东省科技规划项目 (2016B070701007) 支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PGA mesh | Synthecon | ||
| silicone tube | Cole Parmer | ||
| connector | Cole Parmer | ||
| intravascular OCT system | St. Jude Medical, Inc | ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM | |
| scanning electron microscopic | Philips | FEI Philips XL-30 | |
| polarized microscope | Olympus | Olympus BX51 | |
| sutures | Johnson & Johnson | ||
| pulsatile pump | Guangdong Cardiovascular Institute | ||
| LightLab Imaging software | St. Jude Medical, Inc |
References
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