Summary
非破壊と長周期のステップでプロトコルの血管リモデリングと生分解性高分子足場ベース組織設計血管拍動性刺激によるリアルタイム文化における足場分解プロセスの監視光干渉断層計を使用してご紹介します。
Abstract
構造と機械的特性自然な血管のように人工血管は動脈バイパスのための高まる需要を満たすために期待されます。成長動態の特性と分解性高分子足場ベース組織設計血管 (TEBVs) 拍動性刺激の改造過程は、維管束組織工学にとって重要です。光学イメージング技術はリアルタイム文化の高分解能イメージングを有効にするに設計された組織の血管新生を監視するための強力なツールとして頭角を現します。このペーパーは、非破壊高速リアルタイム イメージング増加を監視する戦略と光干渉断層計 (OCT) を使用して、長期的な文化の TEBVs の改造を紹介します。異文化タイム ポイントと拍動性刺激の存在で血管改造プロセス、壁厚 TEBV 厚の比較など、幾何学的な形態が評価されます。最後に、10 月拍動刺激下で再建組織のポリマーの劣化の実時間観測の実用的な可能性を提供しますまたはないと各血管によって比較による高分子の劣化評価電子 microscopic(SEM) と偏光顕微鏡をスキャンします。
Introduction
血管組織エンジニア リング (TEBVs) は理想的な血管1として最も有望な材料です。移植ネイティブ血管として同じような構造と機能特性と臨床的に有用であることを開発するために複数の手法は、血管機能2,3を維持するために設計されています。第 III 相臨床試験4と注入中に許容可能な開存率と設計された船をされているが、また、長期培養と高コストで TEBVs の開発を監視する必要性を示します。バイオミメティック化学力学環境での TEBVs の細胞外今回成長・改造・適応プロセスの理解は、維管束組織工学の開発のための重要な情報を提供できます。
5小口径人工血管の開発を追跡するための理想的な戦略は、非破壊、滅菌、縦、三次元、定量的にする必要があります。異なる培養条件下での TEBVs は、血管移植術前後に変更を含め、このイメージング法によって評価できます。生活設計の船の機能を記述するための戦略が必要です。光イメージング技術は、可視化と組織沈着と生体材料の定量化を許可します。他の利点は、高解像度6,7と深部組織とラベル無料画像を有効にすることです。しかし、イメージ固有の分子とリアルタイム モニタ リングのためのより簡単にアクセス可能な光学機器は、非線形光学顕微鏡の広範なアプリケーションを制限している重要な実用的な障害物です。光干渉断層計 (OCT)、心臓インターベンション治療8を導くための広く使われている臨床ツールとして血管内イメージング法と光アプローチです。文献の 10 月のメソッドは TEBVs9,10, 維管束組織工学研究法の肯定的なイメージと相まっての壁の厚さを評価する方法として報告されました。一方の動力学設計血管成長と改造は観察されなかった。
本稿では、4 週間の文化の生分解性高分子足場ベースの TEBVs の準備を詳しく説明します。ひと臍帯動脈の血管平滑筋細胞 (HUASMCs) が拡張およびバイオリアクター内で多孔性分解性ポリグ リコール酸 (PGA) 足場に播種します。生分解性ポリマーは組織工学のための一時的な基板で役割を果たす、特定劣化率11です。Scaffold の劣化と新組織形成の間の適切な一致を確保するために ECM と PGA 足場効果的な血管リモデリングの重要な要因であります。灌流システムは、ネイティブ血管の力学的な微小環境をシミュレートし、圧刺激の下で一貫した変形を維持します。
提案するプロトコルの目的は、TEBVs イメージングと文化の長期監視のため比較的単純で非破壊戦略を説明します。このプロトコルは、形態学的変化の可視化と異なる培養条件下で設計された容器の厚さ測定に利用できます。また、識別のため足場をエンジニア リング組織で高分子系材料劣化の解析を実行できます。電子スキャンの方法を組み合わせて、microscopic(SEM)、このプロトコル、相関と細胞外マトリックスの分布と PGA 劣化の定量化に使用される偏光顕微鏡可能、評価する足場を促進します。劣化は、OCT イメージングと組み合わせます。
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Protocol
1. 分解 PGA 足場ベース船文化の組織設計
- PGA 足場作製
- PGA メッシュ (直径 19 mm、厚さ 1 mm) (全長 17 cm、直径 5.0 mm、厚さ 0.3 mm) のエチレンオキ サイド滅菌シリコン チューブ周りを縫う 5-0 縫合糸を使用しています。
- ポリテトラフルオロ エチレン (ePTFE, 1 cm 長さ) PGA メッシュの各端に 4-0 縫合糸で縫うし、2 mm とオーバー ラップします。
- 1 mol/L 空間構造メッシュを調整し、3 回 2 分の組織培養グレードの水に浸して 1 分の NaOH で手で PGA 足場を浸しなさい。優しくパットたびにティッシュ ペーパーで足場を乾燥します。1 h の送風機のフードに足場を乾かします。
- バイオリアクターと OCT イメージングの Y 字分岐管の組立
- 自社開発のガラス円筒型バイオリアクター (10 cm の直径および内部 4 唇と図 1に示すように、炉外 4 つサイドアーム高さ 11.7 cm)、PGA 足場、シリコン チューブを浸す (外径 5 mm、厚さ 0.3 mm)、生体適合性チューブ、コネクタ、攪拌棒、2 h の 95% エタノール タンクの組立用機器。
- Y ジャンクションの別の側面と同様に、コネクタが 1 つの側面に接続されているバイオリアクターのサイドアームをプル PGA 足場使用 10 月ガイドワイヤを提供します。同じ方法でバイオリアクター内で別の PGA 足場を組み立てます。図 1を参照してください。
- 4-0 縫合糸で締めることでバイオリアクターの唇に ePTFE を合わせてください。
- 1 h のために再度エタノール タンクに汚泥を入れ、送風機とフードで一晩の乾燥します。
- HUASMCs 静的バイオリアクター エアコンの播種
- 標準植法によるひと臍帯動脈から HUASMCs を隔離します。
- 拡大し、平滑筋細胞分化培地で細胞から成る DMEM 培地 20% 牛胎児血清、2.36 mg/mL HEPES、100 U/mL ペニシリン G、50 μ g/mL プロリン、20 μ G/ml アラニン、50 μ g/mL グリシン、1.5 μ g/mL CuSO4、50 μ g/mL アスコルビン酸を維持、10 ng/mL 塩基性繊維芽細胞成長因子および 10 ng/mL 血小板由来成長因子。
- 5 × 106セル/mL の PGA の足場の上に上記の培地の濃度でシード HUASMCs。
- バイオリアクター内で撹拌 (1.5 cm) を置きます。シリコーン ストッパー蓋を介してガス交換のため 1 つの栄養チューブ (直径 5 mm、長さ 15 cm) と 3 つの短い配管セグメント (直径 5 mm、長さ 7 cm) を挿入します。
- 各チューブの変更と栄養チューブを 1 つヘパリン キャップに PTFE 0.22 μ m フィルターを取り付けます。13 発/分の攪拌速度と攪拌棒を調整します。文化系にガラス バイオリアクター、シリコーン ストッパー蓋と PGA 足場を組み立てます。
- 左と右のスタンド付き 15 分毎、バイオリアクターを薄くことで 45 分の付着する HUASMCs を許可します。原子炉ポートと継手は、パラフィン フィルムでシールされています。
- 羅を接続-あなたがたのポンプ、PBS バッグ、灌流システムとして生体適合性チューブ ドライバー。PBS のチューブに合わせてドライブを開きます。
- 37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターで全体的なバイオリアクターを配置します。450 ml の HUASMCs 培地の培養室を埋めます。
- 停止ボタンを押すし、ドライブのデバイスの電源をオフにします。1 週間静置培養下でシード足場を成長します。
- 吸引チューブと新鮮な培地の相当額が付いているリアクターを補充による古いメディアの半分によって培養培地ごとに 3-4 日を変更します。
- OCT イメージング用灌流システムの作製
- 生体適合性の管や袋に戻って循環する PBS 袋に液体をポンプします。
- ドライバーの電源を開き、分と出力の収縮期血圧 120 mmhg あたり 60 ビートの周波数を持つポンプ設定を調整します。組織エンジニア リング血管文化のニーズに応じて機械のパラメーターを調整します。
- 灌流システムを動作させる実行ボタンをクリックします。一週間静置培養の生体適合性チューブ10,12を繰り返し加圧 3 週間船に固定上の拍動刺激を提供します。
2. OCT 光学イメージングを実行します。
- 光源を使用すると、周波数領域 10 月血管内イメージング システム9TEBV の構造を識別するために 10-20 μ m の軸解像度とイメージ深さ 1-2 mm を確保します。
- 電源スイッチをオンにし、イメージのキャプチャ ソフトウェアを開きます。
- 繊維光学イメージング カテーテル ドライブ モーターと光コント ローラーに接続 (DOC) カテーテル自動後退機能付き。
- 自動撤退速度は 10 mm/s で 1 秒あたり 10 フレームに画像取得率のパラメーターを設定します。
- 18 G 針で Y 字にヘパリン キャップを介してイメージング カテーテルを接続します。
- シリコン チューブにカテーテルを挿入し、バイオリアクターに PGA 足場をロードする前に PGA メッシュの縫合気密性を特定します。
- カテーテル先端を関心領域に置きます。プルバック装置と画像品質8チェック調整します。
- 取得画像 1、4、7、10、14、17、21、28 日間のそれぞれの個々 の TEBV の培養を順番に付けて TEBV 微細構造の実時間挙動観察、表面、内部構造と組成を含みます。
- たびに設計された船舶の正確な測定を得るために 3 回の測定を繰り返します。一連のイメージ キャプチャ ソフトウェアを使用してテスト中の画像をキャプチャします。
3. 画像解析
- TEBV 壁の厚さを測定するのに画像解析ソフトを使用します。分析対象とする画像を選択します。ソフトウェアによって TEBV の内側を自動的に識別し、手動で外側をスケッチする追跡ツールをクリックします。厚さの図は、画面に表示されます。
- 構造の正確な測定を得るために 5 回の測定を繰り返します。取得した情報に目がくらんで 2 つの独立した調査官によって 10 月分析を行った。
4. TEBV とティッシュの処理の収穫
- オープン シリコーン ストッパーふた文化が終わったら、バイオリアクターの上に配置し、培養液を破棄します。バイオリアクターの唇から ePTFE を緩め、ePTFE の外側からシリコン チューブをハサミでカットします。バイオリアクターから TEBVs を収穫し、スキャンの電子顕微鏡検査のためのセクションにカットします。
- TEBVs の残りの部分を取り出して、4 μ m 厚いセクションにカットします。サポートのシリコン チューブを抜くし、4% のパラホルムアルデヒドのセクションを修正します。日常的組織学的染色マッソンのヒアリンとコラーゲンと PGA10,13,14の形態を調べる赤シリウスを実行します。
- PGA コンテンツやコラーゲン成分を評価するには、赤いシリウスは偏光顕微鏡による染色で組織サンプルを観察します。PGA の残党がはっきりと複屈折による区分し、断面積10に基づいて残領域を定量化することができます。
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Representative Results
三次元培養システム培養室、バイオリアクターとクローズド流体サイクル10,13 (図 1) と灌流システムで成っていた。OCT イメージング カテーテルは Y ジャンクションの遠位端に挿入され、イメージング用シリコン チューブの後ろで束ねています。OCT イメージングは、バイオリアクター栽培中に生分解性高分子足場ベース TEBVs の構造キャラクタリゼーションの線引きに初めて使われました。
図 2は示したこれらを通して人工血管リモデリングの過程は断面をリアルタイムに組織の微細構造のイメージングします。拍動性刺激の存在と同様、異文化の時点で壁の厚さ、分解の PGA のコンテンツ、および TEBV の厚さの比較を含む幾何学的な形態が評価されました。減少厚さの動向と劇的に文化の最初の 2 週間以内に設計された組織の変化を見て、信号の豊富な PGA 漸進的な劣化とタイトな緩いから新しい組織の構造を示唆しています。21 日間培養で血管は均等に細胞外マトリックスと大抵消費高信号で滑らかな構造を形成していた。信号の TEBVs の壁の厚さは、文化の 3 週間後に次第に増加しました。以前に発生したこの改造と動的グループ (図 3) でより明らかに明らかに形態学的変化。10 月、それによってその場可視化する設計の血管形態と長時間培養リアルタイムでイメージングできます。
図 4は、TEBV の文化の 4 週間後の病理組織学的検索で OCT 画像を比較しました。マッソンのヒアリン染色人工血管 (図 4 b) のメディア層の PGA 残党と共にある特定の方向に分布するコラーゲン線維を示します。シリウス赤染色、偏光顕微鏡 (図 4) を使用して、PGA の残党とコラーゲン成分が明らかに。コンパクトな微細構造を有する人工血管の走査型電子顕微鏡写真は、病理組織学的評価 (図 4) と比較しました。一緒に取られて、OCT 画像は、PGA が異なるサイズと多孔質ネットワーク構造を示した。PGA 足場の構造に明らかな変化がない文化の初期段階の培養液に直接コンタクトして腫れと。しかし、PGA の信号強度が低下しました。PGA コンポーネントは崩壊し、細胞と細胞外マトリックスに置き換えられます。少数の破片が見られた 4 週間の期間。断面設計された船の SEM 像は、培養時間の延長に繊維破断を示した。材料と細胞外マトリックス複合材料よりコンパクトでより少ない透明な蜂の巣のような構造。
図 1.バイオリアクターと OCT イメージング用灌流培養室から成っていた血管の培養組織模式。拍動流ポンプは、生体力学的微小環境をシミュレートする安定した流体の流れを提供されています。OCT イメージング カテーテルは、培養室でシリコン チューブに戻って引っ張られました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.組織の微細構造は、文化の中に血管を設計。培養時間信号の豊富な PGA が徐々 に劣化し、新しい組織の構造は、緩いからタイトです。TEBVs は、文化の 4 週間後均等に滑らかな表面と豊富な細胞外マトリックスを持っていた。それはリアルタイムの断面画像を人工血管リモデリングの過程を示した。この図は、ら・ w ・陳から変更されています。10ここで使用されるシリコーン チューブの厚さは 0.8 mm です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.10 月の測定から得られた TEBV の壁厚変化時の動的および静的グループの血管リモデリングの比較。誤差は、標準エラーを示しています。この図は、ら・ w ・陳から変更されています。10この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.生分解性ポリマー ベース組織エンジニア リング, 血管イメージングします。(文化の 4 週間後の TEBV のイメージを A) 10 月。M: 培地;S: シリコン チューブ。ここで使用されるシリコーン チューブの厚さは 0.8 mm です。白い矢印は、TEBV を示されました。赤い矢印は、PGA のフラグメントを示されました。(B) マッソンのヒアリン染色メディア層人工血管の PGA の残存量と共によく組織化されたコラーゲン線維を示した。スケール バー 100 μ m (C) シリウス赤染色明らかに PGA 残党 = 偏光顕微鏡を使用しています。緑の矢印は、PGA のフラグメントを示します。スケール バー: 100 μ m。 (D) 走査型電子顕微鏡写真コンパクトな微細構造を有する人工血管の組織学的評価と比較を見せられました。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
生成する構造を持つ船を設計して血管工学の究極の目標は、機械的性質、ネイティブ血管のよう臨床使用のため時間の短縮につながることができます。光学イメージング技術は、不稔7を損なうことがなく文化環境に文化および露出の移植を通して個々 の構成を監視できない組織血管の特定コンポーネントの可視化を許可します。この記事では、培養室は灌流システムから分離されます。比較的独立した灌流システムは、文化においての汚染の減少のリスクと 10 月ガイドワイヤの配置を保証します。一方この腔内画像モダリティ採用簡単と安全監視 TEBVs の病理を TEBV 成長の状態の評価をより実用的に作られ、も高解像度に近づいていると内臓に期待する前にされるか後のインプラント。
現在のプロトコルは、カテーテル ベースの OCT を用いた分解性ポリマー ベースの設計された容器の開発を評価する容易に利用可能な高速リアルタイム、非破壊イメージング戦略を示します。動的過程の観察を通して血管工学に影響を与える主な要因汚染などや比類のない組織の損失をもたらした物質-細胞相互作用が識別されると早期発見。プロトコルの有効性を確保するための重要なステップは、PGA の NaOH 変更足場、足場、監視システム、高速から分離培養システムと熟練したカテーテル操作プロセスにおける HUASMCs の播種成功の作製.
この手法は、劣化状態と新しい組織を使って混ぜられる PGA 足場の複雑な構造を評価するために利用できます。多孔質ネットワーク構造をもつ高分子足場徐々 に低下しての 3 次元構造を持つ細胞接着、細胞外マトリックスの形成に重要な最初の 3 週間で血管リモデリングの過程を支配します。栄養交換と信号キャリア15,16。シリウスによって明確に設計された船で PGA 残党の定量化のため赤染色画像、偏光顕微鏡17分解性の足場に基づく血管工学の使用は後の標準的な評価になる可能性栽培。したがって OCT イメージング偏光顕微鏡と組み合わせて血管工学 PGA 劣化を評価するための定性的および定量的な方法として役立つかもしれない。
この技法の制限は、細胞の増殖、分布、細胞と細胞外マトリクスの相互作用時の人工血管リモデリングを評価するために解像度の制限です。我々 は細胞または細胞内レベル18で TEBVs 微細構造を調査し、成長過程を定量化する適切な方法を見つけることを期待します。OCT イメージングの平均光信号の分析、我々 は血管工学における材料の劣化機構のより認識するかもしれません。そのような実験が検討されている今後の研究課題。
全体的に、我々 の結果を表示、10 月は容易に利用可能な高速リアルタイム、非破壊イメージング増加を監視する戦略と TEBVs の改造します。それを利用して建築構造の特徴と設計された船の長期的な改造プロセスを特徴付けるします。人工血管の高分子の残党の定量化のための補足の証拠を提供する偏光顕微鏡のアプリケーションは、OCT イメージングと組み合わせて足場劣化を評価するために役立ちます。一緒に取られて、現在のプロトコルは、維管束組織工学への応用に 10 月の有望な値を保持します。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があるを宣言します。
Acknowledgments
我々 はこの作業を支援する科学と技術計画プロジェクト中国の広東省 (2016B070701007) を確認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PGA mesh | Synthecon | ||
| silicone tube | Cole Parmer | ||
| connector | Cole Parmer | ||
| intravascular OCT system | St. Jude Medical, Inc | ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM | |
| scanning electron microscopic | Philips | FEI Philips XL-30 | |
| polarized microscope | Olympus | Olympus BX51 | |
| sutures | Johnson & Johnson | ||
| pulsatile pump | Guangdong Cardiovascular Institute | ||
| LightLab Imaging software | St. Jude Medical, Inc |
References
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