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Genetics

जैविक संस्कृतियों को बनाए रखने और Aphis neriiमें जीन अभिव्यक्ति को मापने: संयंत्र के लिए एक गैर मॉडल प्रणाली-कीट बातचीत

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

एफ़िड Aphis nerii उपनिवेश करता dogbane परिवार (Apocyanaceae) में अत्यधिक बचाव संयंत्रों पर और संयंत्र कीट बातचीत के अध्ययन के लिए कई अवसर प्रदान करता है । यहां, हम संयंत्र और एफ़िड संस्कृतियों के रखरखाव के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं, और एक. neriiके लिए और आणविक और-omic डेटा की पीढ़ी और विश्लेषण ।

Abstract

एफ़िड्स symbioses के विकास से लेकर जैविक सवालों की एक किस्म के लिए उत्कृष्ट प्रयोगात्मक मॉडल और polyphenisms के अपने मेजबान संयंत्रों के साथ कीट बातचीत आसपास के सवालों के लिए कर रहे हैं । जीनोमिक संसाधनों कई एफ़िड प्रजातियों के लिए उपलब्ध हैं, और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण में अग्रिम के साथ, transcriptomic अध्ययन गैर मॉडल जीवों कि कमी जीनोम के लिए बढ़ाया जा रहा है । इसके अलावा, एफ़िड संस्कृतियों क्षेत्र से एकत्र किया जा सकता है और शरीर और आणविक प्रयोगों में उपयोग के लिए प्रयोगशाला में पीछे की पारिस्थितिकी और आनुवंशिक अध्ययन के बीच की खाई को पाटने के लिए । पिछले, कई एफ़िड्स सदा, parthenogenic जीवन asexually reproducing पादी की तुलना के लिए अनुमति चक्र में अपने पसंदीदा मेजबान संयंत्रों पर प्रयोगशाला में बनाए रखा जा सकता है । Aphis nerii, milkweed-ओलियंडर एफ़िड, दोनों जीव और आणविक प्रयोगों का उपयोग कर विषाक्त पौधों के साथ कीट बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक ऐसा मॉडल प्रदान करता है । पीढ़ी और संयंत्र और ग्रीनहाउस और प्रयोगशाला, डीएनए और आरएनए निकालने, माइक्रोसेटेलाइट विश्लेषण, डी नोवो transcriptome विधानसभा और एनोटेशन, transcriptome अंतर अभिव्यक्ति में एफ़िड संस्कृतियों के रखरखाव के लिए तरीके विश्लेषण, और विभेदक व्यक्त जीन के qPCR सत्यापन रेखांकित और यहां चर्चा कर रहे हैं ।

Introduction

एफ़िड्स छोटे, hemimetabolous कीड़े है कि दुनिया भर में विविध संयंत्र परिवारों पर उपनिवेश हैं । वे कई सुविधाओं के लिए विशिष्ट हैं, सबसे विशेष रूप से अपने जटिल जीवन चक्रीय अनिषेकजनन और असतत polyphenisms शामिल चक्र, और बैक्टीरियल या खमीर endosymbionts कि आपूर्ति से लापता पोषक तत्वों के साथ उनके बाध्य पोषण symbioses संयंत्र के अपने आहार एसएपी1। जबकि सबसे एफ़िड्स मेजबान संयंत्र विशेषज्ञ हैं, कुछ महासचिव प्रजातियों महत्वपूर्ण फसल कीट हैं, या तो सीधे या रोगजनकों और वायरस वे2वेक्टर के माध्यम से फसलों पर काफी आर्थिक क्षति को दण्डित । २०१० में पहली एफ़िड जीनोम के प्रकाशन, मटर एफ़िड Acyrthosiphon pisum3, एफ़िड जीवविज्ञान के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर के रूप में चिह्नित है क्योंकि यह कीट के बारे में सवालों के समाधान के लिए जीनोमिक संसाधन प्रदान शाकाहारी जीवन शैली के लिए रूपांतरों, उन है कि एक बेहतर नियंत्रण रणनीतियों4के लिए नेतृत्व कर सकते है सहित । उस समय के बाद से, अतिरिक्त जीनोमिक संसाधनों सोयाबीन एफ़िड Aphis glycines5के लिए एक व्याख्या जीनोम के प्रकाशन के साथ जमा है, और सार्वजनिक रूप से एक और तीन के लिए उपलब्ध पूरे जीनोम संसाधन एफ़िड प्रजातियों (Myzus cerasi (black चेरी एफ़िड), Myzus persicae (आड़ू-आलू एफ़िड), Rhopalosiphum padi (बर्ड चेरी-जई एफ़िड)6. मूल्यवान डी नोवो transcriptomic संसाधनों के रूप में अच्छी तरह से अंय एफ़िड प्रजातियों की एक संख्या के लिए उपलब्ध है (जैसे, Aphis gossypii (कपास एफ़िड)7, Sitobion avenae (अनाज एफ़िड)8, Cinara pinitabulaeformis (पाइने एफ़िड)९, Aphis nerii (milkweed-ओलियंडर एफ़िड)१०).

एफ़िड्स भी संयंत्र की हमारी समझ में स्थाई योगदान किया है कीट बातचीत और11पौधों पर जीवन की पारिस्थितिकी । एक क्षेत्र है जहां एफ़िड्स विशेष रूप से महत्वपूर्ण योगदान किया है मेजबान संयंत्र बातचीत के रासायनिक पारिस्थितिकी की हमारी समझ में है । शाकाहारी कीड़ों संयंत्र गढ़ पर काबू पाने के लिए विविध रूपांतरों एक्सप्रेस, और कुछ भी सह अपने स्वयं के लाभ के लिए संयंत्र गढ़ ऑप्ट12,13,14। उदाहरण के लिए, milkweed-ओलियंडर एफ़िड, Aphis nerii, एक चमकीले पीले, इनवेसिव एफ़िड दुनिया भर में शीतोष्ण और उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में पाया जाता है कि उपनिवेश करता परिवार (milkweed) में पौधों पर Apocynaceae है । परिवार Apocynaceae में पौधों दूधिया लेटेक्स और कार्डियक glycosides cardenolides के रूप में जाना सहित विविध रासायनिक गढ़, विकसित किया है, कि कटियन वाहक ना, K-ATPase बांध और15 शाकाहारी महासचिव को प्रभावी निवारक हैं, 16. Milkweed विशेषज्ञों cardenolides करने के लिए प्रतिरोध के विभिंन तरीकों व्यक्त करते हैं, और कुछ चुनिंदा या निष्क्रिय जमा या cardenolides को एक साधन के रूप में अपने ऊतकों में संशोधित predation रोकते या अंय लाभ के लिए17। ए nerii इस तरह से cardenolides एकांत करने के लिए सोचा है, हालांकि तंत्र और कार्यात्मक लाभ स्पष्ट नहीं रह10,18।

हाथ में जीनोमिक संसाधनों को देखते हुए, एक. nerii आणविक और आनुवंशिक chemo में शामिल तंत्र के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है-विषाक्त मेजबान संयंत्रों और उनके विशेषज्ञ शाकाहारी के बीच पारिस्थितिकी बातचीत । यह ध्यान देने योग्य बात है कि, जबकि cardenolides19की ज़ब्ती पर ध्यान केंद्रित एक. nerii के प्रारंभिक अध्ययन के कुछ है, उस समय के बाद से, एक. nerii के अध्ययन विकासवादी और पारिस्थितिक सवालों का एक व्यापक सेट में अंतर्दृष्टि प्रदान की है, इनवेसिव कीड़े की आनुवंशिक संरचना20 और नीचे अप और शाकाहारी घनत्व21पर ऊपर से नीचे नियमन के बीच एक साथ खेलना शामिल है । a. nerii इस प्रकार कीट-पादप इंटरैक्शन के अध्ययनों का एक विशेष रूप से व्यापक सेट के लिए एक प्रायोगिक मॉडल के रूप में एक अच्छा उंमीदवार है । ए. nerii के साथ किसी भी अध्ययन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण एफ़िड आबादी के सावधान संस्कृति है, जो पौधों की संस्कृति है जिस पर एफ़िड्स निर्भर है, साथ ही साथ उच्च गुणवत्ता वाले omic डेटा के एक कुशल पीढ़ी भी शामिल है । हमारा लक्ष्य दोनों के माध्यम से पाठक गाइड है । नीचे उल्लिखित पीढ़ी और संयंत्र और ग्रीनहाउस और प्रयोगशाला, डीएनए और आरएनए निकालने, माइक्रोसेटेलाइट विश्लेषण, डी नोवो transcriptome विधानसभा और एनोटेशन, transcriptome में एफ़िड संस्कृतियों के रखरखाव के लिए तरीके हैं विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण, और अंतर व्यक्त जीन के qPCR सत्यापन । हालांकि इन पद्धतियों के लिए एक. nerii, सामांय संवर्धन, निष्कर्षण और विश्लेषण विधियों के लिए लिखा है एफ़िड प्रजातियों में से एक किस्म का विस्तार कर सकते हैं ।

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Protocol

1. संयंत्र संस्कृतियों

  1. किसी भी वाणिज्यिक विक्रेता से बीज खरीद या क्षेत्र में परिपक्व पौधों से इकट्ठा ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध milkweed प्रजातियों के लिए उपयुक्त है (जैसे, Asclepias incarnata, ए. syriaca, ए. curassavica, Gomphocarpus physocarpus) । कुछ बीजों को ठंडे-स्तरीकृत की आवश्यकता हो सकती है, और बीज आपूर्तिकर्ता से निर्देशों की जाँच की जानी चाहिए.
  2. एक ठीक अंकुरित मिट्टी में संयंत्र के बीज (60-70% ठीक पीट काई, perlite, vermiculite, चूना पत्थर) ।
    1. अंकुरण मिश्रण मिट्टी के साथ एक मानक अंकुर ट्रे भरें; यह सुनिश्चित करना कि मिट्टी कुएं के ऊपर पहुंच जाए । प्रत्येक अच्छी तरह से, एक इंडेंट बनाने के लिए एक 3 सेमी गहरी के बारे में मिट्टी में एक छेद बनाने के लिए ।
    2. एक छेद और पानी में एक बीज प्लेस बहुत अच्छी तरह से एक पानी के साथ ऐसी है कि मिट्टी के बीज शामिल कर सकते है और संतृप्त है ।
    3. एक ग्रीनहाउस में बीज बढ़ो (नीचे शर्तों देखें, १.५) । पानी नियमित रूप से, दैनिक हर-दूसरे दिन के लिए; एक मध्यम स्तर तक मिट्टी की नमी बनाए रखने के लिए पर्याप्त है ।
  3. जब अंकुरों पूर्ण पत्तियों का अपना पहला सेट हो गया है, एक सामांय पॉटी मिश्रण में फिर से बर्तन अंकुर (50-60% पीट काई, छाल, और चूना पत्थर) (चित्रा 1एक) ।
    1. 4 इंच गोल बर्तन है कि कप पिंजरों के साथ एक तंग मुहर के साथ फिट का प्रयोग करें । सामांय पॉटी मिट्टी के साथ रिम नीचे के बारे में 5 सेमी के लिए भरें ।
    2. मिट्टी में एक छेद बनाएं काफी गहरी बर्तन के नीचे तक पहुंचने के लिए ।
    3. हाथ के साथ, धीरे से अपनी अच्छी तरह से परिपक्व अंकुर स्कूप और यह 4 इंच के बर्तन में छेद के अंदर गहरी जगह है । मिट्टी के साथ अंकुर कवर । पानी बहुत अच्छी तरह से ।
    4. ग्रीनहाउस और पानी नियमित रूप से, हर दूसरे दिन के लिए दैनिक में पौधों को विकसित; मध्यम मिट्टी की नमी बनाए रखने के लिए पर्याप्त ।
  4. ग्रीनहाउस शर्तों ।
    1. ग्रीनहाउस थर्मोस्टेट सेट के बीच दिन के तापमान को बनाए रखने के लिए 18 – 28 ° c और रात के तापमान के बीच 16 – 22 ° c निर्माता के निर्देशों का उपयोग.
    2. सर्दियों के महीनों के दौरान जब दिन कम कर रहे हैं, ६०० डब्ल्यू उच्च दबाव सोडियम बल्ब (12 ज, 8 हूं-8 बजे) के साथ डेलाइट पूरक ।
  5. नियंत्रण अवांछित कीट (जैसे, थ्रिप्स, एफ़िड्स) एक पत्तियों कार्बनिक साबुन समाधान के साथ, तथापि, सावधानी के साथ इन उत्पादों का उपयोग करें ।
    1. निर्माता की सिफारिश के अनुसार साबुन समाधान बनाओ और एक स्प्रे बोतल का उपयोग कर लागू होते हैं ।
    2. 4 के लिए पौधों पर साबुन छोड़ दो-24 ज. धीरे पानी के साथ पौधों कुल्ला करने के लिए साबुन 4 हटाने-24 एच के बाद आवेदन और उंहें पानी के साथ कुल्ला एक दूसरी बार से पहले प्रयोगशाला एफ़िड संस्कृतियों के साथ प्रयोग करें ।
  6. संस्कृति पौधों पर औसत एफ़िड जनसंख्या है कि हो गया है कम से कम 3-पूर्ण पत्तियों के 4 सेट और कर रहे है कम से कम 10 सेमी लंबा (चित्रा 1ख) ।

2. एफ़िड संस्कृतियों

  1. एक मौजूदा प्रयोगशाला isoclonal जनसंख्या से लेबोरेटरी एफ़िड आबादी शुरू करें या फ़ील्ड से शुरू करें-नीचे दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए एफ़िड्स ।
    1. जब एक प्रयोगशाला जनसंख्या से एक मौजूदा लैब isoclonal जनसंख्या शुरू, 2.3.1 में वर्णित के रूप में एफ़िड्स हस्तांतरण-2.3.3 ।
  2. जब नए isoclonal, क्षेत्र-एकत्र एफ़िड आबादी और जगह एक एकल, reproducing, एक उपयुक्त मेजबान संयंत्र पर वयस्क एफ़िड के रूप में १.६ कदम में उल्लेख किया ।
    नोट: आबादी पंखों वाला (alate) या unwing्ड (apterous) वयस्कों से शुरू किया जा सकता है ।
    1. मैंयुअल रूप से प्रयोगशाला एफ़िड्स के साथ प्रयोग करने से पहले अवांछित कीट के लिए ग्रीनहाउस से पौधों का निरीक्षण । अवांछित एफ़िड्स के साथ किसी भी संयंत्र फ्रीज । यदि वांछित, एक इथेनॉल वैक्यूम कुप्पी का उपयोग करने के लिए थ्रिप्स या अंय कीट हटा दें ।
      नोट: के रूप में कदम 1.5.2 में वर्णित का उपयोग करने से पहले साबुन के साथ इलाज किया गया है कि पौधों कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. सुरक्षित रूप से एक तूलिका या एक मुंह 3/16 के साथ बनाया पिपेट "आईडी एक्स 1/4" ओडी प्लास्टिक टयूबिंग, एक १,००० µ एल पिपेट टिप, और एक 2, 00 µ एल पिपेट टिप (चित्रा 2ए) के साथ बनाए एफ़िड का उपयोग कर एक एकल वयस्क स्थानांतरण ।
    3. सुरक्षित रूप से एक कप पिंजरे के साथ एक प्लास्टिक कप के साथ बनाया के साथ एफ़िड्स के साथ पौधों को कवर ऊपर से काट, एक ठीक मेष के साथ कवर और टेप के साथ सुरक्षित (चित्रा 2बी) ।
    4. एक ट्रे में एफ़िड-संक्रमित पौधों प्लेस और एक नियंत्रित पर्यावरण चैंबर में रखने के लिए (16L: 8D, 22 डिग्री सेल्सियस, ७०% आर्द्रता).
  3. शेयर आबादी को बनाए रखने के लिए, ताजा करने के लिए एफ़िड्स हस्तांतरण, नए पौधों (2.2.1-2.2.3) साप्ताहिक ।
    1. एक मुंह पिपेट (आंकड़े 2a, 3) का उपयोग कर सुरक्षित रूप से 1-3 2एन डी या 3rd instar देवियां और 1 वयस्क आयु वर्ग के एफ़िड्स स्थानांतरण ।
      नोट: स्टॉक्स पंखों वाले व्यक्तियों को स्थानांतरित करके श्रेष्ठ बनाए जाते हैं ।
    2. सुरक्षित रूप से कवर एफ़िड-संक्रमित पौधों के साथ एक कप पिंजरे के साथ एक प्लास्टिक कप के साथ बनाया ऊपर से काट, एक ठीक मेष के साथ कवर और टेप के साथ सुरक्षित ।
    3. एक ट्रे में पौधों प्लेस और एक पर्यावरण चैंबर में एफ़िड्स रखने के लिए (16L: 8D, 22 डिग्री सेल्सियस, ७०% आर्द्रता).
    4. वैकल्पिक रूप से, यदि वांछित और अगर मेजबान संयंत्र सभ्य गुणवत्ता का है, एक इथेनॉल वैक्यूम कुप्पी का उपयोग करने के लिए केवल एक reproducing वयस्क और दो से तीन 2 या 3 instar अप्सरा जा आबादी को कम ।
  4. प्रयोगों में उपयोग के लिए एक ही उंर की आबादी बनाने के लिए, 5 वयस्कों के लिए जगह (अधिमानतः unwing) एक नया मेजबान संयंत्र पर शेयर जनसंख्या से ।
    1. वयस्कों को निकालें 24 h बाद में ।
    2. के बारे में 5-7 दिनों के बाद, एक बार एफ1 वंश वयस्कता के लिए परिपक्व हो गया है, एक नया मेजबान संयंत्र पर 5 unwing्ड एफ1 वयस्कों के लिए जगह है । वयस्कों को निकालें 24 h बाद में ।
    3. एक बार एफ2 जनसंख्या वयस्कता के लिए परिपक्व हो गया है, इस आबादी के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है ।
      नोट: इस प्रक्रिया को सुनिश्चित करता है कि प्रयोगात्मक जनसंख्या मोटे तौर पर एक ही उंर है और मोटे तौर पर एक ही उंर माताओं के पैदा होते हैं ।
  5. माइक्रोसेटेलाइट genotyping का उपयोग करके फ़ील्ड-isoclonal रेखाओं के बीच genotypic अंतर की पुष्टि करें (नीचे वर्णित, अनुभाग 3 & 4) ।

3. डीएनए निष्कर्षण

  1. तैयारी
    1. 1 L lysis बफर तैयार करने के लिए बाँझ तकनीक का उपयोग करें (०.१ एम NaCl, ०.२ एम सुक्रोज, ०.१ एम Tris (पीएच ९.१), ०.०५ एम EDTA, ०.०५% एसडीएस).
    2. ६५ ° c के लिए हीटिंग ब्लॉक या पानी स्नान गर्म ।
  2. टिशू homogenization और lysis
    1. एक बाँझ, १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के नीचे के पास एफ़िड रखें ।
    2. एफ़िड के साथ ट्यूब में बाँझ मूसल रखें और ट्यूब के नीचे तरल नाइट्रोजन में विसर्जित करें ।
      नोट: एफ़िड के मूसल और साइड ट्यूब के बीच में तैनात होने पर इष्टतम ऊतक विघटन हासिल होता है ।
    3. शुरू में लाइसे कोशिकाओं को खल के साथ एफ़िड पीस लें.
    4. एक एकल वयस्क एफ़िड के लिए, lysis बफ़र के २०० µ l (2 x १०० µ l aliquots में विभाजित) का उपयोग करें । पहले aliquot को पीस लें और कुचले हुए एफ़िड को फिर से सस्पेंड करें जब तक नमूना दिख नहीं जाता है, तब तक खल को धोने के लिए दूसरी aliquot का प्रयोग करें ।
    5. 30 मिनट के लिए पानी में स्नान या गर्मी ब्लॉक में ६५ डिग्री सेल्सियस पर lysis बफर में कुचल एफ़िड्स की मशीन ।
  3. डीएनए वर्षण
    1. जबकि ट्यूब गर्म है, 8 मीटर KOAc के 14 µ एल जोड़ें । मिश्रण करने के लिए ट्यूब उलटा । 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना स्टोर ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, और नमूनों में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c अप करने के लिए 24 ज ।
    2. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १३,००० x g पर केंद्रापसारक । एक पिपेट के साथ नए १.५ एमएल ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण । गोली मारकर मलबे में से किसी को नहीं हटाने के लिए सावधान रहें ।
    3. डीएनए गोली दृश्य में सुधार करने के लिए, supernatant करने के लिए 2 µ l ग्लाइकोजन (20 µ g/एमएल) जोड़ें । नमूना आकार पर्याप्त बड़ा है, तो इस चरण को छोड़ दें ।
    4. supernatant को शीत १००% आणविक ग्रेड इथेनॉल के २०० µ एल जोड़ें । पलटना ट्यूबों मिश्रण करने के लिए और कमरे के तापमान पर कम से कम 15 मिनट के लिए गर्मी ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, और नमूनों में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c अप करने के लिए 24 ज ।
    5. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १३,००० x g पर केंद्रापसारक । pipetting द्वारा इथेनॉल निकालें ।
  4. DNA वॉश और रेफरेंस
    1. ठंड ७०% आणविक ग्रेड इथेनॉल के २०० µ एल जोड़ें । फिर झटका ट्यूब को फिर से सस्पेंड और गोली धो लो ।
    2. 5 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक । जबकि गोली visualizing, ध्यान से pipetting द्वारा इथेनॉल को दूर और ठंड १००% आणविक ग्रेड इथेनॉल के २०० µ एल जोड़ें ।
    3. 5 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक । जबकि गोली visualizing, ध्यान से pipetting द्वारा इथेनॉल को दूर ।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो 100-70-100 इथेनॉल धोने दोहराएँ.
    4. हवा 5 के लिए छर्रों शुष्क-ट्यूब क्षैतिज एक टिशू पेपर पर खुला बिछाने के साथ 10 मिनट ।
    5. कम ते (10 एमएम Tris-एचसीएल, ०.१ एमएम EDTA) के ८० µ एल में डीएनए गोली को फिर से सस्पेंड ।
    6. एक spectrophotometer का उपयोग कर resuspend डीएनए यों तो ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

4. एफ़िड Genotyping के लिए माइक्रोसेटेलाइट पीसीआर और अनुक्रमण

  1. माइक्रोसेटेलाइट अनुक्रमण के लिए उपयुक्त एफ और आर प्राइमर आदेश (तालिका 120) ।
    नोट: रिवर्स प्राइमर दृश्यों के साथ संशोधित किया जाना चाहिए 5 ' -6-FAM या 5 ' -5-हेक्स फ्लोरोसेंट लेबल माइक्रोसेटेलाइट अनुक्रमण के लिए मल्टीप्लेक्स नमूने के लिए अनुमति देने के लिए ।
  2. एकल एफ़िड डीएनए नमूनों के साथ पीसीआर प्रदर्शन (धारा 3 में वर्णित) और फ्लोरोसेंट माइक्रोसेटेलाइट प्राइमरों लेबल ।
    1. मिश्रण पीसीआर प्रतिक्रियाओं के अनुसार निर्माता के प्रोटोकॉल (०.२ µ m प्रत्येक F/आर प्राइमर, २.५ mM MgCl2, 50 – 200 डीएनए टेम्पलेट).
    2. निम्नलिखित thermocycler सेटिंग्स का उपयोग करें: प्रारंभिक विकार पर ९४ ° c के लिए 4 मिनट, ९४ ° c के ३५ चक्र के लिए 30 s, ५८ ° c ३५ s के लिए ७२ ° c ४५ s के लिए, और एक अंतिम बढ़ाव कदम पर ७२ ° c 10 मिनट के लिए.
  3. अनुक्रम नमूनों की संख्या को कम करने और एक genotyping सुविधा पर माइक्रोसेटेलाइट नमूने अनुक्रम के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट टैग के साथ पीसीआर नमूनों का मिश्रण ।
  4. माइक्रोसेटेलाइट विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर. fsa अपुष्ट नमूना फ़ाइलों का विश्लेषण करें ।

5. आरएनए निष्कर्षण

  1. १.५ मिलीलीटर RNase/DNase-मुक्त ट्यूबों और तरल नाइट्रोजन में तत्काल फ्रीज में आरएनए निष्कर्षण के लिए एफ़िड्स ' नमूने ले लीजिए ।
    नोट: निम्न चरणों का पालन तुरंत नहीं किया जाता है, तो नमूने-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. टिशू homogenization
    1. एफ़िड के साथ ट्यूब में बाँझ मूसल के साथ, 10-15 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज, जब तक नमूना जलती हुई बंद करो । ३.२ चरण में वर्णित के रूप में मूसल के साथ अच्छी तरह से एफ़िड क्रश ।
      नोट: एफ़िड के मूसल और साइड ट्यूब के बीच में तैनात होने पर इष्टतम ऊतक विघटन हासिल होता है ।
    2. धुएं डाकू में, guanidinium thiocyanate के ८०० µ एल जोड़ें-phenol-क्लोरोफॉर्म नमूना (1-5 वयस्क एफ़िड्स) को निष्कर्षण रिएजेंट । मूसल से Homogenize के नमूने लिए और खल का निपटान करते हैं ।
  3. चरण पृथक्करण
    नोट: सभी कदम एक धुएं डाकू में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए homogenized नमूने मशीन । क्लोरोफॉर्म के १६० µ l को जोड़ें । 15 एस के लिए हाथ से जोरदार शेक.
    2. कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए मशीन । 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
      नोट: निंनलिखित केंद्रापसारक, मिश्रण 3 परतों में अलग: एक कम, लाल phenol-क्लोरोफॉर्म चरण, एक चरण और एक बेरंग ऊपरी जलीय चरण । आरएनए जलीय चरण में विशेष रूप से रहता है । जलीय की मात्रा ~ ४८० µ एल होगा ।
  4. आरएनए वर्षण
    1. एक धुएं डाकू में, एक ताजा, RNase-मुक्त ट्यूब के लिए जलीय चरण हस्तांतरण । मध्यवर्ती चरण को परेशान न करें ।
    2. isopropanol के ४०० µ एल जोड़ने और 10 मिनट के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी से आरएनए का हाला ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, और नमूनों में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c अप करने के लिए 24 ज ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर 10 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक ।
  5. आरएनए वॉश एण्ड रेफरेंस
    1. supernatant निकालें; आरएनए गोली के लिए देखो ।
    2. DEPC-इलाज पानी में ७५% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ आरएनए गोली धो लें । धीमी गति से भंवर से मिश्रण । 4 डिग्री सेल्सियस पर ७,५०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    3. दोहराएँ चरण 5.5.1 – 5.5.2 phenol दूषित पदार्थों को निकालने में मदद करने के लिए.
    4. एक बाँझ बेंच पर क्षैतिज खुला बिछाने ट्यूब के साथ 5-10 मिनट के लिए supernatant और हवा सूखी गोली निकालें । आरएनए गोली सूखी पूरी तरह से मत देना ।
    5. RNase मुक्त या DEPC इलाज पानी की 30 µ एल में आरएनए गोली भंग. धीरे पिपेट ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए । 55-60 ° c 10 के लिए-15 मिनट में मशीन ।

6. RNAseq De नोवो Transcriptome विधानसभा, एनोटेशन, और विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. एक चिप आधारित केशिका electrophoretic प्रणाली का उपयोग कर आरएनए नमूना एकाग्रता और गुणवत्ता का विश्लेषण ।
    नोट: एक चिप आधारित केशिका ट्रो प्रणाली एक spectrophotometer के साथ विश्लेषण की तुलना में पसंद की बेहतर तरीका है, क्योंकि यह आरएनए एकाग्रता और गुणवत्ता का एक और अधिक सटीक और संवेदनशील उपाय प्रदान करता है ।
    1. यदि नमूने उपयुक्त गुणवत्ता के होते हैं (≥ २५० एनजी कुल, रिण (आरएनए अखंडता संख्या) ≥ 5), आरएनए अनुक्रमण करते हैं ।
      नोट: महत्वपूर्ण रूप से, क्योंकि यह sequencing डेटा दोनों व्यंजक profiling और de नोवो transcriptome असेंबली के लिए उपयोग किया जाएगा, अधिक पढ़ें गहराई में एक उच्च गुणवत्ता transcriptome परिणाम होगा । एक यथोचित व्यापक विधानसभा Illumina अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर के लिए, 100 – 200 १,०००,१०० bp, युग्मित अंत पढ़ता एक अनुशंसित प्रारंभिक बिंदु होगा. कुल mRNA पुस्तकालय तैयारी और आरएनए अनुक्रमण एक sequencing सुविधा द्वारा किया गया ।
  2. त्वरित QC22का उपयोग कर पढ़ता की गुणवत्ता की जांच करें ।
  3. गठबंधन सभी नमूना पढ़ता है और transcriptome de नोवो ट्रिनिटी23,24 (Trimmomatic गुणवत्ता सक्षम फ़िल्टरिंग) का उपयोग कर इकट्ठा ।
  4. विधानसभा को परिष्कृत
    1. Transdecoder25 का उपयोग करने के लिए खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) की पहचान है कि लंबाई में १०० अमीनो एसिड की एक ंयूनतम रहे हैं ।
    2. Pfam26 और UniProt27 BLASTP28 और HMMER29, क्रमशः का उपयोग कर डेटाबेस के विरुद्ध अनुवादित ORFs के लिए समरूपता खोज निष्पादित करें ।
    3. बैक्टीरियल टेप निकालें (किसी भी अनुवाद अनुक्रम जिसका सबसे अच्छा विस्फोट हिट से अधिक ३०० के एक बिट स्कोर और ५०% की एक ंयूनतम एमिनो एसिड अनुक्रम पहचान के साथ एक जीवाणु जीन के लिए गया था) ।
    4. संक्षिप्त किसी भी पूर्ण, अनुवादित ORFs है कि कम से ९९% एमिनो एसिड स्तर पर समान है सीडी का उपयोग कर-मारो30।
    5. शेष, अपूर्ण ORFs को संक्षिप्त करें जो न्यूक्लियोटाइड स्तर पर CD-HIT30का उपयोग करते हुए कम से ९५% समरूप हैं ।
    6. शेष न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को अद्वितीय, प्रजातियों-विशिष्ट पहचानकर्ताओं (उदा., APHNE 0001) के साथ असाइन करें.
  5. परिष्कृत विधानसभा की पूर्णता का आकलन, BUSCO (http://busco.ezlab.org/) और आथ्रोपोडा जीन डेटासेट का उपयोग31.
  6. Transcriptome एनोटेशन
    1. सबसे पहले, Pfam डेटाबेस26,29के खिलाफ HMMER का उपयोग कर परिष्कृत transcriptome व्याख्या ।
    2. दूसरा, UniProt डाटाबेस27,28के खिलाफ BLASTP का उपयोग transcriptome व्याख्या ।
    3. तीसरा, transcriptome प्रकाशित, व्याख्या जीनोम के साथ चयनित कीड़ों की कोडिंग दृश्यों के खिलाफ BLASTP का उपयोग कर व्याख्या ।
    4. पिछले, transcriptome मटर एफ़िड प्रोटीन डाटाबेस के खिलाफ BLASTP का उपयोग केवल व्याख्या ।
    5. का प्रयोग करें Trinotate UniProt प्रवेश से जाने एनोटेशन उत्पंन करने के लिए ।
    6. SQLite डेटाबेस में सभी एनोटेशन परिणामों को व्यवस्थित करने और एक एनोटेशन रिपोर्ट जनरेट करने के लिए Trinotate का उपयोग करें ।
  7. विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण
    नोट: एक संदर्भ के रूप में परिष्कृत transcriptome का उपयोग करना, संरेखित करें और प्रत्येक लायब्रेरी अलग से बढ़ाता है ।
    1. गुणवत्ता फिल्टर करने के लिए Trimmomatic का उपयोग करें और मूल पढ़ें फ़ाइलें३२ट्रिम कर दीजिए ।
      नोट: एक ट्रिनिटी असेंबली के बाद यह चरण निष्पादित कर रहा है, तो एक इसके बजाय उस चरण से Trimmomatic आउटपुट का उपयोग कर सकते हैं ।
    2. Bowtie2३३का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए स्थानीय संरेखण निष्पादित करें ।
    3. SAMtools३४का उपयोग करके प्रत्येक नमूने से पठन गणना निकालें ।
    4. डिफ़ॉल्ट पैरामीटर और एक पैरामीट्रिक फ़िट३५के साथ DESeq2 का उपयोग कर ब्याज के नमूनों के बीच अंतर अभिव्यक्ति की गणना ।

7. विभेदक व्यक्त जीन का qPCR सत्यापन

नोट: यदि उपयोगकर्ताओं को उनके RNAseq प्रयोगों से अंतर व्यक्त जीन में रुचि रखते हैं, निम्न प्रोटोकॉल विभेदक अभिव्यक्ति के पैटर्न को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. (चरण 5) ऊपर वर्णित के रूप में आरएनए नमूने उत्पन्न ।
  2. Quantitate आरएनए एक spectrophotometer का उपयोग कर गुणवत्ता के लिए जाँच करने और एकाग्रता प्राप्त करने के लिए निकालता है ।
  3. निर्माता की अनुशंसा के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके सीडीएनए नमूनों को संश्लेषित करना.
  4. ब्याज की जीन के लिए प्राइमर क्षमता निर्धारित करने के लिए सटीक दो गुना पीसीआर प्रवर्धन सुनिश्चित करते हैं ।
    1. मूल आरएनए सांद्रता के आधार पर, 3 सीडीएनए सांद्रता प्राप्त करने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने (101) प्रदर्शन करते हैं ।
    2. एक मात्रात्मक पीसीआर मास्टर मिश्रण का उपयोग करना, तीन प्रश्नपत्र पतला सीडीएनए सांद्रता के साथ तीन प्राइमरी सांद्रता (जैसे, १०० एनएम, २०० एनएम, ३०० एनएम) का उपयोग कर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार तपसिल qPCR प्रतिक्रियाओं मिश्रण (जैसे, ०.१ एनजी/µ एल, 10 एनजी/µ एल, १०० एनजी/µ एल) ।
    3. प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए, लाइन के ढलान (एम) की गणना निर्भर चर के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए मतलब सीटी मूल्यों का उपयोग कर बनाई गई और स्वतंत्र चर (तीन अंक कुल) के रूप में प्रवेश (सीडीएनए एकाग्रता) ।
    4. निंन समीकरण का उपयोग प्राइमरी क्षमता (ई) की गणना के लिए जहां m 7.4.3 में गणना की ढलान है:
      ई = 10 ^ (-1/
      नोट: 90-110% के बीच प्राइमर क्षमता विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं । यह प्रक्रिया सभी जीन की गणना में शामिल के बराबर प्रवर्धन सुनिश्चित करता है ।
  5. एक गृह व्यवस्था जीन के साथ ΔΔCटी विधि का प्रयोग करें३६ब्याज की जीन के लिए अंतर अभिव्यक्ति मात्रा ।

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Representative Results

संयंत्र संस्कृतियों: बीज लगभग दो से चार सप्ताह लगेंगे, मौसम पर निर्भर करता है, के लिए काफी बड़ा हो जाना फिर से कमरों का (1 चित्रा) । फिर से कमरों का अंकुरित एफ़िड संस्कृतियों (चित्रा 1बी) के लिए एक इष्टतम आकार के लिए विकसित करने के लिए एक और दो से चार सप्ताह लग जाएगा ।

एफ़िड संस्कृतियों: वयस्क ए nerii कुछ काला cauda द्वारा प्रतिष्ठित है और हो सकता है (apterous, चित्रा 3ए, बी) या पंखों वाला (alate, चित्रा 3सी, डी) पंखों वाला । देवियां तीसरे instar (चित्रा 3ई, एफ) तक पहुँचने जब विकासशील विंग पैड दिखाई देते हैं । स्टॉक संस्कृतियों सर्वश्रेष्ठ एक को तीन मध्य instar और एक वयस्क आयु वर्ग के पंखों वाला एफ़िड्स स्थानांतरित करके बनाए रखा है; यह एक स्वस्थ, मिश्रित आयु जनसंख्या सुनिश्चित करता है । प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा आबादी (२.४) ऊपर वर्णित के रूप में पंखों वाला एफ़िड्स का उपयोग कर संस्कृति होना चाहिए । एक nerii वयस्क प्रति दिन 3-10 वंश, मेजबान संयंत्र और एफ़िड10की उंर पर निर्भर उत्पादन कर सकते हैं ।

डीएनए और आरएनए निकालने: एकल, वयस्क ए. nerii लगभग 100-200 एनजी/µ l डीएनए (८० µ l रेफरेंस से निकलेगा; चित्र 4 A) और 150 – 300 एनजी/µ l आरएनए (30 µ l रेफरेंस; चित्र 4 ख). प्रतिनिधि माइक्रोसेटेलाइट चोटियों चित्रा 5में दिखाया गया है । प्रतिनिधि के सापेक्ष अभिव्यक्ति एक उंमीदवार तीन शर्तों के तहत जीन (नियंत्रण, उपचार 1, उपचार 2) तालिका 2 में गणना कर रहे है और चित्रा 6में दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1 : एफ़िड संस्कृतियों के लिए प्रतिनिधि संयंत्रों । (क) अंकुरित होने के बाद वे अपना पहला पूरा सेट विकसित किया है फिर से कमरों का असली पत्तियों का हो सकता है । (ख) पौधों एफ़िड संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब वे असली पत्तियों के 3-4 सेट विकसित किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : संवर्धन एफ़िड्स के लिए प्रयुक्त उपकरणों के उदाहरण । (क) मुंह पिपेट 3/16 "आईडी एक्स 1/4" ओडी प्लास्टिक टयूबिंग, एक १,००० µ l पिपेट टिप, और एक २०० µ एल पिपेट टिप का उपयोग कर बनाया जा सकता है । (ख, ग) कप पिंजरों का प्रयोग करें (शीर्ष काट के साथ साफ प्लास्टिक कप और ठीक मेष के साथ सुरक्षित) को सुरक्षित रूप से एफ़िड संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया बर्तन में 4 के शीर्ष पर फिट । यह पर्याप्त प्रकाश और वेंटिलेशन के लिए अनुमति देता है एफ़िड्स और संयंत्र के लिए एक उपयुक्त वातावरण बनाने के लिए, और एफ़िड्स निहित रहता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रतिनिधि प्रौढ आणि अप्सरा Aphis nerii. (A, B) Apterous (unwing्ड) वयस्क ए nerii उनके पीछे अंत में काला cauda द्वारा की पहचान कर रहे हैं । (सी, डी) Alate (पंखों वाला) वयस्कों को पूरी तरह से विकसित पंखों और उनके पीछे पर काला cauda द्वारा की पहचान कर रहे हैं । (ङ, च) nerii अप्सराओं का विकास चार instar चरणों के माध्यम से हो रहा है और तीसरे instar चरण के दौरान विकासशील विंग पैड स्पष्ट हो जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रतिनिधि जैल. (क) डीएनए निकालने (1kb सीढ़ी). सात A. nerii डीएनए निकालने 3-9 गलियों में कल्पना कर रहे हैं । नकारात्मक नियंत्रण 10 लेन में है । (ख) आरएनए निकालने । ग्यारह ए nerii आरएनए निकालने 3-13 गलियों में कल्पना कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : प्रतिनिधि माइक्रोसेटेलाइट चोटियों । 6-FAM-टैग चोटियों नीले रंग में कल्पना कर रहे हैं । लिज़-५०० सीढ़ी नारंगी में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : एक विभेदक व्यक्त जीन के qPCR सत्यापन । प्रतिनिधि mRNA सापेक्ष मात्रा (RQ) अभिव्यक्ति (ΔΔCt विधि का उपयोग कर परिकलित, तालिका 2) तीन शर्तों के तहत ब्याज की एक उंमीदवार जीन के लिए दिखाया गया है: नियंत्रण, उपचार 1, उपचार 2 । ग्राफ 1 उपचार के तहत उंमीदवार जीन की अभिव्यक्ति की कमी से पता चलता है और 2 नियंत्रण (तालिका 2) की तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्राइमरी का नाम दिशा अनुक्रम (5 '-3 ')
Ago24_F आगे TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R रिवर्स GCCAAACTTTACACCCCGC
पूर्व 53_F आगे TGACGAACGTGGTTAGTCGT
पूर्व 53_R रिवर्स GGCATAACGTCCTAGTCACA
पूर्व 59_F आगे GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
पूर्व 59_R रिवर्स GTTACCCTCGACGATTGCGT
पूर्व 66_F आगे TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
पूर्व 66_R रिवर्स GACTAGGGAGATGCCGGCGA
पूर्व 69_F आगे CGACTCAGCCCCGAGATTT
पूर्व 69_R रिवर्स ATACAAGCAAACATAGACGGAA
पूर्व 84_F आगे GACAGTGGTGAGGTTTCAA
पूर्व 84_R रिवर्स ACTGGCGTTACCTTGTCTA
पूर्व 89_F आगे GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
पूर्व 89_R रिवर्स GACAGCGTAAACATCGCGGT
पूर्व 126_F आगे GGTACATTCGTGTCGATTT
पूर्व 126_R रिवर्स TAAACGAAAAAACCACGTAC

तालिका 1: माइक्रोसेटेलाइट प्राइमरी जुगाड़ में करते थे जीनोटाइप Aphis nerii 20 .

लक्ष्य नमूना सीटी मतलब सीटी एसटीडी देव ΔCt औसत ΔCt ΔΔCt RQ = 2 ^ (-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a १.१ २२.५९ 0
ef1a १.२ २०.३१ 0
ef1a १.३ २०.३६ ०.२२६
ef1a १.४ २०.२७ ०.०३६
ef1a १.५ २०.५५ ०.००३
ef1a १.६ २०.५२ ०.२४५
ef1a २.१ २०.४९ ०.०८२
ef1a २.२ १९.८६ ०.०३३
ef1a २.३ २०.१९ ०.०३७
ef1a २.४ १९.६७ ०.०५८
ef1a २.५ २०.२५ ०.१८८
ef1a २.६ १८.१६ ०.०८९
ef1a ३.१ २०.९३ ०.१५७
ef1a ३.२ २०.२२ ०.००३
ef1a ३.३ २०.४४ ०.०३९
ef1a ३.४ २०.९१ ०.५५९
ef1a ३.५ २०.६३ ०.०१७
ef1a ३.६ २०.३ ०.१३५
प् याज का जीन १.१ २४.६ ०.१७३ २.०१ 0 1
प् याज का जीन १.२ २४.२५ ०.०१९ ३.९४ २.९७५ 0 1 0
प् याज का जीन १.३ २४.७९ ०.०४ ४.४३ 0 1
प् याज का जीन १.४ २५.२३ ०.२८५ ४.९६ ४.६९५ 0 1 0
प् याज का जीन १.५ २४.६ ०.१०३ ४.०५ 0 1
प् याज का जीन १.६ २५.०८ ०.०३३ ४.५६ ४.३०५ 0 1 0
प् याज का जीन २.१ २७.५२ ०.१५५ ७.०३ ५.०१९०३३७६२ ०.०३०८४०४२
प् याज का जीन २.२ २७.२३ ०.०६१ ७.३७ ७.२ ३.४२८३५५६७९ ०.०९२८८८५३३ ०.०३१०२४०५७
प् याज का जीन २.३ २७.१८ ०.०५८ ६.९९ २.५६१५८१७४ ०.१६९३८९७२४
प् याज का जीन २.४ २७.४५ 0 ७.७८ ७.३८५ २.८२०७६४९६७ ०.१४१५३५४१९ ०.०१३९२७१५३
प् याज का जीन २.५ २७.४४ ०.०३२ ७.१९ ३.१३८९५६८९७ ०.११३५२१९४४
प् याज का जीन २.६ 28 0 ९.८४ ८.५१५ ५.२८४२७२०७९ ०.०२५६६१११९ ०.०४३९३०४१३
प् याज का जीन ३.१ २७.२३ ०.१४३ ६.३ ४.२९२४३७३७१ ०.०५१०३२५८८
प् याज का जीन ३.२ २७.०५ ०.०८८ ६.८३ ६.५६५ २.८९१२३४२८२ ०.१३४७८८१६४ ०.०४१८७७७८८
प् याज का जीन ३.३ २७.४५ ०.१०९ ७.०१ २.५७८१४५७२२ ०.१६७४५६०३५
प् याज का जीन ३.४ २७.५८ ०.०१९ ६.६७ ६.८४ १.७०९०३८०८५ ०.३०५८६३९३६ ०.०६९२०३९५१
प् याज का जीन ३.५ २७.०६ ०.०६७ ६.४३ २.३८४४९८९८४ ०.१९१५११२४६
प् याज का जीन ३.६ २७.३६ 0 ७.०६ ६.७४५ २.५१३७२३९३८ ०.१७५१०३०४३ ०.००८२०४१०१

तालिका 2: qPCR ΔΔC के लिए परिकलन टी परीक्षार्थी जीन का सत्यापन । उंमीदवार जीन अभिव्यक्ति ef1a (चित्रा 6) के सापेक्ष गणना की है । नमूने 1.1-1.6 नियंत्रण उपचार के तहत छह जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं; नमूनों 2.1-2.6 छह जैविक प्रतिकृति उपचार 1 के अंतर्गत का प्रतिनिधित्व करते हैं; नमूने 3.1-3.6 छह जैविक प्रतिकृति उपचार 2 के तहत प्रतिनिधित्व करते हैं । Ct Std. Dev. तीन तकनीकी प्रतिकृति से परिकलित की जाती है ।

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Discussion

यह लंबे समय से मांयता प्राप्त है कि aposematic A. nerii पैटर्न और संयंत्र गढ़ और विशेष रूप से रासायनिक ज़ब्ती प्रतिरोध के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है18,३७। जीनोमिक संसाधनों की एक संख्या हाल ही में एक. nerii10के लिए उभरा है, पारिस्थितिक और कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के लिए नए अवसर की पेशकश की है कि एक मॉडल के रूप में एक. nerii का उपयोग करें । हम एफ़िड और संयंत्र संस्कृति में बुनियादी प्रोटोकॉल रूपरेखा, और आणविक/जीनोमिक तकनीक, इस धारणा है कि इस प्रजाति पर भविष्य के काम की संभावना अध्ययन शामिल है कि जीनोमिक और कार्यात्मक पारिस्थितिकी दृष्टिकोण का उपयोग करेंगे । कई खुले सवालों के तंत्र और cardenolide detoxification और एक. neriiमें ज़ब्ती के महत्व के बारे में रहते हैं । इस संबंध में अभिव्यक्ति पछाड़ना या जीन संपादन दृष्टिकोण के लिए RNAi जैसी तकनीकें मूल्यवान साबित होंगी.

संवर्धन एफ़िड्स में चुनौतियों में से एक प्रजनन और फैलाव के लिए अपनी विलक्षण क्षमताओं में है । ये लक्षण है, जो सीधे क्यों वे गंभीर फसल कीट है से संबंधित है, इसका मतलब है कि एफ़िड संस्कृतियों लगभग दैनिक ध्यान की आवश्यकता है, साथ ही अति ध्यान अगर isogenic लाइनों प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं । ऊपर वर्णित तकनीक, जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए डेटा पैदा करने के लिए उन सहित, जबकि एफ़िड पालन और आणविक विश्लेषण के लिए सामांय प्रोटोकॉल के समान है, एक विशिष्ट पर्याप्त जैविक पैदा करने के लिए कदम दर कदम गाइड प्रदान आणविक और पारिस्थितिक अनुप्रयोगों के एक विविध सेट के लिए nerii के लिए सामग्री ।

इस अंत करने के लिए, यदि कार्यात्मक या पारिस्थितिकी जीनोमिक अध्ययन एक. neriiके लिए क्षितिज पर हैं, इन के लिए जीना संस्कृतियों के साथ युग्मित करने के लिए पूरी तरह से प्रायोगिक अवसरों वे प्रस्ताव पर कैपिटल की आवश्यकता होगी । कीट शाकाहारी उनके मेजबान संयंत्रों पर जटिल समुदायों में रहते हैं, और दोनों intraspecific बातचीत३८,३९ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परस्पर विशिष्ट संपर्क४० अपने मेजबान संयंत्रों के लिए एक. nerii की अंतिम प्रतिक्रिया आकार . मेजबान संयंत्रों, ए nerii पर विशेषज्ञ, पौधों की एक विविध सेट है कि एक्सप्रेस अलग जीवन इतिहास रणनीतियों15,21का प्रतिनिधित्व करते हैं, विशुद्ध रूप से जीनोमिक या शारीरिक दृष्टिकोण युग्मन के महत्व को रेखांकित प्रयोगात्मक जोड़तोड़ कि एक. nerii समुदायों में स्वाभाविक रूप से होने वाली भिन्नता के लिए खाते । यहां उल्लिखित तरीकों एक . nerii पर एक कार्यात्मक और पारिस्थितिकी जीनोमिक परिप्रेक्ष्य के लिए अंक शुरू कर रहे है और विषाक्त मेजबान पौधों के साथ अपनी बातचीत ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम फोटोग्राफी के साथ सहायता के लिए मिशेल मून (वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय फिलीस्तीनी अथॉरिटी और SSLB को समर्थन प्रदान की डीजीई-१४४५१९७ द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

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References

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).

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आनुवंशिकी अंक १३८ एफ़िड ग्रीनहाउस milkweed माइक्रोसेटेलाइट RNAseq qPCR संयंत्र-कीट इंटरेक्शन
जैविक संस्कृतियों को बनाए रखने और <em>Aphis nerii</em>में जीन अभिव्यक्ति को मापने: संयंत्र के लिए एक गैर मॉडल प्रणाली-कीट बातचीत
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Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C.,… More

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

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