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Genetics

生物学的文化とワタアブラムシ neriiの遺伝子発現を測定を維持する: 植物・昆虫間の相互作用の非モデル系

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

アブラムシワタアブラムシ nerii付いているバシクルモン家族 (Apocyanaceae) で強く擁護した植物の定着植物昆虫の相互作用を研究する多くの機会を提供しています。ここでは、我々 の文化と生成分子の解析植物とアブラムシの保守のためのプロトコルのシリーズの紹介とA. nerii用プロファイルー データ。

Abstract

アブラムシは宿主植物と昆虫の相互作用をめぐる質問に共生の進化と polyphenisms の開発に至る生物の質問の様々 な優れた実験的モデルです。アブラムシ数種の遺伝子資源があり、非モデル生物のゲノムを欠いているに延長されるトランスクリプトーム研究次世代シーケンシングの進化により、です。さらに、アブラムシの文化はフィールドから収集し、生態学的な遺伝学の間のギャップを埋めるための生物・分子の実験で使用する実験室で飼育できます。最後に、多くのアブラムシは無性再現遺伝子型の比較を可能にする永久的な単為のライフ サイクルでの優先ホスト植物研究所で維持できます。ワタアブラムシ nerii、トウワタ キョウチクトウ アブラムシは、生物分子の実験を使用して有毒な植物と昆虫の相互作用を研究するようなの 1 つのモデルを提供します。世代と温室効果と研究所、DNA および RNA の抽出、マイクロ サテライト解析、 de novoトランスクリプトーム アセンブリおよび注釈、トランスクリプトーム発現の植物とアブラムシの文化の維持の方法分析、および特異的発現遺伝子の qPCR 検証は概説し、ここで説明します。

Introduction

アブラムシは、世界中の多様な植物家族の植民地 hemimetabolous、小さな昆虫です。最も特にから不足している栄養素を供給する酵母や細菌の共生とその偏栄養共生と離散 polyphenisms 循環単為生殖を含む複雑なライフ サイクルのいくつかの機能の独特であります。sap の1工場の彼らの食事療法。ほとんどアブラムシはホスト植物の専門家、いくつか種がどちらか直接にある作物で、かなりの経済ダメージを与える重要な作物害虫や病原体やウイルスを介して彼らはベクトル2。最初アブラムシにおけるゲノム学 2010 年エンドウ アブラムシエンドウヒゲナガアブラムシ3、パブリケーション アブラムシの生物学の研究で重要なマイルス トーンをマークは、昆虫のアドレス指定についての遺伝子資源を提供されているため良いコントロールの戦略4につながる可能性のあるものを含む、草食性のライフ スタイルに適応します。それ以来、追加ゲノム リソース大豆アブラムシワタアブラムシ グリシン5注釈ゲノムと別の 3 アブラムシ種 (モモアカアブラムシの公に利用可能な全ゲノム リソースのパブリケーションと蓄積してきたcerasi (ブラック チェリー アブラムシ)、モモアカアブラムシ(桃ジャガイモ アブラムシ)した padi (鳥チェリー エンバク アブラムシ)6。貴重なデ novoトランスクリプトーム リソースが他のアブラムシの数も利用可能 (e.g.,Aphis gossypii (綿アブラムシ)7, Sitobion 褐(穀物アブラムシ)8, Cinarapinitabulaeformis (松アブラムシ)9、ワタアブラムシ nerii (トウワタ キョウチクトウ アブラムシ)10)。

アブラムシは植物11植物昆虫相互作用と生命の生態学の私達の理解に永続的な貢献をしたも。アブラムシが特に重要な貢献をした 1 つの領域は、宿主植物の化学生態学の私達の理解にあります。共同植物の防御、自分の選ぶも克服する植物の防御、およびいくつかの草食性昆虫表現多様な適応は利益12,13,14です。たとえば、トウワタ キョウチクトウ モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ neriiは、明るい黄色、侵襲的なアブラムシ世界中の温帯、熱帯地域は、トウワタ家族 (キョウチクトウ科) 植物の定着です。キョウチクトウ科の植物は、乳状のラテックスとカチオン キャリア Na, K-atpase をバインドし、ジェネラ リスト草食動物15,に効果的な抑止力は、cardenolides として知られている強心配糖体などを含む、多様な化学防御を進化しています。16. トウワタ専門家エクスプレス、cardenolides に対する抵抗性のさまざまなモード、選択的または受動的蓄積や捕食を阻止するための手段としてまたは他の利点の17のための組織の cardenolides を変更あり。A. neriiはこの方法で cardenolides を隔離するメカニズムと機能上の利点のまま不明10,18です。

手で、ゲノム リソース、 A. neriiを提供します優れた実験モデル有毒な宿主植物との専門家の化学生態学的相互作用に関与する分子および遺伝のメカニズムの調査のため草食動物。A. nerii cardenolides19, その時以来の隔離に焦点を当てたの初期の研究のいくつか、 a. neriiの研究が広範な進化と生態学的な質問に洞察力を提供している注目に値する侵襲的な昆虫20と草食動物密度21のボトムアップとトップダウンの規則間の相互作用の遺伝的構造を含みます。A. neriiはこうして特に広範な昆虫植物相互作用の研究のための実験モデルとしての良い候補です。重要なA. neriiと任意の研究の成功に注意カルチャですアブラムシの植物のアブラムシが依存の文化を含む集団として高品質弔データの効率的な生成。私たちの目標は、両方を介してリーダーを指導することです。世代やメンテナンス、温室効果と研究所、DNA と RNA の抽出、マイクロ サテライト解析、 de novoトランスクリプトーム アセンブリおよび注釈、トランスクリプトームで植物とアブラムシの文化のための方法を以下に発現解析と qPCR 性遺伝子が発現。一方、これらのメソッドは、 A. neriiの書かれている、培養、抽出、および分析の一般的な方法をさまざまな種のアブラムシに拡張できます。

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Protocol

1. 植物培養

  1. 任意の商用ベンダーから種子を購入または分野で成熟した植物から収集します。
    注: このプロトコルは、ほとんどの市販のトウワタ種 (例えば、トウワタ属 incarnata、 A. syriaca、 A. さんに感謝、 Gomphocarpus physocarpus) に適しています。冷たい成層をする必要がありますいくつかの種と種の製造者からの指示をチェックする必要があります。
  2. 細かい発芽土 (60-70% 高級ピートモス、パーライト、バーミキュ ライト、石灰岩) の植物の種子。
    1. 発芽ミックス土壌; 標準的な育苗トレイを埋める井戸の上部を土に達するようにします。各ウェルに約 3 cm の深い土壌に穴を作成する刻み目を作る。
    2. 土種子をカバーは飽和状態、水まき缶を各穴と水の 1 つの種を非常によく配置します。
    3. 温室の種子の成長 (1.5 以下条件を参照してください)。その他-毎日; 毎日定期的に水します。中程度のレベルに土壌水分を維持するのに十分です。
  3. 一般的なポッティング再ポット苗ミックス (50-60% ピートモスや樹皮や石灰岩) における葉の彼らの最初のセットが苗に成長しているとき (図 1A)。
    1. 4 インチのラウンド ポット カップ ケージのタイトなシールと適合するを使用します。縁下約 5 cm までの一般的な用土を詰めます。
    2. 深い土壌に穴を作成する十分な鍋の底に到達します。
    3. 手でそっとその井戸から成熟した苗をスクープし、配置 4 インチの鍋の穴の奥深く。土と苗をカバーします。水は非常によく。
    4. 毎日; のために毎日定期的に、温室と水で植物を育てる適度な土壌水分を維持するのに十分です。
  4. 温室効果の条件。
    1. 18-28 ° C、夜間温度が製造元の指示を使用して 16-22 ° C 間の昼間の温度を維持するために温室のサーモスタットを設定します。
    2. 日が短い冬の間 600 W 高圧ナトリウムの球根 (12 h、8-20) の光を補足します。
  5. しかし葉有機洗剤と (例えばアザミウマ、アブラムシ) 不要な害虫を制御、注意してこれらの製品を使用してください。
    1. 製造元の推奨に従って石鹸液を作る、スプレー ボトルを使用して適用されます。
    2. 植物の石鹸 4-24 h. 優しくリンス石鹸 4-24 h 後アプリケーションを削除し、それらを洗浄するために水が付いている植物の水研究室アブラムシ文化と使用する前に 2 番目の時間を残す。
  6. 文化 10 cm 以上背の高い (図 1B) は、少なくとも 3-4 組の完全葉を成長している植物の平均あぶらむし。

2. アブラムシ文化

  1. 既存のラボ isoclonal 人口から研究室のアブラムシを開始または以下の指示に従ってフィールド収集アブラムシから開始します。
    1. 研究室の作成を開始すると、既存のラボ isoclonal 人口から、2.3.1–2.3.3 で説明されているようにアブラムシが転送されます。
  2. 新しい isoclonal、フィールド収集アブラムシを開始と適切なホスト植物ステップ 1.6 で説明したように単一、再現、大人のアブラムシを配置します。
    注: 人口を開始可能性がありますから翼 (翼) または unwinged (無翅) 大人。
    1. 研究室アブラムシを使用する前に不要な害虫の温室からの植物を調べて手動で。不要なアブラムシを持つ植物を固定します。必要な場合は、アザミウマや他の害虫を削除するエタノールの魔法瓶を使用します。
      注: 必ず 1.5.2 の手順で説明されているように使用する前に石鹸で扱われている植物をすすいでください。
    2. 3/16"x 1/4" 外径チューブ、1,000 μ L ピペット チップおよび 2,00 μ L ピペット チップ (図 2A) ID で作成された口ピペットやブラシを使用して単一アブラムシの成虫を安全に転送します。
    3. 安全に細かいメッシュで覆われているし、テープ (図 2B) で固定、上部をカット、プラスチック製のコップをしたカップ ケージにアブラムシが付いている植物をカバーします。
    4. トレイにアブラムシが出没する植物を置き、制御環境室 (16 L: 8、22 ° C、湿度 70%) にしてください。
  3. 在庫個体群を維持するためにアブラムシを新鮮な新しい植物毎週 (2.2.1–2.2.3) に転送します。
    1. 1-3 2ndを安全に転送または 3rd齢幼虫と口ピペット (図 2 a 3) を使用して 1 の大人高齢者アブラムシ。
      注: 株は最高 unwinged 個人を転送することによって維持されます。
    2. 安全に細かいメッシュで覆われ、テープで固定上部をカット、プラスチック製のコップをしたカップ ケージとアブラムシが出没する植物をカバーします。
    3. トレイに植物を置き、環境チャンバー (16 L: 8、22 ° C、湿度 70%) のアブラムシを維持します。
    4. また、宿主植物がまともな品質の場合は、大人 1 つだけ再現を残しての人口を減らすためにエタノールの魔法瓶を使用して、必要に応じて、2 〜 3 第 2 または第 3 齢幼虫。
  4. 実験使用のため同じ年齢集団を作成するには、新しいホスト植物にストックの人口から (できれば unwinged) 大人 5 名まで配置します。
    1. 大人 24 時間後を削除します。
    2. 約 5-7 日後、F1の子孫が成熟し、成人では、一度は、新しいホスト植物に最大 5 unwinged F1大人を配置します。大人 24 時間後を削除します。
    3. F2人口は成人期に成熟している、一度、この人口は実験で使用する準備ができています。
      注: このプロセスによって実験的人口がほぼ同じ年齢し、ほぼ同じ年齢の母親から生まれた。
  5. マイクロ サテライト遺伝子多型 (以下、セクション 3 と 4 で説明) を使用してフィールド キャッチ isoclonal 線と品種間の相違を確認します。

3. DNA の抽出

  1. 準備
    1. 生殖不能の技術を使用すると、1 リットルの換散バッファー (0.1 M 塩化ナトリウム、スクロース 0.2 M、0.1 M トリス (pH 9.1)、0.05 M EDTA, 0.05 %sds) を準備できます。
    2. 暖かい暖房のブロックや水の 65 ° c. にお風呂
  2. 組織の均質化および換散
    1. アブラムシ、滅菌 1.5 mL 遠心管の底の近くに配置します。
    2. アブラムシと管内滅菌杵を置き、液体窒素でチューブの底部を浸します。
      注: 最適な組織崩壊は杵と管の側との間に、アブラムシが置かれたときに実現されます。
    3. 最初に細胞を溶解する杵で、アブラムシを挽きます。
    4. 単一アブラムシの成虫 200 μ (2 x 100 μ 因数に分割) 換散バッファーを使用します。挽くとサンプルが目に見えて崩壊、まで砕いたアブラムシを再停止しなさい最初の因数を追加し、杵を洗浄する 2 番目の因数を使用します。
    5. 65 ° c で 30 分間水お風呂や熱ブロックでの換散バッファーで押しつぶされたアブラムシを孵化させなさい。
  3. DNA の沈殿物
    1. チューブは暖かいのですが、8 M の KOAc の 14 μ L を追加します。ミックス チューブを反転します。30 分間氷の上、サンプルを格納します。
      注: プロトコルをここでは、一時停止できるし、サンプルは、最大 24 時間-20 ° C で保存できます。
    2. 室温で 15 分間 13,000 × gで遠心分離機します。上澄みをピペットで新しい 1.5 mL チューブに転送します。小球形にされた残骸のいずれかを削除しないように注意します。
    3. DNA ペレット可視化を向上させるため、上清に 2 μ L グリコーゲン (20 μ g/mL) を追加します。サンプル サイズが十分に大きい場合は、この手順を省略します。
    4. 上清に冷たい 100 エタノール分子グレードの 200 μ L を追加します。ミックスし、少なくとも 15 分間室温でインキュベートするチューブを反転します。
      注: プロトコルをここでは、一時停止できるし、サンプルは、最大 24 時間-20 ° C で保存できます。
    5. 室温で 15 分間 13,000 × gで遠心分離機します。ピペッティングでエタノールを削除します。
  4. DNA を洗って、溶出
    1. 冷たい 70 エタノール分子グレードの 200 μ L を追加します。再懸濁します、餌を洗浄し、はじきます。
    2. 13,000 × gで 5 分間遠心します。ペレットを可視化しながら慎重にピペッティングしてエタノールを削除し、冷たい 100 エタノール分子グレードの 200 μ L を追加します。
    3. 13,000 × gで 5 分間遠心します。ペレットを可視化しながらピペットでエタノールを慎重に取り外します。
      注: 繰り返し 100-70-100 エタノール洗浄必要に応じて。
    4. 空気は、ティッシュ ペーパーで横方向に開いてチューブの敷設と 5-10 分のためのペレットを乾燥させます。
    5. 低 TE (10 mM トリス-HCl、0.1 ミリメートルの EDTA) の 80 μ L の DNA ペレットを再懸濁します。
    6. 分光光度計を用いた再懸濁の DNA を定量化します。
    7. 4 ° C でのストア

4. マイクロ サテライト PCR とシーケンス アブラムシ ジェノタイピング

  1. マイクロ サテライト (表 120) をシーケンスの適切な F と R プライマーを注文します。
    注意: マイクロ サテライト配列の多重サンプルのために 5' 6-FAM または 5'-5 HEX の蛍光ラベルと逆プライマー シーケンスを変更ください。
  2. (セクション 3 で説明) 単一アブラムシ中 DNA サンプルと蛍光に分類されたマイクロ サテライト プライマー PCR を実行します。
    1. 製造元のプロトコル (0.2 μ F ・ R プライマー、2.5 mM MgCl250-200 ng DNA テンプレート) によるとの PCR の反作用をミックスします。
    2. たちの次の設定を使用: 4 分、94 ° C で初期変性 94 ° C の 30 のサイクル 35 s、58 ° C、35 s、45 のための 72 ° C s と 10 分のための 72 ° C で最終的な延長のステップ。
  3. PCR のサンプル シーケンスのサンプルの数を減らすし、遺伝子型の施設でマイクロ サテライト サンプルのシーケンスを異なる蛍光タグとを組み合わせた。
  4. マイクロ サテライト解析ソフトウェアを使用して .fsa raw サンプルファイルを分析します。

5. RNA の抽出

  1. 1.5 mL RNase の RNA の抽出のアブラムシのサンプルを収集/チューブ DNase 自由と液体窒素で凍結。
    注: 次の手順がすぐに実行されない場合、サンプル格納できる-80 ° C で
  2. 組織の均質化
    1. アブラムシとチューブの滅菌の杵と焼けるように暑いサンプル停止まで、10-15 秒間液体窒素で凍結します。3.2 の手順で説明するよう、乳棒でよく、アブラムシをつぶします。
      注: 最適な組織崩壊は杵と管の側との間に、アブラムシが置かれたときに実現されます。
    2. 発煙のフード サンプル (1-5 大人アブラムシ) するためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出試薬の 800 μ L を追加します。杵と杵の dispose 試料をホモジナイズしてください。
  3. 相分離
    注: すべての手順は、ヒューム フードで行わなければなりません。
    1. 室温で 5 分間均質化サンプルをインキュベートします。クロロホルムの 160 μ L をサンプルに追加します。15 の手によって積極的に振る s。
    2. 室温で 2-3 分間インキュベートします。4 ° C で 12,000 × gで 15 分間遠心します。
      注: 以下の遠心分離、混合物を分離 3 層: 下、赤いフェノール クロロホルム段階、中間期および無色上水相。RNA は、水相にのみ残ります。水性のボリュームを 〜 480 μ L となります。
  4. RNA の沈殿物
    1. 発煙のフードには、新鮮な RNase フリー チューブに水相を転送します。中間の段階が不可でした。
    2. イソプロパノールの 400 μ L を追加することによって RNA を沈殿し、-20 ° C で 10 分間でサンプルをインキュベートします。
      注: プロトコルをここでは、一時停止できるし、サンプルは、最大 24 時間-20 ° C で保存できます。
    3. 4 ° C で 12,000 × gで 10 分間のサンプルを遠心分離します。
  5. RNA を洗って、溶出
    1. の上清を除去します。RNA の餌を監視します。
    2. DEPC 処理水の 75% エタノール 1 mL で RNA の餌を洗います。ゆっくりボルテックスでミックスします。4 ° C で 7,500 × gで 5 分間遠心
    3. フェノールの汚染物質を除去するために 5.5.1–5.5.2 を手順を繰り返します。
    4. 上澄みを除去し、空気乾燥無菌ベンチの水平方向に開く管敷設と 5-10 分のためのペレット。RNA の餌を完全に乾燥をさせてください。
    5. RNase フリーまたは DEPC 処理水の 30 μ L の RNA ペレットを溶解します。優しくピペットの上下をミックスします。55 ~ 60 ° C で 10-15 分間インキュベートします。

6. RNAseq ・ デ ・ ノボトランスクリプトーム アセンブリ、アノテーション、および発現解析

  1. RNA サンプルの濃度とチップ ベースのキャピラリー電気泳動システムを使用して品質を分析します。
    注: チップ ベース キャピラリー電気泳動システムは、RNA 濃度と品質のより正確な測定を提供するため、分光光度計による分析よりも選択の望ましい方法です。
    1. サンプルに最適な品質 (≥ 250 ng、合計凛 (RNA 整合性番号) ≥ 5) は、RNA シーケンスを実行します。
      注: 重要なは、このシーケンス データは、式プロファイリングとディノウボウトランスクリプトーム アセンブリの両方に使用されるより読み取る高品質トランスクリプトームの深さになります。1 億 100 bp、イルミナ シーケンス技術を使用して合理的に包括的なアセンブリのペア終了読み取りを推奨される開始点となります。合計 mRNA ライブラリ合成と RNA シーケンスは、シーケンス処理施設によって行われました。
  2. 高速 QC22を使用して読み取りの品質を確認します。
  3. サンプルのすべての読み取りを組み合わせるし、トリニティ23,24 (Trimmomatic 品質フィルター有効になっている) を使用してトランスクリプトーム・ デ ・ ノボを組み立てます。
  4. アセンブリを絞り込む
    1. Transdecoder25を 100 アミノ酸の長さの最小値を開いたリーディング ・ フレーム (ORFs) を識別するために使用します。
    2. Pfam26と UniProt27データベースそれぞれ BLASTP28 , HMMER29を使用して翻訳された ORFs のホモロジー検索を実行します。
    3. (最高爆発がヒット、翻訳されたシーケンスは、300 以上のビット スコアと 50% の最小アミノ酸シーケンス id を持つ細菌の遺伝子) 細菌の成績証明書を削除します。
    4. CD ヒット30を使用してアミノ酸レベルで少なくとも 99% 同一である、完全な翻訳された ORFs を折りたたみます。
    5. 少なくとも 95% 同じ CD ヒット30を使用して塩基配列レベルでは、残り、不完全な Orf を折りたたみます。
    6. ユニークな種特異的な識別子 (例えば、 APHNE 0001) と残りの塩基配列を割り当てます。
  5. BUSCO (http://busco.ezlab.org/) や節足動物遺伝子データセット31を使用して、洗練されたアセンブリの完全性を評価します。
  6. トランスクリプトーム注釈
    1. まず、洗練されたトランスクリプトーム Pfam データベース26,29に対して HMMER を使用して注釈を付けます。
    2. 第二に、トランスクリプトーム UniProt データベース27,28に対して BLASTP を使用して注釈を付けます。
    3. 第三に、選択した昆虫、注釈付きの公開されたゲノムのコーディング シーケンスに対して BLASTP を用いたトランスクリプトームに注釈を付けます。
    4. 最後に、エンドウ豆アブラムシ タンパク質データベースのみに対して BLASTP を用いたトランスクリプトームに注釈を付けます。
    5. UniProt 系統から行く注釈を生成するのに Trinotate を使用します。
    6. Trinotate を使用して、SQLite データベースにすべてのアノテーション結果を整理し、注釈レポートを生成します。
  7. 発現解析
    注: は、洗練されたトランスクリプトームを参考にして、合わせ、個別に各ライブラリを定量化します。
    1. 品質フィルターに Trimmomatic を使用し、元のファイルを読み取り32をトリムします。
      注: 三位一体組立後に、この手順を実行、代わりにそのステップから Trimmomatic の出力を使用 1 つ可能性があります。
    2. Bowtie233を使用して各サンプルの局所アライメントを実行します。
    3. SAMtools34を使用して個別に各サンプルからの読み取りの数を抽出します。
    4. デフォルトのパラメーターで DESeq2 を使用して興味のサンプル間の差分式を計算して、パラメトリック合わせて35。

7. qPCR 遺伝子の差動表現の検証

注: ユーザーは、彼らの RNAseq の実験から特異的発現遺伝子に興味が、次のプロトコルが差動式のパターンを確認する使用できます。

  1. (手順 5) 上記のように、RNA サンプルを生成します。
  2. RNA の抽出、品質をチェックし、濃度を分光光度計を使用して量的に表わします。
  3. 製造元の推奨に従って市販キットを用いた cDNA 試料を合成します。
  4. 正確な 2 倍 PCR 増幅できるように興味のある遺伝子のプライマーの効率を決定します。
    1. 元の RNA 濃度に基づいて、シリアルの希薄を実行 (101) 3 cDNA 濃度を取得します。
    2. 3 つのプライマー濃度を使用して製造元のプロトコルに従って帳票 qPCR 反応をミックス定量的 PCR マスター ミックスを使用 (例えば、 100 nM、200 nM、300 nM) 3 希釈した cDNA 濃度 (例えば、 0.1 ng/μ L、10ng/μ l、100 ng/μ L)。
    3. 各ターゲット遺伝子の独立変数 (全 3 箇所) として従属変数とログ (cDNA 濃度) 各サンプルの Ctの平均値を使用して作成された直線の傾き (m) を計算します。
    4. M は 7.4.3 の計算斜面プライマー効率 (E) を計算する次の数式を使用します。
      E = 10^(-1/m)
      注: 90-110% 間プライマー効率解析に適しています。このプロセスは、計算に含まれているすべての遺伝子の等しい増幅を保証します。
  5. ハウスキーピング遺伝子と ΔΔCtメソッドを使用して、利子36の遺伝子の発現を定量化します。

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Representative Results

植物の文化:種子は季節に応じて約 2 〜 4 週間の時間がかかります、大きく十分に鉢植え (図 1A)。再鉢植え苗は、アブラムシの文化 (図 1B) の最適なサイズに成長する別の 2 〜 4 週間かかります。

アブラムシ文化:大人A. neriiいくつかの暗い馬尾によって区別され、翼のあるかもしれない (無翅、図 3A、 B) または翼 (翼、図 3C, D)。ニンフ (図 3E, F) の 3 齢に達するとき、発展途上の翼パッドが表示されます。株式文化ベスト 1 ~ 3 の中間齢と 1 つ大人高齢者 unwinged アブラムシ; 転送によって維持されます。これにより、健康年齢人口を混合します。実験に使用する集団は、(2.4) を上記のように unwinged アブラムシを使用して培養する必要があります。A. nerii大人 1 人産むことができます 3-10 日あたり、宿主植物とアブラムシ10の年齢によって異なります。

DNA および RNA の抽出:シングル、大人A. neriiを行えば、およそ 100-200 ng/μ L の DNA (80 μ L の溶出。図 4A) および 150-300 ng/μ L の RNA (30 μ L の溶出。図 4B). 代表マイクロ サテライト ピークは、図 5に示します。3 つの条件 (制御、治療 1、処理 2) 下候補遺伝子の代表的な相対式は表 2に計算され、図 6に示します。

Figure 1
図 1: アブラムシ文化の代表的な植物。彼らは真の葉の最初の完全なセットを開発した後 (A) 苗は鉢植え再することができます。(B) 植物は、彼らは真の葉の 3-4 セットを開発しているとき、アブラムシ文化の使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: アブラムシを培養するために使用するツールの例です。(A) 口のピペットは、3/16"x 1/4" 外径チューブ、1,000 μ L ピペット チップ 200 μ L ピペット チップ ID を使用して作成できます。(B、C)カップ ケージ (上部を切断し、細かいメッシュで保護と透明なプラスチック カップ) を使用して、アブラムシ文化用 4 インチの鍋の上に合わせて、確実に。これは十分なライトおよび換気のためアブラムシおよび植物に適した環境を作成することができます、含まれているアブラムシを続けています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 代表的な大人とワタアブラムシ neriiニンフ。(A, B)(Unwinged) 大人の無翅A. neriiは、後部端に暗い馬尾によって識別されます。(C, D)翼 (翼) 大人が十分に発達した翼によって識別され、暗く、後方で馬尾。(E, F)発展途上のA. neriiニンフが 4 齢段階を経るし、開発翼パッドは 3 齢段階で明らかになります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 代表的なゲル。(A) DNA 抽出 (はしご 1 kb)。7 A. nerii DNA の抽出に 3-9 のレーンで視覚化されます。否定的な制御は車線 10 で。(B) RNA の抽出を行11 A. nerii RNA の抽出に 3-13 のレーンで視覚化されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: マイクロ サテライト代表ピーク。タグ付き FAM の 6 ピークに青で視覚化されます。リズ 500 はしごがオレンジ色で表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: 特異的発現遺伝子の qPCR 検証します。代表的な相対的な量 (RQ) 発現 (表 2ΔΔCt メソッドを使用して計算される) 3 つの条件の下で興味の候補遺伝子の表示: 制御、処理 1、処理 2。グラフでは、1 と 2 のコントロール (表 2) に比較して治療の下候補遺伝子の発現の低下を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

プライマー名 方向 シーケンス (5' 3')
Ago24_F 楽しみにして TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R リバース GCCAAACTTTACACCCCGC
前 53_F 楽しみにして TGACGAACGTGGTTAGTCGT
前 53_R リバース GGCATAACGTCCTAGTCACA
前 59_F 楽しみにして GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
前 59_R リバース GTTACCCTCGACGATTGCGT
前 66_F 楽しみにして TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
前 66_R リバース GACTAGGGAGATGCCGGCGA
前 69_F 楽しみにして CGACTCAGCCCCGAGATTT
前 69_R リバース ATACAAGCAAACATAGACGGAA
前 84_F 楽しみにして GACAGTGGTGAGGTTTCAA
前 84_R リバース ACTGGCGTTACCTTGTCTA
前 89_F 楽しみにして GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
前 89_R リバース GACAGCGTAAACATCGCGGT
前 126_F 楽しみにして GGTACATTCGTGTCGATTT
前 126_R リバース TAAACGAAAAAACCACGTAC

表 1: 遺伝子型に使用されるマイクロ サテライト プライマー シーケンスワタアブラムシ nerii20.

ターゲット サンプル Ct の意味 Ct 標準開発 ΔCt 平均 ΔCt ΔΔCt RQ=2^(-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a 1.1 22.59 0
ef1a 1.2 20.31 0
ef1a 1.3 20.36 0.226
ef1a 1.4 20.27 0.036
ef1a 1.5 20.55 0.003
ef1a 1.6 20.52 0.245
ef1a 2.1 20.49 0.082
ef1a 2.2 19.86 0.033 お
ef1a 2.3 20.19 0.037
ef1a 2.4 19.67 0.058
ef1a 2.5 20.25 内径 0.188
ef1a 2.6 18.16 0.089
ef1a 3.1 20.93 0.157
ef1a 3.2 20.22 0.003
ef1a 3.3 20.44 0.039
ef1a 3.4 20.91 0.559
ef1a 3.5 20.63 0.017
ef1a 3.6 20.3 0.135
興味の遺伝子 1.1 24.6 0.173 2.01 0 1
興味の遺伝子 1.2 24.25 0.019 3.94 2.975 0 1 0
興味の遺伝子 1.3 24.79 0.04 4.43 0 1
興味の遺伝子 1.4 25.23 0.285 4.96 4.695 0 1 0
興味の遺伝子 1.5 24.6 0.103 4.05 0 1
興味の遺伝子 1.6 25.08 0.033 お 4.56 4.305 0 1 0
興味の遺伝子 2.1 27.52 0.155 7.03 5.019033762 0.03084042
興味の遺伝子 2.2 27.23 0.061 7.37 7.2 3.428355679 0.092888533 0.031024057
興味の遺伝子 2.3 27.18 0.058 6.99 2.56158174 0.169389724
興味の遺伝子 2.4 27.45 0 7.78 7.385 2.820764967 0.141535419 0.013927153
興味の遺伝子 2.5 27.44 0.032 7.19 3.138956897 0.113521944
興味の遺伝子 2.6 28 0 9.84 8.515 5.284272079 0.025661119 0.043930413
興味の遺伝子 3.1 27.23 0.143 6.3 4.292437371 0.051032588
興味の遺伝子 3.2 27.05 0.088 6.83 6.565 2.891234282 0.134788164 0.041877788
興味の遺伝子 3.3 27.45 0.109 7.01 2.578145722 0.167456035
興味の遺伝子 3.4 27.58 0.019 6.67 6.84 1.709038085 0.305863936 0.069203951
興味の遺伝子 3.5 27.06 0.067 倍 6.43 2.384498984 0.191511246
興味の遺伝子 3.6 27.36 0 7.06 6.745 2.513723938 0.175103043 0.008204101

表 2: qPCR ΔΔC の計算t候補遺伝子の検証します。候補遺伝子発現 ef1a を基準にして計算されます (図 6)。1.1 1.6 表す 6 生物複製処理; 下のサンプルします。2.1 2.6 表す 6 生物複製処理 1; 下のサンプルします。3.1 3.6 表す 6 生物学的治療法 2 下で複製をサンプリングします。Ct標準の開発は、3 つの技術的な複製から計算されます。

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Discussion

長いこと、ディアボルスA. neriiパターンと植物の防御、特に化学隔離18,37への抵抗のメカニズムに洞察力を提供できるが認識されています。ゲノム リソースの数は、 A. nerii10, A. neriiを使用して、モデルとして生態学的機能のゲノム研究の新しい機会を提供するため最近浮上しています。アブラムシ、植物文化のこの種の今後の作業がられるゲノムおよび機能の生態学的アプローチを活用した研究を伴う可能性が高いことを前提に、分子/ゲノム技術の基本的なプロトコルの概要を説明します。カルデノライド解毒とA. neriiで隔離の意義とメカニズムについて多くの未解決の問題が残っています。RNAi などの方法によってノックダウン式または遺伝子編集アプローチをこの点で貴重な証明します。

アブラムシを培養する際の課題の 1 つは繁殖と分散戦略のための驚異的な能力です。同質遺伝子系統が実験のために必要な場合、これらの特徴は、なぜ彼らが深刻な作物害虫のアブラムシの文化として、ほぼ毎日注意が必要ことを意味に直接関係するよくとして細心の注意です。遺伝子発現の分析のためのデータを生成するためのそれらを含む上記で説明したテクニック、アブラムシの飼育と分子解析のための一般的なプロトコルと同様に、提供十分な生物を生成する特定のステップ バイ ステップ ガイド分子および生態学的なアプリケーションの多様なセットのa. neriiの材料。

このためには、機能または生態学的なゲノム研究はA. neriiのための地平線上にある場合、完全に彼らを提供する実験の機会を活用する生活文化と結合されるこれら必要があります。草食昆虫が彼らのホスト植物複雑なコミュニティに住んでいるし、種間相互作用40と同様、両方の種内38,39形宿主植物にA. neriiの最終的な応答.A. neriiホスト植物に特化、発散の生活史戦略15、21、カップリングと純粋な genomic または生理学的アプローチの重要性を強調を表す植物の多様なセットを表すA. neriiコミュニティの自然発生する変化の実験操作。ここで説明する方法は、 A. neriiと有毒な宿主植物との相互作用に関する機能と生態学的なゲノムの観点のためのポイントを始めています。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

写真についてミシェル月 (ヴァンダービルト大学) に感謝したいと思います。PA と SSLB にヴァンダービルト大学提供のサポートは、地区ガバナーエレクト ・ 1445197 によってサポートされます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

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References

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Tags

遺伝学、問題 138、アブラムシ、温室効果、トウワタ、マイクロ サテライト、RNAseq、qPCR、植物-昆虫の相互作用
生物学的文化と<em>ワタアブラムシ nerii</em>の遺伝子発現を測定を維持する: 植物・昆虫間の相互作用の非モデル系
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Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C.,… More

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

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