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Genetics

Mantenimento di colture biologiche e misurazione dell'espressione genica in Aphis nerii: un sistema Non-modello per le interazioni pianta-insetto

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

L'afide Aphis nerii colonizza sulle piante altamente difeso nella famiglia dogbane (Apocyanaceae) e offre numerose opportunità per studiare le interazioni pianta-insetto. Qui, presentiamo una serie di protocolli per la manutenzione di impianti e afide, culture e la generazione e l'analisi di molecolare e dati - omic per a. nerii.

Abstract

Gli afidi sono eccellenti modelli sperimentali per una varietà di domande biologiche che vanno dall'evoluzione delle simbiosi e lo sviluppo di polyphenisms a domande che circondano interazioni dell'insetto con le loro piante ospite. Risorse genomiche sono disponibili per diverse specie di afidi, e i progressi compiuti il sequenziamento di nuova generazione, trascrittomica studi sono stati estesi a organismi non-modello che non dispongono di genomi. Inoltre, afide culture possono essere raccolti dal campo e allevate in laboratorio per l'uso negli esperimenti organismi e molecolari per colmare il divario tra gli studi ecologici e genetici. Infine, molti afidi possono essere mantenuti in laboratorio sulle loro piante ospite preferito in perpetui, partenogenetiche cicli di vita consentendo confronti di riprodursi asessualmente genotipi. Aphis nerii, l'afide del milkweed-oleander, fornisce un modello per studiare le interazioni insetto con piante tossiche utilizzando esperimenti sia organismi che molecolari. Metodi per la generazione e la manutenzione delle colture vegetali e afide nell'espressione differenziale di serra e laboratorio, estrazioni di DNA e RNA, l'analisi del microsatellite, de novo del trascrittoma assemblaggio e annotazione, trascrittoma analisi e la verifica di qPCR di geni differenzialmente espressi sono descritte e discusse qui.

Introduction

Gli afidi sono piccoli insetti hemimetabolous che colonizzano su famiglie di piante diverse in tutto il mondo. Sono distintivi per diverse funzioni, più in particolare i cicli di vita complessi che coinvolgono partenogenesi ciclica e discreti polyphenisms e loro simbiosi nutrizionali obbligano con endosimbionti batterici o lievito che forniscono le sostanze nutrienti mancanti da la loro dieta di pianta sap1. Mentre la maggior parte gli afidi sono specialisti di pianta ospite, alcune specie generalista sono parassiti delle colture importanti, infliggendo notevoli danni economici sulle colture sia direttamente o tramite gli agenti patogeni e virus hanno vector2. La pubblicazione del primo genoma afide nel 2010, l'afide di pisello Acyrthosiphon pisum3, segnò un'importante pietra miliare nello studio della biologia dell'afide perché ha fornito le risorse genomiche per questioni dell'insetto adattamenti agli erbivori stili di vita, comprese quelle che potrebbero portare a una migliore di strategie di controllo4. Da quel momento, ulteriori risorse genomiche hanno accumulato con la pubblicazione di un genoma con annotazioni per la soia afide glycines Aphis5e pubblicamente disponibile intero genoma risorse per un'altra specie di tre-afide (Myzus Cerasi (afide nero ciliegia), Myzus persicae (afide peach-patata), Rhopalosiphum padi (afide ciliegia di uccello-avena)6. Sono disponibili anche per un numero di altre specie di afide prezioso de novo Transcrittomica risorse (e.g.,Aphis gossypii (afide del cotone)7, Sitobion avenae (afide grano)8, Cinara pinitabulaeformis (afide pino)9, Aphis nerii (afide del milkweed-oleander)10).

Gli afidi hanno anche fatto duraturo contributo alla nostra comprensione delle interazioni pianta-insetto e l'ecologia della vita su piante11. Un'area dove gli afidi hanno dato contributi particolarmente importanti è nella nostra comprensione dell'ecologia chimica delle interazioni pianta dell'ospite. Adattamenti di esprimere diversi insetti erbivori per superare le difese della pianta e alcuni anche cooptare le difese della pianta per il proprio beneficio12,13,14. Ad esempio, l'afide del milkweed-oleander, Aphis nerii, è un brillante giallo, dilagante afide trovato nelle regioni temperate e tropicali in tutto il mondo che colonizza su piante appartenenti alla famiglia del milkweed (Apocynaceae). Piante della famiglia delle Apocynaceae si sono evolute diverse difese chimiche, tra cui lattice latteo e glicosidi cardiaci, noti come complessi, che legano il trasportatore di cationi Na, K-atpasi e sono efficaci deterrenti a generalista erbivori15, 16. specialisti milkweed express varie modalità di resistenza ai complessi, e alcuni in modo selettivo o passivamente si accumulano o modificare complessi nei loro tessuti come un mezzo per scoraggiare la predazione o per altri benefici17. A. nerii è pensato per sequestrare complessi in questo modo, anche se i meccanismi e i vantaggi funzionali rimangono poco chiari10,18.

Date le risorse genomiche a portata di mano, a. nerii fornisce un eccellente modello sperimentale per lo studio dei meccanismi molecolari e genetici coinvolti nelle interazioni chemio-ecologico tra piante tossiche e loro specialista erbivori. Vale la pena notare che, mentre alcuni dei primi studi di a. nerii incentrato sul sequestro di complessi19, da quel momento, gli studi di a. nerii hanno fornito le comprensioni in una vasta gamma di domande evolutive ed ecologiche, compresa la struttura genetica di insetti invasivi20 e l'interazione tra bottom up e top-down regolamento l'erbivoro densità21. A. nerii è così un buon candidato come un modello sperimentale per un insieme particolarmente vasto di studi delle interazioni insetto-pianta. Critico per il successo di qualsiasi studio con a. nerii è la cultura attenta dell'afide popolazioni, che comprende la coltura delle piante da cui dipendono gli afidi, come pure una generazione efficiente di dati di alta qualità - omic. Il nostro obiettivo è quello di guidare il lettore attraverso entrambi. Descritte di seguito sono i metodi per la generazione e la manutenzione delle colture vegetali e afide in serra e laboratorio, DNA ed estrazioni RNA, analisi dei microsatelliti, de novo del trascrittoma assemblaggio e annotazione, trascrittoma analisi di espressione differenziale e la verifica di qPCR di geni differenzialmente espressi. Mentre questi metodi vengono scritti per a. nerii, i metodi di coltura, estrazione e analisi generali possono estendersi ad una varietà di specie di afidi.

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Protocol

1. pianta culture

  1. Acquistare i semi da qualsiasi fornitore commerciale o raccogliere da piante mature nel campo.
    Nota: Questo protocollo è adatto per la maggior parte delle specie di euforbia commercialmente disponibili (ad es., Asclepias incarnata, a. syriaca, a. curassavica, Asclepias physocarpus). Alcuni semi potrebbero essere necessario essere stratificato al freddo, e le istruzioni direttamente dall'offerente seme dovrebbero essere controllate.
  2. Piantare i semi in un terreno di germinazione fine (60 – 70% bene muschio di torba, perlite, vermiculite, calcare).
    1. Riempire un vassoio standard semenzale con terreno di mix di germinazione; garantire che il terreno raggiunge la sommità dei pozzetti. In ciascun pozzetto, fare un'intaccatura per creare un buco nel terreno a una profondità di 3 cm.
    2. Posizionare un seme in ogni buco e l'acqua molto bene con un annaffiatoio tale che il terreno copre i semi ed è saturo.
    3. Crescere i semi in una serra (Vedi condizioni di seguito, 1.5). Annaffiare regolarmente, ogni giorno per ogni-altro-giorno; sufficiente a mantenere l'umidità del terreno a un livello moderato.
  3. Quando le piantine sono cresciute la loro prima serie di foglie intere, re-pot semenzali in un generale di impregnazione mix (50 – 60% torba, corteccia e calcare) (Figura 1A).
    1. Utilizzare pentole rotonde 4 pollici che si adattano con una guarnizione a tenuta con le gabbie di Coppa. Riempire con terriccio generale fino a circa 5 cm sotto il bordo.
    2. Creare un buco nel terreno profondo abbastanza da raggiungere il fondo della pentola.
    3. Con la mano, delicatamente scoop il semenzale maturo dal suo pozzo e metterlo dentro il foro nella pentola 4 pollici. Coprire la piantina con il terreno. Acqua molto bene.
    4. Crescere le piante in serra e acqua regolarmente, ogni giorno per ogni altro giorno; sufficiente a mantenere l'umidità del terreno moderato.
  4. Condizioni di serra.
    1. Impostare i termostati di serra di mantenere temperature diurne tra 18 – 28 ° C e temperature notturne tra 16 – 22 ° C utilizzando le istruzioni del produttore.
    2. Durante i mesi invernali quando le giornate sono più brevi, supplemento alla luce del giorno con lampade al sodio ad alta pressione 600 W (12 h, 8 – 20).
  5. Controllare i parassiti indesiderati (ad es., tripidi, afidi) con una soluzione di sapone organico fogliare, tuttavia, utilizzare questi prodotti con cautela.
    1. Rendono la soluzione di sapone secondo la raccomandazione del costruttore ed applicare usando un flacone spray.
    2. Lasciare il sapone sulle piante per 4 – 24 h. Sciacquare delicatamente le piante con acqua per rimuovere post-l'applicazione 4 – 24 h di sapone e sciacquare con acqua un secondo prima di tempo di utilizzare con colture di afide del laboratorio.
  6. Cultura della popolazione media afide sulle piante che saranno cresciuti almeno 3 – 4 gruppi di foglie intere e sono almeno 10 cm di altezza (Figura 1B).

2. afide culture

  1. Le popolazioni di afidi di laboratorio a partire da una popolazione di isoclonal di laboratorio esistente o avviare dagli afidi raccolti di campo seguendo le indicazioni qui sotto.
    1. Quando si avvia una popolazione di laboratorio da una popolazione di isoclonal di laboratorio esistente, trasferire gli afidi come descritto in 2.3.1–2.3.3.
  2. Quando a partire il nuovo isoclonal, popolazioni di afide raccolti di campo e si inserisce un afide singolo, riproduzione, adulto su una pianta ospite adatto come indicato nel punto 1.6.
    Nota: Popolazioni possono essere avviati da alato (alate) o trovare adulti (atteri).
    1. Controllare manualmente la piante da serra per parassiti indesiderati prima dell'uso con gli afidi laboratorio. Bloccare tutte le piante con gli afidi indesiderati. Se lo si desidera, è possibile utilizzare un termos di etanolo per rimuovere tripidi o altri parassiti.
      Nota: Assicurarsi di sciacquare le piante che sono state trattate prima di sapone di utilizzare come descritto nel passaggio 1.5.2.
    2. Trasferire in modo sicuro un afide adulto singolo utilizzando un pennello o una pipetta di bocca creato con ID 3/16" x 1/4" tubo di plastica di OD, una punta di pipetta 1.000 µ l e una punta di pipetta di 2,00 µ l (Figura 2A).
    3. In modo sicuro coprire le piante con gli afidi con una gabbia di Coppa creata con un bicchiere di plastica con la parte superiore tagliata fuori, coperto con una maglia fine e fissato con nastro (Figura 2B).
    4. Disporre le piante infestate dagli afidi in un vassoio e conservare in una camera ambientale controllata (L 16:8, 22 ° C, 70% di umidità).
  3. Per mantenere le popolazioni stock, trasferire gli afidi fresche, nuove piante settimanale (2.2.1–2.2.3).
    1. Trasferire in modo sicuro 1 – 3 2nd o 3rd instar ninfe e 1 adulto-invecchiato afidi, utilizzando una pipetta di bocca (figure 2A, 3).
      Nota: Scorte sono meglio mantenute trasferendo trovare individui.
    2. In modo sicuro coprire le piante infestate dagli afidi con una gabbia di Coppa creata con un bicchiere di plastica con la parte superiore tagliata fuori, coperto con una maglia fine e fissato con nastro.
    3. Disporre le piante in un vassoio e mantenere gli afidi in camera ambientale (L 16:8, 22 ° C, 70% di umidità).
    4. In alternativa, se lo si desidera e se la pianta ospite è di qualità decente, utilizzare un termos di etanolo per ridurre le popolazioni lasciando che riproduce un solo adulto e due o tre 2a o 3a instar ninfe.
  4. Per creare stesse popolazioni di età per l'uso negli esperimenti, inserire fino a 5 adulti (preferibilmente trovare) dalla popolazione stock su una nuova pianta ospite.
    1. Rimuovere gli adulti 24 ore più tardi.
    2. Circa 5 – 7 giorni più tardi, una volta che la prole di1 F hanno fatto maturare fino all'età adulta, è possibile posizionare fino a 5 adulti di1 F trovare su una nuova pianta ospite. Rimuovere gli adulti 24 ore più tardi.
    3. Una volta che la popolazione di2 F ha maturato fino all'età adulta, questa popolazione è pronta per essere utilizzato negli esperimenti.
      Nota: Questo processo assicura che la popolazione sperimentale è all'incirca la stessa età e sono nati da madri di età più o meno stessa.
  5. Confermare le differenze genotipiche tra le linee di campo-catturato isoclonal mediante genotipizzazione del microsatellite (descritta di seguito, le sezioni 3 e 4).

3. DNA estrazione

  1. Preparazione
    1. Utilizzare tecniche sterili per preparare il tampone di lisi 1 L (0,1 M NaCl, 0,2 M saccarosio, 0,1 M Tris (pH 9,1), EDTA 0,05 M, 0.05% SDS).
    2. Caldo il blocco riscaldante o sistema a bagnomaria a 65 ° C.
  2. Lisi e l'omogeneizzazione del tessuto
    1. Posizionare l'afide vicino al fondo di una provetta sterile, microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Posto il pestello sterile nel tubo con l'afide e immergere il fondo della provetta in azoto liquido.
      Nota: Disintegrazione del tessuto ottimale si ottiene quando l'afide è posizionato tra il pestello e il lato del tubo.
    3. Macinare l'afide con il pestello per inizialmente lisare cellule.
    4. Per un singolo adulto afide, utilizzare 200 µ l (suddiviso in aliquote di 2 x 100 µ l) di buffer di lisi. Aggiungere la prima aliquota per macinare e risospendere l'afide schiacciato fino a quando il campione è visibilmente disintegrato, quindi utilizzare la seconda aliquota per lavare via il pestello.
    5. Incubare gli afidi schiacciati in tampone di Lisi a 65 ° C nel blocco acqua vasca o calore per 30 min.
  3. Precipitazione del DNA
    1. Mentre il tubo è caldo, aggiungere 14 µ l di 8 M KOAc. Capovolgere la provetta per mescolare. Conservare il campione in ghiaccio per 30 min.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, e i campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a 24 h.
    2. Centrifugare a 13.000 x g per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante nuova provetta da 1,5 mL con una pipetta. Fare attenzione a non rimuovere qualsiasi dei detriti pellettato.
    3. Per migliorare la visualizzazione di pellet di DNA, aggiungere 2 glicogeno µ l (20 µ g/mL) il surnatante. Se la dimensione del campione è sufficientemente grande, omettere questo passaggio.
    4. Aggiungere 200 µ l di etanolo 100% grado molecolare di freddo al supernatante. Invertire i tubi per miscelare e incubare a temperatura ambiente per almeno 15 min.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, e i campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a 24 h.
    5. Centrifugare a 13.000 x g per 15 min a temperatura ambiente. Eliminare l'etanolo di pipettaggio.
  4. Eluizione e lavaggio del DNA
    1. Aggiungere 200 µ l di etanolo 70% grado molecolare di freddo. Scorri il tubo per risospendere e lavare la pallina.
    2. Centrifuga a 13.000 x g per 5 min. Mentre visualizzando il pellet, rimuovere l'etanolo pipettando delicatamente e aggiungere 200 µ l di etanolo 100% grado molecolare di freddo.
    3. Centrifuga a 13.000 x g per 5 min. Mentre visualizzando il pellet, rimuovere con cautela etanolo pipettando.
      Nota: Lavaggio con etanolo ripetere 100-70-100 se necessario.
    4. Asciugare all'aria il pellet per 5 – 10 min con la posa del tubo aperto orizzontalmente su una carta velina.
    5. Risospendere il pellet di DNA in 80 µ l di TE basso (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
    6. Quantificare il sedimento del DNA usando uno spettrofotometro.
    7. Conservare a 4 ° C.

4. Microsatellite PCR e sequenziamento per la genotipizzazione di afide

  1. Ordinare gli appositi primer F e R per microsatellite sequenziamento (tabella 1,20).
    Nota: Sequenze di Reverse primer devono essere modificati con 5'-6-FAM o 5'-5-HEX etichette fluorescenti per consentire multiplexati campioni per la sequenza del microsatellite.
  2. Eseguire PCR con campioni di DNA singolo afide (descritti nella sezione 3) e gli iniettori del microsatellite fluorescente contrassegnati.
    1. Mescolare le reazioni di PCR secondo il protocollo del produttore (primer F/R 0,2 µM ciascuna, 2,5 mM MgCl2, modello di 50-200 ng DNA).
    2. Utilizzare le seguenti impostazioni di thermocycler: denaturazione iniziale a 94 ° C per 4 minuti, 35 cicli di 94 ° C per 30 s, 58 ° C per 35 s, 72 ° C per 45 s e un passo di allungamento finale a 72 ° C per 10 min.
  3. Combinare i campioni PCR con diversi tag fluorescente per ridurre il numero di campioni in sequenza e la sequenza i campioni del microsatellite in un impianto di genotipizzazione.
  4. Analizzare i file di esempio crudo .fsa utilizzando software di analisi dei microsatelliti.

5. estrazione del RNA

  1. Raccogliere campioni di afidi per l'estrazione di RNA in 1,5 mL RNasi / privo di dnasi tubi e immediato congelamento in azoto liquido.
    Nota: Se i passaggi seguenti non sono eseguiti immediatamente, i campioni possono essere conservati a-80 ° C.
  2. Omogeneizzazione del tessuto
    1. Con il pestello sterile nel tubo con afide, congelato in azoto liquido per 10 – 15 secondi, fino a quando il campione fermata sfrigolante. Schiacciare l'afide bene con il pestello come descritto al punto 3.2.
      Nota: Disintegrazione del tessuto ottimale si ottiene quando l'afide è posizionato tra il pestello e il lato del tubo.
    2. In cappa, aggiungere 800 µ l di reagente di estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium nell'esempio (1 – 5 adulti afidi). Omogeneizzare campioni con il pestello e smaltire il pestello.
  3. Separazione di fase
    Nota: Tutti passaggi devono essere eseguiti in una cappa.
    1. Incubare i campioni omogeneizzati per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 160 µ l di cloroformio al campione. Agitare vigorosamente a mano per 15 s.
    2. Incubare per 2-3 min a temperatura ambiente. Centrifuga per 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
      Nota: Dopo la centrifugazione, la miscela si separa in 3 strati: un'inferiore, rosso fenolo-cloroformio, un'interfase e una fase acquosa superiore incolore. il RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa. Il volume di acquoso sarà ~ 480 µ l.
  4. Precipitazione di RNA
    1. In una cappa, trasferire la fase acquosa in una provetta di fresca, RNAsi-libera. Non disturbare la fase intermedia.
    2. Precipiti il RNA aggiungendo 400 µ l di isopropanolo e incubare il campione a-20 ° C per 10 min.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, e i campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a 24 h.
    3. Centrifugare il campione per 10 min a 12.000 x g a 4 ° C.
  5. Eluizione e RNA wash
    1. Rimuovere il surnatante; orologio per la pallina del RNA.
    2. Lavare il pellet di RNA con 1 mL di etanolo al 75% in acqua trattata con DEPC. Mescolare nel Vortex lento. Centrifugare per 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
    3. Ripetere i passaggi 5.5.1–5.5.2 per aiutare a rimuovere i contaminanti di fenolo.
    4. Rimuovere il supernatante e asciugare all'aria il pellet per 5-10 min con posa in opera di tubo in orizzontale aperto su una panchina sterile. Non lasciare asciugare completamente la pallina del RNA.
    5. Dissolva la pallina del RNA in 30 µ l di acqua RNAsi-libera o DEPC-trattati. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Incubare a 55 – 60 ° C per 10 – 15 min.

6. RNAseq De Novo del trascrittoma Assembly, annotazione e l'analisi di espressione differenziale

  1. Analizzare la concentrazione del campione di RNA e qualità con un sistema di elettroforesi capillare basato su chip.
    Nota: Un sistema di elettroforesi capillare basato su chip è il metodo preferibile di scelta che l'analisi con uno spettrofotometro, perché fornisce una misura più precisa e sensibile della concentrazione di RNA e di qualità.
    1. Se i campioni sono di qualità adeguata (≥ 250 ng totale, RIN (RNA integrità numero) ≥ 5), eseguire il sequenziamento di RNA.
      Nota: Importante, poiché questi dati di sequenziamento verranno utilizzati per sia assembly transcriptome expression profiling e de novo , più leggere profondità si tradurrà in un maggiore qualità del trascrittoma. Per un assembly ragionevolmente completo utilizzando tecnologia di sequenziamento Illumina, bp 100 100 milioni, fine accoppiato letture sarebbe un punto di partenza consigliato. Sequenza di RNA e preparazione di biblioteca di mRNA totale sono state effettuate da un centro di sequenziamento.
  2. Controllare la qualità di letture utilizzando Fast QC22.
  3. Combinare tutte le letture di campione e assemblare il trascrittoma de novo utilizzando Trinity23,24 (Trimmomatic qualità filtro abilitato).
  4. Perfezionare l'Assemblea
    1. Utilizzare Transdecoder25 per identificare open reading frame (ORF) che sono un minimo di 100 amminoacidi di lunghezza.
    2. Eseguire ricerche di omologia per ORFs tradotta contro Pfam26 e27 di UniProt database utilizzando BLASTP28 e HMMER29, rispettivamente.
    3. Rimuovere le trascrizioni batteriche (qualsiasi sequenza tradotta cui migliori esplosione ha colpito era di un gene batterico con un punteggio di bit di oltre 300 e un'identità di sequenza dell'amminoacido minimo del 50%).
    4. Comprimere qualsiasi ORFs completa, tradotta che sono almeno 99% identico a livello dell'aminoacido mediante CD-ha colpito30.
    5. Crollo ORFs rimanenti, incompleta che sono almeno 95% identici a livello nucleotidico usando CD-ha colpito30.
    6. Assegnare le sequenze nucleotidiche rimanenti con gli identificatori unici, specie-specifici (ad es., APHNE 0001).
  5. Valutare la completezza del gruppo raffinato, utilizzando BUSCO (http://busco.ezlab.org/) e il Arthropoda gene dataset31.
  6. Annotazione del trascrittoma
    1. In primo luogo, annotare il trascrittoma raffinato utilizzando HMMER contro il Pfam database26,29.
    2. In secondo luogo, annotare il trascrittoma utilizzando BLASTP contro il27,di database UniProt28.
    3. In terzo luogo, annotare il trascrittoma utilizzando BLASTP contro le sequenze di codificazione degli insetti selezionati con genomi pubblicati, con annotazioni.
    4. Ultima, annotare il trascrittoma utilizzando BLASTP contro solo il database della proteina di pisello dell'afide.
    5. Utilizzare Trinotate per generare le annotazioni GO da UniProt adesioni.
    6. Utilizzare Trinotate per organizzare tutti i risultati di annotazione in un database SQLite e generare un report di annotazione.
  7. Analisi di espressione differenziale
    Nota: Utilizzando il trascrittoma raffinato come riferimento, allineare e quantificare ogni libreria separatamente.
    1. Utilizzare Trimmomatic per qualità-filtro e tagliare il file lettura originale32.
      Nota: Se si esegue questo passaggio dopo un'Assemblea di Trinity, si può usare invece l'output di Trimmomatic da quel passo.
    2. Eseguire allineamenti locali per ciascun campione utilizzando Bowtie233.
    3. Estrarre la lettura conta da ciascun campione singolarmente utilizzando SAMtools34.
    4. Calcolare l'espressione differenziale tra campioni di interesse utilizzando DESeq2 con i parametri di default e un parametrico misura35.

7. qPCR verifica dei geni differenzialmente espressi

Nota: Se gli utenti sono interessati a geni differenzialmente espressi dai loro esperimenti RNAseq, il seguente protocollo può essere utilizzato per verificare i modelli di espressione differenziale.

  1. Generare i campioni di RNA come descritto sopra (passo 5).
  2. Quantificare le estrazioni RNA utilizzando uno spettrofotometro per controllare la qualità e ottenere la concentrazione.
  3. Sintetizzare i campioni di cDNA utilizzando un kit disponibile in commercio secondo la raccomandazione del produttore.
  4. Determinare le efficienze di primer per i geni di interesse per garantire accurata amplificazione di PCR di duplice.
    1. Basato sulle concentrazioni di RNA originale, eseguire diluizioni seriali (101) per ottenere 3 concentrazioni di cDNA.
    2. Utilizzando un mix di master di PCR quantitativo, mescolare reazioni qPCR triplice copia secondo il protocollo del produttore utilizzando tre concentrazioni di primer (ad es., 100 nM, 200 nM, 300 nM) con tre concentrazioni di cDNA diluito serialmente (ad es., 0,1 ng / µ l, 10 ng / µ l, 100 ng / µ l).
    3. Per ogni gene target, calcolare la pendenza (m) della linea creata utilizzando i valori medi dit C per ogni campione come variabili dipendenti e nel registro (concentrazione di cDNA) come variabili indipendenti (tre punti totali).
    4. Utilizzare la seguente equazione per calcolare l'efficienza di primer (E) dove m è la pendenza calcolata in 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      Nota: Primer efficienze tra 90-110% sono adatte per le analisi. Questo processo garantisce uguale amplificazione dei geni tutti inclusi nei calcoli.
  5. Utilizzare il metodo dit ΔΔC con un gene housekeeping per quantificare l'espressione differenziale di geni di interesse36.

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Representative Results

Colture della pianta: Semi prenderà circa due-quattro settimane, a seconda della stagione, per diventare grande abbastanza per essere ri-vaso (Figura 1A). Re-potted piantine porterà un altro due-quattro settimane per aumentare a una dimensione ottima per le culture di afide (Figura 1B).

Culture afide: Adulto a. nerii si distinguono per alcuni cauda scurita e possono essere trovare (attere, Figura 3A, B) o alato (alate, Figura 3C, D). Rilievi di ala in via di sviluppo diventano visibili quando ninfe raggiungono il terzo instar (Figura 3E, F). Colture di riserva sono meglio mantenuti trasferendo uno a tre Mid-instar e un adulto età trovare afidi; Questo assicura un sano, popolazione di età mista. Popolazioni ad essere utilizzato per gli esperimenti dovrebbero essere coltivate utilizzando trovare afidi come descritto sopra (2,4). Un a. nerii adulto può produrre prole di 3-10 al giorno, dipenda dalla pianta ospite e l' afide10anni.

Estrazioni di DNA e RNA: Singolo, adulti a. nerii produrrà circa 100 – 200 ng / µ l DNA (eluizione 80 µ l; Figura 4 A) e 150 – 300 ng / µ l RNA (eluizione 30 µ l; Figura 4 B). rappresentante del microsatellite picchi sono mostrati in Figura 5. Rappresentanza relativa espressione di un gene candidato tre condizioni (controllo, 1 trattamento, trattamento 2) sono calcolati nella tabella 2 e illustrato nella Figura 6.

Figure 1
Figura 1 : Piante rappresentative per le culture di afide. Piantine (A) possono essere re-potted dopo che essi hanno sviluppato il loro primo set completo di foglie vere. (B) piante possono essere utilizzati per le culture di afide quando hanno sviluppato 3-4 set di foglie vere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Esempi di strumenti utilizzati per la coltura di afidi. (A) bocca pipette possono essere creati utilizzando ID 3/16" x 1/4" OD tubazione di plastica, punta di una pipetta di 1.000 µ l e una punta di pipetta 200 µ l. (B, C) Utilizzare gabbie di Coppa (tazze di plastica trasparente con la parte superiore tagliata e protetto con maglia fine) per adattarsi in modo sicuro sopra la parte superiore di pentole di 4 pollici utilizzati per colture di afide. Questo permette di abbondante luce e ventilazione per creare un ambiente adatto per gli afidi e la pianta e mantiene gli afidi contenuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Rappresentanza adulto e ninfa Aphis nerii. (A, B) Atteri (trovare) adulto a. nerii sono identificati da cauda buia alla loro estremità posteriore. (C, D) Alate adulti (alati) sono identificati da ali completamente sviluppate e oscurati cauda alle loro posteriore. (E, F) In via di sviluppo a. nerii ninfe passano attraverso quattro fasi di instar e rilievi di ala in via di sviluppo diventano evidenti durante la terza tappa di instar. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Gel rappresentativo. (A), DNA estrazioni (1 kb ladder). Sette le estrazioni di a. nerii DNA sono visualizzate nelle corsie 3-9. Controllo negativo è nel vicolo 10. (B) RNA estrazioni. Undici le estrazioni di a. nerii RNA sono visualizzate nelle corsie 3-13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Rappresentante del microsatellite picchi. 6-FAM-etichetta picchi sono visualizzati in blu. Scaletta di LIZ-500 è indicato in arancione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : verifica di qPCR di un gene differenzialmente espresso. Espressione di quantità relativa (RQ) mRNA rappresentativa (calcolata utilizzando il metodo ΔΔCt, tabella 2) indicato per un gene candidato di interesse tre condizioni: controllo, trattamento 1, trattamento 2. Il grafico mostra diminuita espressione di gene candidato sotto trattamento 1 e 2 rispetto al controllo (tabella 2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome di primer Direzione Sequenza (5' - 3')
Ago24_F avanti TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R inversa GCCAAACTTTACACCCCGC
Fa 53_F avanti TGACGAACGTGGTTAGTCGT
Fa 53_R inversa GGCATAACGTCCTAGTCACA
Fa 59_F avanti GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
Fa 59_R inversa GTTACCCTCGACGATTGCGT
Fa 66_F avanti TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
Fa 66_R inversa GACTAGGGAGATGCCGGCGA
Fa 69_F avanti CGACTCAGCCCCGAGATTT
Fa 69_R inversa ATACAAGCAAACATAGACGGAA
Fa 84_F avanti GACAGTGGTGAGGTTTCAA
Fa 84_R inversa ACTGGCGTTACCTTGTCTA
Fa 89_F avanti GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
Fa 89_R inversa GACAGCGTAAACATCGCGGT
Fa 126_F avanti GGTACATTCGTGTCGATTT
Fa 126_R inversa TAAACGAAAAAACCACGTAC

Tabella 1: sequenze dell'iniettore del Microsatellite utilizzati per genotipo APHIS nerii 20 .

Destinazione Campione Media di CT CT STD. Dev ΔCt medio a ΔCt ΔΔCt RQ=2^(-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a 1.1 22,59 0
ef1a 1.2 20,31 0
ef1a 1.3 20,36 0.226
ef1a 1.4 20,27 0,036
ef1a 1.5 20,55 0,003
ef1a 1.6 20,52 0,245
ef1a 2.1 20,49 0,082
ef1a 2.2 19,86 0,033
ef1a 2.3 20,19 0,037
ef1a 2.4 19.67 0,058
ef1a 2.5 20,25 0,188
ef1a 2.6 18,16 0,089
ef1a 3.1 20,93 0,157
ef1a 3.2 20,22 0,003
ef1a 3.3 20,44 0,039
ef1a 3.4 20.91 0,559
ef1a 3.5 20,63 0,017
ef1a 3.6 20,3 0.135
gene di interesse 1.1 24,6 0,173 2.01 0 1
gene di interesse 1.2 24,25 0,019 3,94 2,975 0 1 0
gene di interesse 1.3 24,79 0,04 4,43 0 1
gene di interesse 1.4 25,23 0,285 4,96 4.695 0 1 0
gene di interesse 1.5 24,6 0,103 4,05 0 1
gene di interesse 1.6 25.08 0,033 4,56 4,305 0 1 0
gene di interesse 2.1 27,52 0.155 7,03 5.019033762 0.03084042
gene di interesse 2.2 27.23 0,061 7,37 7.2 3.428355679 0.092888533 0.031024057
gene di interesse 2.3 27,18 0,058 6.99 2.56158174 0.169389724
gene di interesse 2.4 27.45 0 7.78 7.385 2.820764967 0.141535419 0.013927153
gene di interesse 2.5 27.44 0,032 7.19 3.138956897 0.113521944
gene di interesse 2.6 28 0 9,84 8.515 5.284272079 0.025661119 0.043930413
gene di interesse 3.1 27.23 0,143 6.3 4.292437371 0.051032588
gene di interesse 3.2 27.05 0,088 6.83 6.565 2.891234282 0.134788164 0.041877788
gene di interesse 3.3 27.45 0,109 7,01 2.578145722 0.167456035
gene di interesse 3.4 27,58 0,019 6,67 6,84 1.709038085 0.305863936 0.069203951
gene di interesse 3.5 27.06 0,067 6,43 2.384498984 0.191511246
gene di interesse 3.6 27,36 0 7.06 6.745 2.513723938 0.175103043 0.008204101

Tabella 2: calcoli per qPCR ΔΔC t Verifica del gene candidato. Espressione del gene candidato è calcolata in base all'ef1a (Figura 6). Campioni: 1.1-1.6 rappresentano sei biologico replica nell'ambito del trattamento di controllo; campioni 2.1-2.6 rappresentano sei biologico replica sotto trattamento 1; campioni 3.1-3.6 rappresentano sei biologico replica sotto trattamento 2. Ct Std. Dev. viene calcolato da tre replicati tecnici.

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Discussion

Lungamente è stato riconosciuto che l'aposematico a. nerii può fornire le comprensioni i modelli e meccanismi di resistenza per le difese della pianta e sequestro in particolare chimica18,37. Un numero di risorse genomiche è recentemente emerse per a. nerii10, offrendo nuove opportunità per studi di genomica funzionale ed ecologici che utilizzano a. nerii come un modello. Delineiamo protocolli di base nella cultura dell'afide e pianta e le tecniche molecolari/genomica, con il presupposto che il lavoro futuro su questa specie probabilmente implicherà studi che utilizzano approcci ecologici genomici e funzionali. Molte questioni aperte rimangono circa i meccanismi e l'importanza della disintossicazione cardenolide e sequestro in a. nerii. Tecniche come RNAi per atterramento di espressione o gene editing approcci si riveleranno preziosi in questo senso.

Una delle sfide in coltura afidi è nelle loro capacità prodigiosa per la riproduzione e la dispersione. Questi tratti, che riguardano direttamente perché sono parassiti di coltura grave, significa che culture afide richiedono attenzione quasi quotidiana, come bene come estrema cura se linee isogeniche sono necessarie per gli esperimenti. Le tecniche descritte sopra, compresi quelli per la generazione di dati per l'analisi dell'espressione genica, mentre simile a protocolli generali per l'allevamento dell'afide e l'analisi molecolare, fornire una guida passo-passo specifica per generare sufficiente biologico materiale per a. nerii per una serie diversificata di applicazioni molecolari ed ecologiche.

A tal fine, se studi di genomica funzionali o ecologici sono all'orizzonte per a. nerii, questi dovranno essere accoppiato con live culture completamente capitalizzare sulle opportunità sperimentali che offrono. Degli insetti erbivori vivono in comunità complesse sulle loro piante ospite, e sia interazioni intraspecifica38,39 , nonché interazioni interspecifiche40 modellare la risposta finale di a. nerii alle loro piante ospiti . Le piante ospiti, a. nerii specializzati su, rappresentano un insieme diversificato di piante che esprimono la storia di vita divergenti strategie15,21, sottolineando l'importanza di approcci puramente genomici o fisiologici con di accoppiamento manipolazioni sperimentali che tengono conto di variazione naturale nelle comunità di a. nerii . I metodi descritti qui sono punti di partenza per una prospettiva genomica funzionale ed ecologica su a. nerii e delle sue interazioni con piante tossiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Michelle Moon (Vanderbilt University) per assistenza con la fotografia. Vanderbilt University fornito supporto per PA e SSLB è supportato da DGE-1445197.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

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Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

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