Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Biyolojik kültür ve gen ifadesinde ölçme Aphis neriiBakımı: bitki böcek etkileşimleri için bir sigara-model sistemi

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

Yaprak biti Aphis nerii son derece savundu bitkilerde dogbane aile (Apocyanaceae) üzerinde colonizes ve bitki böcek etkileşimleri eğitim için sayısız fırsat sağlar. Burada, kültür ve üretimi ve moleküler Analizi bir dizi protokol bitki ve yaprak biti bakımı için mevcut ve A. neriiiçin - omic veri.

Abstract

Yaprak biti biyolojik soru onların ana tesisleri ile böceğin etkileşimleri çevreleyen sorulara symbioses evrimi ve polyphenisms gelişimi arasında değişen çeşitli için mükemmel deneysel modellerdir. Genomik kaynaklar birkaç yaprak biti türler için kullanılabilir ve yeni nesil nasıl yapılacağını gelişmeler ile transcriptomic çalışmalar genleri eksikliği olmayan model organizmalar için genişletilmiş. Ayrıca, yaprak biti kültür alanında toplanan ve kullanılmak üzere ekolojik ve genetik çalışmalar arasında köprü organizmalar ve moleküler deneyler laboratuvarda yetiştirilen. Son olarak, pek çok yaprak biti onların tercih edilen ana bitkiler üzerinde laboratuvarda sürekli, parthenogenic genotip eşeysiz üreyen karşılaştırmaların yapılmasına olanak ömürleri içinde muhafaza edilebilir. Aphis nerii, süt kardeş-zakkum yaprak biti, böyle bir model organizma ve moleküler deneyler kullanarak zehirli bitkiler ile böcek etkileşimleri çalışmaya sağlar. Yöntemleri üretimi ve sera ve laboratuvar, DNA ve RNA çekimi, microsatellite analiz, de novo transcriptome montaj ve ek açıklama, transcriptome fark ifade bitki ve yaprak biti kültürler için analiz ve qPCR doğrulama differentially ifade genlerin özetlenen ve burada tartışılan.

Introduction

Yaprak biti dünya çapında çeşitli bitki aileler kolonize küçük, hemimetabolous böcekler var. Özellikle onların karmaşık döngüsel eşeysiz üreme ve ayrı polyphenisms ve onların zorunlu beslenme symbioses eksik besin kaynağı bakteriyel veya Maya endosymbionts ile ilgili ömürleri en çeşitli özellikler için kendine özgü onların yiyecek bitki sap1. Çoğu yaprak biti ana bitki uzmanları olmakla birlikte, bazı kültürlü türler önemli ürün zararlıları inflicting önemli ekonomik zarar bitkileri de bir doğrudan, ya da patojenler ve virüs yolu ile2vektör. Böceğin ilgili adresleme sorular için genomik kaynakları sağlanan çünkü ilk yaprak biti genom bezelye yaprak biti Acyrthosiphon pisum3, 2010, yılında yayınlanması yaprak biti biyoloji çalışma önemli bir kilometre taşı olarak işaretlenmiş uyarlamalar otçul tarzları bir daha iyi kontrol stratejileri4' e neden olabilir de dahil olmak üzere için. O zamandan beri ek genomik kaynaklar yayın halka açık tüm genom kaynak için başka bir üç yaprak biti türler (Myzus ve soya yaprak biti Aphis glycines5için bir ek açıklama eklenen genom birikmiş var Cerasi (siyah kiraz yaprak biti), Myzus persicae (şeftali-patates yaprak biti), Rhopalosiphum PADI (kuş kiraz-yulaf yaprak biti)6. Değerli de novo transcriptomic kaynakları birkaç diğer yaprak biti türler için de mevcuttur (e.g.,Aphis gossypii (pamuk yaprak biti)7, Sitobion avenae (tahıl yaprak biti)8, Cinara pinitabulaeformis (çam yaprak biti)9, Aphis nerii (süt kardeş-zakkum yaprak biti)10).

Yaprak biti da bitkiler11tarihinde bitki böcek etkileşimleri ve hayatı ekolojisi anlayışımız kalıcı katkılarda yaptık. Bir alan nerede yaprak biti özellikle önemli katkılar yapmış anlayışımız ana bitki etkileşimleri Kimya ekolojisi olduğunu. Üstesinden bitki savunma ve bazı bile bitki savunma kendi için Co-e yeğlemek için otçul böceklerin ifade çeşitli uyarlamalar12,13,14yarar. Örneğin, süt kardeş-zakkum yaprak biti, Aphis nerii, bu süt kardeş Aile (Apocynaceae) bitkiler üzerinde colonizes ılıman ve tropikal bölgeler içinde dünya çapında bulundu bir parlak sarı, invaziv yaprak biti olur. Apocynaceae ailesindeki santralleri sütlü lateks ve kardiyak glikosidler katyon taşıyıcı Na, K-ATPaz bağlamak ve etkili caydırmak için kültürlü otobur15, cardenolides bilinen dahil olmak üzere çeşitli kimyasal savunma geliştiğini 16. süt kardeş uzmanları cardenolides direnç çeşitli modları hızlı ve bazı seçerek veya pasif birikir veya değiştirmek onların dokularda cardenolides avlanma caydırmak için bir araç olarak veya diğer yararları17. Her ne kadar işlevsel faydaları ve mekanizmaları belirsiz10,18kalır A. nerii cardenolides bu şekilde çekilmek düşünülmektedir.

Genomik kaynakları el altında göz önüne alındığında, A. nerii mükemmel deneysel modeli moleküler ve genetik mekanizmaları toksik ana bitkiler ve onların uzman arasında kemoterapi ekolojik etkileşimleri dahil incelenmesi için otobur sağlar. Cardenolides19, tutma o zamandan beri üzerinde duruldu A. nerii en erken çalışmaların bazıları ise A. nerii çalışmaların geniş bir dizi evrimsel ve ekolojik soru anlayışlar hazırladık, fazlalaştı, invaziv böcekler20 ve otobur yoğunluğu21alttan üste ve üstten alta regülasyonu arasındaki etkileşimi genetik yapısı dahil olmak üzere. A. nerii böylece böcek-bitki etkileşimleri çalışmaların özellikle geniş bir dizi için deneysel bir model olarak iyi bir aday var. A. nerii ile herhangi bir çalışma başarısı için yaprak biti dikkatli kültürü kültür yaprak biti bağlı hangi bitkilerin içeren nüfus, hem de yüksek kalite - omic verileri verimli bir nesil çok önemlidir. Amacımız okuyucu iki rehber olmaktır. Aşağıda özetlenen üretimi ve sera ve laboratuvar, DNA ve RNA çekimi, microsatellite analiz, de novo transcriptome montaj ve ek açıklama, transcriptome bitki ve yaprak biti kültürler için yöntem vardır fark ifade analizi ve qPCR doğrulanması differentially genler dile getirdi. Süre bu yöntemler yazılı A. nerii, genel kültür, ayıklama için ve analiz yöntemleri yaprak biti türlerin çeşitli için genişletebilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bitki kültürü

  1. Tohum ticari herhangi bir satıcıdan satın almanız veya alanında olgun bitkilerden toplamak.
    Not: Bu protokolü çoğu piyasada bulunan süt kardeş türler (Örneğin, Asclepias incarnata, A. syriaca, A. curassavica, Gomphocarpus physocarpus) için uygundur. Bazı tohum soğuk tabakalı olması gerekebilir ve tohum tedarikçiden talimatları kontrol edilmelidir.
  2. İyi bir germinating toprak içinde (% 60-70 iyi torf yosun, perlit, vermikülit, kireçtaşı) bitki tohumları.
    1. Standart fide tepsisi ile çimlenme mix toprak doldurmak; toprak kuyuları üst ulaşır sağlanması. Her şey, toprak hakkında 3 cm derin bir delik oluşturmak için bir girinti olun.
    2. Öyle ki toprak tohum kapsar ve doymuş bir tohum her delik ve su ile sulama olabilir çok iyi yerleştirin.
    3. Bir sera içinde tohumları büyümeye (aşağıda, 1.5 koşullara bakınız). Düzenli olarak her gün her diğer-gün için su; makul ses seviyelerinde için toprak nemi korumak için yeterli.
  3. Ne zaman fide onların ilk koymak-in tam yapraklar büyüdü, bir genel çömlekçilik içinde yeniden pot fidan (50-%60 torf yosun, ağaç kabuğu ve kireç taşı) mix (Şekil 1A).
    1. Kupası kafesleri ile sıkı bir mühür ile uygun 4-inç yuvarlak tencere kullanın. Jant altında yaklaşık 5 cm kadar genel Çömlekçilik toprak ile doldurun.
    2. Toprak derin bir delik oluşturmak potun alt ulaşmak yeterli.
    3. El ile yavaşça onun kuyudan olgun fide kepçe ve yerleştirin delik 4 inç tencerede içten içe. Fide toprak ile kapak. Su çok iyi.
    4. Bitkiler sera ve su düzenli olarak her gün için her geçen gün büyümek; Orta toprak nemi korumak için yeterli.
  4. Sera koşulları.
    1. 18-28 ° C ve üreticinin yönergelerini kullanarak 16-22 ° C arasında gece sıcaklıklar arasında gündüz sıcaklığı korumak için sera termostatlar ayarlayın.
    2. Ne zaman gün kısadır kış aylarında gün ışığı 600 W yüksek basınçlı sodyum ampuller (12 h, 8 am – 20: 00) ile ek.
  5. İstenmeyen zararlıları (Örneğin, thrips, yaprak bitleri) yaprak organik sabun çözüm ile ancak kontrol, bu ürünleri kullanırken dikkatli olun.
    1. Sabun çözüm üreticinin tavsiye göre yapmak ve püskürtülen ilaç şişe kullanarak uygulayın.
    2. Sabun bitkiler üzerinde 4-24 h. yavaşça durulama için sabun 4-24 h sonrası uygulama kaldırmak ve onlarla durulama su ile bitkiler su laboratuvar yaprak biti kültürlerle kullanmadan ikinci bir saat önce bırakın.
  6. Kültür en az 3-4 setleri tam yaprak büyüdü ve en az 10 cm boyunda (Şekil 1B) bitkiler üzerinde ortalama yaprak biti nüfus.

2. yaprak biti kültürler

  1. Laboratuvar yaprak biti nüfus varolan bir laboratuar isoclonal popülasyon başlatın veya aşağıdaki yönergeleri takip alan toplanan yaprak biti--dan başlamak.
    1. Bir laboratuvar nüfus varolan bir laboratuar isoclonal nüfus başlatırken, yaprak bitleri 2.3.1–2.3.3 içinde açıklandığı gibi aktarın.
  2. Ne zaman yeni isoclonal, alanda toplanan yaprak biti nüfus başlayarak ve bir tek, üreyen, Yetişkin yaprak biti adım 1,6 olarak belirtildiği gibi uygun ana bitki yerleştirin.
    Not: Nüfus Başlatan üzerinden (gece) kanatlı veya unwinged (apterous) Yetişkin.
    1. El ile istenmeyen zararlıları önce laboratuvar yaprak bitleri ile kullanmak için sera bitkilerden inceleyin. Herhangi bir bitki istenmeyen yaprak bitleri ile dondur. İsterseniz, bir etanol vakum flask thrips veya diğer zararlıları kaldırmak için kullanın.
      Not: tedavi edilmiştir bitkiler 1.5.2 adımda anlatıldığı gibi kullanmadan önce sabun ile yıkayın emin olun.
    2. Bir tek yetişkin yaprak biti bir fırça veya kimliği 3/16" x 1/4" OD plastik boru, 1.000 µL pipet ucu ve 2,00 µL pipet ucu (Şekil 2A) ile oluşturulan bir ağız pipet kullanarak güvenli biçimde aktarma.
    3. Güvenli bir şekilde bitki yaprak bitleri ile ben, cut off top ile plastik bir kap ile oluşturulan bir fincan kafes iyi bir mesh ile kaplı ve bant ile (Şekil 2B) güvenli kapak.
    4. Bitkilerin yaprak biti kaynayan bir tepsisine yerleştirin ve kontrollü bir çevre odası (16 L: 8D, 22 ° C, % 70 nem) tutun.
  3. Hisse senedi nüfusu korumak için taze, yeni bitkiler için haftalık (2.2.1–2.2.3) yaprak bitleri aktarın.
    1. 1-3 2nd güvenli biçimde aktarma veya 3rd biçim perileri ve ağzını pipet (Şekil 2A, 3) kullanarak 1 Yetişkin yaşlı yaprak biti.
      Not: Hisse senetleri unwinged bireyler aktararak en iyi korunur.
    2. Güvenli bir şekilde yaprak biti musallat bitkiler, cut off top ile plastik bir kap ile oluşturulan bir fincan kafes iyi bir mesh ile kaplı ve bant ile güvenli kapak.
    3. Bitkiler bir tepsisine yerleştirin ve bir çevre odası (16 L: 8D, 22 ° C, % 70 nem) yaprak bitleri tutun.
    4. Alternatif olarak, istenen ve ana bitki iyi kalitesi ise, yalnızca bir üreyen yetişkin bırakarak nüfus azaltmak için bir etanol vakum flask kullanıyorsanız ve 2-3 2 veya 3 perileri biçim.
  4. Kullanımı için aynı yaş nüfus deneylerde oluşturmak için yeni bir ana bitki üzerine hisse senedi popülasyondan en fazla 5 Yetişkin (tercihen unwinged) yerleştirin.
    1. Yetişkin 24 saat sonra kaldırın.
    2. F1 çoluk çocuk yetişkinlik için olgunlaştı bir kez yaklaşık 5-7 gün sonra yeni bir ana bitki üzerinde 5 unwinged F1 yetişkin yer. Yetişkin 24 saat sonra kaldırın.
    3. Bir kez F2 nüfus yetişkinliğe olgunlaştı, bu nüfus deneylerde kullanılmak üzere hazırdır.
      Not: Bu işlem deneysel Nüfus kabaca aynı yaş ve kabaca aynı yaş anneleri doğarlar sağlanır.
  5. Microsatellite Genotipleme (Bölüm 3 & 4 aşağıda açıklanmıştır) kullanarak alan yakaladı isoclonal satırları arasında genotypic farklar onaylayın.

3. DNA ekstraksiyon

  1. Hazırlık
    1. 1 L lizis arabellek (0.1 M NaCl, 0.2 M sukroz, 0.1 M Tris (pH 9.1), 0,05 M EDTA, % 0.05 SDS) hazırlamak için steril tekniklerini kullanın.
    2. Isıtma blok sıcak veya su banyosu ile 65 ° c
  2. Doku homojenizasyon ve lizis
    1. Yaprak biti alt kısmındaki bir steril, 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin.
    2. Yaprak biti ile tüp steril havaneli yerleştirin ve sıvı azot tüpü dibine sokmak.
      Not: yaprak biti havaneli ve tüp tarafı arasında konumlandırıldığında en uygun doku parçalanma sonucu elde edilir.
    3. Yaprak biti başlangıçta hücreleri parçalayıcı için havaneli ile eziyet.
    4. Bir tek yetişkin yaprak biti için 200 µL lizis arabelleği (2 x 100 µL aliquots split) kullanın. Eziyet ve örnek gözle görülür dağıldı kadar ezilmiş yaprak biti resuspend ilk aliquot ekleyin, sonra ikinci aliquot havaneli yıkamak için kullanın.
    5. Ezilmiş yaprak biti 30 dk su banyosu veya sıcak bir blok içinde 65 ° C'de lizis arabellekte kuluçkaya.
  3. DNA yağış
    1. Tüp sıcakken 8 M KOAc 14 µL ekleyin. Karıştırmak için tüp tersine çevirin. Örnek buz 30 dk için mağaza.
      Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.
    2. 13.000 x g 15 dakika oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi. Süpernatant yeni 1,5 mL tüp bir pipet ile aktarın. Herhangi bir pelleted enkaz kaldırmak değil dikkatli olun.
    3. DNA Pelet görselleştirme geliştirmek 2 µL glikojen (20 µg/mL) süpernatant için ekleyin. Örnek boyutu yeterince büyük ise, bu adımı atlayın.
    4. Soğuk % 100 moleküler düzeyde etanol 200 µL süpernatant için ekleyin. Mix ve en az 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya tüpler tersine çevirin.
      Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.
    5. 13.000 x g 15 dakika oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi. Etanol pipetting tarafından kaldırın.
  4. DNA yıkama ve elüsyon
    1. Soğuk % 70 moleküler düzeyde etanol 200 µL ekleyin. Sonra resuspend ve Pelet yıkamak için tüp hafifçe vur.
    2. 5 min için 13.000 x g , santrifüj. Pelet görüntülenmesi, süre dikkatle etanol pipetting tarafından kaldırın ve soğuk % 100 moleküler düzeyde etanol 200 µL ekleyin.
    3. 5 min için 13.000 x g , santrifüj. Pelet görüntülenmesi sırasında dikkatli bir şekilde etanol pipetting tarafından çıkarın.
      Not: Tekrar 100-70-100 etanol yıkama gerekirse.
    4. Hava Kuru granül için 5-10 dk boru döşeme ile doku kağıt üzerinde yatay olarak açık.
    5. DNA Pelet düşük TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA) 80 µL içinde resuspend.
    6. Bir spektrofotometre kullanarak resuspended DNA ölçmek.
    7. 4 ° C'de mağaza

4. Microsatellite PCR ve sıralamanın yaprak biti Genotipleme için

  1. Microsatellite (Tablo 120) sıralama için uygun F ve R astar sipariş.
    Not: Geriye doğru astar dizileri microsatellite sıralama için çoğaltılmış örnekler için izin vermek için 5'-6-FAM veya 5'-5-HEX floresan etiketleri ile değiştirilmesi gerekir.
  2. PCR tek yaprak biti DNA örnekleri (Bölüm 3'te açıklanan) ve fluorescently etiketli microsatellite astar ile gerçekleştirin.
    1. PCR reaksiyonları üreticinin iletişim kuralı (0.2 µM F/R astar, 2.5 mM MgCl2, 50-200 ng DNA şablon) göre karıştırın.
    2. Aşağıdaki thermocycler ayarları kullanın: ilk denatürasyon 4 dk, 94 ° C'de 35 94 ° C devredir 30 s, 58 ° C için 35 s, 72 ° C 45 için s ve bir final uzama adım 10 dk 72 ° C'de.
  3. PCR örnekleri sıralı örneklerin sayısını azaltmak ve genotipleme tesisinde microsatellite örnekleri sıra farklı floresan etiketlerle birleştirmek.
  4. Microsatellite analiz yazılımı kullanarak .fsa ham örnek dosyaları analiz.

5. RNA çıkarma

  1. Yaprak bitleri örnekleri 1,5 ml RNase RNA çıkarılması için toplamak / DNaz ücretsiz tüpler ve sıvı azot hemen donma.
    Not: aşağıdaki adımları hemen gerçekleştirilmez, örnekleri-80 ° C'de saklanabilir
  2. Doku homojenizasyon
    1. Yaprak biti ile tüp steril havaneli ile sıvı azot örnek dur cızırtılı kadar 10-15 saniye, dondur. Yaprak biti de havaneli ile 3.2 adımda anlatıldığı gibi ezmek.
      Not: yaprak biti havaneli ve tüp tarafı arasında konumlandırıldığında en uygun doku parçalanma sonucu elde edilir.
    2. Duman başlık, guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform ayıklama reaktif 800 µL örnek (1 – 5 Yetişkin yaprak biti) ekleyin. Örnekleri havaneli ve havaneli atmayın lunaparkçı.
  3. Faz ayrımı
    Not: Tüm adımları bir duman mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
    1. Homojenize örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Kloroform 160 µL örneğine ekleyin. Shake şiddetle elle 15 s.
    2. Oda sıcaklığında 2-3 dakika için kuluçkaya. Santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika
      Not: Santrifüjü, karışım ayıran 3 katmanlara: alt, kırmızı fenol kloroform faz, bir interfaz ve renksiz bir üst sulu faz. RNA sulu aşamasında sadece kalır. Sulu hacmi ~ 480 µL olacak.
  4. RNA yağış
    1. Bir duman başlık, sulu faz için taze, RNase free tube aktarın. Ara faz rahatsız etmeyin.
    2. RNA isopropanol 400 µL ekleyerek çökelti ve örnek-20 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya.
      Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.
    3. Örnek için 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
  5. RNA yıkama ve elüsyon
    1. Süpernatant kaldır; RNA Pelet gözlemek.
    2. RNA pelet 1 mL % 75 etanol DEPC tedavi su ile yıkayın. Tarafından yavaş vortexing karıştırın. Santrifüj 7,500 x g 4 ° C'de, 5 min için
    3. Adımları 5.5.1–5.5.2 fenol kirletici kaldırmak için yineleyin.
    4. Süpernatant kaldırmak ve hava kuru Pelet 5-10 dk boru döşeme ile steril bir bankta yatay olarak açık. Tamamen kurumasını RNA Pelet izin vermeyin.
    5. RNA Pelet 30 µL RNase free veya DEPC tedavi su içinde çözülür. Yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için pipet. 55-60 ° C'de 10-15 dk için kuluçkaya.

6. RNAseq De Novo Transcriptome derleme, ek açıklama ve fark ifade Analizi

  1. RNA örnek konsantrasyon ve Kapiler elektroforetik sistem çip tabanlı kullanarak kalitesini analiz.
    Not: Tercih yönteminin seçimi RNA konsantrasyon ve kalite daha doğru ve hassas bir ölçüsü sağlar çünkü bir Spektrofotometre ile analiz daha bir kapiler Elektroforez çip tabanlı sistemdir.
    1. Uygun kalitesini (≥ 250 ng, toplam RIN (RNA bütünlük numarası) ≥ 5) olduğu, RNA sıralama gerçekleştirin.
      Not: Bu sıralama veri-ecek var olmak kullanılmış her iki ifade profil oluşturma ve de novo transcriptome derlemesi için çünkü önemlisi, derinlik içinde daha yüksek bir kalite transcriptome neden olur devamı. Illumina sıralaması teknolojisiyle, 100-200 milyon 100 bp, oldukça kapsamlı bir derleme için eşleştirilmiş son okuma önerilen bir başlangıç noktası olur. Toplam mRNA Kütüphane hazırlık ve RNA sıralama sıralama aracı tarafından yapıldı.
  2. Hızlı QC22kullanarak okuma kalitesini kontrol edin.
  3. Tüm örnek okuma birleştirmek ve Trinity23,24 (Trimmomatic kalitesi etkin filtreleme) kullanarak transcriptome de novo araya.
  4. Derleme rafine
    1. Transdecoder25 en az 100 amino asit uzunluğunda açık okuma çerçevesi (ORFs) tanımlamak için kullanın.
    2. Pfam26 ve BLASTP28 ve HMMER29, sırasıyla kullanarak UniProt27 veritabanları karşı çevrilen ORFs arar Homoloji gerçekleştirin.
    3. Bakteriyel transkript (bakteriyel bir gen 300'ün üzerinde bir bit puan ve en az amino asit dizisi kimlik % 50 ile çevrilmiş herhangi bir sıra olan en iyi patlama vurmak oldu) kaldırın.
    4. En az % 99 özdeş, CD-HIT30kullanılarak amino asit düzeyinde olan eksiksiz, tercüme ORFs daraltın.
    5. En az % 95 aynı CD-HIT30kullanarak nükleotit düzeyinde kalan, eksik ORFs daraltın.
    6. Kalan nükleotit dizileri ile benzersiz, species-specific tanımlayıcıları (Örneğin, APHNE 0001) atayın.
  5. BUSCO (http://busco.ezlab.org/) ve Arthropoda gen veri kümesi31kullanarak rafine derleme completeness değerlendirmek.
  6. Transcriptome ek açıklama
    1. İlk olarak, HMMER karşı Pfam veritabanı26,29kullanarak rafine transcriptome açıklama ekleyin.
    2. İkinci olarak, BLASTP karşı UniProt veritabanı27,28kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.
    3. Üçüncü olarak, seçili böcekler yayımlanmış, ek açıklama eklenen genleri ile kodlama dizisi karşı BLASTP kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.
    4. Son, bezelye yaprak biti protein yalnızca veritabanı karşı BLASTP kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.
    5. Trinotate UniProt katılımların git ek açıklamaları oluşturmak için kullanın.
    6. SQLite veritabanına tüm ek açıklama sonuçlarını düzenlemek ve bir ek açıklama raporu oluşturmak için Trinotate kullanın.
  7. Fark ifade Analizi
    Not: rafine transcriptome referans olarak kullanarak, hizalama ve ayrı ayrı her kitaplık ölçmek.
    1. Kullanım Trimmomatic kalite-filtre ve trim için orijinal dosyalar32okuyun.
      Not: Trinity derleme sonra bu adımı gerçekleştirmek gerekiyorsa, bir o adımı Trimmomatic çıktısı kullanın.
    2. Yerel hizalamaları Bowtie233kullanarak her örnek için gerçekleştirin.
    3. Okuma sayıları kullanarak tek tek SAMtools34her örnekten ayıklayın.
    4. Örnek ilgi DESeq2 varsayılan parametreleriyle kullanma arasındaki fark ifade hesaplamak ve parametrik bir35uygun.

7. qPCR doğrulama Differentially ifade gen

Not: kullanıcılar kendi RNAseq deneyler differentially ifade genler ilgileniyorsanız aşağıdaki protokol desenleri farklı ifade doğrulamak için kullanılabilir.

  1. RNA örnekleri (5 adım) açıklandığı gibi oluşturun.
  2. RNA çekimi için kalite kontrol ve konsantrasyonu elde etmek için bir spektrofotometre kullanarak quantitate.
  3. Üreticinin tavsiye başı olarak piyasada bulunan bir seti kullanarak cDNA örnekleri sentez.
  4. Genler doğru iki kat PCR güçlendirme sağlamak ilgi için astar verimliliği belirlemek.
    1. Özgün RNA konsantrasyonları üzerinde bağlı olarak, seri dilutions gerçekleştirmek (101) 3 cDNA konsantrasyonları elde etmek için.
    2. Kantitatif PCR ana karışımını kullanarak, mix onaylatılacak qPCR tepkiler göre üç astar konsantrasyonları üreticinin iletişim kuralı'nı (Örneğin, 100 nM, 200 nM, 300 nM) ile üç seri olarak seyreltilmiş cDNA konsantrasyonları (Örneğin, 0.1 ng/µL, 10 NG/µL, 100 ng/µL).
    3. Her hedef gen için Ortalama Ct değerlerini her örnek için bağımlı değişkenler ve günlük (cDNA konsantrasyon) bağımsız değişkenler (üç puan toplam) olarak kullanılarak oluşturulan çizgisinin eğimini (m) hesaplar.
    4. Burada m 7.4.3 içinde hesaplanan yamaç ise astar verimliliği (E) hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
      E 10^(-1/m) =
      Not: Astar verimliliği % 90-110 arasında analizleri için uygundur. Bu işlem tüm genler hesaplamalara dahil eşit amplifikasyon sağlar.
  5. Faiz36genler için ifade fark ölçmek için bir temizlik gen ile ΔΔCt yöntemini kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bitki kültürler: Tohum mevsime bağlı olarak yaklaşık 2-4 hafta sürer, büyük büyümeye olacak kadar (Şekil 1A) yeniden saksı. Yeniden saksı fidan yaprak biti kültürler (Şekil 1B) için en uygun bir boyuta büyümek için başka bir 2-4 hafta sürer.

Yaprak biti kültürler: Yetişkin A. nerii tarafından karanlık bazı Kauda ayırt edilirler ve unwinged olabilir (apterous, Şekil 3A, B) veya kanatlı (gece, Şekil 3C, D). Perileri (Şekil 3E, F) üçüncü INSTAR ulaştığınızda gelişmekte olan kanat yastıkları görünür hale gelir. Hisse senedi kültürler en iyi bir-üç orta biçim ve bir yetişkin yaşlı unwinged yaprak biti aktararak korunur; Bu sağlıklı bir yaş nüfusu karışık sağlar. Deneylerde kullanılmak üzere nüfus unwinged yaprak biti (2.4) açıklandığı gibi kullanarak kültürlü. Bir A. nerii yetişkin günlük, bağımlı ana bitki ve yaprak biti10yaş 3-10 yavru üretebilir.

DNA ve RNA çekimi: Tek, Yetişkin A. nerii yaklaşık 100-200 ng/µL DNA (80 µL elüsyon; boyun eğer. Şekil 4 A) ve 150 – 300 ng/µL RNA (30 µL elüsyon; Şekil 4 B). temsilcisi microsatellite doruklarına Şekil 5' te gösterilmektedir. Üç koşul (kontrol, tedavi 1, tedavi 2) altında bir aday gen temsilcisi göreli ifade Tablo 2 ' de hesaplanan ve Şekil 6' da gösterilen.

Figure 1
Resim 1 : Yaprak biti kültürler için temsilcisi bitkiler. (A)fidan-ebilmek var olmak yeniden saksı sonra onlar gerçek yaprakları onların ilk tam set geliştirdik. (B) bitkilerin yaprak biti kültürler olmadığında, 3-4 setleri gerçek yaprakların geliştirdik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Yaprak biti kültürü için kullanılan araçlara örnek olarak. (A)ağız pipetler kimliği 3/16" x 1/4" OD plastik boru, 1.000 µL pipet ucu ve 200 µL pipet ucu kullanarak oluşturulabilir. (B, C) Kupası kafesleri (kesilmiş ve ince mesh ile güvenli top ile şeffaf plastik bardak) kullanmak 4 inç tencere yaprak biti kültürler için kullanılan üst üzerinde güvenli bir şekilde uyacak. Bu yaprak bitleri ve bitki için uygun bir ortam oluşturmak için yeterli ışık ve havalandırma için sağlar ve yer alan yaprak biti tutar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Temsilcisi yetişkin ve su perisi Aphis nerii. (A, B) Apterous (unwinged) Yetişkin A. nerii onların arka sonunda karanlık Kauda tarafından tanımlanır. (C, D) Gece (kanatlı) Yetişkin tam gelişmiş kanatları tarafından tanımlanır ve karanlık Kauda, onların arka. (E, F) Gelişmekte olan A. nerii perileri dört biçim aşamalardan gidin ve gelişmekte olan kanat yastıkları üçüncü INSTAR aşamasında belirgin hale. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Temsilcisi jelleri. (A) DNA çekimi (1 kb merdiven). Yedi A. nerii DNA çekimi yolları 3-9 görüntülenir. Lane 10 negatif denetimidir. (B) RNA çekimi. Onbir A. nerii RNA çekimi yolları 3-13 görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Temsilcisi microsatellite doruklarına. 6-FAM-öğesini doruklarına mavi renkte görüntülenir. LIZ-500 merdiven turuncu renkte gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : qPCR doğrulama differentially ifade bir genin. ( Tablo 2ΔΔCt yöntemini kullanarak hesaplanan) temsilcisi mRNA göreli miktarı (RQ) ifade için bir aday gen üç koşul altında ilgi gösterilen: kontrol, tedavi 1, tedavi 2. Grafik aday gen tedavileri 1 ve 2 (Tablo 2) denetimine göre altında azalan ifade gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Astar adı Yön Sıra (5' - 3')
Ago24_F ileri TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R geriye doğru GCCAAACTTTACACCCCGC
Önce 53_F ileri TGACGAACGTGGTTAGTCGT
Önce 53_R geriye doğru GGCATAACGTCCTAGTCACA
Önce 59_F ileri GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
Önce 59_R geriye doğru GTTACCCTCGACGATTGCGT
Önce 66_F ileri TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
Önce 66_R geriye doğru GACTAGGGAGATGCCGGCGA
Önce 69_F ileri CGACTCAGCCCCGAGATTT
Önce 69_R geriye doğru ATACAAGCAAACATAGACGGAA
Önce 84_F ileri GACAGTGGTGAGGTTTCAA
Önce 84_R geriye doğru ACTGGCGTTACCTTGTCTA
Önce 89_F ileri GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
Önce 89_R geriye doğru GACAGCGTAAACATCGCGGT
Önce 126_F ileri GGTACATTCGTGTCGATTT
Önce 126_R geriye doğru TAAACGAAAAAACCACGTAC

Tablo 1: Microsatellite astar dizileri genotip için kullanılan Aphis nerii 20 .

Hedef Örnek CT demek CT Std. Dev ΔCt Ortalama ΔCt ΔΔCt RQ=2^(-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a 1.1 22.59 0
ef1a 1.2 20.31 0
ef1a 1.3 20.36 0.226
ef1a 1.4 20.27 0.036
ef1a 1.5 20.55 0,003
ef1a 1.6 20,52 0.245
ef1a 2.1 20.49 0.082
ef1a 2.2 19.86 0.033
ef1a 2.3 20.19 0.037
ef1a 2.4 19.67 0.058
ef1a 2.5 20,25 0.188
ef1a 2.6 18,16 0.089
ef1a 3.1 20.93 0.157
ef1a 3.2 20.22 0,003
ef1a 3.3 20.44 0.039
ef1a 3.4 20.91 0.559
ef1a 3.5 20,63 0.017
ef1a 3.6 20,3 0,135
gen ilgi 1.1 24,6 0,173 2,01 0 1
gen ilgi 1.2 24.25 0.019 3,94 2.975 0 1 0
gen ilgi 1.3 24.79 0,04 4,43 0 1
gen ilgi 1.4 25.23 0,285 4,96 4.695 0 1 0
gen ilgi 1.5 24,6 0.103 4.05 0 1
gen ilgi 1.6 25.08 0.033 4,56 4.305 0 1 0
gen ilgi 2.1 27.52 0.155 7,03 5.019033762 0.03084042
gen ilgi 2.2 27.23 0,061 7,37 7.2 3.428355679 0.092888533 0.031024057
gen ilgi 2.3 27.18 0.058 6,99 2.56158174 0.169389724
gen ilgi 2.4 27.45 0 7.78 7.385 2.820764967 0.141535419 0.013927153
gen ilgi 2.5 27.44 0.032 7.19 3.138956897 0.113521944
gen ilgi 2.6 28 0 9,84 8.515 5.284272079 0.025661119 0.043930413
gen ilgi 3.1 27.23 0.143 6.3 4.292437371 0.051032588
gen ilgi 3.2 27.05 0.088 6.83 6.565 2.891234282 0.134788164 0.041877788
gen ilgi 3.3 27.45 0.109 7,01 2.578145722 0.167456035
gen ilgi 3.4 27.58 0.019 6,67 6.84 1.709038085 0.305863936 0.069203951
gen ilgi 3.5 27,06 0.067 6,43 2.384498984 0.191511246
gen ilgi 3.6 27.36 0 7.06 6.745 2.513723938 0.175103043 0.008204101

Tablo 2: hesaplamalar için qPCR ΔΔC t aday gen doğrulanması. Aday gen ekspresyonu ef1a göre hesaplanır (Şekil 6). 1.1-1.6 temsil altı biyolojik kontrol tedavi altında çoğaltır örnekleri; 2.1-2,6 temsil altı biyolojik tedavi 1 altında çoğaltır örnekleri; 3.1-3.6 temsil altı biyolojik tedavi 2 altında çoğaltır örnekler. Ct Std. Dev. üç teknik çoğaltır hesaplanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu uzun aposematic A. nerii desen ve bitki savunma ve özellikle kimyasal haciz18,37direnç mekanizmaları sağlayabilir tanınmış oldu. Genomik kaynak A. nerii10 A. nerii bir model olarak kullanmak ekolojik ve fonksiyonel genomik çalışmalar için yeni fırsatlar sunan, son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Yaprak biti ve bitki kültürü ve bu türler üzerinde yapılacak çalışmalar muhtemelen genomik ve fonksiyonel ekolojik yaklaşımlar kullanmak çalışmalar içerecektir varsayımı ile moleküler/genomik teknikleri temel iletişim kuralları özetlemektedir. Mekanizmaları ve cardenolide detoksifikasyon ve A. neriihaciz önemi hakkında birçok açık sorular kalır. RNAi gibi teknikleri ifade nakavt veya gen yaklaşımlar düzenleme için bu konuda değerli ispat edecektir.

Yaprak biti kültür zorluklar içinde üreme ve yayılma için müthiş onların kapasite biridir. Doğrudan ilgili ciddi ürün zararlıları, yaprak biti kültürler olarak neredeyse her gün dikkat gerektiren anlamına gelir neden oldukları için bu özellikler olarak aşırı bakım madem isogenic satırları deneyler için gereklidir. Teknikleri bu gen ekspresyonu, analizleri için veri oluşturma dahil olmak üzere yukarıda açıklanan benzer olsa da yaprak biti yetiştirme ve moleküler analiz için genel protokoller, sağlamak yeterli biyolojik üreten belirli bir adım adım kılavuz A. nerii için malzeme moleküler ve ekolojik uygulamalar çeşitli bir dizi için.

İşlev veya ekolojik genomik çalışmalar için A. nerii, ufukta iseniz bu amaçla, bunlar tam olarak sundukları deneysel fırsatlarını aktifleştirmek için canlı kültürleri ile birleştiğinde olabilir gerekir. Böcek otobur karmaşık toplulukları kendi ana bitkiler üzerinde yaşayan ve hem intraspecific etkileşimleri38,39 hem de interspecific etkileşimleri40 A. nerii Son Yanıt onların ana bitkiler için şekil . Ana bitkiler, A. nerii üzerinde uzmanlaşmak, tamamen fizyolojik veya genomik yaklaşımlar ile kaplin önemini vurgulamış farklı yaşam öyküsü stratejileri15,21, hızlı bitkiler farklı bir dizi temsil doğal olarak meydana gelen değişim A. nerii topluluklar için hesap deneysel manipülasyonlar. Burada özetlenen yöntemleri bir ekolojik ve fonksiyonel genomik bakış açısı için puan A. nerii ve onun etkileşimleri toksik ana tesisleri ile başladı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Michelle Moon (Vanderbilt Üniversitesi) fotoğrafçılık hakkında yardım almak için teşekkür etmek istiyorum. PA ve SSLB Vanderbilt Üniversitesi sağlanan destek DGE-1445197 tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).

Tags

Genetik sayı 138 yaprak biti sera süt çocuğu microsatellite RNAseq qPCR bitki böcek etkileşim
Biyolojik kültür ve gen ifadesinde ölçme <em>Aphis nerii</em>Bakımı: bitki böcek etkileşimleri için bir sigara-model sistemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C.,… More

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter